CN115721734B - 负载布地奈德的固体脂质纳米颗粒复合物及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种负载布地奈德的固体脂质纳米颗粒复合物及制备方法，该固体脂质纳米颗粒复合物包括固体脂质纳米颗粒和聚电解质复合物层，聚电解质复合物层和固体脂质纳米颗粒的质量比为10:1～1:1，其中，固体脂质纳米颗粒按质量比包括0.5％～5％布地奈德、5％～30％乳化剂和65％～90％油性介质；聚电解质复合物层按质量比包括60％～80％纤维素硫酸钠和20％～40％壳聚糖季铵盐。本发明以天然多糖和天然固态油脂为主要材料，具有良好的生物相容性、可降解性和结肠菌群酶响应性，并且制备原料易于获取，制备工艺简洁，无有机溶剂制剂且易于大规模生产。
Description
技术领域
本发明涉及药物制剂领域，尤其涉及一种负载布地奈德的固体脂质纳米颗粒复合物及制备方法。
背景技术
炎症性肠病(IBD)是一个慢性且易复发的肠道炎症，其包括两种主要形式，克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)。克罗恩病以非连续型影响胃肠道的任何部分(最常见的是回肠末期或肛周区域)，而溃疡性结肠炎发病部位仅限于结肠。目前，由于IBD的病因以及发病机理均不明确，尚无现有药物能彻底治愈IBD，故而IBD的治疗宗旨在缓解临床症状。为此IBD患者需要终身每日服用药物控制病情发展。
布地奈德具有广泛的药理活性，如抗病毒和抗炎活性，是治疗中、重度节段性肠炎、溃疡性结肠炎等局部炎症性大肠疾病的首选药物。
布地奈德(简称BUD)，是一种糖皮质激素，其分子式为C25H34O6，分子量为430.534，CAS.NO：51333-22-3，结构式如下：
虽然布地奈德具有较高的糖皮质激素受体亲和力和良好的肝外代谢稳定性，但由于其90％的药物在口服经小肠吸收后首过效应时被肝脏内CYP3A4代谢失活，水中的低溶解度以及在体内消除半衰期短等因素，导致再分布到结肠发炎部位的药量无法到达足够浓度，造成极低的口服生物利用度。虽然可以通过加大口服剂量的办法提高结肠局部的药物浓度，但由于血药浓度随之增加，反而会引起一系列的类固醇全身性毒副作用(例如全身性免疫抑制和感染易感性，库欣综合征)，使患者难以坚持长期治疗。
因此，近年来有研究将布地奈德制备成不同口服药物递送剂型，以减少全身暴露，提高结肠炎症部位的局部药物浓度，从而解决布地奈德口服生物利用率低和全身毒副作用高的问题。
公开号CN110507627A的中国专利文献公开了一种布地奈德的口服控释药物组合物的制备方式，虽然该专利使用大豆磷脂增加了布地奈德的溶解度，并通过包衣材料尤特奇L100与尤特奇S100降低了布地奈德在胃环境中的提前释放，但是改缓释片会在小肠中释放布地奈德，从而无法有效提升结肠部位药物的浓度。并且，其缓释片制备材料繁多，工艺复杂，且在制备过程中需要使用有机溶剂，导致溶剂残留。
文献Nanomedicine:Nanotechnology，Biology，and Medicine 2008，14:823-834报道了一种负载布地奈德的pH触发药物结肠靶向释放的给药颗粒。此给药系统通过纳米颗粒表面吸附pH敏感带电聚电解质，从而控制药物在不同的pH环境中的释放速率以达到结肠靶向。但是，有临床证据表明IBD患者结肠环境的pH下降，与正常结肠pH值为6.0～7.4相比，IBD患者的右/左结肠的pH在2.3～5.5之间。这主要是由于肠道菌群不断产生的短链脂肪酸，乳酸无法被肠道正常吸收，导致酸性物质在肠道中过量累积。因此，PH触发给药体系不具备良好的结肠靶向能力。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种负载布地奈德的固体脂质纳米颗粒复合物及制备方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：本发明实施例第一方面提供了一种负载布地奈德的固体脂质纳米颗粒复合物，所述固体脂质纳米颗粒复合物包括：
固体脂质纳米颗粒，按质量比，包括0.5％～5％布地奈德、5％～30％乳化剂和65％～90％油性介质；和
聚电解质复合物层，按质量比，包括60％～80％纤维素硫酸钠和20％～40％壳聚糖季铵盐；
其中，所述聚电解质复合物层和所述固体脂质纳米颗粒的质量比为10:1～1:1。
进一步地，所述聚电解质复合物层和所述固体脂质纳米颗粒的质量比为5:1～2:1；
固体脂质纳米颗粒，按质量比，所述布地奈德的用量为1％～3％，所述乳化剂的用量为5％～20％，所述油性介质的用量为75％～90％，
聚电解质复合物层，按质量比，所述纤维素硫酸钠的用量为75％～80％，所述壳聚糖季铵盐的用量为20％～25％。
进一步地，所述油性介质由中链饱和脂肪酸、长链饱和脂肪酸、中链饱和脂肪酸甘油酯、长链饱和脂肪酸甘油酯和液态油中的一种或多种按任意配比混合组成；所述中链饱和脂肪酸和所述长链饱和脂肪酸均由硬脂酸、软脂酸、山嵛酸、棕榈酸、肉豆蔻酸、葵酸中的一种或多种按任意配比混合组成；所述中链饱和脂肪酸甘油酯和所述长链饱和脂肪酸甘油酯均由硬脂酸、软脂酸、山嵛酸、棕榈酸的三甘油酯、双甘油酯、单甘油酯中的一种或多种按任意配比混合组成；所述液态油为油酸、亚油酸、大豆油中的一种。作为优选，所述油性介质由软脂酸、硬脂酸、山嵛酸的三甘油酯、双甘油酯、单甘油酯中的一种或多种按任意配比混合组成。
进一步地，所述乳化剂由十八烷基硫酸钠、十二烷基硫酸钠、十六烷基三甲基溴化铵、胆酸钠、十二烷基纤维素硫酸钠、卵磷脂、吐温80、司班20、泊洛沙姆F68、泊洛沙姆F127中的一种或多种按任意配比混合组成。作为优选，所述乳化剂为十二烷基纤维素硫酸钠、十八烷基硫酸钠、十二烷基硫酸钠、吐温80、泊洛沙姆F127中的一种。
进一步地，所述十二烷基纤维素硫酸钠包括纤维素糖链和十二烷基，所述纤维素糖链为亲水段，所述十二烷基为疏水段，所述纤维素糖链和十二烷基通过酯键相连，它的分子结构式为：
其中，n为10-10000；所述十二烷基纤维素硫酸钠的纤维素硫酸钠上硫酸根取代度为0.2～1；所述十二烷基纤维素硫酸钠中的疏水段的支链取代度为0.2～0.8。
进一步地，所述固体脂质纳米颗粒的尺寸范围为50nm～500nm；所述固体脂质纳米颗粒的zeta电荷范围为-20mv～-50mv。作为优选，所述固体脂质纳米颗粒的尺寸范围为100nm～400nm；所述固体脂质纳米颗粒的zeta电荷范围为-20mv～-40mv。涂有聚电解质复合物层的固体脂质纳米颗粒的尺寸范围为200nm～1000nm；涂有聚电解质复合物层的固体脂质纳米颗粒的zeta电荷范围为-40mv～+40mv。作为优选，涂有聚电解质复合物层的固体脂质纳米颗粒的尺寸范围为200nm～800nm；涂有聚电解质复合物层的固体脂质纳米颗粒的zeta电荷范围为-40mv～+20mv。
本发明实施例第二方面提供了一种上述的负载布地奈德的固体脂质纳米颗粒复合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)室温下，按所述质量百分比称取各种物料：布地奈德、乳化剂、油性介质、纤维素硫酸钠和壳聚糖季铵盐；
(2)将油性介质加热融化作为油相，并将布地奈德溶解于熔融油性介质中；
(3)将乳化剂溶解在水中得到乳液，以作为水相备用，并将溶解有乳化剂的水相加热至与油相相同的温度，所述水相中的乳化剂的质量浓度为0.5％～2％；
(4)将油相分散于水相，并使用200W～800W探头超声仪分散乳液15min～35min，所述油相和水相的体积比为1:2～1:40；
(5)将分散后的乳液倒入4℃～25℃，20mL～100mL去离子水中搅拌10min～120min，以得到负载布地奈德的固体脂质纳米颗粒，其中，所述分散后的乳液和去离子水的体积比为1:1～1:10；
(6)将制备得到的固体脂质纳米颗粒与质量浓度为1％～10％的纤维素硫酸钠溶液混合，经搅拌反应10min～60min得到纤维素硫酸钠-固体脂质纳米颗粒；
(7)将纤维素硫酸钠-固体脂质纳米颗粒与质量浓度为0.5％～4％的壳聚糖季铵盐水溶液混合，经搅拌反应10min～60min得到壳聚糖季铵盐-纤维素硫酸钠-固体脂质纳米颗粒，以获取所述固体脂质纳米颗粒复合物。
进一步地，还可重复所述步骤(6)-步骤(7)，制备多层聚电解质复合层包裹固体脂质纳米颗粒，以获取多层固体脂质纳米颗粒复合物；其中，混合的固体脂质纳米颗粒溶液与壳聚糖季铵盐水溶液的体积比例3:1～50:1，混合的壳聚糖季铵盐-固体脂质纳米颗粒溶液与纤维素硫酸钠水溶液的体积比例3:1～50:1。
进一步地，所述乳化剂为十二烷基纤维素硫酸钠；所述油相和水相的体积比为1:5～1:20；将分散后的乳液倒入4℃的去离子水中搅拌20min～60min，所述分散后的乳液和去离子水的体积比为1:2～1:5。
进一步地，所述十二烷基纤维素硫酸钠的合成具体为：将纤维素硫酸钠悬浮于吡啶中，加入月桂酰氯，加热至60℃～95℃，搅拌催化反应1h～5h，采用乙醇醇沉，使用呋喃和乙醇进行洗涤，放入真空干燥箱中干燥；其中，所述纤维素硫酸钠和吡啶的质量比为1:5～1:50，所述纤维素硫酸钠和月桂酰氯的质量比为1:0.2～1:1。
本发明的有益效果是，本发明所制备的含布地奈德的固体脂质纳米颗粒复合物，以天然多糖和天然固态油脂为主要材料，具有良好的生物相容性、可降解性和结肠菌群酶响应性。并且制备原料易于获取，制备工艺简洁、无有机溶剂制剂且易于大规模生产。
本发明所制备的含布地奈德的固体脂质纳米颗粒复合物，通过电荷相互作用将聚电解质复合物层与固体脂质纳米颗粒相结合。固体脂质纳米颗粒具有高效负载布地奈德的能力。而聚电解质复合物层不但拥有酶响应结肠靶向的能力，并且解决了固体脂质纳米颗粒自身初始快速药物释放以及脂质在上消化道中被胃脂肪酶和胰脂肪酶酶解的缺陷。两者组成的复合物能有效减少布地奈德在上消化道的释放，并在结肠环境中快速释放，提高布地奈德在结肠炎症部位中的药量，进而提升布地奈德的口服生物利用率。
本发明使用的聚电解质纤维素硫酸钠以及壳聚糖季铵盐为强聚电解质。由于其所携带电荷主要来源于硫酸基团以及季铵盐基团，故而聚合物在很宽的pH范围内带电，从而降低了肠道环境对于聚电解质复合物层的影响，增强了聚电解质复合物层在上消化道中的稳定性。并且，纤维素硫酸钠/壳聚糖季铵盐(NaCS/HACC)中高密度的羟基可以通过氢键的形成进一步提高聚电解质复合物层(PEC层)的稳定性。
本发明所制备的含布地奈德的固体脂质纳米颗粒复合物拥有表面带负电荷和纳米级粒径的特性。这两个特性可以增强药物在发炎的肠道组织中的积累和保留。与阳离子纳米粒子相比，阴离子纳米粒子可能更容易通过上消化道，减少与小肠黏膜的非特异性结合。此外，溃疡病灶处积聚的嗜酸性粒细胞和中性粒细胞会分泌高浓度的带正电荷的蛋白质，如转铁蛋白和嗜酸性粒细胞阳离子蛋白，促进带负电荷的纳米粒子对炎症部位的亲和力和粘附性。此外，发炎的结肠组织中被破坏的肠道屏障可以增强纳米颗粒的渗透性，并且富集的免疫和炎症细胞(如：巨噬细胞、树突细胞和中性粒细胞)能够将这些纳米颗粒内化并保留在发炎部位。
附图说明
图1为十二烷基纤维素硫酸钠合成的反应方程式；
图2为固体脂质纳米颗粒层层自组装聚电解质复合物层模式图；
图3为固体脂质纳米颗粒复合物药物释放模式图；
图4为制备的十二烷基纤维素硫酸钠(NaCS-C12)与纤维素硫酸钠(NaCS)的核磁共振氢谱图；
图5为制备的十二烷基纤维素硫酸钠(NaCS-C12)与纤维素硫酸钠(NaCS)的红外光谱；
图6为制备的十二烷基纤维素硫酸钠(NaCS-C12)的临界胶束浓度CMC测定图；
图7(A)为固体脂质纳米颗粒粒径随着颗粒表面自组装聚电解质过程的变化；(B)为固体脂质纳米颗粒zeta电荷随着颗粒表面自组装聚电解质过程的变化；
图8(A)为SLN-BUD与SLN-BUD-2L TEM图；(B)为SLN-BUD-2L壳球结构TEM图；
图9(A)为涂有不同层数聚电解质复合物的固体脂质纳米颗粒在模拟小肠液(PBS)中布地奈德的释放曲线；(B)为涂有不同层数聚电解质复合物的固体脂质纳米颗粒在模拟结肠液(PBS+纤维素酶)中布地奈德的释放曲线；
图10为涂有不同两层聚电解质复合物的固体脂质纳米颗粒在模拟胃液、模拟小肠液和模拟结肠液中布地奈德的释放曲线；
图11为固体脂质纳米颗粒复合物在4℃与25℃温度下储存过程中颗粒粒径，分散性指数(PDI)以及zeta电位的变化；
图12为动物治疗实验方案；
图13(A)为小鼠每日体重百分比变化；(B)为小鼠每日粪便状态变化；(C)为小鼠每日隐血便状态变化；(D)为小鼠每日疾病活动指数(DAI)变化。
图14为各组小鼠结肠样品图；
图15(A)为各组小鼠结肠长度统计图；(B)为各组小鼠脾脏质量统计图。
图16(A)为各组小鼠结肠组织MPO活性统计图；(B)为各组小鼠结肠组织TNF-α活性统计图；(C)为各组小鼠结肠组织IL-6活性统计图；
图17为各组小鼠结肠切片HE染色图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面结合附图，对本发明进行详细说明。在不冲突的情况下，下述的实施例及实施方式中的特征可以相互组合。
本发明利用固体脂质纳米颗粒高效负载布地奈德，并在纳米颗粒表面吸附由纤维素硫酸钠/壳聚糖季铵盐组成的聚电解质复合物层。利用聚电解质复合物层在胃及小肠环境中保持完整，而在结肠中能被肠道菌群分泌的纤维素酶水解的特性，控制布地奈德在结肠环境中释放，提高布地奈德在炎症部位中的浓度，进而提升布地奈德对结肠炎的高效局部治疗作用。所得纳米颗粒复合物减少了给药剂量，克服了布地奈德口服生物利用度低，全身系统毒副作用大的缺点，并且本发明的制备方法简单，制备的纳米颗粒复合物稳定。
本发明中的负载布地奈德的固体脂质纳米颗粒复合物包括固体脂质纳米颗粒和聚电解质复合物层，聚电解质复合物层和固体脂质纳米颗粒的质量比为10:1～1:1。
本实施例中，按质量比，固体脂质纳米颗粒包括0.5％～5％布地奈德、5％～30％乳化剂和65％～90％油性介质；按质量比，聚电解质复合物层包括60％～80％纤维素硫酸钠和20％～40％壳聚糖季铵盐。
优选地，聚电解质复合物层和固体脂质纳米颗粒的质量比为5:1～2:1。
优选地，固体脂质纳米颗粒，按质量比，所述布地奈德的用量为1％～3％，所述乳化剂的用量为5％～20％，所述油性介质的用量为75％～90％。
优选地，聚电解质复合物层，按质量比，所述纤维素硫酸钠的用量为75％～80％，所述壳聚糖季铵盐的用量为20％～25％。
本实施例中，油性介质由中链饱和脂肪酸、长链饱和脂肪酸、中链饱和脂肪酸甘油酯、长链饱和脂肪酸甘油酯和液态油中的一种或多种按任意配比混合组成。
其中，中链饱和脂肪酸和长链饱和脂肪酸均由硬脂酸、软脂酸、山嵛酸、棕榈酸、肉豆蔻酸、葵酸中的一种或多种按任意配比混合组成；中链饱和脂肪酸甘油酯和长链饱和脂肪酸甘油酯均由硬脂酸、软脂酸、山嵛酸、棕榈酸的三甘油酯、双甘油酯、单甘油酯中的一种或多种按任意配比混合组成；液态油为油酸、亚油酸、大豆油中的一种。
优选地，油性介质由软脂酸、硬脂酸、山嵛酸的三甘油酯、双甘油酯、单甘油酯中的一种或多种按任意配比混合组成。
本实施例中，乳化剂由十八烷基硫酸钠、十二烷基硫酸钠、十六烷基三甲基溴化铵、胆酸钠、十二烷基纤维素硫酸钠、卵磷脂、吐温80、司班20、泊洛沙姆F68、泊洛沙姆F127中的一种或多种按任意配比混合组成。
优选地，乳化剂为十二烷基纤维素硫酸钠、十八烷基硫酸钠、十二烷基硫酸钠、吐温80、泊洛沙姆F127中的一种。
示例性地，在本实施例中，选择十二烷基纤维素硫酸钠作为优选的乳化剂。
具体地，十二烷基纤维素硫酸钠包括纤维素糖链和十二烷基，纤维素糖链为亲水段，十二烷基为疏水段，纤维素糖链和十二烷基通过酯键相连，十二烷基纤维素硫酸钠的分子结构式为：
其中，n为10-10000。
进一步地，十二烷基纤维素硫酸钠的纤维素硫酸钠上硫酸根取代度为0.2～1；十二烷基纤维素硫酸钠中的疏水段的支链取代度为0.2～0.8。
本实施例中，固体脂质纳米颗粒的尺寸范围为50nm～500nm；固体脂质纳米颗粒的zeta电荷范围为-20mv～-50mv。
优选地，固体脂质纳米颗粒的尺寸范围为100nm～400nm；固体脂质纳米颗粒的zeta电荷范围为-20mv～-40mv。
本实施例中，涂有聚电解质复合物层的固体脂质纳米颗粒的尺寸范围为200nm～1000nm；涂有聚电解质复合物层的固体脂质纳米颗粒的zeta电荷范围为-40mv～+40mv。
优选地，涂有聚电解质复合物层的固体脂质纳米颗粒的尺寸范围为200nm～800nm；涂有聚电解质复合物层的固体脂质纳米颗粒的zeta电荷范围为-40mv～+20mv。
进一步地，对本发明的负载布地奈德的固体脂质纳米颗粒复合物做进一步的说明。
本实施例中，聚电解质复合物层由阴离子聚电解质纤维素硫酸钠以及阳离子聚电解质壳聚糖季铵盐通过电荷相互作用在固体脂质纳米颗粒表面通过层层自组装的方式逐层交替吸附形成，如图2所示。纤维素硫酸钠以及壳聚糖季铵盐分别是纤维素以及壳聚糖的衍生物，且都具有良好的水溶性、稳定性、生物相容性以及生物酶解性。其最重要的性质是其聚合物单体之间的糖苷键可以被肠道菌群分泌的糖苷酶(如纤维素酶)水解，从而造成聚电解质复合物层结构破坏，形成孔隙，改变布地奈德的释放速率，进而实现结肠靶向药物释放，其给药机理参见图3。
十二烷基纤维素硫酸钠的合成：其化学反应方程式见图1，并通过如图4所示的核磁共振氢谱图以及如图5所示的红外光谱验证十二烷基纤维素硫酸钠的合成；并检测了十二烷基纤维素硫酸钠的临界胶束浓度，其结果如图6所示。
固体脂质纳米颗粒复合物性质表征：通过zeta电位仪对含有不同层数聚电解质复合物的固体脂质纳米颗粒进行表征。其粒径以及电位随聚电解质层数的变化如图7所示，其中表1为固体脂质纳米颗粒以及含有两层聚电解质复合物层的固体脂质纳米颗粒复合物特性的具体数据。并且对固体脂质纳米颗粒复合物形貌特征进行了检测，其电镜图如图8所示，从而所示固体脂质纳米颗粒复合物为球形，并为球壳结构。
表1：SLN-BUD与SLN-BUD-2L纳米颗粒主要性质
进一步对含有两次聚电解质复合物的固体脂质纳米颗粒复合物稳定性进行检测，从图11中可知，28天内固体脂质纳米颗粒复合物粒径，PDI以及Zeta电位在4℃以及25℃环境下中并未发生较大的变化。说明该给药体系稳定。
本发明的体外药物释放行为的测定：本发明所述释放是将涂有不同聚电解质复合物层数的的固体脂质纳米颗粒分别在模拟胃液(SGF，磷酸盐缓冲溶液，pH＝1.2)以及模拟结肠液(SCF，含1200U/L纤维素酶的磷酸盐缓冲溶液，pH＝7.4)中释放，释放条件为含0.5mg布地奈德的固体脂质纳米颗粒复合物装载于透析袋内，并在30mL模拟液中释放，其转速为200r/min，温度为37.0℃±0.5℃。并分别于0.5h、1h、2h、3h、4h、5h、6h、8h、24h、48h、72h取样测定布地奈德浓度。结果如图9(A)所示，当释放介质为磷酸盐缓存溶液时，累积药物释放量随着聚电解质复合物层数增加而下降。其结果表明聚电解质复合物层可以降低药物释放量且下降程度与层数正相关。而如图9(B)所示，当释放介质为含1200U/L纤维素酶的磷酸盐缓存溶液时，累积药物量与图9(A)相比有所上升。
进一步的测定，涂有两层聚电解质复合物的固体脂质纳米颗粒分别在模拟胃液(SGF，磷酸盐缓冲溶液，pH＝1.2)，模拟小肠液(SIF，磷酸盐缓冲溶液，pH＝6.8)以及模拟结肠液(SCF，含1200U/L纤维素酶的磷酸盐缓冲溶液，pH＝7.4)中释放，释放条件为含0.5mg布地奈德的固体脂质纳米颗粒复合物装载于透析袋内，并在30mL模拟液中释放，其转速为200r/min，温度为37.0℃±0.5℃。并分别于0.5h、1h、2h、3h、4h、5h、6h、8h、24h、48h、72h取样测定布地奈德浓度。结果如图10所示，固体脂质纳米颗粒复合物再SCF中累积药物释放量远远大于在SGF和SIF中药物释放量，故而说明固体脂质纳米颗粒复合物具有酶响应药物释放特性。
本发明的体内动物药效的测定：将小鼠随机分配为5组，分别为1-healthy(健康组)，2-colitis(阳性对照组)，3-Free BUD(BUD混悬治疗组)，4-SLN-BUD(固体脂质纳米颗粒治疗组)，5-SLN-BUD-2L(含两层聚电解质复合物层的固体脂质纳米颗粒复合物治疗组)。实验流程参见图12，除健康组小鼠，其余小鼠自由饮用含3％葡聚糖硫酸钠(DSS)水溶液结肠炎建模，建模时间为7天。第8天，小鼠停止饮用DSS水溶液，并开展为期5天的治疗。治疗期间，3-Free BUD，4-SLN-BUD，5-SLN-BUD-2L组小鼠每日通过灌胃，口服含有0.168mg/kg的布地奈德的对应制剂(即本发明中的固体脂质纳米颗粒复合物)。1-健康组，2-阳性对照组每日通过灌胃，口服含有相同体积的PBS(模拟小肠液)缓存液。并在实验期间监测小鼠体重，粪便黏稠程度以及引血便程度，其结果如图13(A)、(B)、(C)所示。并根据表2所示的疾病活动指数评分机制表进行统计，得到的结果如图13(D)所示。
表2：疾病活动指数(disease activity index，DAI)评分机制表
并在第12天，将小鼠处死，其结肠和脾脏被收集。之后测量结肠长度以及对称量脾脏重量，实验结果如图14和图15所示。然后，对远端结肠切面进行组织学评估。结肠段在10％福尔马林溶液中固定48h，石蜡包埋，切片，成像，实验结果见图17。之后，检测了结肠组织中髓过氧化物酶(MPO)，白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-ɑ)的浓度，实验结果见图16。从结果可见，5-SLN-BUD-2L组细胞因子水平相较于其他2组治疗组最低，代表该制剂具有最佳的治疗效果。
值得一提的是，本发明还提供了一种负载布地奈德的固体脂质纳米颗粒复合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)室温下，按质量百分比称取各种物料：布地奈德、乳化剂、油性介质、纤维素硫酸钠和壳聚糖季铵盐。
(2)将油性介质加热融化作为油相，并将布地奈德溶解于熔融油性介质中。
(3)将乳化剂溶解在水中得到乳液，以作为水相备用，并将溶解有乳化剂的水相加热至与油相相同的温度，所述水相中的乳化剂的质量浓度为0.5％～2％。
(4)将油相分散于水相，并使用200W～800W探头超声仪分散乳液15min～35min，所述油相和水相的体积比为1:2～1:40。
(5)将分散后的乳液倒入4℃～25℃，20mL～100mL去离子水中搅拌10min～120min，以得到负载布地奈德的固体脂质纳米颗粒(SLN-BUD)，其中，所述分散后的乳液和去离子水的体积比为1:1～1:10。
(6)将制备得到的固体脂质纳米颗粒与质量浓度为1％～10％的纤维素硫酸钠溶液混合，经搅拌反应10min～60min得到纤维素硫酸钠-固体脂质纳米颗粒。
(7)将纤维素硫酸钠-固体脂质纳米颗粒与质量浓度为0.5％～4％的壳聚糖季铵盐水溶液混合，经搅拌反应10min～60min得到壳聚糖季铵盐-纤维素硫酸钠-固体脂质纳米颗粒(SLN-BUD-1L)，以获取所述固体脂质纳米颗粒复合物。
本实施例中，还可以重复步骤(6)-步骤(7)，制备多层聚电解质复合物层包裹固体脂质纳米颗粒，以获取多层固体脂质纳米颗粒复合物。其中，混合的固体脂质纳米颗粒溶液与壳聚糖季铵盐水溶液的体积比例3:1～50:1，混合的壳聚糖季铵盐-固体脂质纳米颗粒溶液与纤维素硫酸钠水溶液的体积比例3:1～50:1。
应当理解的是，步骤(1)-步骤(7)制备获得的是一层聚电解质复合物层包裹固体脂质纳米颗粒(SLN-BUD-1L)，再重复1次步骤(6)-步骤(7)，获得的是两层聚电解质复合物层包裹固体脂质纳米颗粒(SLN-BUD-2L)，重复2次步骤(6)-步骤(7)，获得的是三层聚电解质复合物层包裹固体脂质纳米颗粒(SLN-BUD-3L)，具体可以根据实际需要重复步骤(6)-步骤(7)。
优选地，油相和水相的体积比为1:5～1:20。
优选地，将分散后的乳液倒入4℃的去离子水中搅拌20min～60min，分散后的乳液和去离子水的体积比为1:2～1:5。
优选地，乳化剂选择为十二烷基纤维素硫酸钠。
进一步地，如图1所示，十二烷基纤维素硫酸钠的合成具体为：将纤维素硫酸钠悬浮于吡啶中，加入月桂酰氯，加热至60℃～95℃，搅拌催化反应1h～5h，采用乙醇醇沉，使用呋喃和乙醇进行洗涤，放入真空干燥箱中干燥。其中，纤维素硫酸钠和吡啶的质量比为1:5～1:50，纤维素硫酸钠和月桂酰氯的质量比为1:0.2～1:1。
下面根据实施例详细描述本发明中负载布地奈德的固体脂质纳米颗粒复合物的制备方法，本发明的目的和效果将变得更加明显。
(一)合成十二烷基纤维素硫酸钠
实施例1
将1g纤维素硫酸钠悬浮于30g吡啶中，加入0.2g月桂酰氯，加热至85℃，搅拌催化反应3h，使用48g乙醇醇沉，抽滤。再次使用20g呋喃/16g乙醇依次反复洗涤两次，最终放置入真空干燥箱50℃干燥过夜。
实施例2
将1g纤维素硫酸钠悬浮于20g吡啶中，加入0.5g月桂酰氯，加热至95℃，搅拌催化反应1h，使用48g乙醇醇沉，抽滤。再次使用40g呋喃/32g乙醇依次反复洗涤两次，最终放置入真空干燥箱50℃干燥过夜。
实施例3
将1g纤维素硫酸钠悬浮于15g吡啶中，加入1g月桂酰氯，加热至60℃，搅拌催化反应5h，使用48g乙醇醇沉，抽滤。再次使用20g呋喃/16g乙醇依次反复洗涤两次，最终放置入真空干燥箱50℃干燥过夜。
实施例4
将1g纤维素硫酸钠悬浮于20g吡啶中，加入0.75g月桂酰氯，加热至80℃，搅拌催化反应3h，使用72g乙醇醇沉，抽滤。再次使用30g呋喃/24g乙醇依次反复洗涤两次，最终放置入真空干燥箱50℃干燥过夜。
实施例5
将1g纤维素硫酸钠悬浮于5g吡啶中，加入0.2g月桂酰氯，加热至95℃，搅拌催化反应1h，使用12g乙醇醇沉，抽滤。再次使用20g呋喃/16g乙醇依次反复洗涤两次，最终放置入真空干燥箱50℃干燥过夜。
实施例6
将1g纤维素硫酸钠悬浮于50g吡啶中，加入0.6g月桂酰氯，加热至60℃，搅拌催化反应4h，使用32g乙醇醇沉，抽滤。再次使用40g呋喃/32g乙醇依次反复洗涤两次，最终放置入真空干燥箱50℃干燥过夜。
实施例7
将1g纤维素硫酸钠悬浮于28g吡啶中，加入0.8g月桂酰氯，加热至75℃，搅拌催化反应2h，使用24g乙醇醇沉，抽滤。再次使用50g呋喃/40g乙醇依次反复洗涤两次，最终放置入真空干燥箱50℃干燥过夜。
实施例8
将1g纤维素硫酸钠悬浮于20g吡啶中，加入1g月桂酰氯，加热至70℃，搅拌催化反应4h，使用16g乙醇醇沉，抽滤。再次使用30g呋喃/24g乙醇依次反复洗涤两次，最终放置入真空干燥箱50℃干燥过夜。
(二)制备固体脂质纳米颗粒复合物
实施例1
称取900mg硬脂酸于离心管中，水浴加热至80℃，待硬脂酸融化后加入5mg布地奈德，搅拌得到黄色澄清透明液体，作为油相备用。称取95mg十二烷基硫酸钠添加至20mL去离子水中，搅拌使其溶解后，水浴加热至80℃，作为水相备用。将油相迅速添加入水相中，使用探头超声仪分散粗乳液20min，其超声功率为400w，超声模式为2s/2s。待超声完毕后，将乳液快速加入至60mL，4℃去离子水中，并搅拌30min。制备1％质量浓度壳聚糖季铵盐水溶液以及4％质量浓度纤维素硫酸钠水溶液作为聚电解质溶液备用。取10ml制备的含布地奈德的固体脂质纳米颗粒溶液，并添加9mL壳聚糖季铵盐水溶液搅拌20min，之后添加8mL纤维素硫酸钠水溶液再搅拌20min，获得含有一层聚电解质复合物的固体脂质纳米颗粒。重复以上步骤依次添加两种聚电解质溶液，以获得含有不同层数聚电解质复合物的固体脂质纳米颗粒。
实施例2
称取632mg山嵛酸单，双，三甘油酯(以质量比为1：1：1混合)于离心管中，水浴加热至85℃，待混合脂质融化后加入53mg布地奈德，搅拌得到黄色澄清透明液体，作为油相备用。称取316mg十二烷基硫酸钠添加至20mL去离子水中，搅拌使其溶解后，水浴加热至85℃，作为水相备用。将油相迅速添加入水相中，使用探头超声仪分散粗乳液25min，其超声功率为400w，超声模式为2s/2s。待超声完毕后，将乳液快速加入至40mL，4℃去离子水中，并搅拌30min。制备1％质量浓度壳聚糖季铵盐水溶液以及4％质量浓度纤维素硫酸钠水溶液作为聚电解质溶液备用。取5ml制备的含布地奈德的固体脂质纳米颗粒溶液，并添加6ml壳聚糖季铵盐水溶液搅拌30min，之后添加5ml纤维素硫酸钠水溶液再搅拌30min，获得含有一层聚电解质复合物的固体脂质纳米颗粒。重复以上步骤依次添加两种聚电解质溶液，以获得含有不同层数聚电解质复合物的固体脂质纳米颗粒。
实施例3
称取900mg硬脂酸单甘油酯(于离心管中，水浴加热至65℃，待硬脂酸单甘油酯融化后加入50mg布地奈德，搅拌得到黄色澄清透明液体，作为油相备用。称取50mg十八烷基硫酸钠添加至20mL去离子水中，搅拌使其溶解后，水浴加热至65℃，作为水相备用。将油相迅速添加入水相中，使用探头超声仪分散粗乳液25min，其超声功率为500w，超声模式为3s/3s。待超声完毕后，将乳液快速加入至50mL，20℃去离子水中，并搅拌20min。制备1％质量浓度壳聚糖季铵盐水溶液以及2％质量浓度纤维素硫酸钠水溶液作为聚电解质溶液备用。取5ml制备的含布地奈德的固体脂质纳米颗粒溶液，并添加5ml壳聚糖季铵盐水溶液搅拌60min，之后添加10ml纤维素硫酸钠水溶液再搅拌40min，获得含有一层聚电解质复合物的固体脂质纳米颗粒。重复以上步骤依次添加两种聚电解质溶液，以获得含有不同层数聚电解质复合物的固体脂质纳米颗粒。
实施例4
称取750mg硬脂酸三甘油酯(于离心管中，水浴加热至86℃，待硬脂酸单甘油酯融化后加入27mg布地奈德，搅拌得到黄色澄清透明液体，作为油相备用。称取223mg十六烷基三甲基溴化铵添加至10mL去离子水中，搅拌使其溶解后，水浴加热至86℃，作为水相备用。将油相迅速添加入水相中，使用探头超声仪分散粗乳液25min，其超声功率为300w，超声模式为3s/3s。待超声完毕后，将乳液快速加入至40mL，4℃去离子水中，并搅拌120min。制备2％质量浓度壳聚糖季铵盐水溶液以及4％质量浓度纤维素硫酸钠水溶液作为聚电解质溶液备用。取4ml制备的含布地奈德的固体脂质纳米颗粒溶液，并添加3ml壳聚糖季铵盐水溶液搅拌45min，之后添加6ml纤维素硫酸钠水溶液再搅拌45min，获得含有一层聚电解质复合物的固体脂质纳米颗粒。重复以上步骤依次添加两种聚电解质溶液，以获得含有不同层数聚电解质复合物的固体脂质纳米颗粒。
实施例5
称取820mg软脂酸三甘油酯于离心管中，水浴加热至70℃，待硬脂酸融化后加入5mg布地奈德，搅拌得到黄色澄清透明液体，作为油相备用。称取175mg十六烷基三甲基溴化铵添加至20mL去离子水中，搅拌使其溶解后，水浴加热至85℃，作为水相备用。将油相迅速添加入水相中，使用探头超声仪分散粗乳液15min，其超声功率为600w，超声模式为2s/2s。待超声完毕后，将乳液快速加入至80mL，4℃去离子水中，并搅拌60min。制备0.5％质量浓度壳聚糖季铵盐水溶液以及2％质量浓度纤维素硫酸钠水溶液作为聚电解质溶液备用。取5ml制备的含布地奈德的固体脂质纳米颗粒溶液，并添加7ml壳聚糖季铵盐水溶液搅拌30min，之后添加7ml纤维素硫酸钠水溶液再搅拌30min，获得含有一层聚电解质复合物的固体脂质纳米颗粒。重复以上步骤依次添加两种聚电解质溶液，以获得含有不同层数聚电解质复合物的固体脂质纳米颗粒。
实施例6
称取800mg硬脂酸，油酸(以质量比为8：2混合)于离心管中，水浴加热至85℃，待硬脂酸融化后加入50mg布地奈德，搅拌得到黄色澄清透明液体，作为油相备用。称取150mg胆酸钠添加至10mL去离子水中，搅拌使其溶解后，水浴加热至85℃，作为水相备用。将油相迅速添加入水相中，使用探头超声仪分散粗乳液35min，其超声功率为300w，超声模式为2s/2s。待超声完毕后，将乳液快速加入至40mL，4℃去离子水中，并搅拌60min。制备2％质量浓度壳聚糖季铵盐水溶液以及6％质量浓度纤维素硫酸钠水溶液作为聚电解质溶液备用。取10ml制备的含布地奈德的固体脂质纳米颗粒溶液，并添加7ml壳聚糖季铵盐水溶液搅拌50min，之后添加9ml纤维素硫酸钠水溶液再搅拌50min，获得含有一层聚电解质复合物的固体脂质纳米颗粒。重复以上步骤依次添加两种聚电解质溶液，以获得含有不同层数聚电解质复合物的固体脂质纳米颗粒。
实施例7
称取700mg硬脂酸三甘油酯，苯甲酸苄酯(以质量比为8：2混合)于离心管中，水浴加热至90℃，待硬脂酸融化后加入50mg布地奈德，搅拌得到黄色澄清透明液体，作为油相备用。称取250mg吐温80添加至20mL去离子水中，搅拌使其溶解后，水浴加热至90℃，作为水相备用。将油相迅速添加入水相中，使用探头超声仪分散粗乳液20min，其超声功率为500w，超声模式为3s/3s。待超声完毕后，将乳液快速加入至20mL，4℃去离子水中，并搅拌60min。制备2％质量浓度壳聚糖季铵盐水溶液以及4％质量浓度纤维素硫酸钠水溶液作为聚电解质溶液备用。取10ml制备的含布地奈德的固体脂质纳米颗粒溶液，并添加4ml壳聚糖季铵盐水溶液搅拌15min，之后添加8ml纤维素硫酸钠水溶液再搅拌15min，获得含有一层聚电解质复合物的固体脂质纳米颗粒。重复以上步骤依次添加两种聚电解质溶液，以获得含有不同层数聚电解质复合物的固体脂质纳米颗粒。
实施例8
称取845mg软质酸，硬脂酸(以质量比为1：1混合)于离心管中，水浴加热至75℃，待硬脂酸融化后加入5mg布地奈德，搅拌得到黄色澄清透明液体，作为油相备用。称取150mg泊洛沙姆F127添加至10mL去离子水中，搅拌使其溶解后，水浴加热至75℃，作为水相备用。将油相迅速添加入水相中，使用探头超声仪分散粗乳液15min，其超声功率为700w，超声模式为4s/4s。待超声完毕后，将乳液快速加入至10mL，4℃去离子水中，并搅拌30min。制备1％质量浓度壳聚糖季铵盐水溶液以及8％质量浓度纤维素硫酸钠水溶液作为聚电解质溶液备用。取5ml制备的含布地奈德的固体脂质纳米颗粒溶液，并添加15ml壳聚糖季铵盐水溶液搅拌60min，之后添加8ml纤维素硫酸钠水溶液再搅拌60min，获得含有一层聚电解质复合物的固体脂质纳米颗粒。重复以上步骤依次添加两种聚电解质溶液，以获得含有不同层数聚电解质复合物的固体脂质纳米颗粒。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种负载布地奈德的固体脂质纳米颗粒复合物，其特征在于，所述固体脂质纳米颗粒复合物包括：
固体脂质纳米颗粒，按质量比，包括0.5％～5％布地奈德、5％～30％乳化剂和65％～90％油性介质；和
聚电解质复合物层，按质量比，包括60％～80％纤维素硫酸钠和20％～40％壳聚糖季铵盐；
其中，所述聚电解质复合物层和所述固体脂质纳米颗粒的质量比为10:1～1:1；所述油性介质由中链饱和脂肪酸、长链饱和脂肪酸、中链饱和脂肪酸甘油酯、长链饱和脂肪酸甘油酯和液态油中的一种或多种按任意配比混合组成；所述中链饱和脂肪酸和所述长链饱和脂肪酸均由硬脂酸、软脂酸、山嵛酸、棕榈酸、肉豆蔻酸、葵酸中的一种或多种按任意配比混合组成；所述中链饱和脂肪酸甘油酯和所述长链饱和脂肪酸甘油酯均由硬脂酸、软脂酸、山嵛酸、棕榈酸的三甘油酯、双甘油酯、单甘油酯中的一种或多种按任意配比混合组成；所述液态油为油酸、亚油酸、大豆油中的一种；所述乳化剂由十八烷基硫酸钠、十二烷基硫酸钠、十六烷基三甲基溴化铵、胆酸钠、十二烷基纤维素硫酸钠、卵磷脂、吐温80、司班20、泊洛沙姆F68、泊洛沙姆F127中的一种或多种按任意配比混合组成；
所述固体脂质纳米颗粒复合物通过以下步骤制备获得：
(1)室温下，按质量百分比称取各种物料：布地奈德、乳化剂、油性介质、纤维素硫酸钠和壳聚糖季铵盐；
(2)将油性介质加热融化作为油相，并将布地奈德溶解于熔融油性介质中；
(3)将乳化剂溶解在水中得到乳液，以作为水相备用，并将溶解有乳化剂的水相加热至与油相相同的温度，所述水相中的乳化剂的质量浓度为0.5％～2％；
(4)将油相分散于水相，并使用200W～800W探头超声仪分散乳液15min～35min，所述油相和水相的体积比为1:2～1:40；
(5)将分散后的乳液倒入4℃～25℃，20mL～100mL去离子水中搅拌10min～120min，以得到负载布地奈德的固体脂质纳米颗粒，其中，所述分散后的乳液和去离子水的体积比为1:1～1:10；
(6)将制备得到的固体脂质纳米颗粒与质量浓度为0.5％～4％的壳聚糖季铵盐水溶液混合，经搅拌反应10min～60min得到壳聚糖季铵盐-固体脂质纳米颗粒；
(7)将壳聚糖季铵盐-固体脂质纳米颗粒与质量浓度为1％～10％的纤维素硫酸钠溶液混合，经搅拌反应10min～60min得到纤维素硫酸钠-壳聚糖季铵盐-固体脂质纳米颗粒，以获取所述固体脂质纳米颗粒复合物。
2.根据权利要求1所述的负载布地奈德的固体脂质纳米颗粒复合物，其特征在于，所述聚电解质复合物层和所述固体脂质纳米颗粒的质量比为5:1～2:1；
固体脂质纳米颗粒，按质量比，所述布地奈德的用量为1％～3％，所述乳化剂的用量为5％～20％，所述油性介质的用量为75％～90％，
聚电解质复合物层，按质量比，所述纤维素硫酸钠的用量为75％～80％，所述壳聚糖季铵盐的用量为20％～25％。
3.根据权利要求1所述的负载布地奈德的固体脂质纳米颗粒复合物，其特征在于，所述油性介质由软脂酸、硬脂酸、山嵛酸的三甘油酯、双甘油酯、单甘油酯中的一种或多种按任意配比混合组成。
4.根据权利要求1所述的负载布地奈德的固体脂质纳米颗粒复合物，其特征在于，所述乳化剂为十二烷基纤维素硫酸钠、十八烷基硫酸钠、十二烷基硫酸钠、吐温80、泊洛沙姆F127中的一种。
5.根据权利要求4所述的负载布地奈德的固体脂质纳米颗粒复合物，其特征在于，所述十二烷基纤维素硫酸钠包括纤维素糖链和十二烷基，所述纤维素糖链为亲水段，所述十二烷基为疏水段，所述纤维素糖链和十二烷基通过酯键相连，它的分子结构式为：
其中，n为10-10000；所述十二烷基纤维素硫酸钠的纤维素硫酸钠上硫酸根取代度为0.2～1；所述十二烷基纤维素硫酸钠中的疏水段的支链取代度为0.2～0.8。
6.根据权利要求1所述的负载布地奈德的固体脂质纳米颗粒复合物，其特征在于，所述固体脂质纳米颗粒的尺寸范围为50nm～500nm；所述固体脂质纳米颗粒的zeta电荷范围为-20mv～-50mv；涂有聚电解质复合物层的固体脂质纳米颗粒的尺寸范围为200nm～1000nm；涂有聚电解质复合物层的固体脂质纳米颗粒的zeta电荷范围为-40mv～+40mv。
7.根据权利要求6所述的负载布地奈德的固体脂质纳米颗粒复合物，其特征在于，所述固体脂质纳米颗粒的尺寸范围为100nm～400nm；所述固体脂质纳米颗粒的zeta电荷范围为-20mv～-40mv；涂有聚电解质复合物层的固体脂质纳米颗粒的尺寸范围为200nm～800nm；涂有聚电解质复合物层的固体脂质纳米颗粒的zeta电荷范围为-40mv～+20mv。
8.根据权利要求1所述的负载布地奈德的固体脂质纳米颗粒复合物，其特征在于，还可重复所述步骤(6)-步骤(7)，制备多层聚电解质复合层包裹固体脂质纳米颗粒，以获取多层固体脂质纳米颗粒复合物；其中，混合的固体脂质纳米颗粒溶液与壳聚糖季铵盐水溶液的体积比例3:1～50:1，混合的壳聚糖季铵盐-固体脂质纳米颗粒溶液与纤维素硫酸钠水溶液的体积比例3:1～50:1。
9.根据权利要求1所述的负载布地奈德的固体脂质纳米颗粒复合物，其特征在于，所述乳化剂为十二烷基纤维素硫酸钠；所述油相和水相的体积比为1:5～1:20；将分散后的乳液倒入4℃的去离子水中搅拌20min～60min，所述分散后的乳液和去离子水的体积比为1:2～1:5。
10.根据权利要求9所述的负载布地奈德的固体脂质纳米颗粒复合物，其特征在于，所述十二烷基纤维素硫酸钠的合成具体为：将纤维素硫酸钠悬浮于吡啶中，加入月桂酰氯，加热至60℃～95℃，搅拌催化反应1h～5h，采用乙醇醇沉，使用呋喃和乙醇进行洗涤，放入真空干燥箱中干燥；其中，所述纤维素硫酸钠和吡啶的质量比为1:5～1:50，所述纤维素硫酸钠和月桂酰氯的质量比为1:0.2～1:1。
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