CN114288404A - 一种禽苗用免疫增强剂、二联灭活疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开的是一种禽苗用免疫增强剂、二联灭活疫苗及其制备方法和应用，免疫增强剂含有1‑1000μg/ml的蜂毒素，制备方法如下：将蜂毒素溶解于生理盐水中，制成母液，用注射器过滤膜以过滤除菌；将免疫增强剂、灭活的新城疫病毒液、灭活的禽流感H9N2亚型病毒液和吐温按照预设的体积比混合制备水相溶液，并且在混合加入吐温后立即水浴，振荡、混匀；将司班和白油按照预设的体积比混合，并另外加入硬脂酸铝制备获得油相溶液；将油相溶液与水相溶液混合，通过高速乳化机搅拌，得到禽苗用免疫增强剂、二联灭活疫苗，具有制备简单、成本低、不良反应小、疫苗免疫效果好等技术特点。

Description

一种禽苗用免疫增强剂、二联灭活疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种灭活疫苗及其制备方法和应用，更具体一点说，涉及一种禽苗用免疫增强剂、二联灭活疫苗及其制备方法和应用，属于免疫佐剂技术领域。

背景技术

新城疫(Newcastle disease,ND)是一种高致病性禽类病毒性传染性疾病。ND是全球家禽业的主要威胁。这种疾病在许多以农业为国民收入主要来源的国家流行，它是由新城疫病毒引起禽的一种急性、热性、败血性和高度接触性传染病。以高热、呼吸困难、下痢、神经紊乱、黏膜和浆膜出血为特征。具有很高的发病率和病死率，是危害养禽业的一种主要传染病。世界动物卫生组织(Office International Des Epizooties,OIE)将其列为A类疫病。新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)可经消化道、呼吸道，也可经眼结膜、受伤的皮肤和泄殖腔黏膜侵入机体。NDV的破坏性影响可以通过使用疫苗来限制。目前，研究重点是改进诊断方法和更好的疫苗开发。由于减毒活疫苗、灭活疫苗以及正在兴起的亚单位疫苗均未能有效遏制多种全球主要病原体的威胁。如众所周知的灭活疫苗，由于其非复制性，它们非常安全，但通常免疫原性较差，不会引起持久的免疫力。因此，共同要求开发可能克服疫苗弱点的新型佐剂策略。

禽流感是禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)是引起的一种禽类烈性传染病，而H9N2亚型属于其低致病性的禽流感病毒，感染低致病性AIV的家禽会导致严重的经济后果。由于疾病导致鸡蛋或肉类产量下降、死亡率、疫苗接种成本和贸易受限，生产力可能会直接或间接降低。鸡群在感染H9N2亚型后主要呈现呼吸、消化、生殖系统和全身组织器官轻度出血等症状和病变；可破环免疫系统，导致严重的免疫抑制，继而引起大肠杆菌或其它病原的的感染。AIV控制方法千差万别，但消除家禽中的这种疾病是一个共同的目标。其中生物安全和疫苗接种是预防家禽感染的最普遍方法。为了让疫苗充分发挥其免疫作用，研发疫苗及其制备方法已经是必然的趋势待。

发明内容

为了解决上述现有技术问题，本发明提供具有具有制备简单、成本低、不良反应小、疫苗免疫效果好等技术特点的一种禽苗用免疫增强剂、二联灭活疫苗及其制备方法和应用。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明一种禽苗用免疫增强剂、二联灭活疫苗，其特征在于：所述免疫增强剂含有1-1000μg/ml的蜂毒素。优选的，包含有灭活的抗原溶液，所述灭活的抗原溶液为灭活的鸡新城疫与H9亚型禽流感病毒。

优选的，还包括油相溶液、水相溶液，所述水相溶液包括免疫增强剂与灭活的抗原溶液，所述水相溶液中免疫增强剂与灭活的抗原溶液的体积之比为1：40；并且所述水相溶液与油相溶液的体积之比为1：2。

优选的，所述油相溶液包括油相油剂、油相乳化剂，所述油相乳化剂包括司班、硬脂酸铝中任一种或多种，所述油相油剂包括药用级白油。

更加具体一点：所述油相乳化剂可以为司班85、司班83、司班80、司班65、司班60、吐温20、吐温40、吐温60、吐温80、吐温85、单硬脂酸甘油酯、硬脂酸铝中任一种或多种，所述油相油剂可以为药用级白油、花生油、矿物油、植物油中任一种。

优选的，所述水相溶液还包括水相乳化剂，所述水相乳化剂包括吐温。

更加具体一点：所述水相乳化剂可以为司班85、司班83、司班80、司班65、司班60、吐温20、吐温40、吐温60、吐温80、吐温85、单硬脂酸甘油酯、硬脂酸铝中任一种或多种。

本发明一种禽苗用免疫增强剂、二联灭活疫苗的制备方法，该制备方法包括如下步骤：

步骤1)将蜂毒素溶解于生理盐水中，制成母液，用注射器过滤膜以过滤除菌；

步骤2)将免疫增强剂、灭活的新城疫病毒液、灭活的禽流感H9N2亚型病毒液和吐温80按照预设的体积比混合制备水相溶液，并且在混合加入吐温80后立即水浴约5min，振荡、混匀；

步骤3)将司班80和白油按照预设的体积比混合，并另外加入硬脂酸铝制备获得油相溶液；

步骤4)将油相溶液与水相溶液混合，通过高速乳化机搅拌5min，得到禽苗用免疫增强剂、二联灭活疫苗。

优选的，该制备方法包括如下步骤：

步骤1)称取100mg的蜂毒素，溶解于10ml的生理盐水中，制成浓度为10mg/ml的母液，用注射器过0.22μm的滤膜，过滤除菌；

步骤2)将免疫增强剂、灭活的新城疫病毒液、灭活的禽流感H9N2亚型病毒液和吐温80按照0.15：1.88：1.88：0.24的体积比混合制备水相溶液，并且在混合加入吐温80后立即水浴约5min，振荡、混匀；

步骤3)将司班80和白油按照1：19的体积比混合，并另外加入0.06mg的硬脂酸铝制备获得油相溶液；

步骤4)将油相溶液与水相溶液混合，通过高速乳化机13000rmp/min搅拌5min，得到禽苗用免疫增强剂、二联灭活疫苗。

本发明一种禽苗用免疫增强剂、二联灭活疫苗的应用。

有益效果：有制备简单，成本低，不良反应小，疫苗免疫效果好，具有非常高的应用价值等优点；具有产生高抗体的能力，免疫效果好，免疫保护作用力持续长久等技术特点；本发明中所包含的免疫增强剂与疫苗中的其他组分之间具有正向导向性，具有增加疫苗成分的溶解度、溶出度和稳定性、控制疫苗的释放速率、提高疫苗的生物利用度、降低毒副作用以及可以启动机体自身含有的免疫应答程序等优势。

附图说明

图1是本发明NDV抗体滴度图。

图2是本发明AIV H9抗体滴度图。

具体实施方式

以下结合说明书附图，对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于以下实施例。

蜂毒素(Melittin，MLT)也称为蜂毒溶血肽，由26个氨基酸组成，是蜂毒中的主要活性物质，有研究报道称，由于蜂毒肽无序蛋白具有自发组装四聚体的物化性质以及其独特的作用机制，在临床具体应用中蜂毒肽表现出具抗菌、抗感染、抗肿瘤、抗病毒等生理效应，其中抗病毒作用更是成为近年来研究热点。NAM等研究发现，蜂毒肽能上调T-bet水平并选择性地诱导Th1细胞谱系发展，终效应为增加Th1细胞的特异性细胞因子γ-干扰素的表达。γ干扰素则为细胞免疫体系的重要调节因子，能够协调多种保护功能，具有极强的免疫反应。

以下对本发明的含有免疫增强剂的鸡新城疫与H9亚型禽流感二联灭活疫苗的评价试验

1.实验目的

评价蜂毒素对H9亚型禽流感(AIV H9)和新城疫(NDV)灭活疫苗的增强效果。

2.实验材料

2.1蜂毒素配置成合适的浓度，按照合适的剂量添加到抗原中，配制水相。

2.2抗原

H9禽流感灭活抗原及新城疫灭活抗原灭活前的EID₅₀均大于10⁹EID₅₀/ml。

2.3试验动物14日龄普通白羽肉鸡。

免疫组1：免疫增强剂组(白油+抗原组)，免疫组2：常规疫苗组(白油+抗原组)，对照组3：生理盐水组(阴性对照组)，每组10只普通白羽肉鸡，共3组。

2.4其它试验物品

白油、吐温-80、司班-80、硬脂酸铝、生理盐水等均购自上海迈宏公司。

2.5检测试剂

AIV H9血凝抑制试验标准抗原及NDV标准抗原购自哈尔滨国生生物科技股份有限公司。

3.试验方法

3.1免疫增强剂制备

称取100mg的蜂毒素，溶解于10ml的生理盐水中，配制成浓度为10mg/ml的原液，过滤除菌。

3.2疫苗制备

参考常规配方配制添加与不添加免疫增强剂的疫苗，各组分配方详见表3。

表3疫苗组成

乳化取2份油相(12ml，含0.6ml司班+0.06mg硬脂酸铝+11.4ml白油)，11000rpm/min，搅拌1min，同时缓慢加入1份水相(6ml)，再以13000rpm/min搅拌5min。加盖密封，贴签标记后置2～8℃保存。

3.2性状与无菌检验

对制备的各疫苗分别进行性状与无菌检验。

3.3SPF鸡效力评价

3.3.1AIV H9-NDV灭活苗

用14日龄白羽肉鸡，分别编号后，任取10只进行免疫前采血，免疫组每组10只，每只鸡经皮下注射疫苗0.3ml，另10只不免疫作对照组。分组详见表4。

表4疫苗AI部分效力检验试验分组与免疫

免疫后7天、14天、21天和28天分别采血。分离血清，测定血清的AI HI抗体效价。所有血清均分为2份，每份100-200μl，均保存于-20℃。然后按照国标GB/T 17999.2-2008的方法进行测定血清中的血凝抑制效价。

4.试验结果及分析

表5平均抗体效价数据

试验结论：

蜂毒素相对于H9N2禽流感疫苗在免疫后，第14、21和28天，含蜂毒素增强剂的疫苗免疫后的鸡血清平均抗体滴度比疫苗对照(即不含增强剂)分别提高了1.28log2、1.34log2和1.28log2，完全符合至少增强抗体滴度0.5log2的行业要求。

蜂毒素对于新城疫灭活疫苗的增强效果在免疫后7、14、21和28天，鸡血清平均抗体滴度比疫苗对照分别提高了1.09log2、1.13log2、1.14log2和1.1log2，完全符合至少增强抗体滴度0.5log2的行业要求。

实例1

1.实验材料

灭活的新城疫病毒液和灭活的禽流感H9N2亚型病毒液，经1％甲醛溶液灭活14日龄健康白羽肉鸡

2.疫苗的配制

免疫增强剂1含有2.5μl/dose的MLT。

将免疫增强剂1与灭活的新城疫病毒液和灭活的禽流感H9N2亚型病毒液和Tween80(吐温80)按照0.15：1.88：1.8：0.24的体积比制备水相溶液，加入吐温后立即水浴约5min，振荡即可混匀。将司班80和白油按照1：19的体积比，另外加入0.06mg的硬脂酸铝制备油相。通过高速乳化机13000rmp/min，搅拌5min，得到疫苗组1。

用生理盐水溶液替代免疫增强剂1，按照疫苗1的制备方法制备疫苗组2。

用生理盐水作为对照疫苗组3。

3.分组、免疫和抗体检测

将健康的白羽肉鸡随机分组，每组10只鸡，共3组。将疫苗组1、疫苗组2、对照3各免疫一组，免疫剂量为0.3mL。

免疫前随机采血10只鸡，免疫后第7、14、21、28天，对各组健康的白羽肉鸡采血分离血清，通过血凝抑制效价实验测定抗体是否合格。

免疫前及免疫后第7、14、21、28天抗体效价如下表1所示。

表1：

4. 1％红细胞制备:

将从SPF鸡采集的血液集中到50ml的离心管中，1％PBS缓冲液加至50ml，1800rmp离心10min，重复2次。将红细胞沉淀转移至15ml离心管，1％PBS缓冲液加至15ml，1500rmp离5min。将离心得到的红细胞按照1：100的比例加入到1％PBS缓冲液中混匀，即可得到1％的红细胞。

5.抗原血凝效价测定

于96孔微量血凝板的第1孔—第12孔加入1×PBS 30μl(排枪最小量程30μl)。每排第一孔加入30μl抗原，第一孔至第十一孔做梯度稀释，吹吸混匀十次，第十一孔吸走30μl，第十二孔做对照孔。每孔加1xPBS 30μl(这一步是为了替代血清)。每孔加1％红细胞悬液30μl。轻微震荡，室温静置20min后读数。将血凝板倾斜70度，出现红细胞完全凝集的抗原最大稀释度为该抗原的血凝效价，一个就是1单位。

6.四单位抗原制备和验证

买到的抗原为干粉，一安瓿用2ml的1xPBS稀释，多余的分装保存于-80℃，干粉保存于-20℃。以4个血凝单位抗原的配制为例，如果抗原原液血凝效价为9log2，稀释倍数为2⁹/2²＝2⁷＝128倍，也就是取生理盐水11.8ml，加入1比10稀释的抗原1ml。此次实验原液效价为10，则稀释256倍，也就是76.8ml的1xPBS，加入1比10稀释的抗原3ml(0.3ml原液+2.7mlPBS)。于96孔微量血凝板的第1孔-第12孔加入1×PBS 30μl(排枪最小量程30μl)。每排第一孔加入30μl四单位抗原，第一孔至第十二孔做梯度稀释，吹吸混匀十次，第十二孔吸走30μl。每孔加1xPBS 30μl(这一步是为了替代血清)。每孔加1％红细胞悬液30μl。轻微震荡，室温静置20min后读数。将血凝板倾斜70度观察，第一孔为2¹第二孔为2²第三孔为2³，理想结果为第一孔和第二孔完全凝集，第三孔开始流下来，也就是刚好4单位。

7.血凝抑制实验

一个样一排，160只鸡也就是160排，一个血凝板8排，也就是20板。所有孔加入30μl的1xPBS。吸取血清至每排第一孔，梯度稀释至第十一孔，弃去30μl，第十二孔作为空白对照(稀释到十二孔，阴性对照最后单独做)。每孔加入四单位抗原30μl，轻微震荡，室温静置半小时。每孔加入1％红细胞悬液30μl，注意加第一板的时间和最后一板的时间，20个板大约6min，按顺序来，每个板刚好20min读取最好，刚好流下来的稀释倍数最高的孔就是抑制价。阴性对照全凝集为正常，禽流感和新城疫的血清血凝抑制效价≥2⁴为阳性。

本发明通过在鸡新城疫与H9亚型禽流感二联灭活疫苗中添加蜂毒素，检测其对鸡体液免疫应答的影响，达到提升鸡新城疫与H9亚型禽流感二联灭活疫苗免疫效果的目的。

最后，需要注意的是，本发明不限于以上实施例，还可以有很多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容中直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种禽苗用免疫增强剂、二联灭活疫苗，其特征在于：所述免疫增强剂含有1-1000μg/ml的蜂毒素。

2.根据权利要求1所述的一种禽苗用免疫增强剂、二联灭活疫苗，其特征在于：包含有灭活的抗原溶液，所述灭活的抗原溶液为灭活的鸡新城疫与H9亚型禽流感病毒。

3.根据权利要求1或2所述的一种禽苗用免疫增强剂、二联灭活疫苗，其特征在于：还包括油相溶液、水相溶液，所述水相溶液包括免疫增强剂与灭活的抗原溶液，所述水相溶液中免疫增强剂与灭活的抗原溶液的体积之比为1：40；并且所述水相溶液与油相溶液的体积之比为1：2。

4.根据权利要求3所述的一种禽苗用免疫增强剂、二联灭活疫苗，其特征在于：所述油相溶液包括油相油剂、油相乳化剂，所述油相乳化剂包括司班、硬脂酸铝中任一种或多种，所述油相油剂包括药用级白油。

5.根据权利要求4所述的一种禽苗用免疫增强剂、二联灭活疫苗，其特征在于：所述水相溶液还包括水相乳化剂，所述水相乳化剂包括吐温。

6.一种禽苗用免疫增强剂、二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于：该制备方法包括如下步骤：

步骤1)将蜂毒素溶解于生理盐水中，制成母液，用注射器过滤膜以过滤除菌；

步骤2)将免疫增强剂、灭活的新城疫病毒液、灭活的禽流感H9N2亚型病毒液和吐温80按照预设的体积比混合制备水相溶液，并且在混合加入吐温80后立即水浴，振荡、混匀；

步骤3)将司班80和白油按照预设的体积比混合，并另外加入硬脂酸铝制备获得油相溶液；

步骤4)将油相溶液与水相溶液混合，通过高速乳化机搅拌，得到禽苗用免疫增强剂、二联灭活疫苗。

7.根据权利要求6所述的一种禽苗用免疫增强剂、二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于：该制备方法包括如下步骤：

步骤1)称取100mg的蜂毒素，溶解于10ml的生理盐水中，制成浓度为10mg/ml的母液，用注射器过0.22μm的滤膜，过滤除菌；

步骤2)将免疫增强剂、灭活的新城疫病毒液、灭活的禽流感H9N2亚型病毒液和吐温80按照0.15：1.88：1.88：0.24的体积比混合制备水相溶液，并且在混合加入吐温80后立即水浴5min，振荡、混匀；

步骤3)将司班80和白油按照1：19的体积比混合，并另外加入0.06mg的硬脂酸铝制备获得油相溶液；

步骤4)将油相溶液与水相溶液混合，通过高速乳化机13000rmp/min，搅拌5min，得到禽苗用免疫增强剂、二联灭活疫苗。

8.一种如权利要求1-7任一项所述的禽苗用免疫增强剂、二联灭活疫苗的应用。

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