CN115716793A

CN115716793A - 一种胆红素中间体胆绿素的提纯方法

Info

Publication number: CN115716793A
Application number: CN202110976900.XA
Authority: CN
Inventors: 陈静; 朱兰芳; 刘成年
Original assignee: Zhejiang Medicine Co Ltd Xinchang Pharmaceutical Factory
Current assignee: Zhejiang Medicine Co Ltd Xinchang Pharmaceutical Factory
Priority date: 2021-08-24
Filing date: 2021-08-24
Publication date: 2023-02-28

Abstract

本发明提供了一种胆红素中间体胆绿素的提纯方法，所述提纯方法包括如下步骤：洗柱：将吸附树脂灌装至树脂柱中，用甲醇冲洗吸附树脂，以除去碎粒和其它杂质；过柱：用甲醇或水溶解胆绿素钙盐，再用离心或布袋粗滤，进行微滤精滤，收集滤液；将滤液从树脂柱上部缓慢进液至树脂柱中，直至出液有胆绿素泄露，停止进料；用去离子水或低浓度甲醇反向洗涤，漂洗去吸附过程析出的杂质；再用甲醇清洗树脂，直至无油脂及杂质出现；洗脱：再用甲醇正向进入树脂柱进行洗脱，直至无胆绿素出来。相比现有技术，本发明的有益效果是解决了现实中筛选出的树脂不能有效地收集胆绿素，而本发明可以有效去除多余杂质，提高胆绿素收率，操作方便，适用工业化生产。

Description

一种胆红素中间体胆绿素的提纯方法

技术领域

本发明属于一种胆红素中间体胆绿素的提纯领域，具体涉及一种采用树脂法提取胆绿素的方法。

背景技术

胆红素具有抗氧化功能，生理活性广泛，是体外培养牛黄的主要原料之一。通过胆绿素转变为胆红素，是制备胆红素的途径之一。但因为胆中的油脂难于分离，尤其是鸡胆，传统溶剂法、树脂法均无法有效分离油脂，且分离过程复杂，所用溶剂品种多，回收困难，成本高，至今未实现工业化生产，本发明一改传统分离方法，通过树脂法提取胆绿素，且可实现工业化生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种可以工业化生产的胆绿素的提纯方法，同时解决现有工艺还没有筛选出合适树脂来提纯胆绿素的技术问题。

为了实现上述目的，本发明提供了一种胆红素中间体胆绿素的提纯方法，所述提纯方法包括如下步骤：(1)洗柱：将D329吸附树脂灌装至树脂柱中，用甲醇冲洗该D329吸附树脂，以除去碎粒和其它杂质，直至出口甲醇清澈，再用甲醇盖住树脂柱中树脂，以排出空气备用；(2)过柱：用甲醇或水溶解胆绿素钙盐，再用离心或布袋粗滤，进行微滤精滤，收集滤液；将滤液从树脂柱上部缓慢进液至树脂柱中，直至出液有胆绿素泄露，停止进料，排空树脂柱中未吸附残液；然后，用去离子水或25～50V/V％甲醇溶液反向洗涤，漂洗去吸附过程析出的杂质；再用甲醇清洗树脂，直至无油脂及杂质出现；(3)洗脱：再用甲醇正向进入树脂柱进行洗脱，直至无胆绿素出来，洗脱完毕。

在本发明的提纯方法的优选技术方案中，优选地，步骤(1)中，所述树脂柱为￠100X1000MM玻璃交换柱。

在本发明的提纯方法的优选技术方案中，优选地，步骤(1)中，所述树脂柱的柱径比5-25:1。

在本发明的提纯方法的优选技术方案中，优选地，步骤(1)中，用99V/V％甲醇溶液反向以2BV速率冲洗该D329吸附树脂。

在本发明的提纯方法的优选技术方案中，优选地，步骤(2)中，用30-60V/V％甲醇溶液溶解胆绿素钙盐，再用离心粗滤或布袋粗滤，进行0.2-0.5MF微滤精滤，收集滤液。

在本发明的提纯方法的优选技术方案中，优选地，步骤(2)中，甲醇溶解胆绿素钙盐时，胆绿素钙盐与甲醇的重量体积比为1:15～25

在本发明的提纯方法的优选技术方案中，优选地，步骤(2)中，将滤液从树脂柱上部缓慢以1-5BV速度进液至树脂柱中。

在本发明的提纯方法的优选技术方案中，优选地，步骤(2)中，在用去离子水或低浓度甲醇反向洗涤，漂洗去吸附过程析出的杂质后，再用50-60V/V％甲醇溶液清洗树脂，其中，消耗甲醇量为树脂3-6倍柱体积，直至无油脂及杂质出现。

在本发明的提纯方法的优选技术方案中，优选地，步骤(3)中，再用95-98V/V％甲醇溶液正向以1-5BV速度进入树脂柱进行洗脱，直至无胆绿素出来，洗脱完毕；其中：采用30g/L NaOH将甲醇溶液的pH值调整为9-10，消耗甲醇量为树脂3-6倍柱体积。

洗脱后还包括吸附柱清洗，所述吸附柱清洗步骤包括：用1.008～1.018g/LHCl和20g/LNaCl水溶液清洗至无色，或用1.008～1.018g/LHCl和10g/L NaCl甲醇溶液处理，完毕后，用去离子水或甲醇冲至中性备用。

相比现有技术，本发明的有益效果是：1)成功将胆绿素钙盐分离成胆绿素和杂质，攻克行业内无法提取胆绿素的难题；2)用树脂代替溶剂，简化分离的步骤，降低成本，提高收率；3)使用交换柱一次性分离出胆绿素钙盐中的杂质，尤其是油脂。因此，本发明的方法解决了现实中筛选出的树脂不能有效地收集胆绿素，而本发明可以有效去除多余杂质，提高胆绿素收率，操作方便，适用工业化生产。

具体实施方式

本发明实施例中所使用的甲醇、HCl、NaCl等常规试剂均为市售产品；仪器：￠100X1000MM玻璃交换柱：购自如皋玻璃仪器厂；蠕动泵：购自天津兰格钢管制造有限公司，天津兰格BT100-2J；

D329吸附树脂购自长春汉诺科技有限公司。

胆绿素钙盐的制备：将鸡鸭胆破皮后，经离心分离出胆汁，将胆汁在搅拌状态下加热至70～80℃，静置30～40min后，用分液漏斗分离掉上层油脂；分离后的胆汁，按重量比的3％～8％加入Ca(OH)₂溶液(该溶液用水调成糊状即可)，搅拌30～60min，过滤出的固体即为胆绿素钙盐。

实施例1

将D329吸附树脂800mL装到￠100X1000MM玻璃交换柱中，用99％甲醇反向以2BV速率冲洗树脂中碎粒和其它杂质，直至出口甲醇清澈，树脂柱中无气泡，完毕，保持甲醇完全覆盖柱中树脂，停止冲洗，准备进料。

将(600g)取自鸡胆的胆绿素钙盐，用40％浓度甲醇10000mL溶解，采用离心粗滤，0.3MF微滤。收集滤液，将滤液从树脂柱上部缓慢以3BV速度进液至树脂柱中，直至出液有胆绿素流出，停止进料，排空树脂柱中未吸附残液，检测吸附量为：胆绿素钙盐消耗505g然后，用5000mL去离子水反向洗涤，漂洗去吸附过程析出的杂质，再用55％甲醇清洗树脂，直至无油脂及杂质出现。消耗甲醇量为树脂5倍体积。

洗脱：配制96％甲醇，pH值调整为9.5，正向以5BV速度进柱洗脱，直至无胆绿素出来，洗脱完毕。消耗甲醇量为：6倍体积。

实施例2

将(600g)胆绿素钙盐用(9000mL)30％浓度甲醇溶解，采用布袋粗滤，0.2MF微滤。收集滤液，将滤液从树脂柱上部缓慢以3BV速度进液至树脂柱中，直至出液有胆绿素泄露，停止进料，排空树脂柱中未吸附残液，检测吸附量为：胆绿素钙盐消耗510g,用5000mL去离子水反向冲洗漂洗去吸附过程中析出机械杂质。

然后，用低浓度甲醇50％反向洗涤，直至无油脂和杂质析出，消耗甲醇量为树脂体积5倍。

洗脱：配制95％甲醇，pH值调整为9，正向以3BV速度进柱洗脱，直至无胆绿素出来，洗脱完毕。

实施例3

将(600g)胆绿素钙盐用60％浓度甲醇15000mL溶解，采用离心粗滤，0.5MF微滤。收集滤液，将滤液从树脂柱上部缓慢以3BV速度进液至树脂柱中，直至出液有胆绿素流出，停止进料，排空树脂柱中未吸附残液，通过紫外分光光度计分析、计算总吸附量为：胆绿素钙盐消耗510g，然后，用5000mL去离子水反向洗涤，漂洗去吸附过程析出机械(如泥巴，残渣等)杂质，再用60％甲醇清洗树脂6倍体积，直至无油脂及杂质出现。

洗脱：配制98％甲醇，pH值调整为10，正向以3BV速度进柱洗脱，直至无胆绿素出来，洗脱完毕。

实施例4

将600g胆绿素钙盐用70％浓度甲醇(9000mL)溶解，采用离心粗滤，0.5MF微滤。收集滤液，将滤液从树脂柱上部缓慢以3BV速度进液至树脂柱中，直至出液有胆绿素流出，停止进料，排空树脂柱中未吸附残液，检测吸附量为：胆绿素钙盐消耗510g然后，用5000mL去离子水反向洗涤，漂洗去吸附过程析出机械杂质，再用70％甲醇清洗树脂2倍体积，直至无油脂及杂质出现。

洗脱：配制94％甲醇，PH值调整为8，正向以3BV速度进柱洗脱，直至无胆绿素出来，洗脱完毕。

对比实施例1

将(D101)吸附树脂800mL装到￠100X1000MM玻璃交换柱中，用99％甲醇反向以2BV速率冲洗树脂中碎粒和其它杂质，直至出口甲醇清澈，树脂柱中无气泡，完毕，保持甲醇完全覆盖柱中树脂，停止冲洗，准备进料。

将(600g)取自鸡胆的胆绿素钙盐，用40％浓度甲醇10000mL溶解，采用离心粗滤，0.3MF微滤。收集滤液，将滤液从树脂柱上部缓慢以3BV速度进液至树脂柱中，直至出液有胆绿素流出，停止进料，排空树脂柱中未吸附残液，检测吸附量为：胆绿素钙盐消耗80g。然后，用5000mL去离子水反向洗涤，漂洗去吸附过程析出机械杂质，再用55％甲醇清洗树脂，直至无油脂及杂质出现。消耗甲醇量为树脂的6倍体积。

洗脱：配制96％甲醇，pH值调整为9.5，正向以5BV速度进柱洗脱，直至无胆绿素出来，洗脱完毕。消耗甲醇量为6倍体积。

分析对比，其它大孔吸附树脂对胆绿素的捕集较难，且难于洗脱。具体数据如下。

对具体实施方式中胆绿素的收率进行统计，结果如表1所示：

表1胆绿素收率表

从本发明的实验结果及其表1可以看出：通过本发明获得的胆绿素的收率和纯度，实施例1的效果最好，实施例2-4次之。

需要声明的是，上述发明内容及具体实施方式意在证明本发明所提供技术方案的实际应用，不应解释为对本发明保护范围的限定。本领域技术人员在本发明的精神和原理内，当可作各种修改、等同替换、或改进。

Claims

1.一种胆红素中间体胆绿素的提纯方法，所述提纯方法包括如下步骤：

(1)洗柱：将D329吸附树脂灌装至树脂柱中，用甲醇冲洗该D329吸附树脂，以除去碎粒和其它杂质，直至出口甲醇清澈，再用甲醇盖住树脂柱中树脂，以排出空气备用；

(2)过柱：用甲醇或水溶解胆绿素钙盐，再用离心或布袋粗滤，进行微滤精滤，收集滤液；将滤液从树脂柱上部缓慢进液至树脂柱中，直至出液有胆绿素泄露，停止进料，排空树脂柱中未吸附残液；然后，用去离子水或25～50V/V％甲醇溶液反向洗涤，漂洗去吸附过程析出的杂质；再用甲醇清洗树脂，直至无油脂及杂质出现；

(3)洗脱：再用甲醇正向进入树脂柱进行洗脱，直至无胆绿素出来，洗脱完毕。

2.根据权利要求1所述的提纯方法，其特征在于，步骤(1)中，所述树脂柱为￠100X1000MM玻璃交换柱。

3.根据权利要求2所述的提纯方法，其特征在于，步骤(1)中，所述树脂柱的柱径比5-25:1。

4.根据权利要求1所述的提纯方法，其特征在于，步骤(1)中，用99V/V％甲醇溶液反向以2BV速率冲洗该D329吸附树脂。

5.根据权利要求1所述的提纯方法，其特征在于，步骤(2)中，用30-60V/V％甲醇溶液溶解胆绿素钙盐，再用离心粗滤或布袋粗滤，进行0.2-0.5MF微滤精滤，收集滤液。

6.根据权利要求5所述的提纯方法，其特征在于，步骤(2)中，甲醇溶解胆绿素钙盐时，胆绿素钙盐与甲醇的重量体积比为1:15～25。

7.根据权利要求1所述的提纯方法，其特征在于，步骤(2)中，将滤液从树脂柱上部缓慢以1-5BV速度进液至树脂柱中。

8.根据权利要求1所述的提纯方法，其特征在于，步骤(2)中，在用去离子水或低浓度甲醇反向洗涤，漂洗去吸附过程析出的杂质后，再用50-60V/V％甲醇溶液清洗树脂，其中，消耗甲醇量为树脂3-6倍柱体积，直至无油脂及杂质出现。

9.根据权利要求1所述的提纯方法，其特征在于，步骤(3)中，再用95-98V/V％甲醇溶液正向以1-5BV速度进入树脂柱进行洗脱，直至无胆绿素出来，洗脱完毕；其中：采用30g/LNaOH将甲醇溶液的pH值调整为9-10，消耗甲醇量为树脂3-6倍柱体积。

10.根据权利要求1-7任一所述的提纯方法，其特征在于，洗脱后还包括吸附柱清洗，所述吸附柱清洗步骤包括：用1.008～1.018g/LHCl和20g/L NaCl水溶液清洗至无色，或用1.008～1.018g/L HCl和10g/LNaCl甲醇溶液处理，完毕后，用去离子水或甲醇冲至中性备用。