CN115737599A - 一种结直肠释放肠菌微胶囊 - Google Patents

Abstract

本发明开发了一种结直肠靶向并且耐极端胃酸pH条件的肠菌微胶囊制剂。肠菌微胶囊制剂以果胶/抗性淀粉为核心基质，不仅提高了递送到结肠的活菌总数，满足结直肠释放活菌量的需求，而且所用微胶囊基质可促进肠菌增殖。

Description

一种结直肠释放肠菌微胶囊

申请人：北京富玛特生物科技有限公司

发明人：张家树 谷志静

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种结直肠靶向释放型肠菌微胶囊。

背景技术

《菌群移植标准方法建立与专家共识》认可口服肠菌活菌制剂是与插管、灌肠具有等同疗效的肠菌移植方式。其中微胶囊是一种老幼皆宜的口服剂型，显著改善菌群移植依从性。肠菌微胶囊作为肠道给药制剂，其释放部位和代谢动力学明显影响其疗效。肠菌结直肠释放给药提供一种相当于下消化道菌群移植的简易方式，解决了胃肠道中常规活菌口服制剂递送面临的两个重要问题：(1)肠菌本身多数来源于结直肠，具有结直肠环境较好的耐受性，结肠靶向释放可提高菌剂特别是益生菌的定植能力(Biorelevant dissolutiontesting of colon-specific delivery systems activated by colonic microflora.JControl Release.2008；125：77-86.)；(2)对于结直肠病变，原位产生可用作治疗剂的生物活性成分短链脂肪酸、氨基酸、多肽等，能高效快速发挥作用。肠道益生菌在到达结肠之前，通过胃肠道的活细胞必须至少达到71gCFU(“益生菌‘量效关系’的科学综述”，中国食品科学技术学会益生菌分会，2021)。但是目前肠菌制剂对于极端pH(pH＜3.0)的耐受仍然非常有限，不足以满足结直肠释放活菌量的需求，导致肠菌制剂的效力较低。因此，本发明基于以上需求对微胶囊技术进行改进并应用于肠菌微胶囊开发。

发明内容

针对现有的肠菌制剂应用中的问题，采用微胶囊制剂克服婴幼儿患者肠菌移植依从性差的问题，并采用果胶/淀粉复合微胶囊基质提高结直肠靶向释放效率。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种结直肠释放肠菌微胶囊，由肠菌菌泥和微胶囊基质按重量比1∶3-1∶5制备；肠菌菌泥由健康供体粪便经过3-6倍无菌生理盐水洗涤，微米过滤网提取获得；其特征在于所述微胶囊基质包括：2.0-8.0％(w/w)低酯果胶；1.0-2.0％(w/w)抗性淀粉；10％(V/V)甘油；2.5％(w/w)L-抗坏血酸、2.5％(w/w)聚L-赖氨酸。

2.根据权利要求1所述的结直肠释放肠菌微胶囊，其特征在于所述低酯果胶酯化度＜35％，在肠菌微胶囊中的最终形式可以为果胶钙或者果胶锌的任意一种。

3.根据权利要求1所述的结直肠释放肠菌微胶囊，其特征在于所述微胶囊基质还可以包括0.5-1.0％(w/w)海藻酸盐，在肠菌微胶囊中的最终形式为海藻酸钙或海藻酸锌的任意一种。

4.根据权利要求1所述的结直肠释放肠菌微胶囊，其特征在于所述微胶囊基质还可以包括0.5-1.0％(w/w)壳聚糖，0.25-0.5％(w/w)交联剂聚磷酸三钠。

本发明的有益效果：

1.本发明低酯果胶/抗性淀粉复合微胶囊基质在pHl.5-6.8.具有较高的稳定性，而在结直肠碱性pH 7.8-8.0作用下实现pH控释；与单一果胶钙或海藻酸钙微胶囊相比既能够耐受极端胃酸pH，也能够充分利用小肠与结肠之间pH值的差异。

2.本发明于采用的果胶/抗性淀粉比例能够保证合适的转运时间，果胶和抗性淀粉均能够耐受小肠中的酶系而不能耐受结直肠酶系作用，通过控制在胃肠道中的转运时间和损失率，提高结直肠的靶向释放效率。

3.本发明所述微胶囊基质均采用可食用的凝胶材质和膳食纤维；其中果胶相对于其他植物食用胶具有更好的风味，较动物胶具有更好的安全性；果胶属于发酵性纤维素在肠道微生物作用下，可以产生有益代谢产物短链脂肪酸(SCFAs)影响宿主代谢状态，有助于改善肠道营养，提高便秘等肠道疾病患者的菌群移植的临床效果(菌群移植标准化方法学的建立与临床应用中国专家共识中华胃肠外科杂志2020年7月第23卷增刊Chin JGastrointest Surg(Suppl)，July 2020，Vol.23)；抗性淀粉作为新型膳食纤维不仅可改善果胶微胶囊的耐胃酸稳定性，还可辅助改善糖尿病、肥胖等代谢疾病患者的菌群移植的临床效果((Fecal microbial transplantation and fiber supplementation in patientswith severe obesity and metabolic syndrome：a randomized double-blind，placebo-controlled phase 2 trial.Mocanu V，Zhang Z，Deehan EC，Kao DH，Hotte N，Karmali S，Birch DW，Samarasinghe KK，Walter J，Madsen KL.Nat Med.2021Jul；27(7)：1272-1279.)。

具体实施方式

设计肠道给药系统时要考虑吞咽能力和消化系统的生理特点，包括胃肠转运时间、收缩点、胃容积、粘膜粘附。消化系统由消化管和消化腺两大部分组成。消化管包括口腔、咽、食管、胃、小肠(十二指肠、空肠、回肠)和大肠(盲肠、阑尾、结肠、直肠、肛管)等。其中胃pH为1.0-3.0，转运时间通常为1-2h，最长可达4h；小肠pH为5.5-6.8，转运时间为1-6h；结直肠pH为6.0-8.0，转运时间为1-3天。对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述如下：

制备肠菌菌泥：将健康供体新鲜粪便样本20g，浸泡于100mL的0.9％无菌生理盐水溶液中，获得原始菌液；将原始菌液经过45目-60目过滤网依次过滤，以7000xg，离心10min，弃去上清；重复滤洗3次，获得肠菌菌泥。

制备微胶囊基质：低酯果胶、海藻酸钠加适量无菌水配制成2.0-8.0％(w/w)低酯果胶和2.0％(w/w)海藻酸盐；100℃灭菌15min；L-抗坏血酸、聚L-赖氨酸配成10倍溶液过滤除菌，冰箱保存，使用前按比例添加；壳聚糖加酸溶胀按10倍浓度配制，115℃灭菌15min；溶液121℃灭菌15min，冷却备用。微胶囊制备前按表1各个实施例的配比，在低酯果胶溶液中加入抗性淀粉、壳聚糖、海藻酸钠、充分搅拌制备成微胶囊基质悬浮液或者溶胶液。

表1 微胶囊实施例及对照的基质组成

果胶是一种天然杂多糖，具有至少65％单位重量的半乳糖醛酸，它是由1，4连接α-d-半乳糖醛酸残基和一系列中性糖，如鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖等组成。果胶的溶解性与果胶的聚合度和其甲氧基的含量和分布有关。果胶是FAO/WHO食品添加剂联合委员会推荐的安全无毒的天然食品添加剂。果胶的功能很多，可作为一种天然膳食纤维，具有增强胃肠蠕动，促进营养吸收的功能，对防治腹泻、肠癌、糖尿病、肥胖症等病症有较好的疗效(Pectin and Pectin-Based Composite Materials：Beyond Food Texture，Molecules2018，23，942：1-35))。低酯果胶与二价离子形成的微胶囊、微珠在pH2.6-6.8范围具有较好的稳定性，(Pectin Matrix as Oral Drug Delivery Vehicle for Colon CancerTreatment，AAPS PharmSciTech，Vol.12，No.1，March 2011)，是一种优良的药物制剂基质。

抗性淀粉又称抗酶解淀粉、难消化淀粉，在小肠中不能被酶解；但作为结肠菌群的营养源，通过结直肠微生物发酵，将碳水化合物代谢后生成丁酸等短链脂肪，有利于减少胺类致癌物的产生，抑制肿癌细胞(Daily Inclusion ofResistant Starch-ContainingPotatoes in a Dietary Guidelines for Americans Dietary Pattern Does NotAdversely Affect Cardiometabolic Risk or Intestinal Permeability in Adultswith Metabolic Syndrome：A Randomized Controlled Trial.Nutrients.2022Apr 8；14(8)：1545.)。抗性淀粉不溶于水和极端酸性pH条件，可以作为与果胶等孔隙率较高的凝胶基质复配，填充微孔，形成类似

的抗胃酸保护层，提高微胶囊的耐胃酸稳定性。

壳聚糖在食品工业中可作为黏结剂、保湿剂、澄清剂、填充剂、乳化剂、上光剂及增稠稳定剂；而作为功能性低聚糖，能降低胆固醇，提高机体免疫力，增强机体抗病抗感染能力，尤其有较强的抗肿瘤作用。

海藻酸来源于褐藻的多糖，用作微胶囊基质。多项临床试验表明海藻酸及其衍生物可以有效调节肠道微生态，预防高血压及相关心血管疾病(Int J Biol Macromol，2021Jul 31；183：1136-1144.Potassium Alginate Oligosaccharides Alter GutMicrobiota，and Have Potential to Prevent the Development of Hypertension andHeart Failure in Spontaneously Hypertensive Rats.Int J Mol Sci.2021 Sep 11；22(18)：9823.doi：10.3390/ijms22189823.)，还能够减轻肠炎及代谢综合症的临床症状(Seaweed Dietary Fiber Sodium Alginate Suppresses the Migration of ColonicInflammatory Monocytes and Diet-Induced Metabolic Syndrome via the GutMicrobiota.Nutrients.2021 Aug 16；13(8)：2812.doi：10.3390/nu13082812.)。

肠菌菌泥和各实施例微胶囊基质悬液按重量比1∶3-1∶5，充分混匀，插入内径0.8-2.4mm的蠕动泵软管，采用Kamoer NKCP-S06B精密蠕动泵以4-6rpm速度挤出，滴加到用含有4.0％(w/w)氯化钙或2.0％(w/w)醋酸锌的二价阳离子溶液中形成微胶囊，冰浴固化15-30min，用无菌生理盐水洗涤，加吸水纸吸取多于水分，即得肠菌微胶囊(图1)。本发明所得肠菌微胶囊平均粒径在4.0mm±0.5mm；未添加淀粉的果胶微胶囊为半透明(图1A)，果胶/抗性淀粉复合基质微胶囊为不透明(图1B)。

附图说明

图1微胶囊形态图(A)果胶微胶囊；(B)果胶/淀粉复合微胶囊

图2微胶囊耐胃酸、耐胆盐稳定性。

图3微胶囊人工结直肠溶液释放曲线。

图4微胶囊SGF2h-SIF3h-SCF1h溶胀/崩解图示。

1.包封率检测

采用厌氧培养活菌计数法。取约0.1g肠菌微胶囊样品研磨后，置于无菌3％(w/v)柠檬酸钠pH8.0-50mM EDTA溶液中15min以溶解胶囊。将各实施例和对照分别制备10倍系列稀释样品，稀释到10^-7；选取三个菌落数在30-300的合适稀释度，浇注改良GAM培养基置于厌氧盒培养48h，按照式1计算活菌总数，式2计算包封率。各实施例的包封率如表2所示。可见各个果胶/淀粉基质实施例、以单独果胶基质对照2、海藻酸基质对照3活菌的包封率均在90％以上。非细胞体系的小分子药物微胶囊研究表明添加抗性淀粉有助于提高包封率；由于肠菌提取物也是富含非细胞活性成分(The fecal metabolome as a functionalreadout of the gut microbiome.Nat Genet.2018 Jun；50(6)：790-795.)，因此本发明优选以果胶/抗性淀粉复配物为微胶囊基质。

活菌总数CFU/g＝计数的加权平均值×10×稀释倍数(式1)

包封率(％)＝各实施例活菌总数÷非微囊化肠菌原液对照1(U)活菌总数×100(式2)

表2 微胶囊包封率

编号	包封率(％)	编号	包封率(％)
				实施例I	95.62±1.95	实施例V	95.47±1.61
实施例II	98.53±2.01	实施例VI	96.18±1.71
				实施例III	94.60±2.03	实施例VII	93.62±1.58
实施例IX	96.29±0.99	实施例VIII	94.27±1.51
				对照2	90.66±2.06	对照3	98.42±1.84

2模拟消化道释放试验

2.1耐胃酸稳定性

根据《中国药典》通则8004附注配制人工胃液SGF(取盐酸1.64ml，加水约80ml，摇匀后，加水稀释成100ml，调pH1.2-1.5)，灭菌后备用，使用前按1％(w/w)加过滤除菌胃蛋白酶。根据《中国药典》通则0931溶出度与释放度测定法：按照每个实施例用9只无菌EP管，称量加入约0.1g微胶囊，再加入1ml人工胃液；于厌氧箱中37℃下静置2-4小时，取出EP管，12,000rpm离心5分钟，去掉上清加入10倍的无菌生理盐水洗涤，取其中3只EP管样品，检测活菌总数，分析耐胃酸稳定性。试验结果如图2所示，本发明各实施例在SGF处理2-4h后的活菌数≥71gCFU，显著高于未微囊化处理的对照1(0.691gCFU)；对照2果胶钙微胶囊经过2h、4hSGF处理后，活菌总数分别降低至6.21gCFU、4.1gCFU；对照3海藻酸钙微胶囊经过2h、4h SGF处理后，活菌总数分别降低至6.21gCFU、4.61gCFU。因此，本发明各实施例果胶/抗性淀粉复配基质制备的微胶囊对极端胃酸条件的耐受性更好。

2.2小肠(SIF)肠溶-耐胆盐试验

根据《中国药典》通则8004附注配制人工小肠液(SIF)。取磷酸二氢钾0.68g，加水50ml使溶解，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8，配成100ml溶液，灭菌备用。另取胰酶，加水适量使溶解，过滤除菌，使用前按照1％(w/w)比例添加；猪胆盐按照0.3％(w/w)添加。

耐胃酸稳定性测试洗涤离心沉淀的6只EP管样品加入1ml人工小肠液；于厌氧盒中37℃下静置3h；取出其中3只EP管，去掉上清加入10倍的无菌生理盐水洗涤，检测活菌总数，即微胶囊肠溶-耐胆盐剩余活菌数。剩余3只EP管样品去上清，12,000rpm离心5分钟，生理盐水洗涤备用。

试验结果如图2所示；表明经SGF处理2h再经SIF(pH6.8)处理3h，本发明的各实施例果胶/抗性淀粉基质微胶囊在SIF中几乎不释放(＜0.51g CFU)，微胶囊中剩余的活菌总数即能够到达结直肠的活菌总数可达6.9-7.51gCFU；而对照2果胶钙微胶囊活菌数降低了1.51gCFU，剩余活菌数为5.51gCFU；对照3海藻酸钙微胶囊则几乎全部释放，剩余活菌总数仅有0.51gCFU。

2.3结直肠释放

根据《中国药典》通则8004附注配制人工结肠液SCF(磷酸氢二钾5.59g/L、磷酸二氢钾0.41g/L，pH7.4-8.0)。将小肠肠溶试验中剩余的3只EP管(即经SGF2h+SIF3h处理后)中加入1ml人工结肠液；于厌氧箱中37℃下静置1-24小时进行结直肠释放试验。在1h、4h、7h、10h、24h分别取100μl上清液加入900μl生理盐水，检测活菌总数，即为结肠(pH8.0)释放活菌数。结果如图3所示，在模拟肠道系统经SGF-SIF转运后，对照2果胶钙微胶囊在1h，上清液中活菌数达4.51g CFU，在4h几乎全部释放；对照3海藻酸钙微胶囊在1h内几乎全部释放并且微胶囊全部溶解(图4)；实施例I-VIII-果胶/淀粉复合微胶囊1h仅释放0.8-2.01gCFU，实施例I-VI果胶/淀粉复合微胶囊在10h几乎全部释放；直至24h各实施例上清活菌量高出进入结直肠初始活菌数(SGF2h+SIF3h处理剩余活菌数)2-41gCFU，推测果胶基可以作为肠菌代谢的底物促进肠菌增殖，也表明本发明所用微胶囊基质可协同提高活菌制剂的生物量。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (4)

1.一种结直肠释放肠菌微胶囊，由肠菌菌泥和微胶囊基质按重量比1∶3-1∶5制备；肠菌菌泥由健康供体粪便经过3-6倍无菌生理盐水洗涤，微米过滤网提取获得；其特征在于所述微胶囊基质包括：2.0-8.0％(w/w)低酯果胶；1.0-2.0％(w/w)抗性淀粉；10％(w/w)甘油；2.5％(w/w)L-抗坏血酸、2.5％(w/w)聚L-赖氨酸。

2.根据权利要求1所述的结直肠释放肠菌微胶囊，其特征在于所述低酯果胶酯化度＜35％，在肠菌微胶囊中的最终形式可以为果胶钙或者果胶锌的任意一种。

3.根据权利要求1所述的结直肠释放肠菌微胶囊，其特征在于所述微胶囊基质还可以包括0.5-1.0％(w/w)海藻酸盐，在肠菌微胶囊中的最终形式为海藻酸钙或海藻酸锌的任意一种。

4.根据权利要求1所述的结直肠释放肠菌微胶囊，其特征在于所述微胶囊基质还可以包括0.5-1.0％(w/w)壳聚糖，0.25-0.5％(w/w)交联剂聚磷酸三钠。

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