CN115716870A

CN115716870A - 一种藻蓝蛋白抗肿瘤肽及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN115716870A
Application number: CN202211454248.6A
Authority: CN
Inventors: 郝帅; 杨起; 张文静; 李前程; 李凡念
Original assignee: Beijing Technology and Business University
Current assignee: Beijing Technology and Business University
Priority date: 2022-11-21
Filing date: 2022-11-21
Publication date: 2023-02-28
Anticipated expiration: 2042-11-21
Also published as: CN115716870B

Abstract

本发明一种藻蓝蛋白抗肿瘤肽及其应用主要介绍了藻蓝蛋白酶解肽的制备和分离纯化的方法，并通过分子对接对分离得到的肽进行筛选，得到MQDAITAV肽，对MQDAITAV肽进行cck‑8试剂盒检测，细胞迁移实验，MQDAITAV肽对于非小细胞肺癌细胞具有良好的抑制作用。

Description

一种藻蓝蛋白抗肿瘤肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种筛选自藻蓝蛋白的多肽，及其制备方法和在抗肿瘤领域的应用。

背景技术

肺癌是由于肺部恶性肿瘤引起的一种发病率和死亡率极高的癌症，其中非小细胞肺癌在肺癌总人群中占比达到85％以上。肺癌早期症状并不明显，常常容易与普通疾病混淆，因此确诊时已经进入晚期，导致治疗难度加大，对患者的生存质量造成严重影响。目前治疗非小细胞肺癌的方法虽然在不断进步，但其疗效并不理想。近年来，分子靶向治疗在癌症的治疗中受到了广泛关注并取得了一定发展，例如，奥希替尼、吉非替尼都作为EGFR酪氨酸激酶抑制剂在临床上得到了应用并表现出良好的抗癌作用。然而，随着肿瘤耐药性的增强，药物使用的剂量也需要随之增加，大剂量的药物进入人体会导致体内正常细胞受到一定程度的损害，因此，研发出天然低毒高效的抗非小细胞肺癌药物具有很重要的价值。

海洋药物是天然药物的重要组成部分，海洋天然药物主要是针对癌症，心脑血管疾病等，近年来，我国已发现1300多种活性化合物，开发出多种新药及保健品。螺旋藻作为海洋生物之一，具有较高的营养价值和生物活性，被公认为是一种极好的食物，具有抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗癌等多种功能。螺旋藻具有丰富的蛋白质、碳水化合物、维生素、不饱和脂肪酸等，藻蓝蛋白是螺旋藻中的一种功能性蛋白质，在抗肿瘤、抗炎、抗氧化等方面都有明显作用，但多种自然因素都会影响藻蓝色素的稳定性使其降解失活。

生物活性肽是以蛋白质为原料，通过酸水解、碱水解、酶水解等方法得到的分子量小于6000Da的具有多种生物活性蛋白质水解物，生物活性肽可以直接参与调节机体生命活动具有一定的营养特性，从而成为研究热点之一。目前现有的生物活性肽大都来源于陆生动植物，对于海洋生物活性肽的研究较少。海洋生物由于生长环境的特殊性，相比于陆生生物具有独特的特点和优势，是一种开发新型生物活性肽的良好资源。因此，对于海洋生物活性肽的研究显得尤为必要。

抗癌肽可以通过抑制癌细胞生长增值迁移，破坏肿瘤细胞膜结构从而达到抗癌效果，而且几乎不会对人体正常细胞造成损伤。

分子对接主要是通过计算机辅助来筛选合适的药物，在运行过程中配体小分子(本文指多肽)会在受体结合位点处寻找最佳结合位点和最佳结合姿势，从而确定配体小分子和受体结合的最佳构象。常用分子对接软件主要有Autodock、Autodockvina、DiscoveryStudio等。对接步骤是先从蛋白数据库RCSB Protein Data Bank(https://www.rcsb.org)下载受体晶体结构，并对其进行加氢去水处理，对接后根据对接结果分析配体和受体相互作用。

发明内容

为克服现有技术存在的上述的缺陷，提供如下的技术方案：

本发明的第一个方面，提供一种制备对肿瘤有抑制活性的藻蓝蛋白多肽的方法，其特征在于，所述的多肽通过以下方法制备：

1)藻蓝蛋白的纯化：将藻蓝蛋白溶解后利用超滤管离心，去除杂蛋白和保护剂；

2)藻蓝蛋白酶解：将步骤1)纯化后的藻蓝蛋白利用胰蛋白酶水解；

3)超滤分离：将步骤2)获得的酶解产物利用三种不同截留分子量的超滤管超滤分离获得三种分子大小范围的产物；

4)对步骤3)获得的三种产物进行反向制备型液相色谱(RP-HPLC)分离纯化。

在一个具体的实施例中所述的藻蓝多肽制备方法中，步骤1)使用的超滤管为截留分子量为10KD。

在另外一个具体的实施例中，所述的步骤2)的反应温度37～42℃，pH6.5～7.5，酶与底物比为(1～2)：(8～15)(g：g)，反应时间4～8h，酶解结束后沸水浴灭酶。

在另外一个具体的实施例中，步骤3)中的三种不同的截留分子量的超滤管分别为3KDa、5KDa和10KDa的超滤管。

在另外一个具体的实施例中，步骤4)中色谱柱为Agilent C18，检测波长220nm；流动相A：超纯水；流动相B：乙腈溶液。

在另外一个具体的实施例中，步骤4)的操作方法为：洗脱梯度：0-6min，80％-65％A(梯度洗脱)；6-10min，65％-45％A(梯度洗脱)；10-15min，45％-30％A(梯度洗脱),15-20min，30％-20％A。将溶好的样品(浓度：10mg/mL；上样量：10ml)通过0.22μm孔径的滤膜后注入RP-HPLC装置分析，以5mL/min的流速梯度洗脱色谱柱，收集峰尖部分，收集并立即冻干，-20℃储存备用。

本发明的第二个方面是提供本发明第一个方面所述的方法制备获得的对肿瘤具有抑制活性的藻蓝蛋白多肽组合物，其中所述的肿瘤为非小细胞肺癌。

本发明的第三个方面是提供一种对肿瘤具有抑制活性的多肽，其特征在于，所述的多肽氨基酸序列为MQDAITAV。在一个具体的实施例中，其特征在于，所述的肿瘤为非小细胞肺癌。

本发明的第四个方面是提供第二个方面或第三个方面所述多肽组合物或多肽在制备治疗非小细胞肺癌的药物中的应用。

本发明的第五个方面是提供一种治疗非小细胞肺癌的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包含本发明第三个方面所述的多肽组合物或本发明第四个方面所述的多肽；所述的药物组合物还包括药学上可接受的载体。

本发明的有益效果在于：

1)本发明一种藻蓝蛋白抗肿瘤肽及其应用主要介绍了藻蓝蛋白酶解肽的制备和分离纯化的方法，通过该方法获得了一种对于非小细胞肺癌具有抑制活性的多肽组合物；

2)并通过分子对接对分离得到的肽进行筛选，得到MQDAITAV肽，对MQDAITAV肽进行cck-8试剂盒检测，细胞迁移实验，MQDAITAV肽对于非小细胞肺癌细胞具有良好的抑制作用。

附图说明

图1藻蓝蛋白纯化前后的对比：藻蓝蛋白经纯化后纯度明显提高，在紫外检测下藻蓝蛋白在280nm和620nm处有特征吸收峰，因此其纯度可表示为A620/A280，纯化前藻蓝蛋白纯度为3.82，纯化后藻蓝蛋白纯度达到4.8，达到食品级。

图2分别比较了相同浓度下的藻蓝蛋白，以及用胰蛋白酶水解纯化前后的藻蓝蛋白对H460(A)、H1299(B)的存活率的影响，发现用胰蛋白酶水解纯化后的藻蓝蛋白对非小细胞肺癌细胞的存活有显著性影响。

图3分别比较了相同浓度下的藻蓝蛋白，以及用胰蛋白酶水解纯化前后的藻蓝蛋白对H460(A)、H1299(B)的生长的影响，发现用胰蛋白酶水解纯化后的藻蓝蛋白对非小细胞肺癌细胞的生长有显著性影响。

图4分别比较了相同浓度下的藻蓝蛋白，以及用胰蛋白酶水解纯化前后的藻蓝蛋白对H460(A)、H1299(B)的迁移的影响，我们发现用胰蛋白酶水解纯化后的藻蓝蛋白对非小细胞肺癌细胞的迁移有显著性影响。

图5实施例1藻蓝蛋白肽RP-HPLC分离结果，结果显示经过超滤和制备型高效液相色谱分离藻蓝蛋白酶解产物后，得到的产物纯度已经达到95％以上。

图6对比例1藻蓝蛋白肽RP-HPLC分离结果，由图分析未经过纯化和超滤的藻蓝蛋白肽经过制备型高效液相色谱分离，也并不能得到高纯度的肽。

图7对比例2藻蓝蛋白肽RP-HPLC分离结果，由图分析经过纯化但未对酶解后的混合肽进行超滤分离，得到的多肽相比于案例2来说纯度有所改善但并未达到我们所需的纯度。

图8比较相同浓度的藻蓝蛋白和案例1得到的多肽对H460(A)、H1299(B)存活的影响，将分子量小于3KDa得到的多肽命名为组分1，分子量在3-5KDa得到的多肽命名为组分2，分子量5-10KDa得到的多肽命名为组分3。分析得知经过制备型液相得到的分子量小于3KDa和分子量5-10KDa的多肽对细胞存活有显著影响。

图9比较相同浓度的藻蓝蛋白和案例1得到的多肽对H460(A)、H1299(B)生长的影响，分析得知经过制备型液相得到的分子量小于3KDa和分子量5-10KDa的多肽对细胞生长有显著影响。

图10比较相同浓度藻蓝蛋白和案例1得到的多肽组分对H460(A)和H1299(B)迁移的影响，我们发现分离纯化得到的组分对细胞迁移的抑制作用相较于藻蓝蛋白来说更为显著。

图11分子量小于3KDa的组分和分子量5-10KDa组分的质谱鉴定结果。采用De novo从头测序法对组分进行结构鉴定，置信度在95％以上。

图12MQDAITAV肽分别与靶点蛋白EGFR、VEGFR-2的对接结果。图13比较了相同浓度的MQDAITAV肽和藻蓝蛋白的抗癌活性。如图为采用cck-8试剂盒检测多肽和藻蓝蛋白对H1299(A)和H460(B)细胞存活率的影响，多肽能显著抑制H1299和H460的存活率。

图13采用cck-8试剂盒检测多肽和藻蓝蛋白对H1299(A)和H460(B)细胞存活率的影响，多肽能显著抑制H1299和H460的存活率。

图14采用cck-8试剂盒检测多肽和藻蓝蛋白对H1299(A)和H460(B)细胞生长的影响，可以看出，多肽在第1天和第2天能显著抑制H1299和H460的生长。

图15比较相同浓度多肽和藻蓝蛋白对H1299(A)和H460(B)细胞迁移的影响。发现经过多肽处理的相比于经过藻蓝蛋白处理的细胞迁移率显著降低。

具体实施方式

以下通过参考示范性实施例，本发明的目的和功能以及用于实现这些目的和功能的方法将得以阐明。然而，本发明并不受限于以下所公开的示范性实施例；可以通过不同形式来对其加以实现。说明书的实质仅仅是帮助相关领域技术人员综合理解本发明的具体细节。

实施例1藻蓝蛋白获得

1)藻蓝蛋白纯化

避光称取1g藻蓝蛋白粉末溶解于40ml超纯水中，震荡混匀，将混匀后的藻蓝蛋白转移至截留分子量为10KDa的超滤管中，4000r,4℃条件下离心30min，保留管内的藻蓝蛋白，除掉其中的杂蛋白和保护剂等物质，得到我们所需纯度的藻蓝蛋白。

2)藻蓝蛋白酶解

用胰蛋白酶水解纯化后的藻蓝蛋白，反应温度40℃，pH7.0，酶与底物比为1：10(g：g)，反应时间6h，酶解结束后沸水浴15min灭酶，之后在10000r/min条件下离心10min，弃沉淀，得到最终酶解产物。

3)超滤分离

利用截留分子量为3KDa、5KDa和10KDa的超滤管分离酶解产物，得到分子量小于3KDa，分子量3-5KDa，分子量5-10KDa的多肽，分别命名为PC-1,PC-2,PC-3用冻干机冻干，储存在-20℃，以备后用。

4)RP-HPLC分离纯化

将PC-1,PC-2,PC-3经RP-HPLC分离纯化。色谱柱为Agilent C18(250mm×4.6mm，5μm；柱温：25℃)，检测波长220nm。流动相A：超纯水；流动相B：乙腈溶液(流动相都要过0.22μm滤膜和超声处理)。

洗脱梯度：0-6min，80％-65％A(梯度洗脱)；6-10min，65％-45％A(梯度洗脱)；10-15min，45％-30％A(梯度洗脱),15-20min，30％-20％A。将溶好的样品(浓度：10mg/mL；上样量：10ml)通过0.22μm孔径的滤膜后注入RP-HPLC装置分析，以5mL/min的流速梯度洗脱色谱柱，收集峰尖部分，验证为单一峰后大量收集并立即冻干，-20℃储存备用(图1，图5)。

实施例2纯化后的藻蓝蛋白酶解多肽对于非小细胞肺癌的作用

1)细胞培养

NSCLC细胞H1299在含10％胎牛血清、1％双抗(抗青霉素-链霉素)的DMEM培养基中培养，且置于37℃、5％CO2的培养箱中，当细胞汇合度达到90％时进行细胞传代。

2)CCK-8实验

将对数生长期的非小细胞肺癌细胞用胰酶消化，离心收集细胞，用血球计数板进行计数，培养基稀释细胞浓度至5×10³个/100μL。将细胞均匀铺于96孔板，置于培养箱(37℃，5％CO₂)过夜。细胞融合度在70％-80％时，加药，同时设置空白组、对照组。加药处理24h后，每孔加入含有10μLMTT的培养基，继续培养2h，用酶标仪测定细胞在450nm处的吸光值。

As：实验孔吸光度(含细胞、培养基、CCK-8溶液和药物溶液)

Ac：对照孔吸光度(含细胞、培养基、CCK-8溶液，不含药物)

Ab：空白孔吸光度(含培养基、CCK-8溶液，不含细胞、药物)。

3)划痕实验

将对数生长期的非小细胞肺癌细胞用胰酶消化，离心收集细胞，将离心后的细胞按照60％-70％的汇合度铺于六孔板，六孔板底部提前用马克笔划线，当细胞汇合度达到100％时进行划痕实验，使用无菌黄枪头在六孔板底部垂直划过细胞，再用PBS缓冲液清洗以去除细胞碎片，加入3％浓度血清的新鲜培养基培养，根据坐标在同一位置分别在0、24、48h时进行拍照保存，同时计算细胞体外迁移率。

对比例1未纯化藻蓝蛋白酶解后分离

1)藻蓝蛋白酶解

用胰蛋白酶水解纯化后的藻蓝蛋白，反应温度40℃，pH7.0，酶与底物比为1：10，反应时间6h，酶解结束后沸水浴15min灭酶，之后在10000r/min条件下离心10min，弃沉淀，得到最终酶解产物。

2)RP-HPLC分离纯化

将酶解产物经RP-HPLC分离纯化。色谱柱为Agilent C18(250mm×4.6mm，5μm；柱温：25℃)，检测波长220nm。流动相A：超纯水；流动相B：乙腈溶液(流动相都要过0.22μm滤膜和超声处理)。

洗脱梯度：0-6min，80％-65％A(梯度洗脱)；6-10min，65％-45％A(梯度洗脱)；10-15min，45％-30％A(梯度洗脱),15-20min，30％-20％A。将溶好的样品(浓度：10mg/mL；上样量：10ml)通过0.22μm孔径的滤膜后注入RP-HPLC装置分析，以5mL/min的流速梯度洗脱色谱柱，收集峰尖部分，收集并立即冻干，-20℃储存备用(纯度如图6)。

对比例2藻蓝蛋白纯化酶解后未超滤分离

1)藻蓝蛋白纯化

避光称取1g藻蓝蛋白粉末溶解于40ml超纯水中，震荡混匀，将混匀后的藻蓝蛋白转移至截留分子量为10KDa的超滤管中，4000r,4℃条件下离心30min，除掉藻蓝蛋白中的杂蛋白和保护剂等物质，得到我们所需纯度的藻蓝蛋白。

2)藻蓝蛋白酶解

3)RP-HPLC分离纯化

洗脱梯度：0-6min，80％-65％A(梯度洗脱)；6-10min，65％-45％A(梯度洗脱)；10-15min，45％-30％A(梯度洗脱),15-20min，30％-20％A。将溶好的样品(浓度：10mg/mL；上样量：10ml)通过0.22μm孔径的滤膜后注入RP-HPLC装置分析，以5mL/min的流速梯度洗脱色谱柱，收集峰尖部分，收集并立即冻干，-20℃储存备用(纯度如图7)。

实施例3检测实施例1获得的三种组分对于肺癌细胞的存活率影响

在实施例1中的方法中，将分子量小于3KDa得到的多肽命名为组分1，分子量在3-5KDa得到的多肽命名为组分2，分子量5-10KDa得到的多肽命名为组分3。

分析得知经过制备型液相得到的分子量小于3KDa和分子量5-10KDa的多肽对细胞存活有显著影响(图8)。

实施例4检测实施例1获得的三种组分对于肺癌细胞的生长影响

分析得知经过制备型液相得到的分子量小于3KDa和分子量5-10KDa的多肽对细胞存活有显著影响(图9)。

实施例5检测实施例1获得的三种组分对于肺癌细胞的迁移影响

分析得知经过制备型液相得到的分子量小于3KDa和分子量5-10KDa的多肽对细胞存活有显著影响(图10)。

实施例6多肽的序列鉴定

1)质谱鉴定

肽段用20ul溶解液(0.1％甲酸)溶解，充分振荡涡旋，13500rpm，4℃离心20min，上清转移到上样管中，吸取8uL进行质谱鉴定；

液相色谱设置参数

流动相A 0.1％甲酸

流动相B 0.1％甲酸，80％ACN

流动相参数

质谱参数

2)分子对接

本发明采用Autodock Vina软件进行多肽与EGFR，VEGFR-2的分子对接，从蛋白数据库下载EGFR，VEGFR-2的晶体结构，对接前，对受体结构进行加氢去水处理，进行对接。对接结果采用Chimera1.16进行分析，结果如图11,12所示。

如图为MQDAITAV肽分别与靶点蛋白EGFR、VEGFR-2的对接结果，两者结合能低于-5KJ/mol，即MQDAITAV肽与靶点蛋白EGFR、VEGFR-2均可自发结合并且结合的可能性较高。参照gefitinib与EGFR的结合模式，推断出EGFR激酶活性口袋周围的保守氨基酸有Asp831，Phe699，Lys851，Leu718，Val726，Ala743，Lys745，Thr790，Leu792，Pro794，Gly796，Leu844，Thr854，Pro853，Leu723，Glu734，Csx797，由图我们看到MQDAITAV肽与EGFR的Asp831，Phe699，Lys851，Pro853，Leu723，Glu734存在疏水相互作用。根据文献得知VEGFR-2的活性位点的氨基酸有Asp1046,Cys919，Glu885，Ala881，His1026，Phe1047，Leu1049，Arg1027，Arg1028，Leu1067，MQDAITAV肽与VEGFR-2的Leu1049，Ala881，Asp1046，Arg1027存在疏水相互作用。

实施例7检测多肽MQDAITAV肽对非小细胞肺癌的影响

对实施例6鉴定获得的多肽，采用实施例2所述的方法，检测其对非细小细胞肺癌细胞系H1299和H460的存活率、生长、迁移的影响，结果如图13-图15所示。由图13-图15可以看出，纯化后的短肽MQDAITAV在抑制非小细胞肺癌的存活、生长以及迁移方面优于藻蓝蛋白。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种制备对肿瘤有抑制活性的藻蓝蛋白多肽的方法，其特征在于，所述的多肽通过以下方法制备：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的藻蓝多肽制备方法中，步骤1)使用的超滤管为截留分子量为10KD。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤2)的反应温度37～42℃，pH6.5～7.5，酶与底物比为(1～2)：(8～15)(g：g)，反应时间4～8h，酶解结束后沸水浴灭酶。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中的三种不同的截留分子量的超滤管分别为3KDa、5KDa和10KDa的超滤管。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中色谱柱为Agilent C18，检测波长220nm；流动相A：超纯水；流动相B：乙腈溶液。

6.根据权利要求1-5所述的方法制备获得的对肿瘤具有抑制活性的藻蓝蛋白多肽组合物，其中所述的肿瘤为非小细胞肺癌。

7.一种对肿瘤具有抑制活性的多肽，其特征在于，所述的多肽氨基酸序列为MQDAITAV。

8.根据权利要求7所述的多肽，其特征在于，所述的肿瘤为非小细胞肺癌。

9.权利要求7或8所述的多肽在制备治疗非小细胞肺癌的药物中的应用。

10.一种治疗非小细胞肺癌的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包含权利要求6所述的多肽组合物或权利要求7所述的多肽以及药学上可接受的载体。