CN115721708A - 一种含有复合免疫增强剂的h9n2禽流感-新城疫二联灭活疫苗的制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开的是一种含有复合免疫增强剂的H9N2禽流感‑新城疫二联灭活疫苗的制备与应用，免疫增强剂含有的羟丙基纤维素的左旋咪唑和黄芪多糖。一种含有该免疫增强剂的灭活疫苗的制备方法如下：将该免疫增强剂与灭活抗原、吐温‑80混合，制备成水相溶液；将白油、司班和硬脂酸铝混合，得到油相溶液；将油相溶液与水相溶液混合，即可得到灭活疫苗。该发明中所包含的免疫增强剂与疫苗中的其他组分之间具有正向导向性，具有增加难溶性药物的溶出度，提高这类药物的生物利用度，延长抗原在机体内的停留时间，达到缓释目的，来保持对免疫系统的持续激活作用，进而提高细胞免疫和体液免疫功能，增强免疫后机体的抗体水平，增强免疫效果。

Description

一种含有复合免疫增强剂的H9N2禽流感-新城疫二联灭活疫 苗的制备与应用

技术领域

本发明涉及一种动物疫苗的制备和应用，更具体一点说，涉及一种含有复合免疫增强剂的H9N2禽流感-新城疫二联灭活疫苗的制备与应用，属于免疫佐剂领域。

背景技术

鸡新城疫(Newcastle disease,ND)是由副黏病毒科副黏病毒属的新城疫病毒(Newcastle disease virs,NDV)感染引起的高度接触性传染性疾病，又称亚洲鸡瘟。伴有呼吸困难，高热，黏膜出血，神经紊乱，运动失调等疾病特征。鸡新城疫疾病具有传播速度快、发病率和病死率高等特征,对家禽业产生巨大的影响,造成不可估量的损失。世界动物卫生组织(Office International Des Epizooties,OIE)将其列为A类疫病。

禽流感是由正黏病毒科亚洲A型流感病毒(Avian inflenza virs,AIV)感染引起的由呼吸系统至全身败血症等多种病症的传染病。主要有发热、采食量下降、呼吸困难、肺出血、肌肉痛等疾病特征，主要发生在冬、春季节。禽流感病毒的多种亚型，多种传播渠道，造成了禽类大规模传染，给养鸡业带来了巨大经济损失，同时也严重危害公共卫生安全。

在禽养殖的过程中，为控制传染源，切断传播途径，保证养殖产量，使用疫苗免疫接种是控制禽流感疫情发生和流行的有效措施，家禽免疫接种疫苗后能够有效减少机体向外界的排毒量，在增加抵抗力的同时降低病毒传播的风险，对禽流感的防控起到了积极作用。灭活疫苗的高安全性和强免疫效果，是一种良好的疫苗免疫选择项。但是油乳剂灭活疫苗与活疫苗相比，免疫保护产生较慢，因此生产上需要进行疫苗增强剂的开发，达到延长抗原在机体内的存在时间和保持对免疫系统的持续激活作用。因此近年来寻找有效增强机体的细胞/体液免疫应答的免疫增强剂成为研究热点。

羟丙基纤维素(hydroxypropyl cellulose,简称HPC)，是纤维素羟丙基化的产物。是纤维素与氢氧化钠溶通过醚化反应后得到羟丙基纤维素。Qi X等研究发现HPC显示出良好的漂浮特性，延长了药物在胃部的停留时间，并提高了相对生物利用度。Bielska D研究HPC纳米微球包裹姜黄素，具有热敏性，可作为缓控释剂。Sarode A L等以HPC为载体，发现它起到促溶剂的作用，可以增加难溶性药物的溶出度并且能够提高这类药物的生物利用度。研究还发现，添加HPC的药物制剂可增加高溶性和低渗透性药物的鼻吸收作用。因此，HPC在医药领域的应用开拓非常重要。

左旋咪唑(levamisole,简称LMS)，由消旋四咪唑与d-樟脑-10-磺酸环合，再水解成盐而得。或由DL-四咪唑经拆分，用烧碱中和，得到L-四咪唑，最后成盐而得。LMS能促进EAE大鼠脊髓内单个核细胞上CD4和CD28的表达，提示LMS上调CD4和CD28的表达。左旋咪唑作为一种免疫调节剂，具有增强鸡细胞免疫和体液免疫功能的作用，左旋咪唑可使CD4^+/CD8^+淋巴细胞比值明显升高。

黄芪多糖(Astragalus polysaccharide，APS)主要由甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、木糖和L-阿拉伯糖组成，具有抗病毒提高动物生长性能、改善免疫性能、提高抗氧化能力等多种药理作用。Kallon等研究发现，APS能大幅度降低H9N2禽流感病毒的增殖，提高IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、LITAF和IL-12表达，促进细胞生长，增强抗H9N2活性；Wu研究指出APS可通过促进淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶等消化酶的表达，提高肉仔鸡生长性能；Shan等研究了APS对新城疫(ND)免疫雏鸡空肠黏膜免疫功能的影响，结果表明APS能提高sIgA的含量；Liu等研究表明当APS的添加量为0.10％时，可显著提高大黄鱼幼鱼血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性，降低丙二醛(MDA)含量。

本篇说明通过在鸡新城疫与H9亚型禽流感二联灭活疫苗中添加羟丙基纤维素、左旋咪唑和黄芪多糖，检测其对鸡体液免疫应答的影响，达到提升鸡新城疫与H9亚型禽流感二联灭活疫苗免疫效果的目的。

发明内容

为了解决上述现有技术问题，本发明提供具有增加难溶性药物的溶出度，提高这类药物的生物利用度，延长抗原在机体内的停留时间，达到缓释目的，来保持对免疫系统的持续激活作用，进而提高细胞免疫和体液免疫功能，增强免疫后机体的抗体水平，增强免疫效果等技术特点的一种含有复合免疫增强剂的H9N2禽流感-新城疫二联灭活疫苗的制备与应用。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

一种含有免疫增强剂的鸡新城疫与H9亚型禽流感二联灭活疫苗，其优势在于所描述免疫增强剂含有1-1000μg/ml的羟丙基纤维素、1-1000μg/ml的左旋咪唑和1-1000μg/ml的黄芪多糖。

优选的，所述灭活疫苗包含有灭活的抗原溶液。

优选的，所述灭活疫苗还包括油相溶液。

优选的，所述的特有免疫增强剂成分与灭活的抗原溶液组成了水相溶液，且所述水相溶液与油相溶液的体积之比为1:2；所述水相溶液中免疫增强剂与灭活的抗原溶液的体积之比为1:2。

优选的，所述油相溶液为白油、司班。

优选的，所述灭活的抗原溶液为灭活的鸡新城疫与H9亚型禽流感病毒。

一种所述灭活疫苗的制备方法，其特征在于：将该免疫增强剂与灭活抗原、吐温-80混合，制备成水相溶液；将白油、司班和硬脂酸铝混合，得到油相溶液；将油相溶液与水相溶液混合，即可得到灭活疫苗。

有益效果：具有增加难溶性药物的溶出度，提高这类药物的生物利用度，延长抗原在机体内的停留时间，达到缓释目的，来保持对免疫系统的持续激活作用，进而提高细胞免疫和体液免疫功能，增强免疫后机体的抗体水平，增强免疫效果等技术特点。

附图说明

图1是本发明肉鸡NDV抗体效价图。

图2是本发明肉鸡H9AIV抗体效价图。

具体实施方式

以下结合说明书附图，对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于以下实施例。

禽苗用免疫增强剂评价试验方案

1.实验目的

评价羟丙基纤维素+左旋咪唑+黄芪多糖对新城疫(NDV)和H9亚型禽流感(AIV H9)灭活疫苗的增强效果。

2.实验材料

2.1免疫增强剂

羟丙基纤维素+左旋咪唑+黄芪多糖配置成合适的浓度，按照合适的剂量添加至抗原中，配制水相。

2.2抗原

H9禽流感灭活抗原及新城疫灭活抗原灭活前的病毒滴度均大于10⁹EID₅₀/ml。

2.3试验动物

生理盐水组(阴性对照组)，常规疫苗组(白油+抗原组)，免疫增强剂+常规疫苗组(白油+抗原组)，每组10只14日龄普通白羽肉鸡，共3组。

2.4其它试验物品

白油、吐温-80、司班-80、硬脂酸铝、生理盐水等均购自上海迈宏公司。

2.5检测试剂

AIV H9血凝抑制试验标准抗原及NDV标准抗原购自哈尔滨国生生物科技股份有限公司。

3.试验方法

3.1免疫增强剂的制备

将10mg的羟丙基纤维素溶解于1ml生理盐水中，制成浓度为10mg/ml的一号母液，用注射器过滤膜以过滤除菌；将1mg的左旋咪唑溶解于1ml生理盐水中，制成浓度为1mg/ml的二号母液，用注射器过滤膜以过滤除菌；将10mg的黄芪多糖溶解于1ml生理盐水中，制成浓度为10mg/ml的三号母液，用注射器过滤膜以过滤除菌。

3.2疫苗制备

参考常规配方配制添加与不添加免疫增强剂的疫苗，各组分配方详见表1。

表1疫苗组成

乳化取2份油相(12ml，含0.6ml司班+0.06mg硬脂酸铝+11.4ml白油)，11000rpm/min搅拌1min，同时徐徐加入1份水相(6ml)，再以13000rpm/min搅拌5min。加盖密封，贴签标记后置2～8℃保存。

3.3检验

3.3.1性状：

外观白色均匀乳状液体

剂型油包水型

稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000rmp/min离心15min，未出现分层现象。

3.3.2无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，无菌生长。

3.4白羽肉鸡效力评价

3.4.1H9N2禽流感-新城疫灭活苗

用14日龄白羽肉鸡，分别编号后，随机分到16组中，每组10只，每只鸡经皮下注射疫苗0.3ml，其中10只免疫用生理盐水作为阴性对照组。分组详见表2。

表2疫苗AI部分效力检验试验分组与免疫

免疫后7天、14天、21天和28天分别采血。分离血清，测定血清的AI、HI抗体效价。所有血清均分为2份，每份100-200μl，均保存于-20℃。然后按照国标GB/T 17999.2-2008的方法进行测定血清中的血凝抑制效价(详见附件)。

4.试验结果及分析

表3平均抗体效价数据

试验结论：

羟丙基纤维素+左旋咪唑+黄芪多糖增强剂组相对于NDV疫苗对照组，在免疫后7、14、21和28天，羟丙基纤维素+左旋咪唑+黄芪多糖增强剂组的鸡血清平均抗体滴度比疫苗对照组分别提高了1.1log2、1.6log2、0.9log2和1.5log2，完全符合至少增强抗体滴度0.5log2的行业要求。

羟丙基纤维素+左旋咪唑+黄芪多糖增强剂组相对于H9 AIV疫苗对照组，在免疫后14天、21和28天，羟丙基纤维素+左旋咪唑+黄芪多糖组增强剂组的鸡血清平均抗体滴度比疫苗对照分别提高了1.3log2、1.8log2和1.7log2，完全符合至少增强抗体滴度0.5log2的行业要求。

实施例1

1.实验材料

1.1免疫增强剂

羟丙基纤维素+左旋咪唑+黄芪多糖配置成合适的浓度，按照合适的剂量添加至抗原中，配制水相。

1.2抗原

H9禽流感灭活抗原及新城疫灭活抗原灭活前的病毒滴度均大于10⁹EID₅₀/ml。

1.3试验动物

生理盐水组(阴性对照组)，常规疫苗组(白油+抗原组)，免疫增强剂+常规疫苗组(白油+抗原组)，每组10只14日龄普通白羽肉鸡，共3组。

1.4其它试验物品

白油、吐温-80、司班-80、硬脂酸铝、生理盐水等均购自上海迈宏公司。

1.5检测试剂

AIV H9血凝抑制试验标准抗原及NDV标准抗原购自哈尔滨国生生物科技股份有限公司。

2.疫苗的配制

将10mg的羟丙基纤维素溶解于1ml生理盐水中，制成浓度为10mg/ml的一号母液，用注射器过滤膜以过滤除菌；将1mg的左旋咪唑溶解于1ml生理盐水中，制成浓度为1mg/ml的二号母液，用注射器过滤膜以过滤除菌；将10mg的黄芪多糖溶解于1ml生理盐水中，制成浓度为10mg/ml的三号母液，用注射器过滤膜以过滤除菌。

将免疫增强剂、灭活的新城疫病毒液、灭活的禽流感H9N2亚型病毒液和Tween-80(吐温80)按照2：1.88：1.8：0.24的体积比制备水相溶液，加入吐温后立即水浴约5min，振荡即可混匀。将司班-80和白油按照1：19的体积比，另外加入0.06mg的硬脂酸铝制备油相。通过高速乳化机13000rmp/min搅拌5min，得到实验组1(即组1)。

将灭活的禽流感H9N2亚型病毒液和Tween-80按照2：1.88：1.8：0.24的体积比制备水相溶液，加入吐温后立即水浴约5min，振荡即可混匀。将司班-80和白油按照1：19的体积比，另外加入0.06mg的硬脂酸铝制备油相。通过高速乳化机13000rmp/min搅拌5min，得到实验组2(即组2)。

直接加入同等体积的生理盐水，得到实验组3(即组3)。

3.分组、免疫和抗体检测

将健康的白羽肉鸡随机分组，每组10只鸡，共3组。将组1、组2、组3、各免疫一组，免疫剂量为0.3ml。

免疫前随机采血15只鸡，免疫后第7、14、21、28天，对各组健康的白羽肉鸡采血分离血清，通过血凝抑制效价实验测定抗体是否合格。或者换成合格率，但效价达到多少为合格。

免疫前及免疫后第7、14、21、28天抗体效价如表1所示。

表1平均抗体效价数据

4.1％红细胞制备

将从SPF鸡采集的血液集中到50ml的离心管中，1％PBS缓冲液加至50ml，1800rmp离心10min，重复2次。将红细胞沉淀转移至15ml离心管，1％PBS缓冲液加至15ml，1500rmp离5min。将离心得到的红细胞按照1：100的比例加入到1％PBS缓冲液中混匀，即可得到1％的红细胞。

5.抗原血凝效价测定

于96孔微量血凝板的第1孔-第12孔加入1 x PBS 30ul(排枪最小量程30ul)。每排第一孔加入30ul抗原，第一孔至第十一孔做梯度稀释，吹吸混匀十次，第十一孔吸走30ul，第十二孔做对照孔。每孔加1 x PBS 30ul(这一步是为了替代血清)。每孔加1％红细胞悬液30ul。轻微震荡，室温静置20min后读数。将血凝板倾斜70度，出现红细胞完全凝集的抗原最大稀释度为该抗原的血凝效价，一个就是1单位。

6.四单位抗原制备和验证

将买到的抗原干粉，一安瓿用2ml的1 x PBS稀释，多余的分装保存于-80℃，干粉保存于-20℃。以4个血凝单位抗原的配制为例，如果抗原原液血凝效价为9log2，稀释倍数为2^9/2^2＝2^7＝128倍，也就是取生理盐水11.8ml，加入1比10稀释的抗原1ml。此次实验原液效价为10，则稀释256倍，也就是76.8ml的1 x PBS，加入1比10稀释的抗原3ml(0.3原液+2.7 1 x PBS)。于96孔微量血凝板的第1孔-第12孔加入1 x PBS 30ul(排枪最小量程30ul)。每排第一孔加入30ul四单位抗原，第一孔至第十二孔做梯度稀释，吹吸混匀十次，第十二孔吸走30ul。每孔加1 x PBS 30ul(这一步是为了替代血清)。每孔加1％红细胞悬液30ul。轻微震荡，室温静置20min后读数。将血凝板倾斜70度观察，第一孔为2^1第二孔为2^2第三孔为2^3，理想结果为第一孔和第二孔完全凝集，第三孔开始流下来，也就是刚好4单位。

7.血凝抑制实验

一个样一排，160只鸡也就是160排，一个血凝板8排，也就是20板。所有孔加入30ul的1 x PBS。吸取血清至每排第一孔，梯度稀释至第十一孔，弃去30ul，第十二孔作为空白对照。(我们稀释到十二孔，阴性对照最后单独做)。每孔加入四单位抗原30ul，轻微震荡，室温静置半小时。每孔加入1％红细胞悬液30ul，注意加第一板的时间和最后一板的时间，20个板大约6min，按顺序来，每个板刚好20min读取最好，刚好流下来的稀释倍数最高的孔就是抑制价。阴性对照全凝集为正常，禽流感和新城疫的血清血凝抑制效价≥2^4为阳性。

最后，需要注意的是，本发明不限于以上实施例，还可以有很多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容中直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种含有免疫增强剂的鸡新城疫与H9亚型禽流感二联灭活疫苗，其优势在于所描述免疫增强剂含有1-1000μg/ml的羟丙基纤维素、1-1000μg/ml的左旋咪唑和1-1000μg/ml的黄芪多糖。

2.根根据权利要求1所述灭活疫苗，其特点在于：所述灭活疫苗包含有灭活的抗原溶液。

3.根据权利要求1或2所描述灭活疫苗，其特点在于：所述灭活疫苗还包括油相溶液。

4.根据权利要求3所述灭活疫苗，其特点在于：所述的特有免疫增强剂成分与灭活的抗原溶液组成了水相溶液，且所述水相溶液与油相溶液的体积之比为1:2；所述水相溶液中免疫增强剂与灭活的抗原溶液的体积之比为1:2。

5.根据权利要求4所述灭活疫苗，其特征在于：所述油相溶液为白油、司班。

6.根据权利要求5所述灭活疫苗，其特征在于：所述灭活的抗原溶液为灭活的鸡新城疫与H9亚型禽流感病毒。

7.一种如权利要求1-6任意一项所述的灭活疫苗的制备方法，其特征在于：将该免疫增强剂与灭活抗原、吐温-80混合，制备成水相溶液；将白油、司班和硬脂酸铝混合，得到油相溶液；将油相溶液与水相溶液混合，即可得到灭活疫苗。

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