CN115715192A - 用于治疗或预防血液系统异常和/或相关疾病的包含15-hepe的组合物 - Google Patents

用于治疗或预防血液系统异常和/或相关疾病的包含15-hepe的组合物 Download PDF

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CN115715192A CN202080101694.1A CN202080101694A CN115715192A CN 115715192 A CN115715192 A CN 115715192A CN 202080101694 A CN202080101694 A CN 202080101694A CN 115715192 A CN115715192 A CN 115715192A
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Abstract

本公开涉及通过施用15‑HEPE或其组合物来治疗或预防血液系统异常的方法。

Description

用于治疗或预防血液系统异常和/或相关疾病的包含15-HEPE 的组合物
技术领域
本申请整体涉及包含15-HEPE的组合物，以及使用这类组合物的方法。
序列表
本公开包括经由EFS-Web以ASCII格式提交的序列表，该序列表据此全文以引用方式并入本文。2020年4月1日创建的ASCII拷贝被命名为序列表124318-8014.US00_ST25.txt，大小为3千字节。
背景技术
血液系统异常包括红细胞异常和血栓形成倾向。红细胞异常是一类影响红细胞(RBC)及其氧转运分子血红蛋白的产生、寿命和形状的状态。这些状态抑制氧从肺运送到身体的其余部分。血栓形成倾向是一类导致个体的动静脉中形成血凝块的风险增大的异常。这些凝块可能从血管上松脱，并通过血流到达某个器官，因此阻止血液流向该器官，从而导致局部缺血。这些状态导致卒中和/或肺栓塞风险增大。
发明内容
本申请涉及包含15-羟基二十碳五烯酸(15-HEPE)的组合物，以及使用此类组合物治疗多种疾病和异常的方法。
在一些方面，本公开提供了治疗和/或预防对其有需要的受试者的血液系统异常的方法，该方法包括向受试者施用15-HEPE或包含15-HEPE的组合物。
在一些方面，本公开提供了治疗和/或预防对其有需要的受试者的血液系统异常的方法，该方法包括向受试者施用最多约8g包含15-HEPE的组合物，其中15-HEPE按重量计占该组合物中所有脂肪酸的至少约90％。
在另一个方面，本公开提供了治疗和/或预防对其有需要的受试者的血液系统异常的方法，该方法包括向受试者施用最多约8g包含15-HEPE的组合物，其中15-HEPE按重量计占该组合物中所有脂肪酸的至少约90％，并且受试者表现出一种或多种下列现象：(a)红细胞计数增加；(b)红细胞分布宽度减小；以及/或者(c)网织红细胞计数减少。
在各种实施方案中，血液系统异常选自由以下项组成的组：遗传性溶血性贫血、获得性溶血性贫血、范科尼贫血、缺铁性贫血、叶酸缺乏症、B12缺乏症和骨髓增生异常综合征。
在一些方面，本公开提供了治疗和/或预防对其有需要的受试者的血红蛋白异常的方法，该方法包括向受试者施用15-HEPE或包含15-HEPE的组合物。
在其他方面，本公开提供了治疗和/或预防对其有需要的受试者的红细胞异常的方法，该方法包括向受试者施用15-HEPE或包含15-HEPE的组合物。
在另一个方面，本公开提供了治疗和/或预防对其有需要的受试者的血红蛋白异常和/或红细胞异常的方法，该方法包括向受试者施用最多约8g包含15-HEPE的组合物，其中15-HEPE按重量计占该组合物中所有脂肪酸的至少约90％。
在又一个方面，本公开提供了治疗和/或预防对其有需要的受试者的血红蛋白异常和/或红细胞异常的方法，该方法包括向受试者施用最多约8g包含15-HEPE的组合物，其中15-HEPE按重量计占该组合物中所有脂肪酸的至少约90％，并且受试者表现出一种或多种下列现象：(a)红细胞计数增加；(b)红细胞分布宽度减小；以及/或者(c)网织红细胞计数减少。
在各种实施方案中，血液系统异常、血红蛋白异常和/或红细胞异常选自由以下项组成的组：遗传性溶血性贫血、获得性溶血性贫血、范科尼贫血、缺铁性贫血、叶酸缺乏症、B12缺乏症和骨髓增生异常综合征。
在又一个方面，本公开提供了治疗和/或预防对其有需要的受试者的溶血性贫血的方法，该方法包括向受试者施用最多约8g包含15-HEPE的组合物，其中15-HEPE按重量计占该组合物中所有脂肪酸的至少约90％。
在一些实施方案中，溶血性贫血是遗传性溶血性贫血或获得性溶血性贫血。在另一个实施方案中，获得性溶血性贫血是继发于感染获得的，从药物治疗、血液恶性肿瘤、自身免疫疾病、脾功能亢进获得的，在置入机械心脏瓣膜、输血后获得的，或者是由于这些原因的组合而获得的。在又一个实施方案中，镰状细胞病和镰状细胞贫血与镰状细胞危象、血管闭塞危象、脾隔离危象或它们的组合相关联。
在一些实施方案中，受试者表现出红细胞计数增加、红细胞分布宽度减小和网织红细胞计数减少。在一些方面，本公开提供了治疗和/或预防对其有需要的受试者的血栓形成倾向异常的方法，该方法包括向受试者施用15-HEPE或包含15-HEPE的组合物。
在其他方面，本公开提供了治疗和/或预防对其有需要的受试者的血栓形成倾向的方法，该方法包括向受试者施用最多约8g包含15-HEPE的组合物，其中15-HEPE按重量计占该组合物中所有脂肪酸的至少约90％。
在另一个方面，本公开提供了治疗和/或预防对其有需要的受试者的血栓形成倾向的方法，该方法包括向受试者施用最多约8g包含15-HEPE的组合物，其中15-HEPE按重量计占该组合物中所有脂肪酸的至少约90％，并且受试者表现出一种或多种下列现象：(a)凝血酶原时间延长；(b)活化部分凝血活酶时间延长；和/或(c)纤维蛋白原浓度降低。
在又一个方面，本公开提供了治疗和/或预防对其有需要的受试者的静脉血栓栓塞的方法，该方法包括向受试者施用最多约8g包含15-HEPE的组合物，其中15-HEPE按重量计占该组合物中所有脂肪酸的至少约90％。
在一个方面，本公开提供了治疗和/或预防对其有需要的受试者的动脉血栓形成的方法，该方法包括向受试者施用最多约8g包含15-HEPE的组合物，其中15-HEPE按重量计占该组合物中所有脂肪酸的至少约90％。
在另一个方面，本公开提供了预防对其有需要的受试者的栓塞的方法，该方法包括向受试者施用最多约8g包含15-HEPE的组合物，其中15-HEPE按重量计占该组合物中所有脂肪酸的至少约90％。
在一些实施方案中，受试者表现出凝血酶原时间延长、活化部分凝血活酶时间延长和纤维蛋白原浓度降低。
在另一个实施方案中，15-HEPE为游离酸形式、酯化形式或盐形式。在又一个实施方案中，酯化形式为烷基酯形式或甘油三酯形式。在一些实施方案中，15-HEPE包括15(S)-HEPE、15(R)-HEPE，或两者的组合。
在一些实施方案中，15-HEPE为乙酯形式(15-HEPE EE)，或者15-HEPE为光学活性酯形式(15(S)-HEPE EE)。
在一些实施方案中，该组合物包含约10mg至约10,000mg的15-HEPE。在另一个实施方案中，该组合物包含约1g至约2g的15-HEPE。在另一个实施方案中，该组合物包含约2g或更多的15-HEPE。在又一个实施方案中，该组合物被配制为向受试者提供约5mg每kg体重(mg/kg)、约50mg/kg、约250mg/kg或约500mg/kg的15-HEPE。在各种实施方案中，15-HEPE按重量计占该组合物中存在的所有脂肪酸的至少约90％。
在一些实施方案中，15-HEPE服施用。在各种实施方案中，该组合物以每天1至8粒胶囊施用。
附图说明
图1是实施例1中描述的研究及其持续时间的示意图。
图2示出了根据实施例1所述研究的动物体重变化。
图3示出了根据实施例1所述研究的动物在处死当天的体重。
图4A至图4D示出了根据实施例1所述研究的动物在处死当天的肾重量和肾重量/体重比。
图5示出了根据实施例1所述研究的动物肾羟脯氨酸含量。
图6A至图6G示出了根据实施例1所述研究的动物天狼星红染色情况。
图7示出了描绘根据实施例1所述研究的动物天狼星红阳性面积(％)的图。
图8A至图8D分别示出了根据实施例1所述研究的动物α-SMA、TIMP-1、TGF-β和1型胶原蛋白的基因表达分析结果。
图9是实施例2中描述的研究及其持续时间的示意图。
图10示出了根据实施例2所述研究的动物体重变化。
图11示出了根据实施例2所述研究的动物在处死当天的体重。
图12A和图12B分别示出了根据实施例2所述研究的动物在处死当天的肝重量和肝重量/体重比。
图13示出了根据实施例2所述研究的动物血清ALT水平变化。
图14示出了根据实施例2所述研究的动物血清总胆红素水平变化。
图15A至图15E示出了根据实施例2所述研究的动物天狼星红染色情况和纤维化面积。
图16示出了描绘根据实施例2所述研究的动物天狼星红阳性面积(％)的图。
图17A至图17D分别示出了根据实施例2所述研究的动物α-SMA、TIMP-1、TGF-β和1型胶原蛋白的基因表达分析结果。
图18A和图18B示出了根据实施例3所述研究的DS102(15-HEPE)诱导TGF-βδ抑制的情况。
图18C至图18G分别示出了根据实施例3所述研究的DS102对I型TGF-β受体、II型TGF-β受体、III型TGF-β受体、EGFR和小窝蛋白-1的膜转位和降解的影响。
图19是实施例4中描述的研究及其持续时间的示意图。
图20示出了根据实施例4所述研究的患者基线脂质组学分布。
图21A至图21C是分别描绘施用依普乐通(15-HEPE)和安慰剂的患者的胰岛素、葡萄糖和游离脂肪酸水平变化的图。
图22A和图22B是分别描绘施用依普乐通和安慰剂的患者的HOMA-IR和apido-IR水平变化的图。
图23A和图23B是分别描绘施用依普乐通和安慰剂的患者的平均HbA1C水平变化以及在第16周HbA1C水平≥6.5％的患者的比例的图。
图24A和图24B是分别描绘施用依普乐通和安慰剂的患者的脂质分布的平均变化和中值(％)变化的图。
图25A至图25C是分别描绘施用依普乐通和安慰剂的患者的胆固醇、甘油三酯和VLDL-C水平变化的图。
图26是描绘施用DS102的患者的肝毒性脂质分布变化的图表。
图27是使用OWL肝脏保健测试证实施用DS102解决了NASH的图。
图28是描绘施用DS102和安慰剂的患者中由CAP引起的肝脂肪含量变化的图。
图29A至图29C是描绘施用DS102和安慰剂的患者的炎性蛋白水平和促纤维化蛋白水平变化的图表。
图30是描绘施用DS102和安慰剂的患者的蛋白质表达(包括NASH发展目标的蛋白质表达)变化的图。
图31是描绘施用DS102和安慰剂的患者的炎性蛋白和促纤维化蛋白减少的火山图。
图32是描绘施用DS102和安慰剂的患者的血管粘附分子变化的图。
图33是描绘施用DS102和安慰剂的患者的心血管风险蛋白变化的图。
图34是描绘施用DS102和安慰剂的患者的趋化因子变化的图。
图35是描绘施用DS102和安慰剂的患者的肿瘤坏死因子受体超家族成员变化的图。
图36A和图36B是描绘施用DS102和安慰剂的患者的ALP水平降低的图。
图37是15-HEPE乙酯血浆谷值相对浓度的箱形图。
图38A至图38C是分别描绘施用15(S)-HEPE EE和安慰剂的大鼠的红细胞计数、红细胞分布宽度和网织红细胞计数的平均变化和标准偏差的柱形图。
图39A至图39C是分别描绘施用15(S)-HEPE EE和安慰剂的大鼠的凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间和纤维蛋白原浓度的平均变化和标准偏差的柱形图。
具体实施方式
虽然本发明能够以各种形式实施，但是以下对几个实施方案的描述是在理解将本公开认为是本发明范例的前提下进行的，并非旨在将本发明限于举例说明的具体实施方案。提供标题仅仅是为了方便起见，而不应解释为以任何方式限制本发明。在任何标题下示出的实施方案均可以与在任何其他标题下示出的实施方案组合。
除非另外明确指出，否则本申请中指定的各种定量值中对数值的使用表示为近似值，好像在规定范围内的最小值和最大值前面均有词语“约”一样。这样，与规定值的细微偏差可以用于获得与规定值基本上相同的结果。同样，范围的公开旨在作为连续范围，包括所列举的最小值与最大值之间的每个值，以及可以由这些值形成的任何范围。本文还公开了可以通过将列举的数值划分为任何其他列举的数值而形成的任何和所有比率(以及任何此类比率的范围)。因此，本领域技术人员将认识到，许多此类比率、范围和比率范围可以由本文呈现的数值明确地推导出来；而且，在所有情况下，此类比率、范围和比率范围代表本发明的各种实施方案。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管在本公开的实践中可以使用与本文所述的那些方法和材料类似或等同的方法和材料，但是下文描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均全文以引用方式明确地并入。如发生矛盾，以本说明书(包括定义)为准。此外，本文所述的材料、方法和实施例仅是说明性的，而不是限制性的。
定义
如本文所用，“15-HEPE”为15-羟基-二十碳-5Z，8Z，11Z，13E，17Z-五烯酸。15-HEPE(有时也称为15-OHEPA)可以根据本领域已知的方法由二十碳五烯酸(“EPA”，二十碳-5，8，11，14，17-五烯酸或20:5n-3)、ω-3脂肪酸合成。例如，15-HEPE可以通过将EPA暴露于酶15-脂氧合酶来合成。如本文所用，术语“15-HEPE”是指为其游离酸形式的15-HEPE(例如，15-羟基-二十碳-5Z，8Z，11Z，13E，17Z-五烯酸)和/或其药学上可接受的酯、缀合物或盐，或者任何前述物质的混合物。可以替代地使用15-HEPE的衍生物，然而这不包括缺少15-HEPE的羟基的任何衍生化合物。在一些实施方案中，15-HEPE以游离酸形式使用。替代性地，在本公开中使用15-HEPE的药学上可接受的酯或盐。在一些实施方案中，15-HEPE为C1-4烷基酯(诸如甲酯、乙酯，或甲酯和乙酯的组合)形式。在又一个实施方案中，15-HEPE为甘油酯(例如，甘油二酯或甘油三酯)形式。在另一个实施方案中，15-HEPE为乙酯形式(在本文中也称为E-15-HEPE、15-HEPE EE或乙基-15-HEPE)。
15-HEPE是手性分子，并且能够以(S)-或(R)-对映体形式或作为外消旋混合物使用。本文使用的“15-HEPE”包括所有这类形式，而不受立体专一性限制。在另一个实施方案中，15-HEPE包括(S)形式：15(S)-羟基-(5Z，8Z，11Z，13E，17Z)-二十碳五烯酸或(R)形式：15(R)-羟基-(5Z，8Z，11Z，13E，17Z)-二十碳五烯酸。在又一个实施方案中，15-HEPE EE包括(S)形式：15(S)-HEPE EE。
如本文所用，“DS102”是指15-HEPE、15-HEPE EE、包含15-HEPE的组合物、包含15-HEPE EE的组合物，或者包含15-HEPE和15-HEPE EE的组合物。
如本文所用，“依普乐通”是指15-HEPE、15-HEPE EE、包含15-HEPE的组合物、包含15-HEPE EE的组合物，或者包含15-HEPE和15-HEPE EE的组合物。
如本文所用，对疾病、异常或病症的“治疗”至少部分地包括：(1)抑制疾病、异常或病症，即阻止或减少疾病、异常或病症或者其临床症状的发展；或(2)缓解疾病、异常或病症，即引起疾病、异常或病症或者其临床症状的消退。与给定疾病或异常有关的术语“预防”意指：如果没有发生疾病发展，则预防疾病发展发生；预防疾病或异常在可能易患该异常或疾病但尚未诊断为患有该异常或疾病的受试者中发生；以及/或者如果已经存在疾病/异常发展，则预防进一步的疾病/异常发展。
如本文所用，“有效量”是指对受试者产生治疗效果所需的活性组合物的量。如本文所用，“治疗有效量”是指将在一定程度上缓解所治疗的疾病、异常或病症的一种或多种症状的所施用的药剂或化合物的足够量。在一些实施方案中，结果是疾病的体征、症状或病因的减少和/或减轻，或者生物系统的任何其他期望的改变。例如，在一些实施方案中，用于治疗用途的“有效量”是提供疾病症状的临床显著减少而没有过度不良副作用所需的包含如本文所公开的化合物的组合物的量。在一些实施方案中，使用诸如剂量递增研究等技术确定任何个别情况下的适当“有效量”。术语“治疗有效量”包括例如预防有效量。在其他实施方案中，本文所公开的化合物(诸如式(A)或式(I)化合物)的“有效量”是有效实现期望的药理作用或治疗改善而没有过度不良副作用的量。在其他实施方案中，应当理解，“有效量”或“治疗有效量”因受试者的代谢、年龄、体重、一般状况，所治疗的病症，所治疗的病症的严重度和处方医师所下判断存在差异而在受试者与受试者之间有所不同。当前语境中的术语“药学上可接受的”意指所考虑的物质不会对受试者产生无法接受的毒性，或者不会与组合物的其他组分相互作用。
根据以下详细描述，本公开的其他特征和优点将变得显而易见。
组合物
在一个实施方案中，本公开的组合物包含15-HEPE作为活性成分。当前语境中的术语“药学上可接受的”意指所考虑的物质不会对受试者产生无法接受的毒性，或者不会与组合物的其他组分相互作用。
在一个实施方案中，15-HEPE为酯形式(在本文中也称为E-15-HEPE、乙基-15-HEPE或15-HEPE EE)。在另一个实施方案中，15-HEPE包括15-HEPE的C1-C5烷基酯。在另一个实施方案中，15-HEPE包括15-HEPE甲酯、15-HEPE丙酯或15-HEPE丁酯。在又一个实施方案中，15-HEPE包括光学活性的15(S)-羟基-(5Z，8Z，11Z，13E，17Z)-二十碳五烯酸。该异构体能够以上文论述的任何形式使用。
在另一个实施方案中，15-HEPE包括15-HEPE锂盐，15-HEPE甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯，或者15-HEPE的任何其他酯或盐，或者15-HEPE的游离酸形式。
在各种实施方案中，本公开提供了包含15-的药物组合物，例如可口服递送的组合物。在一个实施方案中，该组合物包含治疗有效量的15-HEPE。在一个实施方案中，该药物组合物包含按重量计约0.1％至约99％、约1％至约95％、约5％至约90％的15-HEPE。如本文所提供的，“组合物”和短语“药物组合物”可互换使用。
在一个实施方案中，该药物组合物按重量计包含至少约70％、至少约80％或至少约90％的15-HEPE。在一个实施方案中，该药物组合物按重量计包含至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％的15-HEPE。
在另一个实施方案中，15-HEPE以下列量存在于本公开的组合物中：约1mg至约10,000mg、约25mg至约7500mg、约25mg至约5000mg、约50mg至约5000mg、约50mg至约3000mg、约75mg至约2500mg，或约100mg至约1000mg，例如约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约8mg、约9mg、约10mg、约11mg、约12mg、约13mg、约14mg、约15mg、约16mg、约17mg、约18mg、约19mg、约20mg、约21mg、约22mg、约23mg、约24mg、约25mg、约50mg、约75mg、约100mg、约125mg、约150mg、约175mg、约200mg、约225mg、约250mg、约275mg、约300mg、约325mg、约350mg、约375mg、约400mg、约425mg、约450mg、约475mg、约500mg、约525mg、约550mg、约575mg、约600mg、约625mg、约650mg、约675mg、约700mg、约725mg、约750mg、约775mg、约800mg、约825mg、约850mg、约875mg、约900mg、约925mg、约950mg、约975mg、约1000mg、约1025mg、约1050mg、约1075mg、约1100mg、约1025mg、约1050mg、约1075mg、约1200mg、约1225mg、约1250mg、约1275mg、约1300mg、约1325mg、约1350mg、约1375mg、约1400mg、约1425mg、约1450mg、约1475mg、约1500mg、约1525mg、约1550mg、约1575mg、约1600mg、约1625mg、约1650mg、约1675mg、约1700mg、约1725mg、约1750mg、约1775mg、约1800mg、约1825mg、约1850mg、约1875mg、约1900mg、约1925mg、约1950mg、约1975mg、约2000mg、约2025mg、约2050mg、约2075mg、约2100mg、约2125mg、约2150mg、约2175mg、约2200mg、约2225mg、约2250mg、约2275mg、约2300mg、约2325mg、约2350mg、约2375mg、约2400mg、约2425mg、约2450mg、约2475mg、约2500mg、2525mg、约2550mg、约2575mg、约2600mg、约2625mg、约2650mg、约2675mg、约2700mg、约2725mg、约2750mg、约2775mg、约2800mg、约2825mg、约2850mg、约2875mg、约2900mg、约2925mg、约2950mg、约2975mg、约3000mg、约3025mg、约3050mg、约3075mg、约3100mg、约3125mg、约3150mg、约3175mg、约3200mg、约3225mg、约3250mg、约3275mg、约3300mg、约3325mg、约3350mg、约3375mg、约3400mg、约3425mg、约3450mg、约3475mg、约3500mg、约3525mg、约3550mg、约3575mg、约3600mg、约3625mg、约3650mg、约3675mg、约3700mg、约3725mg、约3750mg、约3775mg、约3800mg、约3825mg、约3850mg、约3875mg、约3900mg、约3925mg、约3950mg、约3975mg、约4000mg、约4025mg、约4050mg、约4075mg、约4100mg、约4125mg、约4150mg、约4175mg、约4200mg、约4225mg、约4250mg、约4275mg、约4300mg、约4325mg、约4350mg、约4375mg、约4400mg、约4425mg、约4450mg、约4475mg、约4500mg、约4525mg、约4550mg、约4575mg、约4600mg、约4625mg、约4650mg、约4675mg、约4700mg、约4725mg、约4750mg、约4775mg、约4800mg、约4825mg、约4850mg、约4875mg、约4900mg、约4925mg、约4950mg、约4975mg、约5000mg、约5025mg、约5050mg、约5075mg、约5100mg、约5125mg、约5150mg、约5175mg、约5200mg、约5225mg、约5250mg、约5275mg、约5300mg、约5325mg、约5350mg、约5375mg、约5400mg、约5425mg、约5450mg、约5475mg、约5500mg、约5525mg、约5550mg、约5575mg、约5600mg、约5625mg、约5650mg、约5675mg、约5700mg、约5725mg、约5750mg、约5775mg、约5800mg、约5825mg、约5850mg、约5875mg、约5900mg、约5925mg、约5950mg、约5975mg、约6000mg、约6025mg、约6050mg、约6075mg、约6100mg、约6125mg、约6150mg、约6175mg、约6200mg、约6225mg、约6250mg、约6275mg、约6300mg、约6325mg、约6350mg、约6375mg、约6400mg、约6425mg、约6450mg、约6475mg、约6500mg、约6525mg、约6550mg、约6575mg、约6600mg、约6625mg、约6650mg、约6675mg、约6700mg、约6725mg、约6750mg、约6775mg、约6800mg、约6825mg、约6850mg、约6875mg、约6900mg、约6925mg、约6950mg、约6975mg、约7000mg、约7025mg、约7050mg、约7075mg、约7100mg、约7125mg、约7150mg、约7175mg、约7200mg、约7225mg、约7250mg、约7275mg、约7300mg、约7325mg、约7350mg、约7375mg、约7400mg、约7425mg、约7450mg、约7475mg、约7500mg、约7525mg、约7550mg、约7575mg、约7600mg、约7625mg、约7650mg、约7675mg、约7700mg、约7725mg、约7750mg、约7775mg、约7800mg、约7825mg、约7850mg、约7875mg、约7900mg、约7925mg、约7950mg、约7975mg、约8000mg、约8025mg、约8050mg、约8075mg、约8100mg、约8125mg、约8150mg、约8175mg、约8200mg、约8225mg、约8250mg、约8275mg、约8300mg、约8325mg、约8350mg、约8375mg、约8400mg、约8425mg、约8450mg、约8475mg、约8500mg、约8525mg、约8550mg、约8575mg、约8600mg、约8625mg、约8650mg、约8675mg、约8700mg、约8725mg、约8750mg、约8775mg、约8800mg、约8825mg、约8850mg、约8875mg、约8900mg、约8925mg、约8950mg、约8975mg、约9000mg、约9025mg、约9050mg、约9075mg、约9100mg、约9125mg、约9150mg、约9175mg、约9200mg、约9225mg、约9250mg、约9275mg、约9300mg、约9325mg、约9350mg、约9375mg、约9400mg、约9425mg、约9450mg、约9475mg、约9500mg、约9525mg、约9550mg、约9575mg、约9600mg、约9625mg、约9650mg、约9675mg、约9700mg、约9725mg、约9750mg、约9775mg、约9800mg、约9825mg、约9850mg、约9875mg、约9900mg、约9925mg、约9950mg、约9975mg，或约10,000mg。
在一个实施方案中，本公开的组合物中存在的15-HEPE包括按重量计至少约90％的15-HEPE(术语“15-HEPE”如本文所定义和例示)。15-HEPE组合物可以包含甚至更高纯度的15-HEPE，例如按重量计至少约95％的15-HEPE或按重量计至少约97％的15-HEPE，其中15-HEPE是如本文所阐述的任何形式的15-HEPE。15-HEPE的纯度可以进一步通过本文所提供的对15-HEPE的任何描述来限定(例如，杂质分布)。
上文讨论了药物组合物中15-HEPE的量及其纯度。必需脂肪酸的性质及其合成使得15-HEPE组合物可以包含来自必需脂肪酸代谢级联中的其他必需脂肪酸的部分。
在一个实施方案中，本公开的组合物包含按重量计不超过约10％、不超过约9％、不超过约8％、不超过约7％、不超过约6％、不超过约5％、不超过约4％、不超过约3％、不超过约2％、不超过约1％或不超过约0.5％的其他ω-3脂肪酸，包括α-亚麻酸、十八碳四烯酸、二十二碳六烯酸(DHA)或它们的衍生物。在其他实施方案中，基本上不存在或完全不存在这些另外的ω-3脂肪酸。
在另一个实施方案中，15-HEPE按重量计占本公开组合物中存在的所有脂肪酸的至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％。
在一个实施方案中，本发明的组合物中存在的盐形式的15-HEPE包括按重量计至少90％的盐形式的15-HEPE。含有盐形式的15-HEPE的组合物可以包含甚至更高纯度的盐形式的15-HEPE，例如，按重量计至少91％、按重量计至少92％、按重量计至少93％、按重量计至少94％、按重量计至少95％、按重量计至少96％，或按重量计至少97％。
可能存在来自15-HEPE合成的一些残余二十碳五烯酸。可能存在按重量计不超过约10％、不超过约9％、不超过约8％、不超过约7％、不超过约6％、不超过约5％、不超过约4％、不超过约3％、不超过约2％、不超过约1％或不超过约0.5％的EPA。替代性地，基本上不存在或完全不存在其形式没有被修饰成羟基形式的EPA。
在一个实施方案中，本公开提供了封装在胶囊壳中的包含15-HEPE或其衍生物的药物组合物。在一个实施方案中，该组合物以足以每天最多提供约1g、约2g、约3g、约4g、约5g、约6g、约7g、约8g、约9g或约10g 15-HEPE E或其衍生物的量施用于受试者。在一个实施方案中，该组合物以足以每天提供约4g至约8g、约1g至约2g、约2g至约4g、约3g至约8g、约4g至约6g 15-HEPE或其衍生物的量施用于受试者。在一个实施方案中，约500mg至约1g的15-HEPE或其衍生物封装在胶囊壳中。
在一个实施方案中，胶囊壳包含明胶(例如，分子量较低的RXL明胶或碱法骨明胶)。在另一个实施方案中，胶囊壳包含这样的RXL明胶：其已通过蛋白水解酶处理，以切割明胶图案并有效降低其分子量。在另一个实施方案中，该药物组合物包含D-山梨糖醇和1，4-脱水山梨糖醇的15-HEPE酯。在一个实施方案中，胶囊壳包含(a)明胶和(b)增塑剂，其中增塑剂选自D-山梨糖醇和1，4-脱水山梨糖醇中的一者或多者。在一个实施方案中，明胶如U.S.7,485,323中所述，并且据此全文以引用方式并入本文。
在一个实施方案中，增塑剂包含其量为约20％至约30％(例如约24％至约28％、24％或28％)(干基)的1，4-脱水山梨糖醇，以及含量为约30％至约50％(例如约35％至约45％)(干基)的D-山梨糖醇。
在一些实施方案中，胶囊是硬明胶胶囊。在另一个实施方案中，胶囊是软明胶胶囊。
在一些实施方案中，胶囊壳包含改性淀粉、角叉菜胶(例如，红海藻提取物)、磷酸二钠、甘油和/或山梨糖醇。在一些实施方案中，胶囊壳还包含水。在一些实施方案中，胶囊壳在最高约65℃的温度和/或约12的pH下是稳定的。
在一些实施方案中，胶囊壳无气味并具有中性色(例如，无色、白色或透明)。
在一些实施方案中，胶囊壳还包含甘油、纯化水、二氧化钛、中链甘油三酯和卵磷脂。
附加活性剂
在一个实施方案中，药物组合物还包含一种或多种附加活性剂。在一个实施方案中，药物组合物包含的附加活性剂的量小于该活性剂公认的治疗有效量。在一个实施方案中，药物组合物包含的附加活性剂的量等于或大于该活性剂公认的治疗有效量。如果要使用附加活性剂，则可以将其与15-HEPE共同配制为单一剂量单位，或者可以将其与15-HEPE配制为用于协调、组合或伴随施用的两个至多个剂量单位。
EPA本身具有治疗脂肪肝病和/或心血管疾病的有益特性，因而在一个替代性实施方案中可以将15-HEPE与EPA组合。
在一个实施方案中，15-HEPE和一种或多种活性剂存在于本公开的组合物中，或者以15-HEPE：附加活性剂的下列重量比共同施用：约1∶1000至约1000∶1、约1∶500至约500∶1、约1∶100至约100∶1、约1∶50至约50∶1、约1∶25至约25∶1、约1∶10至约10∶1、约1∶5至约5∶1、约1∶4至约4∶1、约1∶3至约3∶1、约1∶2至约2∶1，或者约1∶1。
剂型
根据本公开使用的组合物可以配制为一种或多种剂量单位。本文中的术语“剂量单位”是指组合物的一部分，该部分含有适于单次施用以提供治疗效果的一定量的治疗剂。此类剂量单位可以每天施用一次至多次(例如，1次至约10次、1次至8次、1次至6次、1次至4次，或1次至2次)，或者根据需要施用多次以引起治疗反应。
在一些实施方案中，本公开的组合物为可口服递送剂型或单位的形式。合适剂型的非限制性示例包括片剂(例如，混悬片、口腔崩解片、快速分散片、咀嚼片等)、囊片、胶囊剂(例如，软或硬明胶胶囊，或者HPMC胶囊)、锭剂、小药囊、扁囊剂、锭剂、丸剂、混悬剂、酏剂、糖浆剂，或者合理地适于口服施用的任何其他固体剂型。本文中的术语“口服递送”和“口服施用”包括其中将药剂或组合物置于接受治疗的受试者的口中(无论是否吞咽)的任何递送形式。因此，这包括含服和舌下施用，以及食道施用。
替代性地，本公开的组合物还可以配制用于直肠、局部或肠胃外(例如，皮下、肌内、静脉内和皮内或输注)递送。
在论述本公开组合物中15-HEPE的量时，该量可以分成几种剂型。就口服施用而言，大小存在限制。如果每天向受试者施用约1g至约4g 15-HEPE，则大小可以最多为4粒胶囊，每粒胶囊提供约1g 15-HEPE。
本公开的组合物可以是将直接吸入的液体剂型或剂量单位的形式，或者它们可以在摄入之前与食物或饮料混合。合适的液体剂型的非限制性示例包括溶液剂、混悬剂、酏剂、糖浆剂、液体气溶胶制剂，等等。
在另一个实施方案中，本公开的组合物包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。本文中的术语“药学上可接受的赋形剂”意指以下任何物质：其本身不是治疗剂，但用作将治疗剂递送至受试者的载剂或媒剂，或者被添加至组合物中以改善组合物的处理或储存特性或者允许或促进单位剂量组合物的形成，并且不产生无法接受的毒性也不与组合物中的其他组分相互作用。仅举例来说，根据本公开的药物组合物可以包含一种或多种以下物质：抗氧化剂、表面活性剂、防腐剂、矫味剂、共溶剂、粘性助剂、悬浮助剂和亲脂相。
在一个实施方案中，该药物组合物包含一种或多种抗氧化剂，诸如抗坏血酸、棕榈酸、棕榈酸抗坏血酸酯、α-生育酚、艾地苯醌、泛醌、阿魏酸、辅酶Q10、番茄红素、绿茶、儿茶素、表没食子儿茶素3-没食子酸酯(EGCG)、绿茶多酚(GTP)、水飞蓟素、咖啡莓果、白藜芦醇、葡萄籽、石榴提取物、染料木素、碧萝芷、烟酰胺，等等。在一个实施方案中，该药物组合物包含约0.01重量％至约2重量％的抗氧化剂，例如约0.01重量％、约0.02重量％、约0.03重量％、约0.04重量％、约0.05重量％、约0.06重量％、约0.07重量％、约0.08重量％、约0.09重量％、约0.1重量％、约0.11重量％、约0.12重量％、约0.13重量％、约0.14重量％、约0.15重量％、约0.16重量％、约0.17重量％、约0.18重量％、约0.19重量％、约0.2重量％、约0.21重量％、约0.22重量％、约0.23重量％、约0.24重量％、约0.25重量％、约0.26重量％、约0.27重量％、约0.28重量％、约0.29重量％、约0.3重量％、约0.31重量％、约0.32重量％、约0.33重量％、约0.34重量％、约0.35重量％、约0.36重量％、约0.37重量％、约0.38重量％、约0.39重量％、约0.4重量％、约0.41重量％、约0.42重量％、约0.43重量％、约0.44重量％、约0.45重量％、约0.46重量％、约0.47重量％、约0.48重量％、约0.49重量％、约0.5重量％、约0.51重量％、约0.52重量％、约0.53重量％、约0.54重量％、约0.55重量％、约0.56重量％、约0.57重量％、约0.58重量％、约0.59重量％、约0.6重量％、约0.61重量％、约0.62重量％、约0.63重量％、约0.64重量％、约0.65重量％、约0.66重量％、约0.67重量％、约0.68重量％、约0.69重量％、约0.7重量％、约0.71重量％、约0.72重量％、约0.73重量％、约0.74重量％、约0.75重量％、约0.76重量％、约0.77重量％、约0.78重量％、约0.79重量％、约0.8重量％、约0.81重量％、约0.82重量％、约0.83重量％、约0.84重量％、约0.85重量％、约0.86重量％、约0.87重量％、约0.88重量％、约0.89重量％、约0.9重量％、约0.91重量％、约0.92重量％、约0.93重量％、约0.94重量％、约0.95重量％、约0.96重量％、约0.97重量％、约0.98重量％、约0.99重量％、约1重量％、约1.1重量％、约1.2重量％、约1.3重量％、约1.4重量％、约1.5重量％、约1.6重量％、约1.7重量％、约1.8重量％、约1.9重量％或约2重量％的一种或多种抗氧化剂。
治疗方法
本文所公开的组合物和制剂可以用于治疗和/或预防对其有需要的受试者的血液系统异常。在一些实施方案中，血液系统异常是血红蛋白异常、红细胞异常、溶血性贫血、血栓形成倾向异常、静脉血栓栓塞、动脉血栓形成、栓塞，或者它们的组合。在一些实施方案中，这些方法包括向受试者施用15-羟基二十碳五烯酸(15-HEPE)或包含15-羟基二十碳五烯酸(15-HEPE)的组合物。
本文所公开的组合物和制剂可以用于治疗和/或预防血液系统异常、血红蛋白异常和/或红细胞异常。血液系统异常是指影响血液和血液形成器官的一类状态。尽管血红蛋白异常和红细胞异常与血液系统异常相似，但血红蛋白异常和红细胞异常这两者定义的异常类别较窄。具体地讲，血红蛋白异常是指血红蛋白(红细胞中的氧转运蛋白)的缺陷。而红细胞异常是指红细胞本身的缺陷。血液系统异常、血红蛋白异常和红细胞异常的风险因素的非限制性示例包括红细胞计数减少、红细胞分布宽度增大，以及网织红细胞计数增加。血液系统异常、血红蛋白异常和红细胞异常的非限制性示例包括贫血(营养性贫血和非营养性贫血，遗传性溶血性贫血诸如镰状细胞病、镰状细胞贫血、β-地中海贫血和遗传性球形红细胞增多症，获得性溶血性贫血诸如继发于感染、药物治疗、血液恶性肿瘤、自身免疫疾病、脾功能亢进、机械心脏瓣膜和输血的溶血性贫血，范科尼贫血、缺铁性贫血)、血癌(淋巴瘤、白血病和骨髓瘤)、凝血缺陷(血栓形成倾向、血友病、血管性血友病和血小板减少症)、叶酸缺乏症、B12缺乏症和骨髓增生异常综合征。在一些实施方案中，镰状细胞病和镰状细胞贫血与镰状细胞危象、血管闭塞危象和/或脾隔离危象相关联。
在一些实施方案中，受试者的红细胞计数减少，比正常值至少低10％、比正常值至少低15％、比正常值至少低20％、比正常值至少低25％，或者比正常值至少低30％。
在一些实施方案中，受试者的红细胞分布宽度增大，其中红细胞的大小变化约15％至20％、约20％至25％、约25％至30％、约30％至35％，或者约35％至40％。
在另一个实施方案中，受试者的网织红细胞计数增加，为红细胞总量的至少约5％、红细胞总量的至少约10％、红细胞总量的至少约15％，或者红细胞总量的至少约20％。
在一些实施方案中，受试者的基线甘油三酯水平升高，为约135mg/dL至约2000mg/dL，例如约135mg/dL至约500mg/dL、约150mg/dL至约500mg/dL、约200mg/dL至约499mg/dL、约200mg/dL至＜500mg/dL、约300mg/dL至约1800mg/dL、约500mg/dL至约1500mg/dL、约500mg/dL至约＜2000mg/dL，或者约500mg/dL至约2000mg/dL。在一些实施方案中，受试者的空腹基线甘油三酯水平为约50mg/dL至约2000mg/dL，例如约50mg/dL至约1500mg/dL、约80mg/dL至约1500mg/dL、约50mg/dL至约190mg/dL、约80mg/dL至约190mg/dL、约190mg/dL至约250mg/dL、约250mg/dL至约1400mg/dL、约500mg/dL至约1200mg/dL、约500mg/dL至约1500mg/dL、约500mg/dL至约＜2000mg/dL，或者约500mg/dL至约2000mg/dL。在一个实施方案中，受试者的空腹基线甘油三酯水平为约80mg/dL至约1400mg/dL。在一些实施方案中，受试者或受试者组的进食或空腹基线甘油三酯水平(或在受试者组的情况下的中值基线甘油三酯水平)为约50mg/dL、约55mg/dL、约60mg/dL、约65mg/dL、约70mg/dL、约75mg/dL、约80mg/dL、约85mg/dL、约90mg/dL、约95mg/dL、约100mg/dL、约105mg/dL、约110mg/dL、约115mg/dL、约120mg/dL、约125mg/dL、约130mg/dL、约135mg/dL、约140mg/dL、约145mg/dL、约150mg/dL、约155mg/dL、约160mg/dL、约165mg/dL、约170mg/dL、约175mg/dL、约180mg/dL、约185mg/dL、约190mg/dL、约195mg/dL、约200mg/dL、约205mg/dL、约210mg/dL、约215mg/dL、约220mg/dL、约225mg/dL、约230mg/dL、约235mg/dL、约240mg/dL、约245mg/dL、约250mg/dL、约255mg/dL、约260mg/dL、约265mg/dL、约270mg/dL、约275mg/dL、约280mg/dL、约285mg/dL、约290mg/dL、约295mg/dL、约300mg/dL、约305mg/dL、约310mg/dL、约315mg/dL、约320mg/dL、约325mg/dL、约330mg/dL、约335mg/dL、约340mg/dL、约345mg/dL、约350mg/dL、约355mg/dL、约360mg/dL、约365mg/dL、约370mg/dL、约375mg/dL、约380mg/dL、约385mg/dL、约390mg/dL、约395mg/dL、约400mg/dL、约405mg/dL、约410mg/dL、约415mg/dL、约420mg/dL、约425mg/dL、约430mg/dL、约435mg/dL、约440mg/dL、约445mg/dL、约450mg/dL、约455mg/dL、约460mg/dL、约465mg/dL、约470mg/dL、约475mg/dL、约480mg/dL、约485mg/dL、约490mg/dL、约495mg/dL、约500mg/dL、约1000mg/dL、约1100mg/dL、约1200mg/dL、约1300mg/dL、约1400mg/dL、约1500mg/dL、约2000mg/dL、约2500mg/dL、约3000mg/dL、约3500mg/dL、约4000mg/dL、约4500mg/dL、约5000mg/dL，或者大于约5000mg/dL。在一些实施方案中，受试者或受试者组的进食或空腹基线甘油三酯水平(或在受试者组的情况下的中值基线甘油三酯水平)大于或等于80mg/dL、大于或等于约100mg/dL、大于或等于约120mg/dL、大于或等于约150mg/dL、大于或等于约175mg/dL、大于或等于约250mg/dL，或者大于或等于约500mg/dL，例如为约190mg/dL至约250mg/dL、约80mg/dL至约190mg/dL、约250mg/dL至约1400mg/dL、约200mg/dL至约500mg/dL、约300mg/dL至约1800mg/dL、约500mg/dL至约1500mg/dL、约80mg/dL至约1500mg/dL、约80mg/dL至小于约2000mg/dL、约80mg/dL至约2000mg/dL、约500mg/dL至小于约2000mg/dL，或者约500mg/dL至约2000mg/dL。
在另一个实施方案中，受试者的基线血压升高，为至少约100mmHg、至少约115mmHg、至少约120mmHg、至少约125mmHg、至少约130mmHg、至少约135mmHg、至少约140mmHg、至少约145mmHg、至少约150mmHg、至少约155mmHg、至少约160mmHg、至少约165mmHg，或者至少约170mmHg。
在一些实施方案中，受试者的基线空腹葡萄糖水平升高，为至少约100mg/dL、至少约115mg/dL、至少约120mg/dL、至少约125mg/dL、至少约130mg/dL、至少约135mg/dL、至少约140mg/dL、至少约145mg/dL、至少约150mg/dL、至少约155mg/dL、至少约160mg/dL、至少约165mg/dL，或者至少约170mg/dL。
在一些实施方案中，受试者的基线HDL-C水平降低，小于约60mg/dL、小于约55mg/dL、小于约50mg/dl、小于约45mg/dL、小于约40mg/dL、小于约35mg/dL、小于约30mg/dL、小于约25mg/dL、小于约20mg/dL、小于约15mg/dL、小于约10mg/dL，或者小于约5mg/dL。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗和/或预防受试者的血液系统疾病的方法，该方法包括向受试者施用15-HEPE。在另一个实施方案中，该方法包括向受试者施用最多约8g 15-HEPE。在又一个实施方案中，15-HEPE按重量计占该组合物中所有脂肪酸的至少约90％。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗和/或预防受试者的血液系统疾病的方法，该方法包括向受试者施用15-HEPE或包含15-HEPE的组合物。在另一个实施方案中，该方法包括向受试者施用最多约8g 15-HEPE或包含15-HEPE的组合物。在又一个实施方案中，15-HEPE按重量计占该组合物中所有脂肪酸的至少约90％。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗和/或预防对其有需要的受试者的血液系统异常的方法，该方法包括向受试者施用15-羟基二十碳五烯酸(15-HEPE)或包含15-HEPE的组合物。在另一个实施方案中，该方法包括向受试者施用最多约8g包含15-HEPE的组合物。在另一个实施方案中，15-HEPE按重量计占该组合物中所有脂肪酸的至少约90％。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗和/或预防受试者的血液系统疾病的方法，该方法包括向受试者施用15-HEPE或包含15-HEPE的组合物。在一些实施方案中，该方法还包括在施用15-HEPE或包含15-HEPE的组合物之前确定受试者具有至少一种血液系统疾病风险因素。在一些实施方案中，该方法还包括在施用15-HEPE之前确定受试者的基线红细胞计数、红细胞分布宽度和/或网织红细胞计数。在一个实施方案中，受试者表现出红细胞计数增加、红细胞分布宽度减小和/或网织红细胞计数减少。在另一个实施方案中，该方法包括向受试者施用最多约8g 15-HEPE或包含15-HEPE的组合物。在又一个实施方案中，15-HEPE按重量计占该组合物中所有脂肪酸的至少约90％。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗和/或预防对其有需要的受试者的血液系统异常的方法，该方法包括向受试者施用15-羟基二十碳五烯酸(15-HEPE)或包含15-HEPE的组合物。在一些实施方案中，该方法还包括在施用15-HEPE或包含15-HEPE的组合物之前确定受试者具有至少一种血液系统疾病风险因素。在一些实施方案中，该方法还包括在施用15-HEPE之前确定受试者的基线红细胞计数、红细胞分布宽度和/或网织红细胞计数。在一个实施方案中，受试者表现出红细胞计数增加、红细胞分布宽度减小和/或网织红细胞计数减少。在另一个实施方案中，该方法包括向受试者施用最多约8g包含15-HEPE的组合物。在另一个实施方案中，15-HEPE按重量计占该组合物中所有脂肪酸的至少约90％。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗和/或预防对其有需要的受试者的血红蛋白异常的方法，该方法包括向受试者施用15-羟基二十碳五烯酸(15-HEPE)或包含15-HEPE的组合物。在另一个实施方案中，该方法包括向受试者施用最多约8g包含15-HEPE的组合物。在另一个实施方案中，15-HEPE按重量计占该组合物中所有脂肪酸的至少约90％。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗和/或预防对其有需要的受试者的血红蛋白异常的方法，该方法包括向受试者施用15-羟基二十碳五烯酸(15-HEPE)或包含15-HEPE的组合物。在一些实施方案中，该方法还包括在施用15-HEPE或包含15-HEPE的组合物之前确定受试者具有至少一种血红蛋白异常风险因素。在一些实施方案中，该方法还包括在施用15-HEPE之前确定受试者的基线红细胞计数、红细胞分布宽度和/或网织红细胞计数。在一个实施方案中，受试者表现出红细胞计数增加、红细胞分布宽度减小和/或网织红细胞计数减少。在另一个实施方案中，该方法包括向受试者施用最多约8g包含15-HEPE的组合物。在另一个实施方案中，15-HEPE按重量计占该组合物中所有脂肪酸的至少约90％。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗和/或预防对其有需要的受试者的红细胞异常的方法，该方法包括向受试者施用15-HEPE或包含15-HEPE的组合物。在另一个实施方案中，该方法包括向受试者施用最多约8g包含15-HEPE的组合物。在另一个实施方案中，15-HEPE按重量计占该组合物中所有脂肪酸的至少约90％。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗和/或预防对其有需要的受试者的红细胞异常的方法，该方法包括向受试者施用15-HEPE或包含15-HEPE的组合物。在一些实施方案中，该方法还包括在施用15-HEPE或包含15-HEPE的组合物之前确定受试者具有至少一种红细胞异常风险因素。在一些实施方案中，该方法还包括在施用15-HEPE之前确定受试者的基线红细胞计数、红细胞分布宽度和/或网织红细胞计数。在一个实施方案中，受试者表现出红细胞计数增加、红细胞分布宽度减小和/或网织红细胞计数减少。在另一个实施方案中，该方法包括向受试者施用最多约8g包含15-HEPE的组合物。在另一个实施方案中，15-HEPE按重量计占该组合物中所有脂肪酸的至少约90％。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗和/或预防对其有需要的受试者的血液系统异常、血红蛋白异常和/或红细胞异常的方法，该方法包括向受试者施用15-HEPE或包含15-HEPE的组合物。在另一个实施方案中，该方法包括向受试者施用最多约8g包含15-HEPE的组合物。在另一个实施方案中，15-HEPE按重量计占该组合物中所有脂肪酸的至少约90％。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗和/或预防对其有需要的受试者的血液系统异常、血红蛋白异常和/或红细胞异常的方法，该方法包括向受试者施用15-HEPE或包含15-HEPE的组合物。在一些实施方案中，该方法还包括在施用15-HEPE或包含15-HEPE的组合物之前确定受试者具有下列至少一种风险因素：血液系统异常、血红蛋白异常和/或红细胞异常。在一些实施方案中，至少一种风险因素是红细胞计数减少、红细胞分布宽度增大，和/或网织红细胞计数增加。在一些实施方案中，受试者表现出一种或多种下列现象：红细胞计数增加、红细胞分布宽度减小和/或网织红细胞计数减少。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗和/或预防对其有需要的受试者的血液系统异常、血红蛋白异常和/或红细胞异常的方法，该方法包括向受试者施用15-HEPE或包含15-HEPE的组合物。在另一个实施方案中，该方法包括向受试者施用最多约8g包含15-HEPE的组合物。在另一个实施方案中，15-HEPE按重量计占该组合物中所有脂肪酸的至少约90％。在另一个实施方案中，血液系统异常、血红蛋白异常和/或红细胞异常选自由以下项组成的组：遗传性溶血性贫血、获得性溶血性贫血、范科尼贫血、缺铁性贫血、叶酸缺乏症、B12缺乏症和骨髓增生异常综合征。在一些实施方案中，该方法还包括在施用15-HEPE或包含15-HEPE的组合物之前确定受试者具有下列至少一种风险因素：遗传性溶血性贫血、获得性溶血性贫血、范科尼贫血、缺铁性贫血、叶酸缺乏症、B12缺乏症和/或骨髓增生异常综合征。在一些实施方案中，该方法还包括在施用15-HEPE之前确定受试者的基线红细胞计数、红细胞分布宽度和/或网织红细胞计数。在一个实施方案中，受试者表现出红细胞计数增加、红细胞分布宽度减小和/或网织红细胞计数减少。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗和/或预防对其有需要的受试者的溶血性贫血的方法，该方法包括向受试者施用15-HEPE或包含15-HEPE的组合物。在另一个实施方案中，该方法包括向受试者施用最多约8g包含15-HEPE的组合物。在另一个实施方案中，15-HEPE按重量计占该组合物中所有脂肪酸的至少约90％。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗和/或预防对其有需要的受试者的溶血性贫血的方法，该方法包括向受试者施用15-HEPE或包含15-HEPE的组合物。在一些实施方案中，该方法还包括在施用15-HEPE或包含15-HEPE的组合物之前确定受试者具有至少一种溶血性贫血风险因素。在一些实施方案中，至少一种风险因素是红细胞计数减少、红细胞分布宽度增大，和/或网织红细胞计数增加。在一些实施方案中，受试者表现出一种或多种下列现象：红细胞计数增加、红细胞分布宽度减小和/或网织红细胞计数减少。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗和/或预防对其有需要的受试者的溶血性贫血的方法，该方法包括向受试者施用最多约8g包含15-HEPE的组合物。在一些实施方案中，15-HEPE按重量计占该组合物中所有脂肪酸的至少约90％。在一些实施方案中，溶血性贫血是遗传性溶血性贫血或获得性溶血性贫血。在另一个实施方案中，遗传性溶血性贫血选自由以下项组成的组：镰状细胞病、镰状细胞贫血、β-地中海贫血和遗传性球形红细胞增多症。在又一个实施方案中，获得性溶血性贫血选自由以下项组成的组：继发于感染、药物治疗、血液恶性肿瘤、自身免疫疾病、脾功能亢进、机械心脏瓣膜和输血。在各种实施方案中，镰状细胞病和镰状细胞贫血与镰状细胞危象、血管闭塞危象和/或脾隔离危象相关联。在一些实施方案中，受试者在施用后表现出红细胞计数增加、红细胞分布宽度减小和网织红细胞计数减少。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗和/或预防对其有需要的受试者的溶血性贫血的方法，该方法包括向受试者施用最多约8g包含15-HEPE的组合物。在一些实施方案中，15-HEPE按重量计占该组合物中所有脂肪酸的至少约90％。在一些实施方案中，溶血性贫血是遗传性溶血性贫血或获得性溶血性贫血。在另一个实施方案中，遗传性溶血性贫血选自由以下项组成的组：镰状细胞病、镰状细胞贫血、β-地中海贫血和遗传性球形红细胞增多症。在一些实施方案中，该方法还包括在施用15-HEPE或包含15-HEPE的组合物之前确定受试者具有至少一种遗传性溶血性贫血或获得性溶血性贫血风险因素。在又一个实施方案中，获得性溶血性贫血选自由以下项组成的组：继发于感染、药物治疗、血液恶性肿瘤、自身免疫疾病、脾功能亢进、机械心脏瓣膜和输血。在各种实施方案中，镰状细胞病和镰状细胞贫血与镰状细胞危象、血管闭塞危象和/或脾隔离危象相关联。在一些实施方案中，该方法还包括在施用15-HEPE之前确定受试者的基线红细胞计数、红细胞分布宽度和/或网织红细胞计数。在一个实施方案中，受试者表现出红细胞计数增加、红细胞分布宽度减小和/或网织红细胞计数减少。
本文所公开的组合物和制剂还可以用于治疗和/或预防血栓形成倾向异常。血栓形成倾向异常是指特征在于凝血异常的一类状态，其中凝血异常使血栓形成风险增加。血栓形成倾向异常的风险因素的非限制性示例包括凝血酶原时间缩短、活化部分凝血活酶时间缩短和纤维蛋白原浓度增加。
在一些实施方案中，受试者的凝血酶原时间缩短，比正常值至少短10％、比正常值至少短15％、比正常值至少短20％、比正常值至少短25％，或者比正常值至少短30％。
在一些实施方案中，受试者的活化部分凝血活酶时间缩短，比正常值至少短10％、比正常值至少短15％、比正常值至少短20％、比正常值至少短25％，或者比正常值至少短30％。
在一些实施方案中，受试者的纤维蛋白原浓度增加，比正常值至少低10％、比正常值至少低15％、比正常值至少低20％、比正常值至少低25％，或者比正常值至少低30％。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗和/或预防对其有需要的受试者的血栓形成倾向异常的方法，该方法包括向受试者施用15-羟基二十碳五烯酸(15-HEPE)或包含15-HEPE的组合物。在另一个实施方案中，该方法包括向受试者施用最多约8g包含15-HEPE的组合物。在另一个实施方案中，15-HEPE按重量计占该组合物中所有脂肪酸的至少约90％。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗和/或预防对其有需要的受试者的血栓形成倾向异常的方法，该方法包括向受试者施用15-HEPE或包含15-HEPE的组合物。在一些实施方案中，该方法还包括在施用15-HEPE或包含15-HEPE的组合物之前确定受试者具有至少一种血栓形成倾向异常风险因素。在一些实施方案中，至少一种风险因素为凝血酶原时间缩短、活化部分凝血活酶时间缩短，以及/或者纤维蛋白原浓度增加。在一些实施方案中，在施用15-HEPE或包含15-HEPE的组合物之后，受试者表现出一种或多种下列现象：凝血酶原时间延长、活化部分凝血活酶时间延长，以及/或者纤维蛋白原浓度降低。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗和/或预防对其有需要的受试者的静脉血栓栓塞的方法，该方法包括向受试者施用15-羟基二十碳五烯酸(15-HEPE)或包含15-HEPE的组合物。在另一个实施方案中，该方法包括向受试者施用最多约8g包含15-HEPE的组合物。在另一个实施方案中，15-HEPE按重量计占该组合物中所有脂肪酸的至少约90％。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗和/或预防对其有需要的受试者的静脉血栓栓塞的方法，该方法包括向受试者施用15-HEPE或包含15-HEPE的组合物。在一些实施方案中，该方法还包括在施用15-HEPE或包含15-HEPE的组合物之前确定受试者具有至少一种静脉血栓栓塞风险因素。在一些实施方案中，至少一种风险因素为凝血酶原时间缩短、活化部分凝血活酶时间缩短，以及/或者纤维蛋白原浓度增加。在一些实施方案中，受试者表现出一种或多种下列现象：凝血酶原时间延长、活化部分凝血活酶时间延长，以及/或者纤维蛋白原浓度降低。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗和/或预防对其有需要的受试者的动脉血栓形成的方法，该方法包括向受试者施用15-羟基二十碳五烯酸(15-HEPE)或包含15-HEPE的组合物。在另一个实施方案中，该方法包括向受试者施用最多约8g包含15-HEPE的组合物。在另一个实施方案中，15-HEPE按重量计占该组合物中所有脂肪酸的至少约90％。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗和/或预防对其有需要的受试者的动脉血栓形成的方法，该方法包括向受试者施用15-HEPE或包含15-HEPE的组合物。在一些实施方案中，该方法还包括在施用15-HEPE或包含15-HEPE的组合物之前确定受试者具有至少一种动脉血栓形成风险因素。在一些实施方案中，至少一种风险因素为凝血酶原时间缩短、活化部分凝血活酶时间缩短，以及/或者纤维蛋白原浓度增加。在一些实施方案中，受试者表现出一种或多种下列现象：凝血酶原时间延长、活化部分凝血活酶时间延长，以及/或者纤维蛋白原浓度降低。
在一些实施方案中，本公开提供了预防对其有需要的受试者的栓塞的方法，该方法包括向受试者施用15-羟基二十碳五烯酸(15-HEPE)或包含15-HEPE的组合物。在另一个实施方案中，该方法包括向受试者施用最多约8g包含15-HEPE的组合物。在另一个实施方案中，15-HEPE按重量计占该组合物中所有脂肪酸的至少约90％。
在一些实施方案中，本公开提供了预防对其有需要的受试者的栓塞的方法，该方法包括向受试者施用15-HEPE或包含15-HEPE的组合物。在一些实施方案中，该方法还包括在施用15-HEPE或包含15-HEPE的组合物之前确定受试者具有至少一种栓塞形成风险因素。在一些实施方案中，至少一种风险因素为凝血酶原时间缩短、活化部分凝血活酶时间缩短，以及/或者纤维蛋白原浓度增加。在一些实施方案中，受试者表现出一种或多种下列现象：凝血酶原时间延长、活化部分凝血活酶时间延长，以及/或者纤维蛋白原浓度降低。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗和/或预防受试者的内皮功能障碍的方法，该方法包括向受试者施用15-HEPE。在另一个实施方案中，该方法包括向受试者施用最多约8g 15-HEPE。在又一个实施方案中，15-HEPE按重量计占该组合物中所有脂肪酸的至少约90％。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗和/或预防受试者的内皮功能障碍的方法，该方法包括向受试者施用15-HEPE或包含15-HEPE的组合物。在另一个实施方案中，该方法包括向受试者施用最多约8g 15-HEPE或包含15-HEPE的组合物。在又一个实施方案中，15-HEPE按重量计占该组合物中所有脂肪酸的至少约90％。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗、预防或减轻细胞应激凋亡的方法，该方法包括向受试者施用15-HEPE或包含15-HEPE的组合物。在一些实施方案中，受试者表现出与细胞凋亡相关联的标记物减少，所述标记物诸如来自Bcl-2家族的蛋白质、胱天蛋白酶活化片段和/或经切割PARP-1。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗、预防和/或减轻炎症的方法，该方法包括向受试者施用15-HEPE或包含15-HEPE的组合物。在一些实施方案中，受试者表现出T细胞活化、B细胞活化和/或趋化性降低。
本文所公开的组合物和制剂可以用于治疗或预防心血管疾病或异常。在一个实施方案中，心血管疾病或异常选自：血脂异常、高脂血症、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、原发性高胆固醇血症、原发性高脂血症、常见原发性高脂血症、常见高胆固醇血症、家族性高脂血症、家族性原发性高脂血症、家族性高胆固醇血症、家族性高甘油三酯血症、家族性混合型高脂血症、家族性载脂蛋白b-100缺陷症、继发性高脂血症、混合型高脂血症、心血管疾病、残留心血管风险、预防动脉粥样硬化斑块形成/进展、微血管疾病、大血管疾病、动脉粥样硬化、冠状动脉粥样硬化、舒张功能障碍、降低心血管风险、预防严重冠状动脉事件、预防严重不良心血管事件、预防缺血事件、二级/一级预防心血管事件、预防心血管性死亡、心肌梗塞、卒中、心绞痛、恢复正常内皮功能、糖尿病(diabetes)、糖尿病(diabetes mellitus)、胰岛素抵抗、高胰岛素血症、高血糖症、血糖代谢障碍、诱导血糖控制、葡萄糖耐量受损，以及空腹葡萄糖受损。微血管疾病的非限制性示例包括视网膜病、肾病和神经病。大血管疾病的非限制性示例包括卒中、外周血管疾病、肢体缺血和心脏病。在一些实施方案中，受试者患有非酒精性肝病、胆汁淤积性肝病、肾病或代谢综合征。心血管疾病的任何前述示例还可以指心血管代谢疾病的非限制性示例。
在一个实施方案中，本公开提供了治疗和/或预防受试者的心血管疾病的方法，该方法包括向受试者施用15-HEPE。
在一个实施方案中，本公开提供了治疗和/或预防受试者的心血管疾病的方法，该方法包括向受试者施用15-HEPE或包含15-HEPE的组合物。
在另一个实施方案中，本公开提供了预防患有糖尿病(例如I型或II型)的受试者的血液系统异常的方法，该方法包括向受试者施用15-HEPE。在一些实施方案中，该方法还包括在施用15-HEPE之前确定受试者患有糖尿病。在另一个实施方案中，该方法包括向受试者施用约10mg每kg受试者体重(mg/kg)、约50mg/kg、约250mg/kg或约500mg/kg的15-HEPE。在又一个实施方案中，15-HEPE按重量计占该组合物中所有脂肪酸的至少约90％。
在另一个实施方案中，本公开提供了预防患有糖尿病(例如I型或II型)的受试者的血液系统异常的方法，该方法包括向受试者施用15-HEPE或包含15-HEPE的组合物。在一些实施方案中，该方法还包括在施用15-HEPE或包含15-HEPE的组合物之前确定受试者患有糖尿病。在另一个实施方案中，该方法包括向受试者施用约10mg每kg受试者体重(mg/kg)、约50mg/kg、约250mg/kg或约500mg/kg的15-HEPE或包含15-HEPE的组合物。在又一个实施方案中，15-HEPE按重量计占该组合物中所有脂肪酸的至少约90％。
在另一个实施方案中，本公开提供了治疗和/或预防患有心血管疾病的受试者的血液系统异常的方法，该方法包括向受试者施用15-HEPE。在一些实施方案中，该方法还包括在施用15-HEPE之前确定受试者患有心血管疾病。在另一个实施方案中，该方法包括向受试者施用约10mg每kg受试者体重(mg/kg)、约50mg/kg、约250mg/kg或约500mg/kg的15-HEPE。在又一个实施方案中，15-HEPE按重量计占该组合物中所有脂肪酸的至少约90％。
在另一个实施方案中，本公开提供了治疗和/或预防患有心血管疾病的受试者的血液系统异常的方法，该方法包括向受试者施用15-HEPE或包含15-HEPE的组合物。在一些实施方案中，该方法还包括在施用15-HEPE或包含15-HEPE的组合物之前确定受试者患有心血管疾病。在另一个实施方案中，该方法包括向受试者施用约10mg每kg受试者体重(mg/kg)、约50mg/kg、约250mg/kg或约500mg/kg的15-HEPE或包含15-HEPE的组合物。在又一个实施方案中，15-HEPE按重量计占该组合物中所有脂肪酸的至少约90％。
在另一个实施方案中，本公开提供了治疗和/或预防具有高血压的受试者的血液系统异常的方法，该方法包括向受试者施用15-HEPE。在一些实施方案中，该方法还包括在施用15-HEPE之前确定受试者具有高血压。在一些实施方案中，受试者具有至少约130mmHg、至少约135mmHg、至少约140mmHg、至少约145mmHg、至少约150mmHg、至少约155mmHg、至少约160mmHg、至少约165mmHg或至少约170mmHg的高血压。在另一个实施方案中，该方法包括向受试者施用约10mg/kg、约50mg/kg、约250mg/kg或约500mg/kg 15-HEPE。在又一个实施方案中，15-HEPE按重量计占该组合物中所有脂肪酸的至少约90％。
在另一个实施方案中，本公开提供了治疗和/或预防具有高血压的受试者的血液系统异常的方法，该方法包括向受试者施用15-HEPE或包含15-HEPE的组合物。在一些实施方案中，该方法还包括在施用15-HEPE或包含15-HEPE的组合物之前确定受试者具有高血压。在一些实施方案中，受试者具有至少约130mmHg、至少约135mmHg、至少约140mmHg、至少约145mmHg、至少约150mmHg、至少约155mmHg、至少约160mmHg、至少约165mmHg或至少约170mmHg的高血压。在另一个实施方案中，该方法包括向受试者施用约10mg/kg、约50mg/kg、约250mg/kg或约500mg/kg15-HEPE或包含15-HEPE的组合物。在又一个实施方案中，15-HEPE按重量计占该组合物中所有脂肪酸的至少约90％。
本文所公开的组合物和制剂还可以用于减少患有心血管疾病和/或血液系统疾病的受试者的细胞因子和/或趋化因子。非限制性细胞因子和/或趋化因子包括α-平滑肌作用(α-SMA)、金属肽酶抑制因子-1(TIMP-1)、转化生长因子-β(TGF-β)和1型胶原蛋白。
在另一个实施方案中，在用本发明的组合物治疗后，受试者或受试者组表现出一种或多种以下结果：
(a)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，血清转氨酶(ALT)水平和/或天冬氨酸转氨酶(AST)水平未升高，或出现降低；
(b)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，胆红素(BUN)水平未升高，或出现降低；
(c)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，纤维化面积未增大，或出现减小；
(d)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，空腹葡萄糖水平未升高，或出现降低；
(e)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，胰岛素水平未升高，或出现降低；
(f)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，碱性磷酸酶(ALP)水平未升高，或出现降低；
(g)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，血红蛋白A1C(HbA1C)水平未升高，或出现降低；
(h)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，稳态模型评估胰岛素抵抗(HOMA-IR)水平未增大，或出现减小；
(i)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，脂肪组织胰岛素抵抗(adipo-IR)水平未升高，或出现降低；
(j)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，总胆固醇水平未升高，或出现降低；
(k)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，甘油三酯水平未升高，或出现降低；
(l)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，甘油二酯水平未升高，或出现降低；
(m)相对于基线、安慰剂对照和/或未处理的患者，极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)水平未升高，或出现降低；
(n)相对于基线、安慰剂对照和/或未处理的患者，残粒样颗粒胆固醇(RLP-C)水平未升高，或出现降低；
(o)相对于基线、安慰剂对照和/或未处理的患者，非高密度脂蛋白胆固醇(非HDL-C)水平未升高，或出现降低；
(p)相对于基线、安慰剂对照和/或未处理的患者，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平未降低，或出现升高；
(q)相对于基线、安慰剂对照和/或未处理的患者，低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平未升高，或出现降低；
(r)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，肾羟脯氨酸水平未升高，或出现降低；
(s)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，白介素-33(IL-33)水平未升高，或出现降低；
(t)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，白介素-17(IL-17)水平未升高，或出现降低；
(u)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，芳香烃受体(AhR)水平未升高，或出现降低；
(v)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，TNF样配体1A(TL1A)水平未升高，或出现降低；
(w)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，肿瘤坏死因子(TNF-α)水平未升高，或出现降低；
(x)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，白介素-13(IL-13)水平未升高，或出现降低；
(y)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，白介素-6(IL-6)水平未升高，或出现降低；
(z)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，白介素-1β(IL-1β)水平未升高，或出现降低；
(aa)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，1型胶原蛋白水平未升高，或出现降低；
(bb)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，转化生长因子-β(TGF-β)水平未升高，或出现降低；
(cc)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，α-平滑肌作用(α-SMA)水平未升高，或出现降低；
(dd)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，肿瘤坏死因子配体超家族成员11A(TNRSF11A)水平未升高，或出现降低；
(ee)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，丝氨酸蛋白酶2(PRSS2)水平未升高，或出现降低；
(ff)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，含铜胺氧化酶3(AOC3)水平未升高，或出现降低；
(gg)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，白细胞免疫球蛋白样受体B1(LILBR1)水平未升高，或出现降低；
(hh)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，转铁蛋白受体蛋白1(TR)水平未升高，或出现降低；
(ii)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，Elafin(PI3)水平未升高，或出现降低；
(jj)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，血清淀粉样蛋白A4(SAA4)水平未升高，或出现降低；
(kk)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)水平未升高，或出现降低；
(ll)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，趋化因子(C-C基序)配体16(CCL16)水平未升高，或出现降低；
(mm)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，TREM样转录物2(TLT2)水平未升高，或出现降低；
(nn)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，二肽基肽酶4(DPP4)水平未升高，或出现降低；以及
(oo)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，金属蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)水平未升高，或出现降低；
(pp)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，纤溶酶原激活物抑制因子-1(PAI-1)水平未升高，或出现降低；
(qq)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，NAFLD评分(NFS)未升高，或出现降低；以及
(rr)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，纤维化-4(FIB-4)水平未升高，或出现降低；
(ss)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，肝硬度水平未升高，或出现降低；
(tt)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，肝脂肪含量未升高，或出现降低；
(uu)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，甘油磷脂水平未降低，或出现升高；
(vv)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，血压未升高，或出现降低；
(ww)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，肝纤维化增强(ELF)评分未升高，或出现降低；
(xx)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，肺成纤维细胞和/或皮肤成纤维细胞中的胶原蛋白产量未增加，或出现减少；
(yy)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，葡萄糖摄取量未减少，或出现增加；
(zz)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，肺成纤维细胞和/或皮肤成纤维细胞的活力增加；
(ab)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，白介素-8(IL-8)水平未改变，或出现降低；
(ac)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，白介素-23(IL-23)水平未改变，或出现降低；
(ad)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，白介素-11(IL-11)水平未改变，或出现降低；以及/或者
(ae)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，干扰素γ(IFNγ)水平未改变，或出现降低；
(af)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，T和/或B细胞活化未改变，或出现降低；
(ag)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，趋化性未改变，或出现降低；
(ah)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，磷酸化B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)家族成员未改变，或出现减少；
(ai)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，胱天蛋白酶活化片段水平未改变，或出现降低；
(aj)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，经切割聚(ADP-核糖)聚合酶-1(PARP-1)水平未改变，或出现降低；
(ak)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，腰围未改变，或出现减小；
(al)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，AST与血小板比值指数(ARPI)未改变，或出现减小；
(am)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，肝脏炎症和纤维化(LIF)评分未改变，或出现降低；
(an)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，Lok评分未改变，或出现降低；
(ao)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，纤维化评分未改变，或出现降低；
(ap)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，King评分未改变，或出现降低；
(aq)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，Bonacini评分未改变，或出现降低；
(ar)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，瞬时弹性成像(TE)评分未改变，或出现降低。
(as)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，血管粘附分子未增加，或出现减少；
(at)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，心血管风险蛋白未增加，或出现减少；
(au)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，趋化因子未增加，或出现减少；
(av)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，肿瘤坏死因子受体超家族成员未增加，或出现减少；
(aw)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，红细胞计数未改变，或出现增加；
(ax)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，白细胞计数未改变，或出现增加；
(ay)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，血小板计数未改变，或出现增加；
(az)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，凝血酶原时间未改变，或出现增加；
(ba)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，活化部分凝血活酶时间未改变，或出现增加；
(bc)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，血红蛋白产量未改变，或出现增加；
(bd)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，血红蛋白四聚体的β珠蛋白链的合成未改变，或出现增加；
(be)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，红细胞溶血未改变，或出现减少；
(bf)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，呼吸短促未改变，或出现减少；
(bg)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，心率未改变，或出现降低；
(bh)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，脾脏大小未改变，或出现减小；
(bi)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，肝脏大小未改变，或出现减小；
(bj)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，指炎未改变，或出现减轻；
(bk)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，疼痛危象未改变，或出现减少；
(bl)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，异常血凝块形成未改变，或出现减少；
(bm)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，红细胞分布宽度未改变，或出现减小；
(bn)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，网织红细胞计数未改变，或出现减少；以及/或者
(bo)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，纤维蛋白原浓度未改变，或出现降低。
在一个实施方案中，本发明的方法包括在对受试者或受试者组给药之前测量(a)至(bo)中所阐述的一种或多种标记物或参数的基线水平。在另一个实施方案中，这些方法包括在测定(a)至(bo)中所阐述的一种或多种标记物或参数的基线水平之后，将本文所公开的组合物施用于受试者，随后对所述一种或多种标记物进行附加测量。
在另一个实施方案中，受试者或受试者组在用本发明的组合物治疗后(例如，在约1周至约12周、约1周至约8周或者约1周至约4周的一段时间内)表现出上文刚描述过的结果(a)至(bo)中的任何5项或更多项、任何10项或更多项、任何15项或更多项、任何20项或更多项、任何25项或更多项、任何30项或更多项、任何35项或更多项、任何40项或更多项、任何45项或更多项、任何50项或更多项、任何55项或更多项、任何60项或更多项、任何65项或更多项、任何70项或更多项、任何75项或更多项、任何80项或更多项、任何85项或更多项、任何90项或更多项，或者全部91项。
在另一个实施方案中，在用本发明的组合物治疗后，受试者或受试者组表现出一种或多种以下结果：
(a)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，血清ALT和/或AST水平未升高，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％；
(b)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，BUN水平未升高，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％：
(c)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，纤维化面积未增大，或减小至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％：
(d)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，空腹葡萄糖水平未升高，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％：
(e)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，胰岛素未升高，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％；
(f)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，ALP水平未升高，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％；
(g)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，HB1Ac水平未升高，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％：
(h)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，HOMA-IR水平未升高，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％：
(i)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，adipo-IR水平未升高，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％：
(j)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，总胆固醇水平未升高，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％；
(k)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，甘油三酯水平未升高，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％；
(l)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，甘油二酯水平未升高，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％：
(m)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，VLDL-C水平未升高，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％：
(n)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，RLP-C水平未升高，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％：
(o)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，非HDL-C水平未升高，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％；
(p)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，HDL-C水平未降低，或升高至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％；
(q)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，LDL-C水平未升高，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％：
(r)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，肾羟脯氨酸水平未升高，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％：
(s)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，IL-33水平未升高，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％：
(t)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，IL-17水平未升高，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％；
(u)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，AhR水平未升高，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％；
(v)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，TL1A水平未升高，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％：
(w)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，TNF-α水平未升高，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％：
(x)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，IL-13水平未升高，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％：
(y)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，IL-6水平未升高，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％；
(z)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，IL-1β水平未升高，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％；
(aa)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，1型胶原蛋白水平未升高，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％：
(bb)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，TGF-β水平未升高，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％：
(cc)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，α-SMA未升高，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％；
(dd)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，TNRSF11A未升高，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％；
(ee)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，PRSS2水平未升高，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％。
(ff)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，AOC3水平未升高，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％：
(gg)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，LILBR1水平未升高，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％：
(hh)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，TR水平未升高，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％；
(ii)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，PI3未升高，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％；
(jj)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，SAA4水平未升高，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％；
(kk)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，MCP-1水平未升高，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％：
(ll)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，CCL16水平未升高，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％：
(mm)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，TLT2水平未升高，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％：
(nn)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，DPP4水平未升高，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％；
(oo)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，TIMP-1水平未升高，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％；
(pp)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，PAI-1水平未升高，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％：
(qq)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，NFS未升高，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％；
(rr)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，FIB-4水平未升高，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％：
(ss)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，肝硬度未升高，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％；
(tt)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，肝脂肪含量未升高，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％；
(uu)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，甘油磷脂水平未降低，或升高至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％：
(vv)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，血压未升高，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％；
(ww)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，ELF评分未升高，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％：
(zz)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，肺成纤维细胞和/或皮肤成纤维细胞中的胶原蛋白产量评分未升高，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％；
(yy)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，葡萄糖摄取量未减少，或增加至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％：
(zz)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，肺成纤维细胞和/或皮肤成纤维细胞的活力增加至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％；
(ab)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，IL-8水平评分未改变，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％；
(ac)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，IL-23水平未改变，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％的水平；以及/或者
(ad)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，IL-11水平评分未改变，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％；
(ae)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，IFNγ水平未改变，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％：
(af)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，T和/或B细胞活化未改变，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％；
(ag)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，趋化性未改变，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％；
(ah)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，Bcl-2家族成员未改变，或减少至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％；
(ai)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，胱天蛋白酶活化片段水平未改变，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％；
(aj)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，经切割PARP-1水平未改变，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％；
(ak)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，腰围未改变，或减小至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％；
(al)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，ARPI未改变，或减小至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％；
(am)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，LIF评分未改变，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％；
(an)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，Lok评分未改变，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％；
(ao)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，纤维化评分未改变，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％：
(ap)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，King评分未改变，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％；
(aq)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，Bonacini评分未改变，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％；以及/或者
(ar)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，TE评分未改变，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％。
(as)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，血管粘附分子增加至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％；
(at)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，心血管风险蛋白增加至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％；
(au)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，趋化因子增加至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％；以及
(av)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，肿瘤坏死因子受体超家族成员增加至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％；
(aw)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，红细胞计数未改变，或增加至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％；
(ax)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，白细胞计数未改变，或增加至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％；
(ay)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，血小板计数未改变，或增加至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％：
(az)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，凝血酶原时间未改变，或增加至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％；
(ba)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，活化部分凝血活酶时间未改变，或增加至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％；
(bc)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，血红蛋白产量未改变，或增加至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％；
(bd)相对于基线、安慰剂对照和/或未处理的患者，血红蛋白四聚体的β珠蛋白链的合成未改变，或增加至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％；
(be)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，红细胞溶血未改变，或减少至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％：
(bf)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，呼吸短促未改变，或减少至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％；
(bg)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，心率未改变，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％；
(bh)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，脾脏大小未改变，或减小至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％；
(bi)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，肝脏大小未改变，或减小至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％；
(bj)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，指炎未改变，或减轻至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％；
(bk)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，疼痛危象未改变，或减少至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％；
(bl)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，异常血凝块形成未改变，或减少至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％；
(bm)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，红细胞分布未改变，或减少至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％；
(bn)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，网织红细胞计数未改变，或减少至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％；以及/或者
(bo)相对于基线、安慰剂对照和/或未治疗的患者，纤维蛋白原浓度未改变，或降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％。
在没有进一步描述的情况下，相信本领域普通技术人员可以使用前述描述和以下说明性实施例来制备和利用本公开的药剂并实施受权利要求书保护的方法。提供以下工作实施例以促进本公开的实践，并且这些工作实施例不应被解释为以任何方式限制本公开的其余部分。
实施例
实施例1：单侧输尿管梗阻引起的肾间质纤维化
本研究的目的是检查DS109(15-HETrE)和DS102(15-HEPE)对UUO引起的肾间质纤维化的作用。
图1描绘了从手术和治疗到研究第14天的研究设计。
1.1材料和方法
试验物质：本研究的试验物质为DS109(15-HETrE)和DS102(15-HEPE)。为了制备每种物质的给药溶液，首先将DS109称重，然后溶解在0.5％羟丙基甲基纤维素(HPMC)的媒剂中，并将DS102稀释在0.5％HPMC的媒剂中。
UUO手术：在研究的第0天，在戊巴比妥钠麻醉下对小鼠进行UUO手术。首先剃除小鼠毛发，然后切开腹部，将小鼠的左侧输尿管从腹中取出。用4-0尼龙缝线在两点对输尿管进行结扎。然后用缝线缝合小鼠的腹膜和皮肤，将小鼠转移到干净的笼子中，直到从麻醉中恢复。做过假手术的小鼠暴露左侧输尿管，但该侧输尿管未结扎。
药物施用：将DS109和DS102以10毫升(mL)/千克(Kg)的量让小鼠口服。
治疗剂量：DS109以5、50和250毫克(mg)/Kg的3个剂量水平从研究的第0天至第13天每天施用一次。DS102以50mg/kg和500mg/kg的2个剂量水平从研究的第0天至第13天每天施用一次。
动物：7周龄雌性C57BL/6小鼠(即动物)获自日本SLC，Inc.(Japan)，在受控条件下圈养并喂食正常饮食(CE-2；CLEA Japan，Japan)。将动物饲养在无特定病原体(SPF)设施中，该设施保持以下受控条件：温度(例如，23℃±2℃)，湿度(例如，45％±10％)，光照(例如，12小时光照/12小时黑暗的人工周期；光照时间为8:00至20:00)，有空气交换。在实验室中保持高压，以防止设施被污染。将动物圈养在TPX笼(CLEA Japan)中，每笼最多4只小鼠。用无菌Paper-Clean(Japan SLC)做垫材，每周更换一次。让小鼠自由采食无菌固体普通饮食，饮食置于笼子顶部的金属盖中。还让小鼠从配备有橡胶塞和吸管的水瓶饮水器中自由饮用纯水。水瓶饮水器每周换一次，清洁后在高压灭菌器中灭菌，然后重复使用。用耳打孔器来标识小鼠，并用特定的识别代码来标记每个笼子。
测量肾生化：为了量化肾羟脯氨酸含量，通过如下的碱性-酸性水解方法处理冷冻的左肾样本：在65℃下将肾样本溶解于2当量(N)氢氧化钠(NaOH)中，然后在121℃下高压灭菌20分钟。将裂解的样本(400μL)用400μL 6N盐酸(HCl)在121℃下酸水解20分钟，再用400μL含有10mg/mL活性炭的4N NaOH中和。向样本中添加AC缓冲液(例如，2.2M乙酸/0.48M柠檬酸，400μL)，之后离心收集上清液。用反式-4-羟基-L-脯氨酸(Sigma-Aldrich，USA)的连续稀释液从16μg/mL开始构建羟脯氨酸的标准曲线。将制备的样本和标准品(例如，各400μL)与400μL氯胺T溶液(Wako Pure Chemical Industries，Japan)混合，在室温下孵育25分钟。然后将样本与Ehrlich溶液(例如，400μL)混合，在65℃下加热20分钟以显色。样本在冰上冷却并离心除去沉淀后，在560纳米(nm)处测量每种上清液的光密度。根据羟脯氨酸标准曲线来计算羟脯氨酸的浓度。使用二辛可宁酸(BCA)蛋白质测定试剂盒(Thermo FisherScientific，USA)测定肾样本的蛋白质浓度，使用这些蛋白质浓度来将计算的羟脯氨酸值归一化。肾羟脯氨酸含量表示为微克(μg)/mg蛋白质。
组织病理学分析：为了显现胶原蛋白沉积，使用picro天狼星红溶液(Waldeck，Germany)将肾切片染色。为了量化间质纤维化面积，使用数码相机(例如，DFC295；LeicaMicrosystems，Germany)以200倍放大率捕获皮髓质区的亮视场图像，然后使用ImageJ软件(National Institute of Health，USA)测量每个切片5个视野中的阳性面积。
定量RT-PCR：根据制造商的说明书，使用RNAiso(Takara Bio，Japan)从肾样本中提取总核糖核酸(RNA)。使用含有4.4微摩尔(mM)氯化镁(MgCl2)(F.Hoffmann-La Roche，Switzerland)、40U RNA酶抑制剂(Toyobo，Japan)、0.5mM dNTP(Promega，USA)、6.28μM随机六聚体(Promega)、5×第一链缓冲液(Promega)、10mM二硫苏糖醇(Invitrogen，USA)和200UMMLV-RT(Invitrogen)且最终体积为20μL的反应混合物，对1μg RNA进行逆转录。反应在37℃下进行1小时，之后在99℃下进行5分钟。使用实时PCR DICE和TB GreenTMPremix ExTaqTMII(Takara Bio)进行实时PCR。为了计算相对微RNA(mRNA)表达水平，将每种基因(例如α-SMA、TIMP-1、TGF-β和1型胶原蛋白)的表达相对于参照基因36B4(基因符号：Rplp0)的表达归一化。关于PCR引物组和板布局的信息描述于表1和表2中。
表1：用于定量RT-PCR测量的PCR引物
Figure BDA0003977255610000571
表2：关于定量RT-PCR测量的PCR板的详情
Figure BDA0003977255610000572
样本采集：对于血清样本，通过直接心脏穿刺在不含抗凝剂的血清分离管中采集非空腹血液，并在4℃下以3，500×g离心4分钟。采集上清液，储存在-80℃以便运输。对于肾样本，采集左肾并沿水平方向切成2片。将左肾上部固定在Bouin氏液中，然后包埋在石蜡中。石蜡块在室温下储存，用于组织学分析。将左肾下部沿冠状面切成2片。将左肾前部置于液氮中速冻，并储存在-80℃用于基因表达测定。将左肾后部置于液氮中速冻，并储存在-80℃用于肾生化分析。
统计学检验：在GraphPad Prism 6(GraphPad Software Inc.，USA)上使用Bonferroni多重比较检验进行统计学分析。P值＜0.05被认为具有统计学显著性。当单尾t检验返回P值＜0.1时，认为有趋势。结果表示为平均值±SD。
1.2实验设计和治疗
研究设计包括以下研究组：
·第1组(假手术对照)：八只做过假手术的小鼠保持无任何处理，直到处死。
·第2组(媒剂)：从第0天至第13天每天一次让八只UUO小鼠口服体积为10mL/kg的媒剂[0.5％HPMC]。
·第3组(DS109低)：从第0天至第13天每天一次让八只UUO小鼠口服补充有5mg/kg剂量的DS109的媒剂。
·第4组(DS109中)：从第0天至第13天每天一次让八只UUO小鼠口服补充有50mg/kg剂量的DS109的媒剂。
·第5组(DS109高)：从第0天至第13天每天一次让八只UUO小鼠口服补充有250mg/kg剂量的DS109的媒剂。
·第6组(DS102低)：从第0天至第13天每天一次让八只UUO小鼠口服补充有50mg/kg剂量的DS102的媒剂。
·第7组(DS102高)：从第0天至第13天每天一次让八只UUO小鼠口服补充有500mg/kg剂量的DS102的媒剂。
表3汇总了研究期间第1组至第7组中每一组的治疗时间表。
表3：治疗时间表汇总
Figure BDA0003977255610000591
动物监测和处死：每天监测小鼠的活力、临床体征和行为。治疗期间，每天在治疗前测量个体的体重。每次施用后约60分钟观察小鼠中毒、濒死和死亡的显著临床体征。第14天，在异氟烷麻醉(Pfizer Inc.)下通过直接心脏穿刺放血将动物处死。
1.3结果
体重变化和一般考虑：图2示出了所有动物的体重变化。所有动物术后体重均下降，治疗期间体重逐渐恢复。从第2天到第5天和从第10天到第11天，媒剂组的平均体重显著低于假手术对照组。媒剂组与治疗组之间在治疗期间的任一天平均体重均没有显著变化。治疗期间所有组均无动物死亡。在本研究中，没有动物表现出一般状况恶化。
处死当天的体重和肾重量：图3和表4示出了处死当天动物的体重。在处死当天，假手术对照组与媒剂组之间不存在平均体重的显著差异。在处死当天，媒剂组与治疗组之间不存在平均体重的显著差异。
表4：处死当天的体重
Figure BDA0003977255610000601
图4A至图4D和表4示出了处死当天动物的肾重量和肾重量/体重比。与假手术对照组相比，媒剂组示出平均右肾重量显著增加。然而，媒剂组与治疗组之间不存在平均右肾重量的显著差异。与假手术对照组相比，媒剂组还示出平均右肾重量/体重比显著增加。媒剂组与治疗组之间不存在平均右肾重量/体重比的显著差异。与假手术对照组相比，媒剂组还示出平均左肾重量显著增加。媒剂组与治疗组之间不存在平均左肾重量的显著差异。最后，与假手术对照组相比，媒剂组还示出平均左肾重量/体重比显著增加，但是媒剂组与治疗组之间不存在平均左肾重量/体重比的显著差异。
肾化学：图5和表5示出了动物的肾羟脯氨酸含量。与假手术对照组相比，媒剂组示出肾羟脯氨酸含量显著增加。与媒剂组相比，“DS109低”组、“DS109高”组、“DS102低”组和“DS102高”组示出肾羟脯氨酸含量显著降低。媒剂组与“DS109中”组之间不存在肾羟脯氨酸含量的显著差异。
表5：肾羟脯氨酸含量
组 肾羟脯氨酸(μg/mg总蛋白)
假手术对照，(n＝8) 3.02±1.89
媒剂，(n＝8) 16.67±7.83
DS109低，(n＝8) 9.94±2.02
DS109中，(n＝8) 13.94±6.44
DS109高，(n＝8) 8.30±1.04
DS102低，(n＝8) 8.47±2.08
DS102高，(n＝8) 8.59±1.99
组织学分析：图6A至图6G和表6示出了天狼星红染色，而图7示出了动物的纤维化面积。图6A显示天狼星红染色的肾切片的代表性显微照片。与假手术对照组相比，媒剂组示出纤维化面积(天狼星红阳性面积)百分比显著增加。Bonferroni多重比较揭示，与媒剂组相比，“DS109中”组的纤维化面积倾向于减小。媒剂组与其他治疗组之间不存在纤维化面积的显著差异。由于存在显著离群值，进行了Mann-Whitney U检验，结果揭示“DS109低”组、“DS109中”组、“DS109高”组、“DS102低”组和“DS102高”组的纤维化面积与媒剂组相比倾向于减小(p＜0.1)。
表6：动物的纤维化面积
组 天狼星红阳性面积(％) 天狼星红阳性面积(％)中值
假手术对照，(n＝8) 0.63±0.22 0.51±0.15
媒剂，(n＝8) 5.00±1.37 4.55±0.94
DS109低，(n＝8) 4.23±1.90 3.22±1.47
DS109中，(n＝8) 3.58±1.04 3.28±1.41
DS109高，(n＝8) 4.71±0.96 3.76±0.81
DS102低，(n＝8) 5.01±3.11 4.19±3.33
DS102高，(n＝8) 4.01±1.92 3.08±1.16
基因表达分析：α-SMA、TIMP-1、TGF-β、1型胶原蛋白的基因表达分析示于图8A至图8D和表7中。
表7：基因表达分析
组 α-SMA TIMP-1 TGF-β 1型胶原蛋白
假手术对照，(n＝8) 1.00±0.18 1.00±0.14 1.00±0.09 1.00±0.13
媒剂，(n＝8) 3.82±0.58 133.20±26.86 3.88±0.30 11.52±2.15
DS109低，(n＝8) 3.87±0.82 153.60±37.12 4.29±0.93 10.76±1.45
DS109中，(n＝8) 4.61±3.15 167.70±122.60 6.01±4.77 15.23±11.52
DS109高，(n＝8) 4.85±1.22 180.90±23.12 5.48±0.36 13.88±1.91
DS102低，(n＝8) 3.74±0.81 138.30±30.39 4.31±0.69 11.80±1.78
DS102高，(n＝8) 5.54±1.54 124.80±28.60 5.37±0.76 14.09±2.88
α-SMA：与假手术对照组相比，媒剂组示出α-SMA mRNA表达水平显著增加。媒剂组与治疗组之间不存在α-SMA mRNA表达水平的显著差异。
TIMP-1：与假手术对照组相比，媒剂组示出TIMP-1 mRNA表达水平显著增加。媒剂组与治疗组之间不存在TIMP-1 mRNA表达水平的显著差异。
TGF-β：与假手术对照组相比，媒剂组示出TGF-βmRNA表达水平显著增加。媒剂组与治疗组之间不存在TGF-βmRNA表达水平的显著差异。
1型胶原蛋白：与假手术对照组相比，媒剂组示出1型胶原蛋白mRNA表达水平显著增加。媒剂组与治疗组之间不存在1型胶原蛋白mRNA表达水平的显著差异。
1.4总结
如天狼星红染色和肾羟脯氨酸含量所示，本研究在媒剂组中建立了肾纤维化。
DS109：与媒剂组相比，用低剂量的DS109治疗示出肾羟脯氨酸含量显著降低(p＜0.05)和纤维化面积减小趋势(p＜0.1)。与媒剂组相比，用中等剂量的DS109治疗示出纤维化面积减小趋势(p＜0.1)。最后，与媒剂组相比，用高剂量的DS109治疗示出肾羟脯氨酸含量显著降低(p＜0.05)和纤维化面积减小趋势(p＜0.1)。
DS102：与媒剂组相比，用低剂量的DS102治疗示出肾羟脯氨酸含量显著降低(p＜0.05)和纤维化面积减小趋势(p＜0.1)。与媒剂组相比，用高剂量的DS102治疗示出肾羟脯氨酸含量显著降低(p＜0.05)和纤维化面积减小趋势(p＜0.1)。
总之，本研究的结果表明DS109和DS102对肾纤维形成具有抑制作用，并且具有作为发展成纤维化的慢性肾病的治疗剂的潜力。
实施例2：胆汁淤积性肝病和/或肝纤维化胆管结扎(BDL)研究
本研究的目的是检查DS012对BDL引起的胆汁淤积的作用。
图9描绘了从手术和治疗到研究第14天的研究设计。
1.1材料和方法
试验物质：本研究的试验物质为DS102。为了制备每种物质的给药溶液，将DS102在0.5％羟丙基甲基纤维素(HPMC)媒剂中稀释。
BDL手术：在研究的第0天，在戊巴比妥(Kyoritsu Seiyaku，Japan)麻醉下进行BDL手术。首先剃除小鼠毛发，切开腹腔，用7-0手术丝结扎胆总管两次。用缝线缝合小鼠的腹膜和皮肤，将小鼠转移到干净的笼子(例如，休息笼)中，直到从麻醉中恢复。做过假手术的小鼠暴露胆总管，但胆总管未结扎。
药物施用：将DS102以10毫升(mL)/千克(Kg)的量让小鼠口服。
治疗剂量：DS102以50、250和500毫克(mg)/Kg的3个剂量水平从研究的第0天至第13天每天施用一次。
动物：无病原体的6周龄雄性C57BL/6J小鼠获自日本SLC，Inc.(Japan)。将动物饲养在无特定病原体(SPF)设施中，该设施保持以下受控条件：温度(例如，23℃±2℃)，湿度(例如，45％±10％)，光照(例如，12小时光照/12小时黑暗的人工周期；光照时间为8:00至20:00)，有空气交换。在实验室中保持高压，以防止设施被污染。将动物圈养在TPX笼(CLEAJapan)中，每笼最多4只小鼠。用无菌Paper-Clean(Japan SLC)做垫材，每周更换一次。让小鼠自由采食无菌固体普通饮食，饮食置于笼子顶部的金属盖中。还让小鼠从配备有橡胶塞和吸管的水瓶饮水器中自由饮用纯水。水瓶饮水器每周换一次，清洁后在高压灭菌器中灭菌，然后重复使用。用耳打孔器来标识小鼠，并用特定的识别代码来标记每个笼子。
血清生化测量：为了显现胶原蛋白沉积，使用picro天狼星红溶液(Waldeck，Germany)将Bouin氏固定的肝切片染色。为了定量分析纤维化面积，使用数码相机(DFC295；Leica，Germany)以100倍放大率捕获天狼星红染色切片的亮视场图像，然后使用ImageJ软件(National Institute of Health，USA)测量每个切片5个视野中的阳性面积。
组织学分析：为了显现胶原蛋白沉积，使用picro-Sirius红色溶液(Waldeck，Germany)将肾切片染色。为了量化间质纤维化面积，使用数码相机(例如，DFC295；LeicaMicrosystems，Germany)以200倍放大率捕获皮髓质区的亮视场图像，然后使用ImageJ软件(National Institute of Health，USA)测量每个切片5个视野中的阳性面积。
定量RT-PCR：根据制造商的说明书，使用RNAiso(Takara Bio，Japan)从肝样本中提取总核糖核酸(RNA)。使用含有4.4mM氯化镁(MgCl2)(F.Hoffmann-La Roche，Switzerland)、40U RNA酶抑制剂(Toyobo，Japan)、0.5mM dNTP(Promega，USA)、6.28μM随机六聚体(Promega)、5×第一链缓冲液(Promega)、10mM二硫苏糖醇(Invitrogen，USA)和200UMMLV-RT(Invitrogen)且最终体积为20μL的反应混合物，对1μg RNA进行逆转录。反应在37℃下进行1小时，之后在99℃下进行5分钟。使用实时PCR DICE和TB GreenTMPremix ExTaqTMII(Takara Bio)进行实时PCR。为了计算相对mRNA表达水平，将每种基因(α-SMA、TIMP-1、TGF-β和1型胶原蛋白)的表达相对于参照基因36B4(基因符号：Rplp0)的表达归一化。关于PCR引物组和板布局的信息描述于表8和表9中。
表8：用于定量RT-PCR测量的PCR引物
Figure BDA0003977255610000641
表9：关于定量RT-PCR测量的PCR板的详情
Figure BDA0003977255610000651
样本采集：对于血清样本，通过直接心脏穿刺在不含抗凝剂的血清分离管中采集非空腹血液，并在4℃下以3,500×g离心4分钟。采集上清液，储存在δ-80℃以便进行生化分析(30μL)和运输(所有剩余量)。对于肝样本，采集左侧叶并切成6片。将两片左侧叶固定在Bouin氏液中，然后包埋在石蜡中。样本在室温下储存，用于组织学分析。将另外两片左侧叶包埋在O.C.T.化合物中，置于液氮中速冻。样本储存在δ-80℃下。将左侧叶的剩余切片置于液氮中速冻，并储存在-80℃用于基因表达分析。将右中叶、左中叶、右叶和尾叶置于液氮中速冻，并储存在-80℃以便运输。
统计学检验：在GraphPad Prism 6(GraphPad Software Inc.，USA)上使用Bonferroni多重比较检验进行统计学分析。P值＜0.05被认为具有统计学显著性。当单尾t检验返回P值＜0.1时，认为有趋势。结果表示为平均值±SD。
1.2实验设计和治疗
研究设计包括以下研究组：
·第1组(假手术对照)：八只做过假手术的小鼠保持无任何处理，直到处死。
·第2组(媒剂)：从第0天至第13天每天一次让十五只做过BDL手术的小鼠口服体积为10mL/kg的媒剂[0.5％HPMC]。
·第3组(DS102低)：从第0天至第13天每天一次让十五只做过BDL手术的小鼠口服补充有50mg/kg剂量的DS102的媒剂。
·第4组(DS102中)：从第0天至第13天每天一次让十五只做过BDL手术的小鼠口服补充有250mg/kg剂量的DS102的媒剂。
·第5组(DS102高)：从第0天至第13天每天一次让十五只做过BDL手术的小鼠口服补充有500mg/kg剂量的DS102的媒剂。
表10汇总了研究期间第1组至第5组中每一组的治疗时间表。
表10：治疗时间表汇总
Figure BDA0003977255610000661
动物监测和处死：每天监测小鼠的活力、临床体征和行为。治疗期间，每天在治疗前测量个体的体重。每次施用后约60分钟观察小鼠中毒、濒死和死亡的显著临床体征。在BDL手术后第14天，在异氟烷麻醉(Pfizer Inc.)下通过直接心脏穿刺放血将动物处死。
1.3结果
体重变化和一般考虑：图10示出了所有动物的体重变化。除假手术对照组外，所有组的平均体重在研究期间均逐渐降低。从第2天到第14天，媒剂组的平均体重显著低于假手术对照组。媒剂组与DS102治疗组之间在研究期间的任一天平均体重均没有显著变化。
在治疗期间，在达到第14天之前发现死亡的小鼠如下：在媒剂组中发现15只小鼠中有3只死亡；在“DS102低”组、“DS102中”组和“DS102高”组中发现15只小鼠中有7只死亡。在该模型中，预期死亡百分比仅仅是由于疾病诱导而产生的，并且观察到的死亡率与历史数据一致。
处死当天的体重和肝重量：图11和表11示出了处死当天动物的体重。与假手术对照组相比，媒剂组在处死当天示出平均体重显著降低。在处死当天，媒剂组与DS102治疗组之间不存在平均体重的显著差异。
表11：处死当天的体重
组 体重(g) 肝重量(mg) 肝重量/体重比(％)
假手术对照，(n＝8) 23.1±0.7 1132±90 4.9±0.4
媒剂，(n＝12) 16.8±1.8 1438±180 8.7±1.4
DS102低，(n＝8) 17.4±2.9 1392±328 8.3±2.3
DS102中，(n＝8) 17.0±2.4 1513±182 9.0±1.2
DS102高，(n＝8) 16.4±1.6 1231±255 7.6±1.5
图12A和图12B以及表11示出了处死当天动物的肝重量和肝重量/体重比。与假手术对照组相比，媒剂组示出平均肝重量显著增加。与媒剂组相比，“DS102高”组的平均肝重量倾向于减小。媒剂组与其他治疗组之间不存在平均肝重量的显著差异。与假手术对照组相比，媒剂组示出平均肝重量/体重比显著增加。与媒剂组相比，“DS102高”组的平均肝重量/体重比倾向于减小。媒剂组与其他治疗组之间不存在平均肝重量/体重比的显著差异。
生化：图13和表12示出了动物的血清转氨酶(ALT)。与假手术对照组相比，媒剂组示出血清ALT水平显著增加。媒剂组与DS102治疗组之间不存在血清ALT水平的显著差异。然而，根据该模型的历史数据，已知ALT水平在没有治疗的第14天降低。因此，这可能会影响检测各组间差异的能力。
表12：生化
组 血清ALT(U/L) 血清总胆红素(mg/dL)
假手术对照，(n＝8) 22±2 0.4±0.1
媒剂，(n＝12) 335±185 24.9±9.6
DS102低，(n＝8) 402±112 26.8±6.9
DS102中，(n＝8) 351±155 23.5±9.8
DS102高，(n＝8) 383±147 26.2±6.1
图14和表12示出了动物的血清总胆红素。与假手术对照组相比，媒剂组示出血清总胆红素水平显著增加。媒剂组与DS102治疗组之间不存在血清总胆红素水平的显著差异。
组织学分析：图15A至图14E和表13示出了天狼星红染色，而图16示出了动物的纤维化面积。图14A显示天狼星红染色的肝切片的代表性显微照片。与假手术对照组相比，媒剂组的肝切片示出肝小叶门静脉区域中的胶原蛋白沉积增加，以及PV-CV或PV-PV桥接纤维化增加。与假手术对照组相比，媒剂组示出纤维化面积(天狼星红阳性面积)显著增加。与媒剂组相比，“DS102中”组示出纤维化面积显著减小。与媒剂组相比，“DS102高”组的纤维化面积倾向于减小。媒剂组与“DS102低”组之间不存在纤维化面积的显著差异。
表13：组织学分析
组 天狼星红阳性面积(％)
假手术对照，(n＝8) 0.46±0.25
媒剂，(n＝12) 1.93±0.67
DS102低，(n＝8) 1.70±0.63
DS102中，(n＝8) 1.06±0.48
DS102高，(n＝8) 1.42±0.60
基因表达分析：α-SMA、TIMP-1、TGF-β和1型胶原蛋白的基因表达分析示于图17A至图17D和表14中。
表14：基因表达分析
组 α-SMA TIMP-1 TGF-β 1型胶原蛋白
假手术对照，(n＝8) 1.00±0.24 1.00±0.82 1.00±0.08 1.00±0.24
媒剂，(n＝12) 2.98±2.16 33.09±13.75 1.65±0.44 4.77±2.53
DS102低，(n＝8) 3.21±1.67 43.82±26.19 1.48±0.48 4.94±2.76
DS102中，(n＝8) 2.66±1.33 30.65±16.80 1.50±0.44 4.21±1.90
DS102高，(n＝8) 1.42±0.75 16.09±10.16 1.00±0.23 2.51±1.39
α-SMA：与假手术对照组相比，媒剂组示出α-SMA mRNA表达水平显著增加。与媒剂组相比，“DS102高”组中的α-SMA mRNA表达水平倾向于降低。媒剂组与DS102治疗组之间不存在α-SMA mRNA表达水平的显著差异。
TIMP-1：与假手术对照组相比，媒剂组示出TIMP-1 mRNA表达水平显著增加。与媒剂组相比，“DS102高”组中的TIMP-1 mRNA表达水平倾向于降低。媒剂组与DS102治疗组之间不存在TIMP-1 mRNA表达水平的显著差异。
TGF-β：与假手术对照组相比，媒剂组示出TGF-βmRNA表达水平显著增加。与媒剂组相比，“DS102高”组示出TGF-βmRNA表达水平显著降低。媒剂组与DS102治疗组之间不存在TGF-βmRNA表达水平的显著差异。
1型胶原蛋白：与假手术对照组相比，媒剂组示出1型胶原蛋白mRNA表达水平显著增加。与媒剂组相比，“DS102高”组中的1型胶原蛋白mRNA表达水平倾向于降低。媒剂组与DS102治疗组之间不存在1型胶原蛋白mRNA表达水平的显著差异。
1.4总结
在本研究中，与假手术对照组相比，媒剂组中的生化参数(例如，ALT和总胆红素)、组织学胶原蛋白沉积(例如，纤维化面积)和基因表达水平(例如，α-SMA、TIMP-1、TGF-β、1型胶原蛋白)显著增加。这些结果表明，在媒剂组中建立了胆汁淤积和肝纤维化。
与媒剂组相比，用中等剂量的DS102治疗示出纤维化面积显著减小(p＜0.05)。与媒剂组相比，用高剂量的DS102治疗示出TGF-βmRNA表达水平显著降低(p＜0.05)，并且纤维化面积、肝重量、肝重量/体重比、α-SMA、TIMP-1和1型胶原蛋白mRNA表达水平的降低趋势接近显著性水平(p＜0.01)。这些结果表明，DS102抑制肝中多种促纤维化细胞因子的产生，对肝纤维化具有抑制作用，并且具有作为胆汁淤积性肝病的治疗剂的潜力。
实施例3：DS102对TGF-β受体、信号传导和诱导的纤维化蛋白的作用
本研究的目的是检查15-HEPE和15-HEPE EE对TGF-β受体表达、TGF-β诱导的细胞内信号传导和促纤维化上皮间质转化蛋白的作用。
1.1材料和方法
细胞毒性试验：在不同的肝(肝癌)细胞系中测试了15-HEPE游离酸和乙酯的细胞毒性，以了解试验系统中的浓度范围。
转录活性：进行启动子(萤光素酶)测定，以测量施用15-HEPE后TGFβ诱导的转录激活。
用蔗糖梯度超速离心和共聚焦显微镜鉴定蔗糖引起的15-HEPE诱导的TGF-β受体微域易位。在37℃下用100μM 15-HEPE和等体积DMSO(二甲亚砜)处理0、1、4和24小时的Mv1Lu细胞(貂肺上皮细胞)的质膜中进行TGF-β受体的蔗糖密度梯度分析，使来自这些经处理细胞的细胞裂解物经受蔗糖密度梯度超速离心。然后使用抗TβR-I(I型TGF-β受体)、抗TβR-II(II型TGF-β受体)、抗TβR-III(III型TGF-β受体、β蛋白聚糖)、抗EGFR(表皮生长因子受体)和抗小窝蛋白-1抗体，通过Western印迹分析来分析蔗糖梯度级分。评估了未处理细胞或用15-HEPE处理的细胞的质膜中的TβR-I、TβR-II、TβR-III、EGFR和小窝蛋白-1的脂筏/小窝和非脂筏微域定位，以确定15-HEPE对TGF-β受体的膜微域定位的作用。
1.2结果
测定了15-HEPE对TGF-β诱导的信号传导和细胞应答的作用。为了测试15-HEPE对TGF-β诱导的信号传导的作用，测试了15-HEPE调节TGF-β刺激的Smad2磷酸化与核易位的活性，这两者都是导致TGF-β诱导的细胞应答的关键信号传导事件。TGF-β的一种重要生物活性是对负责上皮-间质转化(EMT)的基因的转录激活，其中EMT是伤口愈合、组织纤维化和癌症进展中的关键事件。评估了15-HEPE对HepG2细胞和LXR细胞中TGFβ诱导的上皮间质转化相关蛋白(诸如纤连蛋白、PAI-1和N-钙黏着蛋白等)表达的作用。在含有0.1％FBS的DMEM中用递增剂量的15-HEPE阶段II将HepG2细胞(人肝癌细胞系)处理1小时，然后在使用或不使用200皮摩尔(pM)的TGF-β的情况下连续刺激48小时。
15-HEPE直接抑制TGF-β信号传导，如图18A和图18B中所示。具体地讲，图18A示出15-HEPE诱导II型TGF-β受体的降解并阻断TGF-β诱导的上皮间质转化(EMT)(即，促纤维化)蛋白产生。在含有0.1％FBS的DMEM中用递增剂量的15-HEPE阶段II将HepG2细胞(人肝癌细胞系)处理1小时，然后在使用或不使用200皮摩尔(pM)的TGF-β的情况下连续刺激48小时。图18A所示的两个小图片是在相同实验条件下运行的两个单独的实验。来自这些单独实验的结果表明15-HEPE阻断TGF-β诱导的EMT蛋白产生和II型TGF-β受体的诱导降解。图18A还示出了15-HEPE对纤溶酶原激活物抑制因子-1(PA-1)(一种由TGF-β诱导并且与心血管风险增加相关联的蛋白质)的作用。图18B示出了15-HEPE抑制肝星状细胞中由TGF-β刺激的细胞内信号传导(例如，SMAD2/3磷酸化)。图18B中进行的实验包括用介于0δμM至100μM之间的递增浓度的DS102预处理LX2细胞(人肝星状细胞)24小时，之后用TGF-β刺激30分钟。实验结果表明15-HEPE抑制TGF-β刺激。
在37℃下用100μM 15-HEPE和等体积二甲亚砜(DMSO)处理0、1、4和24小时的貂肺上皮细胞(Mv1Lu细胞)的质膜中进行TGF-β受体的15-HEPE蔗糖密度梯度分析，使来自这些经处理细胞的细胞裂解物经受蔗糖密度梯度超速离心。然后使用抗TβR-I(I型TGF-β受体-图18C)、抗TβR-II(II型TGF-β受体-图18D)、抗TβR-III(III型TGF-β受体、β蛋白聚糖-图18E)、抗EGFR(表皮生长因子受体-图18F)和抗小窝蛋白-1抗体(图18G)，通过Western印迹分析来分析蔗糖梯度级分。级分4至5含有脂筏/小窝，而级分7至10是非脂筏级分。用15-HEPE处理没有影响TβR-I蛋白的丰度，但在24小时处理时诱导TβR-I易位至脂筏(图18C)。星号(★)表明与对照和较短的处理持续时间相比，15-HEPE增加了级分中TβR-I的丰度(24小时)(图18C)。15-HEPE从1小时至4小时诱导TβR-II易位并且在24小时处理时进一步诱导降解(图18D)。三角形
Figure BDA0003977255610000711
表明与对照细胞相比，级分中的TβR-II易位并且丰度降低(图18D)。在图18E、图18F和图18G中，15-HEPE没有改变TβR-III、EGFR和小窝蛋白-1的定位和丰度。
1.3总结
因此，总而言之，这些结果表明游离酸或乙酯形式的15-HEPE诱导II型TGF-p受体的易位和降解、阻断TGF-β诱导促纤维化蛋白产生，并且抑制肝星状细胞中TGF-β诱导的细胞内信号传导(SMAD2/3)。因此，15-HEPE和15-HEPE EE可以直接抑制TGF-β信号传导，结果支持15-HEPE和15-HEPE EE在治疗包括非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的多种纤维化疾病、其他纤维化疾病、心血管代谢疾病以及癌症的多种适应症中的治疗潜力。
实施例4：口服DS102对于NAFLD患者的功效
本研究的目的是评估口服DS102胶囊与安慰剂相比在治疗患有非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的成年患者中的安全性和功效。
1.1研究终点
主要终点：本研究的主要终点包括施用DS102的功效和安全性。基于血清丙氨酸转氨酶(ALT)从基线到第16周的变化以及通过瞬时弹性成像测量的肝硬度从基线到第16周的变化来评价功效。根据每个治疗组中导致治疗中止的治疗突发不良事件(TEAE)的数量来评价安全性。
次要终点：本研究的次要终点包括以下任一项变化：血清ALT从基线到第2、4、8和12周的变化；天冬氨酸转氨酶(AST)从基线到第2、4、8、12和16周的变化；AST：ALT比值从基线到第2、4、8、12和16周的变化；纤维化-4(FIB-4)指数从基线到第16周的变化；NAFLD纤维化评分(NFS)从基线到第16周的变化；由受控衰减参数(CAP)测量的肝脂肪从基线到第16周的变化；肝纤维化增强(ELF)评分从基线到第16周的变化；以及稳态模型评估胰岛素抵抗(HOMA-IR)和脂肪组织胰岛素抵抗(adipo-IR)从基线到第2、4、8、12和16周的变化。
探索性分析：探索性分析包括对脂质和代谢参数的分析，这些参数包括：总胆固醇、甘油三酯、极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、非高密度脂蛋白胆固醇(非HDL-C)、残粒样颗粒胆固醇(RLP-C)、空腹葡萄糖、胰岛素、游离脂肪酸和血红蛋白A1C(HbA1C)。另外的探索性分析包括高通量脂质组学和蛋白质组学。
1.2研究设计
这是一项随机、安慰剂对照的双盲、平行组、多中心探索性IIa期研究，旨在调研18至75岁NAFLD患者口服DS102胶囊的安全性和功效以及两种DS102剂量与安慰剂之间的剂量-反应关系。在本研究中调研了确认患有NAFLD的患者的三个平行组，以在16周的治疗期内将DS102的两种不同剂量与安慰剂进行比较。本研究计划包括96名可评价患者，给每个治疗组随机分配32名患者。
本研究包括28天的筛选期、16周的治疗期和4周的随访期。在筛选访视时，使用筛选检查对患者进行评估。符合纳入标准与不符合排除标准的患者入选。
图19中提供了本研究的总体时间范围的示意图。一旦患者入选本研究，他们就被限制使用任何其他针对NAFLD的治疗。被认为对患者是必要的，并且研究者认为不会干扰安全性和功效评价的任何药物(例如，处方药和非处方药(OTC))或治疗干预，如果它们没有被包括在下文提供的“伴随用药”列表中，则将继续使用。
在比较治疗期开始之前，患者返回研究中心完成其疾病的基线评估，以1∶1∶1随机化将符合条件的患者随机分配给三种平行组治疗方案之一：
·治疗组A：2×安慰剂500mg胶囊，每天口服两次(每天4粒胶囊)，持续16周。
·治疗组B：1×DS102 500mg胶囊与1×安慰剂500mg胶囊，每天口服两次(每天4粒胶囊)，持续16周。
·治疗组C：2×DS102 500mg胶囊，每天口服两次(每天4粒胶囊)，持续16周。
为了维持双盲条件，DS102胶囊和安慰剂胶囊外观相同。
1.3患者和筛选
为了参与本研究，要求患者符合以下所有纳入标准，并且必须不符合以下任何排除标准。在筛选访视(第1次访视)时以及治疗/基线访视(第2次访视)开始时验证纳入标准和排除标准。
本研究的纳入标准如下：
·因影像学或组织学上存在肝脂肪变性而诊断为NAFLD但无任何继发性病因的患者。
·筛选期间间隔7天或更多天出现两次1.5ULN≤ALT＜5ULN的患者。
·筛选3个月内历史肝活检示出NASH并且/或者≥F1纤维化或者NFS≥-1.455或Fib-4≥1.3或Fibroscan≥8kPa的患者。
·体重指数(BMI)介于25.0kg/m2与40.0kg/m2之间的患者。研究中允许纳入有受控肥胖症或受控糖尿病病史的患者。
·研究者认为其研究前的临床实验室结果不干扰其参与本研究的患者。
·年龄介于18岁与75岁之间的患者。
·女性患者和拥有具备生育潜力的女性伴侣的男性患者在研究期间需要使用充分的避孕措施，或伴侣已绝育。充分的避孕措施被定义为：全身激素避孕药；子宫内避孕器，或者结合杀精子剂的屏障避孕法；或同意禁欲，禁欲被定义为患者在与研究治疗相关的整个风险期中避免与异性性交，以及符合患者首选和通常的生活方式。要求激素避孕药在基线之前按稳定的剂量至少服用一个月。
·能够与研究者良好沟通、理解并遵守研究要求、理解并签署书面知情同意书的患者。
本研究的排除标准如下：
·纳入前3个月内代谢状况不稳定(诸如体重变化＞5％)的患者。
·有胃旁路手术病史/手术史，进行过原位肝移植(OLT)或已被记
录准备进行OLT的患者。
·不受控制的2型糖尿病(即，筛选时HbA1c≥9％(75mmol/mol))患者。
·具有失代偿或严重肝病的患者，如以下一项或多项所证实：确诊肝硬化或疑似肝硬化、食管静脉曲张、腹水、疑似门静脉高压、在筛选60天内住院治疗肝病、胆红素≥2×ULN，或者ALT或AST≥5×ULN。Gilbert综合征患者在结合胆红素≤1.5×ULN的情况下符合条件。
·炎性肠病处于活动期或需要药物治疗的患者。
·诊断患有或疑似患有自身免疫疾病(诸如系统性红斑狼疮(SLE)和/或类风湿性关节炎(RA))的患者。
·有经根治性治疗的皮肤癌(基底细胞癌或鳞状细胞癌)之外的活动性非肝恶性肿瘤病史的患者。
·患有肝脏疾病之外的严重全身性或重大疾病的患者，包括冠状动脉疾病、脑血管疾病、肺部疾病、肾功能不全、严重精神疾病、呼吸系统疾病或高血压疾病，以及糖尿病和关节炎，研究者认为这些疾病妨碍了患者参与和完成研究。
·排除需要抗糖尿病治疗(包括胰岛素增敏剂)和/或降脂治疗并且在筛选前未按稳定的剂量至少服用3个月的患者。如果患者依赖于胰岛素，该治疗应当已在筛选程序的至少3个月前开始，但允许改变剂量。
·已知对研究治疗的任何成分过敏的患者。
·筛选时人免疫缺陷病毒(HIV)抗体、乙型肝炎表面抗原或丙型肝炎抗体检测呈阳性的患者。
·其他病因的肝病患者，诸如药物诱导的自身免疫性肝炎、原发性胆汁性胆管炎(PBC)、原发性硬化性胆管炎(PSC)、血色素沉着病、α-1抗胰蛋白酶(A1AT)缺乏症或威尔逊氏病。
·研究者认为有严重的药物/溶剂滥用史的患者。
·研究者认为有酗酒史，或者每周饮酒超过21个单位(男性)或超过14个单位(女性)的患者，其中一个单位由10ml或8mg纯酒精组成。
·在基线前4周内使用了富含ω-3或ω-6脂肪酸的膳食补充剂的患者。
·在研究治疗的第一天给药之前的3个月内已经参与使用研究药物的任何其他临床研究的患者。
·在试验期间怀孕、计划怀孕、哺乳和/或不愿意使用充分的避孕措施的患者。
·研究者认为不适合参与本研究的患者。
1.4研究执行
在研究期间，在筛选访视后安排10次诊所访视：1次在比较治疗期/基线(第0天/第2次访视)开始时，8次在比较治疗期期间(第2周/第3次访视、第4周/第4次访视、第6周/第5次访视、第8周/第6次访视、第10周/第7次访视、第12周/第8次访视、第14周/第9次访视、第16周/第10次访视)。如果患者未完成研究，则在第10次访视后4周或参加的最后一次访视后2周进行最终的安全性随访(第11次访视)。表17描述了针对研究的临床访视。
表17：本研究临床访视的研究流程图
Figure BDA0003977255610000761
Figure BDA0003977255610000771
筛选访视(第1次访视)：在筛选时访视以下内容
筛选访视(第1次访视)：获得知情同意后，为患者分配患者筛选号。理想情况下，患者禁食。进行了以下筛选评估/样本采集：验证纳入/排除标准；人口统计数据；病史；体格检查；12导联心电图(ECG)；生命体征(血压、心率和体温)；用于临床实验室安全性检验(血液学检验、血清生化检验和凝血检验)的样本；病毒学；妊娠检验(针对具备生育潜力的女性患者)；ALT、AST检验(筛选期间测量ALT两次)；以及伴随用药评估。当患者因不良事件(AE)、难以遵守研究方案要求或疾病状态显著改变而需要在计划访视日期之间进行访视时，发生计划外访视。遵循医学上必要的所有程序。如果患者合格，则在患者离开诊所前，指导其在下次访视前不进食任何早餐，保证禁食期最少为8小时。
治疗期：成功完成筛选访视后，患者开始比较治疗期(16周)。在比较治疗期开始时，确认持续合格性之后，将患者随机分配给三种治疗方案之一。在整个比较治疗期中，患者每天两次服用分配的研究药物产品(IMP)即DS102胶囊，或安慰剂胶囊。每次自行服用IMP均记录在患者日志卡中。指导患者在早晨和晚上随餐或餐后服用DS102(例外情况是，在诊所第3、第4、第6、第8和第10次访视的早晨，指导患者在访视前不要服用DS102，而是在诊所访视之后尽快服用DS102)。在基线(第2次访视)、第2周(第3次访视)、第4周(第4次访视)、第8周(第6次访视)、第12周(第8次访视)、第16周(第10次访视)和第20周(第11次访视)开始时，询问患者在访视前是否已最少禁食8小时。如果未满足该条件，则记录禁食期的持续时间，并且重新指导患者有关禁食期持续时间的要求。然后为患者提供清淡早餐(例如茶或橙汁和烤面包片)。在基线(第2次访视)、第8周(第8次访视)和第16周(第10次访视)时，在患者进食清淡早餐之前进行血液采样评估。当患者因不良事件(AE)、难以遵守研究方案要求或疾病状态显著改变而需要在计划访视日期之间进行访视时，发生计划外访视。遵循医学上必要的所有程序。提前中止研究的患者在退出研究后尽快完成了为执行的第10次访视安排的研究程序，以便能够记录所有与研究相关的信息。根据研究者的判断，在该试验进行期间随时进行尿DOA和酒精呼气检验。
基线(第2次访视)：患者在第2次访视时前往研究中心。对血液采样进行首次评估。在血液采样后进行了以下评估：验证纳入/排除标准；病史；体格检查；12导联ECG；药代动力学采样；生命体征(血压、心率和体温)；用于临床实验室安全性检验(血液学检验、血清生化检验和凝血检验)的样本；脂质分布；尿分析；妊娠检验(针对具备生育潜力的女性患者)；ALT、AST检验；HOMA-IR/Adipo-IR；ELF；肝硬度和CAP；FIB-4；NFS(包括BMI)；生物标记物血液样本；探索性血液样本；患者随机化；研究药物/安慰剂施用；AE评估；以及伴随用药评估。如果满足所有研究进入标准，研究者将患者随机分组，并向患者提供来自其中一个患者治疗包的指定IMP或安慰剂。一旦完成了所有基线评估，就在研究中心施用第一剂IMP或安慰剂。患者在第0天晚上服用第二剂IMP或安慰剂。然后每天施用胶囊两次。患者在返回研究中心进行访视(第3次访视)的早晨服用IMP或安慰剂。在患者离开诊所前，指导患者在下次访视前不进食任何早餐，保证禁食期最少为8小时。
第2周(第3次访视)：患者在第3次访视时返回研究中心。患者在第3次访视的早晨没有服用IMP和安慰剂。进行了以下评估：体格检查；药代动力学采样；生命体征(例如，血压、心率和体温)；ALT、AST检验；HOMA-IR/Adipo-IR；AE评估；以及伴随用药评估。回收IMP或安慰剂，向患者提供另外的IMP或安慰剂。一旦完成所有访视评估，患者便立即服用下一剂IMP或安慰剂。继续每天施用胶囊两次。完成此次访视后，通知患者要求其在两周后第4次访视时返回研究中心。患者在返回研究中心进行访视(第4次访视)的早晨没有服用IMP和安慰剂。在患者离开诊所前，指导患者在下次访视前不进食任何早餐，保证禁食期最少为8小时。
第4周(第4次访视)：患者在第4次访视时返回研究中心。患者在第4次访视的早晨没有服用IMP和安慰剂。进行了以下评估：体格检查；药代动力学采样；生命体征(血压、心率和体温)；用于临床实验室安全性检验(血液学检验、血清生化检验和凝血检验)的样本；妊娠检验(针对具备生育潜力的女性患者)；ALT、AST检验；HOMA-IR/Adipo-IR；AE评估；以及伴随用药评估。回收IMP或安慰剂，向患者提供另外的IMP或安慰剂。一旦完成所有访视评估，患者便立即服用下一剂IMP或安慰剂。继续每天施用胶囊两次。完成此次访视后，通知患者要求其在两周后第5次访视时返回研究中心。患者在返回研究中心进行访视(第5次访视)的早晨没有服用IMP和安慰剂。
第6周(第5次访视)：患者在第5次访视时返回研究中心。进行了以下评估：AE评估和伴随用药评估。回收IMP或安慰剂，向患者提供另外的IMP或安慰剂。一旦完成所有访视评估，患者便立即服用下一剂IMP或安慰剂。继续每天施用胶囊两次。完成此次访视后，通知患者要求其在两周后第6次访视时返回研究中心。患者在返回研究中心进行访视(第6次访视)的早晨没有服用IMP和安慰剂。在患者离开诊所前，指导患者在下次访视前不进食任何早餐，保证禁食期最少为8小时。
第8周(第6次访视)：患者在第6次访视时返回研究中心。患者在第6次访视的早晨没有服用IMP和安慰剂。对血液采样进行首次评估。在血液采样后进行了以下评估：体格检查；药代动力学采样；生命体征(血压、心率和体温)；用于临床实验室安全性检验(血液学检验、血清生化检验和凝血检验)的样本；脂质分布；妊娠检验(针对具备生育潜力的女性患者)；ALT、AST检验；HOMA-IR/Adipo-IR；生物标记物血液样本；AE评估；以及伴随用药评估。回收IMP或安慰剂，向患者提供另外的IMP或安慰剂。一旦完成所有访视评估，患者便立即服用下一剂IMP或安慰剂。继续每天施用胶囊两次。完成此次访视后，通知患者要求其在两周后第7次访视时返回研究中心。患者在返回研究中心进行访视(第7次访视)的早晨服用IMP或安慰剂。
第10周(第7次访视)：患者在第7次访视时返回研究中心。进行了以下评估：AE评估和伴随用药评估。回收IMP或安慰剂，向患者提供另外的IMP或安慰剂。一旦完成所有访视评估，患者便立即服用下一剂IMP或安慰剂。继续每天施用胶囊两次。完成此次访视后，通知患者要求其在两周后第8次访视时返回研究中心。患者在返回研究中心进行访视(第8次访视)的早晨没有服用IMP和安慰剂。在患者离开诊所前，指导患者在下次访视前不进食任何早餐，保证禁食期最少为8小时。
第12周(第8次访视)：患者在第8次访视时返回研究中心。患者在第8次访视的早晨没有服用IMP和安慰剂。进行了以下评估：体格检查；药代动力学采样；生命体征(血压、心率和体温)；用于临床实验室安全性检验(血液学检验、血清生化检验和凝血检验)的样本；妊娠检验(针对具备生育潜力的女性患者)；ALT、AST检验；HOMA-IR/Adipo-IR；AE评估；以及伴随用药评估。回收IMP或安慰剂，向患者提供另外的IMP或安慰剂。一旦完成所有访视评估，患者便立即服用下一剂IMP或安慰剂。继续每天施用胶囊两次。完成此次访视后，通知患者要求其在两周后第9次访视时返回研究中心。患者在返回研究中心进行访视(第9次访视)的早晨没有服用IMP和安慰剂。
第14周(第9次访视)：患者在第9次访视时返回研究中心。进行了以下评估：AE评估和伴随用药评估。回收IMP或安慰剂，向患者提供另外的IMP或安慰剂。一旦完成所有访视评估，患者便立即服用下一剂IMP或安慰剂。继续每天施用胶囊两次。完成此次访视后，通知患者要求其在两周后第10次访视时返回研究中心。患者在返回研究中心进行访视(第10次访视)的早晨不应服用IMP和安慰剂。在患者离开诊所前，指导患者在下次访视前不进食任何早餐，保证禁食期最少为8小时。
第16周(第10次访视)或提前退出：患者在第10次访视时返回研究中心。患者在第10次访视的早晨没有服用IMP和安慰剂。对血液采样进行首次评估。在血液采样后进行了以下评估：体格检查；12导联ECG；药代动力学采样；生命体征(血压、心率和体温)；用于临床实验室安全性检验(血液学检验、血清生化检验和凝血检验)的样本；尿分析；脂质分布；妊娠检验(针对具备生育潜力的女性患者)；ALT、AST检验；HOMA-IR/Adipo-IR；ELF；肝硬度和CAP；FIB-4；NFS[包括BMI]；生物标记物血液样本；探索性血液样本；AE评估；以及伴随用药评估。回收IMP或安慰剂。没有发放另外的IMP和安慰剂泡罩包装，也没有发放另外的患者日志卡。在本次访视完成研究评估后，研究限制继续存在。完成此次访视后，通知患者要求其在四周后第11次访视时返回研究中心，以评估本次访视以来的任何AE，并进行安全性和功效评估。在患者离开诊所前，指导患者在下次访视前不进食任何早餐，保证禁食期最少为8小时。
随访(第20周/第11次访视)：第10次访视后4周(或提前退出访视后2周)，患者返回研究中心。进行了以下评估：体格检查；药代动力学采样；生命体征(血压、心率和体温)；用于临床实验室安全性检验(血液学检验、血清生化检验和凝血检验)的样本；妊娠检验(针对具备生育潜力的女性患者)；ALT、AST检验；HOMA-IR/Adipo-IR；生物标记物；AE评估；以及伴随用药评估。
1.5评估
功效评估包括：ALT、AST、ALT：AST比值；HOMA-IR/Adipo-IR；ELF；肝硬度和CAP；FIB-4指数；和NFS。下面提供每一者的详细说明。
ALT、AST、ALT：AST比值：增加的肝酶(ALT和AST)是肝损伤的标记物，在下列时间点对肝酶进行了评估：第1次访视/筛选(筛选期间间隔7天或更多天评估两次)、第2次访视/基线、第3次访视/第2周、第4次访视/第4周、第6次访视/第8周、第8次访视/第12周、第10次访视/第16周，以及随访即第11次访视/第20周。
HOMA-IR/Adipo-IR：HOMA-IR/Adipo-IR水平是测量胰岛素抵抗的方法。HOMA-IR通过将空腹血浆胰岛素(FPI)乘以空腹血浆葡萄糖(FPG)，然后除以常数405来计算。Adipo-IR通过将空腹非酯化脂肪酸(NEFA)×空腹胰岛素来计算。在下列时间点取得血液样本对HOMA-IR和Adipo-IR进行了评估：第2次访视/基线、第3次访视/第2周、第4次访视/第4周、第6次访视/第8周、第8次访视/第12周、第10次访视/第16周，以及随访即第11次访视/第20周。要求所有受试者在血液采样前最少禁食8小时。如果受试者禁食未满最少8小时，则记录禁食的持续时间，并且鼓励受试者在下一次临床访视前禁食足够长的时间。
ELF：ELF评分是由金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP-1)、III型前胶原蛋白氨基末端前肽(PIIINP)和透明质酸(HA)组成的细胞外基质标记物组。在基线(第2次访视)和第16周(第10次访视)时取得血液样本进行了该评估。
肝硬度和CAP：使用瞬时弹性成像(例如，
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502 Touch型产品或等同产品)对肝硬度和CAP进行了评估。如果可能，对于基线(第0周)和第10次访视(第16周)，患者禁食，并在当天同一时间扫描。对于本次评估，符合以下条件：患者以仰卧位平躺，右臂置于头部后方外展到最大程度，位置与肝活检(LB)时相似；将换能器顶端置于肝脏右叶上方的肋骨之间的皮肤上(医生将探头置于肋间隙中进行测量)；在用
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检查期间，通过自动探头选择工具(APS)确定是选择M+探头还是XL+探头(如果APS工具建议使用“XL+探头”或者在“M+和XL+探头”之间连续“切换”，则仅使用XL+探头)；在超声时间运动图像辅助下，操作者定位了肝脏中没有大血管结构的一部分(XL+探头的测量深度介于35mm至75mm之间，M+探头的测量深度介于25mm至65mm之间，所探查的体积为3cm3)。对于每位患者，操作者在同一点使用XL+或M+探头进行包括至少10次有效测量或最多20次尝试的检查。整个检查持续不超过10至15分钟。最终的硬度值和CAP值记录为有效测量结果的中值。
FIB-4指数：FIB-4指数基于年龄、血小板计数、ALT水平和AST水平，并且在基线(第2次访视)和第16周(第10次访视)时评估。FIB-4分数如下式所示确定。
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NFS：NFS基于年龄、高血糖、BMI、血小板计数、白蛋白水平和AST/ALT比值。NAFLD纤维化评分＝-1.675+0.037×年龄(岁)+0.094×BMI(kg/m2)+1.13×IFG/糖尿病(是＝1，否＝0)+0.99×AST/ALT比值-0.013×血小板(×109/l)-0.66×白蛋白(g/dl)。在基线(第2次访视)和第16周(第10次访视)时对NFS进行了评估。
安全性评估包括以下项：病史；体格检查；ECG；生命体征；临床实验室安全性检验(例如，血液学、血清生化、凝血、脂质分布和尿分析)；病毒学；妊娠检验；血液采样；药代动力学采样；探索性血液采集；生物标记物血液采集；尿DOA和酒精呼气检验；不良事件评估；伴随用药；生物分析；样本、储存、处理；运输；和限制。下面提供每一者的详细说明。
病史：研究者或指定人员在筛选访视(第1次访视)和基线(第2次访视)时对患者病史进行了全面审查，以确保不符合排除标准。报告了任何伴随疾病，无论研究者认为是否与本研究相关。尽可能记录诊断日期或症状持续时间。
体格检查：根据当地实践，研究者按照表19中的研究流程图在第1次访视/筛选、第2次访视/基线、第3次访视/第2周、第4次访视/第4周、第6次访视/第8周、第8次访视/第12周、第10次访视/第16周和随访即第11次访视/第20周进行了体格检查(包括身高和体重)。该检查在基线时全面完成，之后仅针对症状进行检查(即，不对身体系统标准检测组合进行评估，除非患者示意这样做)。例如，如果患者向研究者报告出现“皮疹”，则对皮肤进行评价。无需对另外的身体系统进行评估，除非临床上认为有必要做这样的评估。记录任何异常结果。将体格检查结果与基线检查相比的变化记录为AE。
ECG：在每个时间点用10秒导联II节律条以10mm/1mv、25mm/s记录12导联ECG。使用GE Mac 1200或等效模型来记录ECG。在获取ECG之前，患者以完全仰卧位静息5分钟。在表19的研究流程图中所指示的第1次访视/筛选、第2次访视/基线和第10次访视/第16周的那些日期做记录。
生命体征：根据表19中的研究流程图，在第1次访视/筛选、第2次访视/基线、第3次访视/第2周、第4次访视/第4周、第6次访视/第8周、第8次访视/第12周、第10次访视/第16周和随访即第11次访视/第20周时进行了生命体征测量。在采集任何血液样本之前进行生命体征测量。如果在患者签名后获得了发现，则被认为具有临床意义的所有新发现或先前的发现发生的变化均被记录为AE。生命体征测量结果包括：仰卧位血压(例如，休息至少5分钟后)、收缩压和舒张压(单位是mmHg)；静息时的心率，单位是每分钟的心跳次数(bpm)；以及根据临床实践获取的体温。
临床实验室安全性检验：对血液学、血清生化、凝血、脂质分布和尿分析进行了安全性检验。按照表19中的研究流程图获取血液样本和尿液样本，用于进行常规血液学检验、血清生化检验、凝血检验和尿分析检验，以及脂质分布检验。在中心实验室对所有样本进行了分析。所有受试者在血液采样前最少禁食8小时。如果受试者禁食未满最少8小时，则记录禁食的持续时间，并且鼓励受试者在下一次临床访视前禁食足够长的时间。
·血液学：全血计数包括红细胞计数、血红蛋白、血细胞比容、白细胞计数、白细胞分类计数、血小板计数和网织红细胞计数。
·血清生化：尿素(血尿素氮；BUN)、肌酸酐、尿酸、总胆红素、间接和直接胆红素、钠、碳酸氢钾、磷、氯化钙、碱性磷酸酶(ALP)、天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、ALT/AST比值、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸磷酸激酶(CPK)、白蛋白、总蛋白、胆固醇、甘油三酯、葡萄糖、C-反应蛋白(CRP)。
·凝血：凝血酶原时间(PT)、国际标准化比值(INR)和活化部分凝血酶原时间(APTT)。
·脂质分布：LDL、HDL和VLDL-C。
·尿分析：pH、蛋白质、葡萄糖、血液、酮、白细胞、白细胞酯酶、胆红素、比重、尿胆素原和硝酸盐。如果存在血液、蛋白质、白细胞酯酶或硝酸盐/亚硝酸盐，则进行反射显微镜检查。
病毒学：采集血液样本进行病毒学检验，包括HIV、Hep C和Hep B，详见表19的研究流程图。
妊娠检验：针对具备生育潜力的女性患者，根据表19的研究流程图，在第1次访视/筛选、第2次访视/基线、第4次访视/第4周、第6次访视/第8周、第8次访视/第12周、第10次访视/第16周和第11次访视/第20周进行了妊娠检验。
血液采样：获得血液样本，在样本分析和验证后由每位研究者审查实验室结果，确定具有临床意义的值。重复实验室安全性检验可能需要额外的血液。
药代动力学(PK)采样：按照表19中的研究流程图，在第2次访视/基线、第3次访视/第2周、第4次访视/第4周、第6次访视/第8周、第8次访视/第12周、第10次访视/第16周和随访即第11次访视/第20周时经由直接静脉穿刺采集了用于PK分析的血液样本。在每个时间点取1mL血液样本。离心后，将血浆样本分成两份，备用样本保存在中心实验室，直到完成生物分析测定。
探索性血液采集：根据表19中的研究流程图，在基线(第0周)和第10次访视/16周时采集了血液并储存起来，用于潜在基因阵列分析或以后的附加探索性检验。
生物标记物血液采集：根据表19中的研究流程图，在基线(第0周)、第6次访视/第8周、第10次访视/第16周和随访即第11次访视/第20周时采集了血液并储存起来，用于潜在生物标记物分析。
尿DOA和酒精呼气检验：根据研究者的判断，在临床上适当时进行酒精呼气检验，并且在进行试验和检验期间随时从患者采集尿液样本以检测以下物质：苯丙胺、巴比妥酸盐、苯二氮
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类药物、可卡因、大麻素和阿片类药物。
伴随用药：患者在筛选前按稳定的剂量服用任何伴随药物至少3个月，该剂量应当在整个研究的持续时间内保持稳定。如果患者依赖于胰岛素，该治疗应当已在筛选程序的至少3个月前开始，但允许改变剂量。
限制：本研究包括饮食、酒精、咖啡因和体力活动方面的限制。对于饮食，患者在研究期间和基线前4周避免摄入富含ω-3或ω-6脂肪酸的食物补充剂(例如，鳕鱼肝油胶囊)。对于酒精，患者避免每周饮酒超过21个单位(男性)或14个单位(女性)，其中一个单位由10ml或8mg纯酒精组成。在本研究之前或期间对咖啡因没有限制。对于体力活动，患者在实验室安全性检验(例如，生化检验)前至少3至4小时避免锻炼和剧烈体力活动。
1.6研究药物
DS102胶囊为白色不透明的硬壳胶囊(0号)，其装有500mg 15-HEPE乙酯(EE)与5％w/w作为粘度调节剂的胶态二氧化硅。
DS102安慰剂(石蜡油)为白色不透明的硬壳胶囊(0号)，其装有相等填充重量的液体石蜡与1％w/w作为粘度调节剂的胶态二氧化硅。
DS102胶囊和安慰剂胶囊均在2至8℃下储存在安全区域(例如上锁的柜子或药物储藏室)，以防止意外使用。标签对剂量设盲，并包含随机化编号。
剂量和施用：本研究涉及DS102与安慰剂的比较，每天两次口服施用，总持续时间为16周。最后一次施用研究药物发生在第16周访视/提前终止(ET)访视前一天。要求患者随餐或餐后服用胶囊。本研究允许的针对其他病症的药物照常服用。钱夹式泡罩包装由7天用量的4粒胶囊组成，最后，患者连续16周服用分配的药物。
1.7不良事件和严重不良事件
本研究的不良事件(AE)和严重不良事件(SAE)定义如下。
不良事件(AE)：已服用第一剂研究药物的患者出现的任何不希望有的体验，无论是否认为与试验用IMP相关。AE记录在病例报告表中，定义了与IMP的关系和严重度。
严重不良事件(SAE)：如果患者在服用第一剂研究药物之后经历了严重不良事件，则将该事件记录为SAE。SAE的特征在于在任何剂量下的不幸医疗事件，包括以下任何一种：导致死亡、危及生命、需要患者住院治疗或延长现有住院治疗，或者导致持续或显著的残疾/能力丧失。术语“危及生命”是指患者在事件发生时处于死亡风险中的事件。该术语并不指假设在更严重的情况下可能已经造成死亡的事件。严重但不危及生命的事件的示例包括急诊室的强化治疗、过敏性支气管痉挛，未导致住院的血液恶质病或抽搐，或者药物依赖或药物滥用的发展。
非预期不良事件(UAE)：之前未在研究者手册或类似的产品信息表(诸如产品特性总结(SPC))中报告的经历。
AE的强度是研究者根据其临床经验对事件相对严重度作出的估计。使用以下定义来评定AE的严重度：
·轻度：不良事件为一过性事件，容易耐受。
·中度：不良事件引起患者不适，中断患者的日常活动。
·严重：不良事件对患者的日常活动造成了相当大的干扰，可能已导致丧失能力或危及生命。
还考虑到患者病史、最近的体格检查结果和伴随用药，确定了AE与实验治疗的因果关系。使用以下定义来确定AE的因果关系：
·不相关：AE发作相对于实验治疗的时间关系不合理，或另一种原因可以解释AE的发生。
·相关：AE发作相对于实验治疗的时间关系是合理的，遵循已知的治疗反应模式，并且不可能有其他原因。
报告了整个研究的持续时间(直到并包括随访期)内的所有AE。
1.8药物诱导性肝损伤
严重的药物诱导性肝损伤(DILI)：不考虑感知到的因果关系，如果发生严重的DILI，则停止施用研究药物，直到认为症状发作已消退。如果研究药物被认为是肝损伤的原因，则患者不再用该药物进行再激发治疗。严重DILI明确要求肝损伤的证据，如总胆红素＞2×ULN或INR＞1.5所证明。
具有异常基线肝生化的患者：在测定异常基线肝生化时，计算相对于基线水平的倍数增加，而不使用ULN。因此，在获得3×基线ALT或AST(或＞200IU/L)的数字后，在72小时内进行重复检验，以确认/确定这些生化变化是改善了还是恶化了。在全面体格检查的同时收集AE信息。进行了肝脏病因筛查和/或其他适当的检验。如果发生肝功能障碍，则患者作为严重DILI管理。如果发生符合严重DILI的任何标准的情况，则考虑暂停药物治疗。
1.9严重不良反应和非预期不良反应
不良反应：与任何剂量相关的对医药产品的所有有害和非预期反应均被视为药物不良反应。短语“对医药产品的反应”意指医药产品与AE之间的因果关系至少有合理的可能性(即，不能排除该关系)。对于市售的医药产品，不良反应是对药物的有害和非预期反应，其在用于人类时，通常在用于预防、诊断或治疗疾病或者用于改变生理功能的剂量下发生。
非预期不良反应：不良反应的性质或严重度与适用产品信息不一致。
疑似非预期严重不良反应(SUSAR)：根据上述定义，任何可能与IMP相关且非预期的严重不良反应。
1.10统计方法和数据管理
该临床试验采用随机、双盲、安慰剂对照的平行组设计。使用随机化来最小化分配偏倚并增加已知和未知患者属性(例如人口统计学特征)在治疗组之间达到均衡的可能性。在数据收集以及安全性和功效评价期间使用设盲来减少潜在偏倚。基于研究持续时间的短暂性并且不存在任何可能的长期不可逆损害，使用安慰剂作为比较物被证明是评估对于患者的安全性和功效的合理设计，其可能已经出现安慰剂治疗的结果。
样本量的估计：假设活性药物组与安慰剂组之间的反应百分比有20％的增量，标准偏差为25％，脱落率为20％，这导致为取得5％的显著性水平和80％的把握度，需要每组包含32名患者进行统计学检验。根据揭盲建议，在中期分析时重新估计样本量。样本量最多总共可能增加至150名患者，以使主要终点达到80％的条件把握度。
设盲和破码说明：所有研究中心人员以及参与监查或开展本研究的人员均对患者个体治疗分配设盲。随机化细节在正式揭盲前被严格保密，只有在紧急情况下，被授权人才能接触了解。只有在已记录和验证所有患者数据并锁定数据库后，试验的设盲代码才被破坏。
中期分析和数据监测：在至少50％的患者已完成第16周访视后，进行中期安全性分析以估计条件把握度。中期分析基于针对主要和共同主要功效终点以及次要终点收集的数据，并用于估计实现主要研究目的的条件把握度，从而可能重新估计样本量，并可能丢弃有效性较低的治疗组。
临床上有意义的反应：与安慰剂相比，ALT或肝硬度降低的百分比具有至少为20％的较高平均值或中值；以及与安慰剂相比，ALT和肝硬度降低的百分比均具有至少为10％的较高平均值或中值。
分析集包括入选集、全分析集(FAS)、符合方案集(PPS)、安全性分析集(SAS)和药代动力学(PK)集。下文提供每个分析集的详细说明。
入选集：签署知情同意书的患者。“筛选失败”是来自入组群体的不符合资格要求并在随机化前退出研究的患者。
FAS：接受了至少一次研究治疗给药并进行了至少一次基线后测量的随机化患者。根据随机分配的治疗对患者进行分析，不考虑他们实际接受的是何种治疗。
PPS：FAS的子集，由无重大方案违背的那些FAS患者组成。在数据库锁定前，逐例评估并记录所有方案偏离，被认为严重影响功效结果的重大偏离导致相关患者从PPS中排除。
SAS：接受了至少一次研究治疗给药的患者。根据实际采取的治疗，对患者进行分析。
PK集：SAS中具有至少一个DS102 PK浓度的患者。根据实际接受的治疗，对患者进行分析。
安全性分析：列出了每名患者的人口统计学、病史和体格检查数据，并以描述的方式进行了总结。使用当前版本的监管活动医学词典(MedDRA)将研究期间记录的所有AE编码为系统器官类别和首选术语。按照治疗、与治疗的关系、严重性和严重度将AE制成表格并进行总结。按治疗和天数列出每名患者的临床实验室值(例如，血液学、生化和尿分析)。实验室正常范围之外的值分开列出，并加上关于其临床意义的相关评论，按治疗将潜在临床显著异常突出显示并进行了总结。将给药前获得的临床实验室值定义为基线值。列出了每名患者的酒精呼气检验结果和DOA检验结果。列出并以描述的方式总结了每种治疗和每天的个体生命体征值。列出了每名患者的12导联ECG评估结果以及所有相关评论，并按治疗和天数进行了总结。按根据世界卫生组织药物词典最新版本的药物组和药物亚组分类的伴随用药(如果有的话)按治疗列出和总结。一般来讲，根据变量的性质，应用适当的描述性统计。分类变量采用计数和百分比表示，而连续变量则采用平均值、标准偏差、中值、最小值、最大值、变异系数和患者数表示。
药代动力学分析：将15(S)-HEPE的血浆浓度制成表格并以描述的方式进行了总结。以图形方式呈现了15(S)-HEPE的各个血浆浓度-时间分布和平均血浆浓度-时间分布。
主要变量：主要功效变量是第16周(第10次访视)时血清ALT相对于基线的变化。经由协方差分析(ANCOVA)模型，将相应基线值作为协变量包括进来，从而将活性治疗组与安慰剂组进行比较。根据Dunnett多重检验过程，进行与安慰剂组的比较。对于缺失的第16周数值，最后一个可用值被结转(LOCF)。将类似的方法应用于肝硬度。对于ALT，另外考虑纵向建模。
次要变量：次要功效变量及其从基线到第16周(第10次访视)的变化按照每个治疗组和每次访视，利用描述性统计进行了总结。这适用于AST、AST：ALT比值、由CAP测量的肝脂肪、通过瞬时弹性成像测量的肝硬度、FIB-4、NFS、ELF和HOMA-IR/Adipo-IR。经由ANOVA模型(包括中心效应项)将活性治疗组的相对于基线的变化与安慰剂组进行比较。5％的显著性水平用于所有治疗比较。
探索性分析：探索性分析包括对脂质和代谢参数的分析，这些参数包括：总胆固醇、甘油三酯、极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、非高密度脂蛋白胆固醇(非HDL-C)、残粒样颗粒胆固醇(RLP-C)、空腹葡萄糖、胰岛素、游离脂肪酸和血红蛋白A1C(HbA1C)。另外的探索性分析包括高通量脂质组学和蛋白质组学。
1.11结果
该研究证明，被诊断患有NAFLD并以1g或2g/天的剂量施用DS102的患者表现出代谢过载标记物的统计学显著降低，以及胰岛素敏感性和血糖控制的改善。
图20示出了三个治疗组在基线时平衡良好且具有相似的脂质组学和代谢组学分布。患者的基线特征在表18中示出，其中10％至13％的患者在基线时接受他汀类治疗。
表18：受试者的基线特征
Figure BDA0003977255610000911
图21A至图21C描绘了与安慰剂组相比，每天施用1g或2g DS102的患者从基线到第16周胰岛素、葡萄糖和游离脂肪酸水平的变化。施用DS102后胰岛素、葡萄糖和游离脂肪酸水平的降低在临床上是显著的，因为代谢底物(包括葡萄糖、碳水化合物和游离脂肪酸)驱动NASH的发病机制。
图22A和图22B示出了与安慰剂组相比，每天施用1g或2g DS102的患者从基线到第16周HOMA-IR和adipo-IR水平的变化。患者在第16周表现出两种胰岛素抵抗指数有所改善(例如，HOMA-IR水平和adipo-IR水平降低)，且对于施用2g DS102的那些患者，在符合方案集(PPS)观察到显著改善。
图23A和图23B描绘了与安慰剂组相比，每天施用1g或2g DS012的患者从基线到第16周糖基化血红蛋白(例如，HbA1c)水平的变化。具体地讲，图23A示出HbA1c水平的变化，图23B示出在基线时HbA1c水平高但在第16周达到正常水平的一定比例患者中HbA1c水平的变化。由于Hb1Ac是附着于体内红细胞的葡萄糖的量的量度并且是长期血糖控制的替代值，所以这些结果表明施用DS102提供了临床上显著的改善并且以剂量依赖性方式使血糖控制正常化。
图24A和图24B示出了安全性分析集(SAS)中第16周患者脂质分布的平均变化和中值(％)变化。这些结果进一步描绘于图25A至图25C中，说明施用DS102通过维持或降低患者的总胆固醇、VLDL-C、非HDL-C、残粒样颗粒(RLP)胆固醇和甘油三酯水平，显著地改善了患者的脂质分布。很明显，降低在第16周没有达到平台期，表明施用DS102可能在持续时间更长的研究中引起甚至更大的变化。
如图26所示，施用DS102还逆转了NASH的肝毒性脂质特征，并改善了在诊断为NASH的患者中改变的多种脂质类别。具体地讲，施用2gDS102显著降低了多种肝毒性甘油二酯的水平并显著提高了多种甘油磷脂基团的水平。这一发现很重要，因为NASH患者的肝和血浆甘油磷脂水平低。
图27示出，基于经验证的诊断检验(诸如OWL肝脏护理非侵入性NASH诊断检验)，施用DS102还解决了NASH。OWL肝脏护理是基于经活检证实的NASH患者的血浆脂质组学开发的检验，具有高预测价值。OWL肝脏护理用于区分NAFLD患者与正常肝脏患者的曲线下面积(AUC)为0.88，并且用于区分无脂肪性肝炎的NAFLD患者与NASH患者的AUC为0.79。在第16周，与安慰剂组相比，施用DS102以剂量依赖性方式显著改善了OWL肝脏护理诊断的NASH并使其正常化。表19示出了每个治疗组在基线时的检验诊断，证明大多数患者在基线时被分类为NASH或NAFLD，且2g DS102组中患者的百分比较低。
表19：基线时的OWL检验诊断
Figure BDA0003977255610000931
施用DS102还降低了诊断为NAFLD的患者按照CAP评估的肝脂肪含量，如图28所示。进一步设想，预期DS102在持续时间更长的研究中以及在通过更灵敏的方法评估时引起肝脂肪含量的更大变化。
施用DS102还降低了患者的甘油三酯水平，如表20所示，因此设想DS102还将有效降低心血管风险。
表20：施用DS102的患者在第16周时的甘油三酯水平变化
Figure BDA0003977255610000932
图29A至图29C示出，施用DS102减少了炎性蛋白和促纤维化蛋白。对于该评估，分析了用DS102治疗之前和之后的血液样本中包含大于350种不同蛋白质生物标记物的组。用2g DS102治疗显著下调了与炎症、纤维化、脂质代谢、细胞凋亡和趋化性相关联的超过150种标记物的表达。用DS102治疗后观察到代谢过载和脂毒性消退，其防止随后的细胞应激、炎症和纤维化。炎性蛋白和促纤维化蛋白减少表明DS102具有促使NASH消退和预防纤维化的潜力。
如图30所示，施用DS102还降低了多种NASH发展靶标的表达。特别地，施用2gDS102减少了NASH药物开发靶标，包括CCR2/5信号传导(Cenicriviroc-Allergan)、半乳凝素3(GR-MD-02-Galectin)和AOC3(Boehringer Ingelheim)。
图31中的火山图(Bonferroni和Benjamini-Hochberg检验的数据)示出，基于蛋白质表达的变化，施用2g DS102减少了炎性蛋白和促纤维化蛋白。表21示出了基于Bonferroni检验的最显著的炎性蛋白和促纤维化蛋白减少。
表21：基于Bonferroni检验的重要蛋白质
Figure BDA0003977255610000941
施用1g DS102还示出了TR的显著减少。表22示出了基于线性模型分析的最显著的炎性蛋白和促纤维化蛋白减少。
表22：基于线性模型的重要蛋白质
Figure BDA0003977255610000942
Figure BDA0003977255610000951
该分析还表明，基于Benjamini-Hochberg检验，1g DS107组中的1种蛋白质和安慰剂组中的0种蛋白质超过第一阈值。
施用DS102还降低了多种血管粘附分子的表达，如图32所示。血管粘附分子与动脉粥样硬化有关，它们的循环水平与心血管风险有关。
施用DS102还降低了与心血管风险增加相关的多种蛋白质的表达，如图33所示。
施用DS102还降低了多种循环趋化因子的表达，如图34所示。趋化因子是动脉粥样硬化慢性炎症的重要驱动因素。
施用DS102还降低了多种肿瘤坏死因子受体超家族成员的表达，如图35所示。肿瘤坏死因子受体超家族成员涉及炎症和动脉粥样硬化。
DS102还被证明是安全且耐受良好的，与安慰剂相比，没有观察到安全性和耐受性的差异。无药物相关严重不良事件(SAE)并且不良事件(AE)发生率低，这些现象在所有治疗组中都是一致的。大多数AE为轻度至中度并且是一过性的，患者均未发生导致治疗中止的AE。每个治疗组的安全性特征在表23中示出。
表23：研究组的安全性特征
患者，n(％) 2g DS102(n＝30) 1g DS102(n＝32) 安慰剂(n＝31)
≥1AE 15(50.0) 19(59.4) 17(54.8)
与研究药物相关的AE≥1 3(10.0) 2(6.3) 4(12.9)
≥1SAE 1(3.3) 0 1(3.2)
导致治疗中止的AE 0 0 1(3.2)
与药物研究相关的SAE 0 0 0
死亡 0 0 0
还评价了DS102改善相关适应症、原发性胆汁性肝硬化(PBC)和原发性硬化性胆管炎(PSC)的潜在功效，如图36A和图36B所示。重要的是，施用2g DS102使得碱性磷酸酶(ALP)以及肝纤维化的多种标记物减少，这表明DS102对于治疗PBC和PSC也会是有效的。
图37是15-HEPE乙酯(EE)血浆谷值相对浓度的箱形图，其表明DS102治疗组在第8周和第16周时如预期的那样存在较高的系统性暴露。
1.12总结
总而言之，这些结果表明，DS102通过显著降低代谢负荷以及改善胰岛素敏感性来靶向NASH病理的多个阶段。施用DS102还通过逆转与NASH相关的脂质累积水平，改善了患者的脂质分布。具体地讲，施用DS102的那些患者表现出肝毒性脂质水平(包括总胆固醇、非HDL胆固醇、RLP胆固醇、甘油三酯、甘油二酯和VLDL-C)的累积减少，以及甘油磷脂水平升高。这些作用是显著的，因为诊断为NASH的患者的特征在于总胆固醇、甘油三酯、甘油二酯和VLDL-C的水平高，以及甘油磷脂和ω-3 PUFA的水平低。此外，预期多种脂质的变化可降低心血管风险并改善代谢综合征的多个方面。
结果还表明存在有利于施用2g或更多DS102的剂量依赖性作用，且与安慰剂相比，存在较大且统计学显著的改善。
综上所述，DS102非常适合作为单一疗法或联合疗法的组成部分用于治疗NASH，并且预期可以降低心血管风险，包括对于诊断患有NASH或心血管代谢疾病(包括代谢综合征)的患者。
实施例5：对大鼠经口管饲15(S)-HEPE EE的26周毒性研究，随后是4周恢复期
本研究的目的是：(1)确定15(S)-HEPE EE(一种用于治疗肝脏疾病和肺部疾病的ω-3脂肪酸)在通过经口管饲法给予大鼠26周后的潜在毒性，并且评价任何发现的潜在可逆性；以及(2)确定15(S)-HEPE EE的毒代动力学特征。
1.1研究设计
通过每周7天、每天1次经口管饲法向适当的动物施用测试物和对照物，持续最少26周。用于每只动物的体积基于最近的体重测量结果。使用附接有管饲套管的注射器给予多剂药物。给药的第一天指定为第1天。从冰箱中取出给药配制物，在给药前至少搅拌30分钟。在给药期间也不断地搅拌给药制剂。
由于临床体征发作(包括弓背姿势、皮毛竖立、步态异常以及体重减轻)，从第45天起给予动物3206M、3515F和3703F给药假期，并且从第48天起给予组3的剩余动物给药假期。动物将从第64天起开始以较低剂量水平(3000mg/kg/天)给药。以下表格展示了本研究中使用的治疗(表23)和动物分组(表24)。
表24：治疗图表
Figure BDA0003977255610000971
a由于临床体征发作(包括弓背姿势、皮毛竖立、步态异常以及体重减轻)，从第48天起给予动物给药假期。动物将从第64天起开始以较低剂量水平(3000mg/kg/天)给药。
b用于批次2540M-1801和2540M-1802的经调整的浓度。
c用于批次2540M/1901和2540M/1902的经调整的浓度。
表25：动物分组
Figure BDA0003977255610000972
备用动物编号为4001M、4002M，以及4501F、4502F。
恢复期：在给药期结束后，留给指定的恢复中的动物最少4周的恢复期。
途径和剂量水平的合理性：选择口服施用途径用于本研究，因为该途径是向人给药的预期途径。每日给药一次的大鼠的前26周口服毒性显示，在所测试的最高剂量(1mg/kg/天)下没有副作用。参见Warren，H(2017).A 26 Week Study of 15(S)-HEPE EE byOral(Gavage)in Rats with a 4 Week Recovery Period.Charles River第529123号研究。鉴于在该研究中未观察到剂量限制性毒性，加28天剂量范围研究确定口服最大耐受剂量(MTD)为6g/kg/天。参见Murie，E(持续更新)。A Pilot 28-Day Study of DS102 by OralGavage in Rats.Charles River第506611号研究。开展本研究是为了评价15(S)-HEPE EE(DS102)在该MTD下的慢性毒性潜力，以符合ICH M3(R2)的要求。参见ICH HarmonisedTripartite Guideline M3(R2).Nonclinical Safety Studies for the Conduct ofHuman Clinical Trials and Marketing Authorisation for Pharmaceuticals。
1.2活体(In-Life)程序、观察和测量：
对所有主要研究动物和恢复中的动物进行了活体程序、观察和测量。对毒代动力学动物进行称重，在与主要研究动物相同的时间点记录了临床观察结果。
每天进行死亡率/濒死率检查。观察动物的总体健康率/死亡率和濒死率。观察期间没有将动物从笼中取出，除非有必要取出动物来鉴定或确认可能的发现。
临床观察：
每天进行笼侧观察。观察期间没有将动物从笼中取出，除非需要取出动物来鉴定或确认可能的发现。
每周进行详细的临床观察。将动物从笼中取出以便检查。
全天定期进行给药后观察。检查所有动物对治疗的反应。记录这些体征的发作、强度和持续时间；在给药期间以及给药后第一小时内特别注意动物的情况。
在预治疗期期间测量体重两次；在给药期期间每天测量一次；然后在恢复期期间每周测量两次。将动物一只只地称重。在计划内尸体剖检的第一天记录体重(仅对于主要研究动物和恢复中的动物)。
从第1周开始，直到给药期和恢复期，每周定量测量食物消耗量。
在整个研究过程中，定期目测水瓶饮水器，来观察水消耗量。
在施用散瞳剂(1％托吡卡胺，Mydriacy)之后，使用间接检眼镜进行了眼科检查。在预治疗期间，检查了所有主要研究动物和恢复中的动物。在第13周和第26周期间，检查了主要研究动物(对照和高剂量)。在第30周期间，检查了所有恢复中的动物。
1.3实验室评价：
临床病理学
样本采集：经由尾静脉采集血液，除非是在临尸体剖检前，在不可恢复的异氟烷麻醉下从眼窝窦采集血液。以递增顺序从动物采集血液，除非是在尸体剖检前，遵循安乐死顺序采集样本。如果没有超过允许的采样频率和血液体积，则获取额外的血液样本(例如，由于非血清样本凝结)。采集后，将样本转移到适当的实验室进行处理。根据下表采集样本。
表26：用于临床病理学评价的样本
Figure BDA0003977255610000991
X＝待采集样本；-＝不适用。
血液学：使用抗凝剂K2EDTA采集了0.5mL血液样本。对血液涂片进行标记、染色，然后储存起来。根据以下参数分析血液涂片。
表27：血液学参数
Figure BDA0003977255610001001
凝血：使用抗凝剂3.8％(w/v)柠檬酸三钠采集了0.5mL血液样本，将其处理为血浆。为了评估凝血，测量了以下凝血参数。
表28：凝血参数
Figure BDA0003977255610001002
临床化学：使用抗凝剂肝素锂采集了0.7mL血液样本，将其处理为血浆。为了评估临床化学，测量了以下参数：
表29：临床化学参数
Figure BDA0003977255610001003
a当总胆红素＞8.55μmol/L时，还要测量间接胆红素和直接胆红素。
尿分析：在未摄入食物但摄入了水的情况下，在6小时(+/-30min)的时段内从动物采集尿液。采集后，将样本转移到适当h的实验室进行处理。为了评估尿分析，测量了以下参数：
表30：尿分析参数
Figure BDA0003977255610001011
骨髓涂片分析：从所有动物采集骨髓，保存在10％中性缓冲福尔马林中。
生物分析和毒代动力学评价
生物分析样本采集：使用抗凝剂K2EDTA，采用无菌针头和一次性注射器经由颈静脉(或尾静脉，如果不能评估颈静脉的话)采集0.5mL血液样本。在完成血液采集计划后，将毒代动力学动物安乐死，不对动物尸体进行检查，直接丢弃。根据下表采集样本。
表31：毒代动力学评价样本采集方案
Figure BDA0003977255610001012
X＝待采集样本。-＝不适用。
a样本将在给药前采集
b动物3702F采集了第1天的样本，但在第44天，出于人道原因对该动物实施了安乐死。将在第26周从动物3707F(0ha采集)和3704F(4h采集)采集额外的样本，以涵盖动物3702F的缺失时间点。
生物分析样本处理：将样本轻轻混合并保持在湿碎冰上，直到在抽血后60分钟内离心。在4℃下将样本以1500g离心10分钟。将所得血浆分离，转移到被独特标记的透明聚丙烯管中，置于干冰上或设定为保持-20℃的冷冻器中尽可能快地冷冻。
生物分析样本分析：使用经验证的分析程序分析血浆样本的未酯化HEPE和总HEPE的浓度。测定了以下参数：
a)未酯化HEPE(HEPE以游离脂肪酸形式存在于血浆中，或与血浆白蛋白结合)。
b)在每个采样时间处的总HEPE(量化未酯化HEPE和酯化HEPE(例如，作为甘油三酯、胆固醇酯))浓度。
本研究按照生物分析实验室的适当标准操作规程进行了未酯化HEPE的已测样本再分析(ISR)。在试验机构的第527943号研究期间，已使用上文提到的分析过程成功地进行了ISR以测定大鼠血浆样本中的总HEPE，在本研究中无需重复ISR。
报告草案发布后，任何残留/留存的生物分析样本至少保存6个月，之后将样本丢弃。替代性地，如果最终报告在6个月保存期结束之前发布，则在6个月保存期结束之前将残留/留存样本丢弃。研究负责人也可以要求并授权提前将这些残留/留存样本丢弃。
毒代动力学评价：使用Phoenix药代动力学软件对毒代动力学参数进行了估计。使用与口服施用途径一致的非房室模型方法进行参数估计。只要可行，从第1天和第26周的血浆中的15(S)-HEPE EE组合物浓度的总游离酸和未结合游离酸生成所有参数。对以下参数进行了估计。
表32：待估计的参数
Figure BDA0003977255610001031
可以导出部分AUC(在任何给定的采样时间之间)并报告，以帮助解释。使用Phoenix生成适当分组和分类变量的描述性统计(Cmax和AUC(0-t)的标准误差)。还生成了TK表和TK图。
1.4末期程序
下表总结了本研究中使用的末期程序。
表33：主要研究动物的末期程序
Figure BDA0003977255610001032
X＝待开展的程序；-＝不适用
a参见组织采集与防腐表以查看组织列表。
b靶组织是肝(雄性和雌性)、甲状腺(雄性和雌性)、肾(仅雌性)、骨髓胸骨(仅雄性)。
计划外死亡：如果主要研究动物或恢复中的动物在研究期间死亡，则进行尸体剖检并保存指定的组织。如有必要将动物冷藏，以使自溶最小化。按照试验机构SOP，出于人道原因对主要研究动物或恢复中的动物实施了安乐死。记录体重，如果可能，获得用于评价临床病理学参数的样本。对这些动物进行尸体剖检，留存指定的组织。如有必要将动物冷藏，以使自溶最小化。对在研究期间死亡或因人道原因被安乐死的毒代动力学动物进行了有限的尸体剖检检查。该检查包括评价胸腔、腹腔和盆腔中的器官和组织，并且没有留存组织。在该有限的尸体剖检检查期间，特别关注可能存在管饲创伤的证据。记录体重，采集用于评价毒代动力学分析的样本。
计划内安乐死：对存活到计划内安乐死的主要研究动物和恢复中的动物实施安乐死，手段是通过将这些动物暴露于含量不断上升的二氧化碳；记录最终体重，随后将动物放血。在可能的情况下，跨各剂量组以旋转顺序对动物实施安乐死，使得在全天内对来自每个组的相似数量的动物(包括对照)进行尸体剖检。在计划内尸体剖检之前，动物未禁食。通过批准的方法对存活到计划内安乐死的毒代动力学动物实施安乐死。未进行尸体剖检，也未采集组织。
尸体剖检：对主要研究动物和恢复中的动物进行完整的尸体剖检检查，包括评价动物尸体和肌肉骨骼系统；所有外表面和孔口；颅腔和脑外表面；以及胸腔、腹腔和盆腔，及其相关联的器官和组织。尸体剖检程序是由经过适当动物解剖和眼观病理学培训以及具备相关经验的合格人员进行的。
器官重量：在尸体剖检时(除非另外指明)，对所有计划内安乐死动物的在组织采集与防腐表中被确认用于称重的器官进行称重。未记录发现死亡或者在不良状态或濒死状态下安乐死的动物的器官重量。将成对的器官一起称重。在眼观异常的情况下，除该总重量外，还取一对器官中的每个器官称重，输入结果作为对组织的注释。将最终的体重和脑重量用于器官重量分析。
组织采集和防腐：根据下表采集的组织保存在10％中性缓冲福尔马林中。
表34：组织采集与防腐表
器官 重量 宏观评价和采集 组织学处理 显微镜评价
动物ID - X - -
主动脉 - X X X
体腔(鼻腔) - X - -
骨髓(胸骨) - X X X
骨髓涂片 - X<sup>a</sup> - -
股骨 - X(1) X(1) X(1)
胸骨 - X X X
脑 X X X X
子宫颈 - X X X
附睾 X(2) X(2)<sup>b</sup> X(2) X(2)
食道 - X X X
眼睛 - X(2)<sup>b</sup> X(2) X(2)
肾上腺 X(2) X(2) X(2) X(2)
阴蒂腺 - X(2) - -
泪腺 - X(2，眶外) - -
Figure BDA0003977255610001051
Figure BDA0003977255610001061
X＝待开展的程序-＝不适用(1)＝单侧。(2)＝两侧。
所列器官和其他器官的宏观异常将在尸体剖检时采样，组织学处理后进行显微镜检查。
a在计划内和计划外尸体剖检时将从股骨采集两份骨髓涂片(用于可能的检查)。不从发现死亡的动物、也不从濒死状态下安乐死的动物采集涂片，涂片在尸体剖检前储存在冰箱中。使骨髓涂片风干，不将其固定在福尔马林中。
b眼睛和视神经保存在Davidson固定液中。睾丸和附睾保存在改良的Davidson固定液中。
c来自小肠：派尔斑或孤立淋巴滤泡。
d固定后称重
1.5剂量配制物及分析
对照项：本研究的对照项是0.5％HPMC的Milli-Q水溶液。根据需要制备对照项，在不使用时将其储存在设定为保持4℃的冰箱中。从冰箱中取出制备的对照项，在给药前至少搅拌30分钟。在给药期间也不断地搅拌对照项。
试验项：本研究的试验项是DS102或15(S)-HEPE EE。基于在试验机构建立的方法，以满足剂量水平要求的适当浓度制备了试验项给药配制物。每周制备给药配制物，储存在设定为保持4℃的冰箱中，每天分配。从冰箱中取出给药配制物，在给药前至少搅拌30分钟。在给药期间也不断地搅拌给药配制物。
样本采集和分析
在确定的稳定期内提交分析样本。所有分析样本均在环境温度下转移到试验机构的分析实验室中。报告草案发布后，任何残留/留存的分析样本至少保存6个月，之后将样本丢弃。替代性地，在最终报告于6个月保存期结束之前发布的情况下，在6个月保存期结束之前将残留/留存样本丢弃。与申办者协商后，研究负责人也可以授权提前将这些残留/留存样本丢弃。采集剂量配制物样本用于分析，如下表所指示。可以由研究负责人自行决定采集附加样本并加以分析。
表35：剂量配制物样本采集计划表
间隔 浓度 均质性 稳定性
第1天 所有组 第2组至第3组<sup>a</sup> N/A
第2周 所有组 第2组至第3组<sup>a</sup> N/A
第10周 第3组 第3组 N/A
第13周 所有组 N/A N/A
第14周 所有组 所有组<sup>a</sup> N/A
第26周 所有组 N/A N/A
N/A＝不适用。
a将从第2组至第3组的制备物的顶部、中部和底部获得的均质性结果求平均值，将该平均值用作浓度结果。
分析方法
通过带UV检测的UPLC，使用经验证的分析程序进行了下述分析。
浓度分析：
·分析用样品：将顶部、中部和底部的平行双样(中部的平行双样仅用作对照)送去分析。在仅对浓度进行评估的情况下，仅采集了中部平行双样。
·备用样品：顶部、中部和底部的三个平行样(中部的三个平行样仅用作对照)保存在试验机构。可以由研究负责人自行决定分析备用样品。在仅对浓度进行评估的情况下，将仅采集中部的三个平行样。
·采样容器：适当尺寸的容量瓶。
·样品体积：
·第1组：取0.5mL移入50mL容量瓶中。
·第2组：取0.25mL移入50mL容量瓶中。
·第3组：取0.25mL移入50mL容量瓶中。
·记录所有样品的重量。
·储存条件：储存在设定为保持4℃的冰箱中。
·合格标准：可接受性标准为平均样品浓度结果与理论浓度相差不超过±10％。对于均质性，可接受性标准为每组浓度的相对标准偏差(RSD)≤10％。
稳定性分析：之前结合试验机构第439414号研究进行的稳定性分析证明，试验项当在与本研究所用相同的条件下以加括号的浓度制备和储存时，在媒剂中是稳定的。参见Rogers，E(2018).Validation of an Ultra High-Performance Liquid ChromatographicMethod for the Determination of 15(S)HEPE EE in oral(Gavage)DosingFormulations.Charles River第439414号研究。稳定性数据留存在试验机构同上的第439414号研究的研究记录中。
1.6试验系统
动物：本研究使用购自Charles River UK Limited(Margate，Kent，UK)的雄性和雌性Sprague Dawley大鼠。初始给药时的目标年龄为7至8周。初始给药时的目标体重为175g至300g(雄性)和120g至250g(雌性)。使用皮下植入的圆柱形“玻璃焊封”TROVAN电子微芯片来标识每只动物。
1.7饲养
饲养设施：在开始给药前，使动物适应试验机构的啮齿动物毒理学饲养环境长达3周的时间。将动物随机分配给各组。雄性和雌性分别随机分组。健康状况差的动物未分配给各组。将动物以按性别每笼2或3只的数量饲养在悬挂的适当尺寸的聚碳酸酯/聚丙烯笼中，笼顶部为不锈钢网格，底部为实心的。使用白色无菌刨花作为垫材。
环境条件：动物房环境的目标条件如下：温度为19℃至23℃；湿度为40％至70％；通风频率为每小时最少换气10次；光照周期为12小时光照和12小时黑暗。自动控制光照、温度和湿度，并且连续监测和记录。
饮食：让SDS大鼠和小鼠自由采食(改良的)1号SQC扩展饮食。让动物从水瓶饮水器中自由饮用自来水。定期分析试验机构使用的水中的溶解物质、重金属、农药残留、pH、硝酸盐和亚硝酸盐。还进行了微生物筛查。
动物丰容：为了在心理/环境方面丰容，将动物以群居方式饲养，并且为动物提供诸如用于藏身的装置和用于咀嚼的物体等多种物件，被研究程序/活动中断时除外。
兽医护理：在整个研究过程中可获得兽医护理，动物由兽医工作人员根据临床体征或其他变化进行检查。兽医的所有检查结果和推荐的治疗处置(如果有的话)均记载于研究记录中。
1.8组织学和组织病理学
组织学：将组织采集与防腐表中确认的组织包埋在石蜡中，切片后固定在载玻片上，用苏木精和曙红染色。
组织病理学：由经过委员会认证的兽医病理学家或拥有实验室动物病理学培训背景和经验的兽医病理学家进行了组织病理学评价。对来自主要研究的对照动物和高剂量动物、计划外死亡和眼观病变(包括来自主要研究的低剂量组和恢复中的动物)的组织进行了显微镜检查。如果在主要研究的高剂量组中存在治疗效果，则在获得申办者和研究负责人的同意后，通过方案修订对来自主要研究的低剂量组和恢复中的动物的靶组织进行了显微镜检查。
1.9计算机化系统
计算机化系统：计算机化系统的下表可用于本研究：
表36：关键的计算机化系统
Figure BDA0003977255610001101
1.10统计分析
将给药前的时期期间收集的数据制成表格，总结并统计分析。除非另外指明，否则所有统计分析均在相应的研究阶段内进行。对在计划的场合收集的数值数据(除了来自毒代动力学动物的数据之外)进行总结和统计分析，如下文根据性别和场合所指示的。
构造的变量：计算了每个计划的间隔之间的体重变化。对于计划的间隔，针对最终体重计算了器官重量相对于体重的比例。对于计划的间隔，针对脑重量计算了器官重量相对于脑重量的比例。
描述性统计分析：平均值、标准偏差(或者％变异系数或标准误差(当认为适当时))、百分比、数字和/或发病率将视情况由数据集报告。
推断性统计分析：所有统计分析均以5％显著性水平进行。除非另外指明，否则所有成对比较均使用双侧检验进行，并且以1％和5％的水平报告。感兴趣的成对比较在下方列出：
·第2组对比第1组
·第3组对比第1组
当可能时，根据以下矩阵进行分析，但排除了观察次数少于3次的任何组。
表37：统计矩阵
Figure BDA0003977255610001111
参数/非参数：Levene检验用于评估组方差的均一性。如果Levene检验不显著或Kruskal-Wallis检验不显著，则使用整体单因素方差分析F检验对各组进行了比较。如果发现整体F检验或Kruskal-Wallis检验是显著的，则分别使用Dunnett或Dunn检验进行成对比较。
1.11结果
红细胞计数、红细胞分布宽度和网织红细胞计数的变化：图38A至图38C示出了施用15(S)-HEPE EE或安慰剂的大鼠的红细胞计数(RBC)、红细胞分布宽度(RDW)和网织红细胞计数(RETIC)的变化。通过经口管饲法每天施用一次15(S)-HEPE EE或安慰剂，一周施用7天，至少持续26周。用于每只动物的体积基于最近的体重测量结果。如表38中所指出的，6g/kg/天的最高剂量不能很好地耐受，因而将其替换为3g/kg/天的较低剂量。
表38：施用15(S)-HEPE EE的大鼠中RBC、RDW和RETIC的变化
Figure BDA0003977255610001121
RBC的变化：图38A和表38示出，与对照相比，施用3g/kg/天的剂量导致RBC显著增加。
RDW的变化：图38B和表38示出，与对照相比，施用2g/kg/天和3g/kg/天这两种剂量均导致RDW显著减小。
RETIC的变化：图38C和表38示出，与对照相比，施用2g/kg/天和3g/kg/天这两种剂量均导致RETIC显著减少。
这些结果表明，15-HEPE对影响血红蛋白和红细胞的许多病症具有治疗潜力。
凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间和纤维蛋白原浓度的变化：图39A至图39C示出了施用15(S)-HEPE EE或安慰剂的大鼠的凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)和纤维蛋白原(FIB)浓度的变化。通过经口管饲法每天施用一次15(S)-HEPE EE或安慰剂，一周施用7天，至少持续26周。用于每只动物的体积基于最近的体重测量结果。如表39中所指出的，6g/kg/天的最高剂量不能很好地耐受，因而将其替换为3g/kg/天的较低剂量。
表39：施用15(S)-HEPE EE的大鼠中PT、APTT和FIB浓度的变化
Figure BDA0003977255610001131
PT的变化：图39A和表39示出，与对照相比，施用2g/kg/天和3g/kg/天这两种剂量均导致PT显著增加。
APTT的变化：图39B和表39示出，与对照相比，施用2g/kg/天和3g/kg/天这两种剂量均导致APTT显著增加。
FIB浓度的变化：图39C和表39示出，与对照相比，施用2g/kg/天和3g/kg/天这两种剂量均导致FIB浓度显著减小。
这些结果表明，15-HEPE具有抗凝血作用和抗血栓形成作用。
下文阐述本公开的各种实施方案：
段落A：一种治疗和/或预防对其有需要的受试者的代谢综合征的方法，该方法包括向受试者施用15-HEPE、15-HETrE，或者包含15-HEPE和/或15-HETrE的组合物。
段落B：一种治疗和/或预防对其有需要的受试者的心血管代谢疾病的方法，该方法包括向受试者施用15-HEPE、15-HETrE，或者包含15-HEPE和/或15-HETrE的组合物。
段落C：一种治疗和/或预防对其有需要的受试者的代谢综合征和/或心血管代谢疾病的方法，该方法包括向受试者施用最多约8g包含15-HEPE和/或15-HETrE的组合物，其中15-HEPE和/或15-HETrE按重量计占该组合物中所有脂肪酸的至少约90％。
段落D：一种治疗和/或预防对其有需要的受试者的代谢综合征和/或心血管代谢疾病的方法，该方法包括向受试者施用最多约8g包含15-HEPE的组合物，其中15-HEPE按重量计占该组合物中所有脂肪酸的至少约90％，并且其中受试者表现出一种或多种下列现象：甘油二酯、甘油磷脂、肝脂肪、血压、腰围和/或游离脂肪酸的水平降低；和/或甘油磷脂水平升高。
段落E：一种预防受试者的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)从第一阶段进展至第二阶段的方法，该方法包括向受试者施用最多约8g包含15-HEPE的组合物。
段落F：根据段落E所述的方法，其中第一阶段是代谢过载、肝脂肪含量增加和脂毒性、细胞应激凋亡、炎症和/或纤维化重塑。
段落G：根据段落E或段落F所述的方法，其中第二阶段是肝脂肪含量增加和脂毒性、细胞应激凋亡、炎症和/或纤维化重塑。
段落H：一种治疗和/或预防对其有需要的患有非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、代谢综合征和/或心血管代谢疾病的受试者的心血管疾病的方法，该方法包括向受试者施用15-HEPE、15-HETrE，或者包含15-HEPE和/或15-HETrE的组合物。
段落I：一种治疗和/或预防对其有需要的患有非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、代谢综合征或心血管代谢疾病的受试者的心血管疾病的方法，该方法包括向受试者施用最多约8g包含15-HEPE的组合物，其中15-HEPE按重量计占该组合物中所有脂肪酸的至少约90％。
段落J：根据段落A至I中任一者所述的方法，其中受试者表现出以下一项或多项的水平降低：α-平滑肌作用(α-SMA)、金属肽酶抑制因子-1(TIMP-1)、转化生长因子-β(TGF-β)和/或1型胶原蛋白。
段落K：根据段落A至C或E至J中任一者所述的方法，其中受试者表现出甘油二酯、肝脂肪、血压、腰围和/或游离脂肪酸的水平降低，以及/或者甘油磷脂水平升高。
段落L：根据段落A至K中任一者所述的方法，其中受试者表现出碱性磷酸酶(ALP)水平降低。
段落M：根据段落A至L中任一者所述的方法，其中受试者表现出血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)和/或胆红素(BUN)的水平降低。
段落N：根据段落A至M中任一者所述的方法，其中受试者表现出纤维化面积减小。
段落O：根据段落A至N中任一者所述的方法，其中受试者表现出血红蛋白A1C(HbA1C)、稳态模型评估胰岛素抵抗(HOMA-IR)和/或脂肪组织胰岛素抵抗(adipo-IR)的水平降低。
段落P：根据段落H至O中任一者所述的方法，其中NAFLD是非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
段落Q：根据段落B至D或F至P中任一者所述的方法，其中心血管代谢疾病或心血管疾病是以下一项或多项：血脂异常、高脂血症、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、原发性高胆固醇血症、原发性高脂血症、常见原发性高脂血症、常见高胆固醇血症、家族性高脂血症、家族性原发性高脂血症、家族性高胆固醇血症、家族性高甘油三酯血症、家族性混合型高脂血症、家族性载脂蛋白b-100缺陷症、继发性高脂血症、混合型高脂血症、心血管疾病、残留心血管风险、预防动脉粥样硬化斑块形成/进展、微血管疾病、大血管疾病、动脉粥样硬化、冠状动脉粥样硬化、舒张功能障碍、降低心血管风险、预防严重冠状动脉事件、预防严重不良心血管事件、预防缺血事件、二级/一级预防心血管事件、预防心血管性死亡、心肌梗塞、卒中、心绞痛、恢复正常内皮功能、糖尿病(diabetes)、糖尿病(diabetes mellitus)、胰岛素抵抗、高胰岛素血症、高血糖症、血糖代谢障碍、诱导血糖控制、葡萄糖耐量受损，以及空腹葡萄糖受损。
段落R：根据段落Q所述的方法，其中微血管疾病是视网膜病、肾病、神经病、或它们的组合。
段落S：根据段落Q所述的方法，其中大血管疾病是卒中、外周血管疾病、肢体缺血、心脏病、或它们的组合。
段落T：根据段落A至S中任一者所述的方法，其中受试者表现出极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)、非高密度脂蛋白胆固醇(非HDL-C)和/或残粒样颗粒胆固醇(RLP-C)和/或高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的水平降低。
段落U：根据段落A至T中任一者所述的方法，其中受试者表现出肝硬度、纤维化-4(FIB-4)、肝纤维化增强(ELF)评分和/或NAFLD评分(NFS)降低。
段落V：根据段落A至U中任一者所述的方法，其中受试者表现出炎性蛋白和促纤维化蛋白减少，其中炎性蛋白和促纤维化蛋白选自由以下项组成的组：纤溶酶原激活物抑制因子-1(PAI-1)、金属肽酶抑制因子-1(TIMP-1)、二肽基肽酶4(DPP4)、TREM样转录物2(TLT2)、趋化因子(C-C基序)配体16(CCL16)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、血清淀粉样蛋白A4(SAA4)、磷酸肌醇3(PI3)、硫氧还蛋白还原酶(TR)、白细胞免疫球蛋白样受体B1(LILBR1)、含铜胺氧化酶3(AOC3)、丝氨酸蛋白酶2(PRSS2)，以及肿瘤坏死因子配体超家族成员11A(TNRSF11A)。
段落W：一种治疗或预防受试者的胆汁淤积性肝病的方法，该方法包括向受试者施用15-HEPE、15-HETrE，或者包含15-HEPE和/或15-HETrE的组合物。
段落X：根据段落W所述的方法，其中胆汁淤积性肝病是原发性胆汁性胆管炎(PBC)、原发性硬化性胆管炎(PSC)、进行性家族性肝内胆汁淤积、或它们的组合。
段落Y：根据段落W或段落X所述的方法，其中胆汁淤积性肝病是由以下原因引起的：药物诱导的肝损伤、全胃肠外营养(TPN)、病毒性和酒精性肝炎、继发于全身性疾病的胆汁淤积、移植物功能障碍、肝移植后胆汁淤积、胰腺炎、胆总管结石病、Mirizzi综合征、遗传疾病、恶性肿瘤、或它们的组合。
段落Z：根据段落Y所述的方法，其中恶性肿瘤是肝细胞癌、胆管肿瘤、胰腺癌、或它们的组合。
段落AA：根据段落W至Z中任一者所述的方法，其中受试者表现出细胞因子和/或趋化因子的水平降低，其中细胞因子和/或趋化因子选自由以下项组成的组：α-平滑肌作用(α-SMA)、金属肽酶抑制因子-1(TIMP-1)、转化生长因子-β(TGF-β)和1型胶原蛋白。
段落BB：一种治疗或预防受试者的肾病的方法，该方法包括向受试者施用15-HEPE和/或15-HETrE或者包含15-HEPE和/或15-HETrE的组合物，其中受试者具有至少一种肾病风险因素。
段落CC：根据段落BB所述的方法，其中肾病选自由以下项组成的组：肾纤维化、肾小管间质纤维化、慢性肾病、严重间质纤维化、肾间质纤维化和终末期肾病。
段落DD：根据段落CC所述的方法，其中肾病导致纤维化。
段落EE：根据段落BB至DD中任一者所述的方法，其中至少一种肾病风险因素选自由以下项组成的组：糖尿病、高血压、心血管疾病、肾小球肾炎和多囊性肾病。
段落FF：根据段落BB至EE中任一者所述的方法，其中受试者表现出肾羟脯氨酸水平降低。
段落GG：根据段落BB至FF中任一者所述的方法，其中受试者表现出α-SMA、TIMP-1、TGF-β和/或1型胶原蛋白的水平未升高。
段落HH：根据段落BB至GG中任一者所述的方法，其中受试者表现出α-SMA、TIMP-1、TGF-β和/或1型胶原蛋白的水平降低。
段落II：根据段落AA至HH中任一者所述的方法，其中受试者表现出肝脏中的促纤维化细胞因子减少。
段落JJ：根据段落II所述的方法，其中促纤维化细胞因子是以下一项或多项：α-SMA、TIMP-1、TGF-β、1型胶原蛋白、白介素1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、白介素-6(IL-8)、白介素-13(IL-13)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、TNF样配体1A(TL1A)、芳香烃受体(AhR)、白介素-17(IL-17)、白介素-23(IL-23)、白介素-11(IL-11)和/或白介素-33(IL-33)。
段落KK：根据段落A至JJ中任一者所述的方法，其中受试者表现出血管粘附分子和/或趋化因子和/或肿瘤坏死因子受体超家族成员减少。
段落LL：根据段落A至KK中任一者所述的方法，其中15-HEPE、15-HETrE或者包含15-HEPE和/或15-HETrE的组合物口服施用。
段落MM：根据段落A至LL中任一者所述的方法，其中15-HEPE和/或15-HETrE为游离酸形式、酯化形式或盐形式。
段落NN：根据段落MM所述的方法，其中酯化形式为烷基酯形式或甘油三酯形式。
段落OO：根据段落A至NN中任一者所述的方法，其中15-HEPE包括15(S)-HEPE、15(R)-HEPE或它们的组合，并且/或者15-HETrE包括15(S)-HETrE、15(R)-HETrE或它们的组合。
段落PP：根据段落A至OO中任一者所述的方法，其中该组合物包含约1g至约2g的15-HEPE和/或15-HETrE。
段落QQ：根据段落A至PP中任一者所述的方法，其中该组合物包含约2g或更多的15-HEPE和/或15-HETrE。
段落RR：根据段落A至QQ中任一者所述的方法，其中该组合物包含约1g或约2g的15-HEPE和/或15-HETrE。
段落SS：根据段落A至RR中任一者所述的方法，其中该组合物包含约10mg至约10,000mg的15-HEPE和/或15-HETrE。
段落TT：根据段落A至SS中任一者所述的方法，其中该组合物包含约5mg/kg、约50mg/kg、约250mg/kg或约500mg/kg的15-HEPE和/或15-HETrE。
段落UU：根据段落A至TT中任一者所述的方法，其中15-HEPE和/或15-HETrE按重量计占该组合物中存在的所有脂肪酸的至少约90％。
段落VV：根据段落A至UU中任一者所述的方法，其中该组合物以每天1至8粒胶囊施用。
段落WW：根据段落A至C或H至VV中任一者所述的方法，其中该方法包括向受试者施用15-HEPE或包含15-HEPE的组合物。
段落XX：根据段落A至C或H至VV中任一者所述的方法，其中该方法包括向受试者施用15-HETrE或包含15-HETrE的组合物。
段落YY：一种治疗和/或预防对其有需要的受试者的血液系统异常的方法，该方法包括向受试者施用15-羟基二十碳五烯酸(15-HEPE)或包含15-羟基二十碳五烯酸(15-HEPE)的组合物。
段落ZZ：根据段落YY所述的方法，其中血液系统异常选自由以下项组成的组：贫血、血癌和凝血缺陷。
段落AB：根据段落ZZ所述的方法，其中贫血选自由以下项组成的组：营养性贫血和非营养性贫血。
段落AC：根据段落ZZ所述的方法，其中血癌选自由以下项组成的组：淋巴瘤、白血病和骨髓瘤。
段落AD：根据段落ZZ所述的方法，其中凝血缺陷选自由以下项组成的组：血栓形成倾向、血友病、血管性血友病和血小板减少症。
段落AE：一种治疗和/或预防对其有需要的受试者的血红蛋白异常的方法，该方法包括向受试者施用15-羟基二十碳五烯酸(15-HEPE)或包含15-HEPE的组合物。
段落AF：一种治疗和/或预防对其有需要的受试者的红细胞异常的方法，该方法包括向受试者施用15-羟基二十碳五烯酸(15-HEPE)或包含15-HEPE的组合物。
段落AG：一种治疗和/或预防对其有需要的受试者的血红蛋白异常和/或红细胞异常的方法，该方法包括向受试者施用最多约8g包含15-HEPE的组合物，其中15-HEPE按重量计占该组合物中所有脂肪酸的至少约90％。
段落AH：一种治疗和/或预防对其有需要的受试者的血红蛋白异常和/或红细胞异常的方法，该方法包括向受试者施用最多约8g包含15-HEPE的组合物，其中15-HEPE按重量计占该组合物中所有脂肪酸的至少约90％，并且其中受试者表现出一种或多种下列现象：
(a)红细胞计数增加；
(b)红细胞分布宽度减小；以及/或者
(c)网织红细胞计数减少。
段落AI：根据段落AH所述的方法，其中与未接受该组合物的对照受试者相比，受试者的红细胞计数增加至少10％、至少15％、至少20％、至少25％或至少30％。
段落AJ：根据段落AI所述的方法，其中对照受试者的红细胞计数为约4×1012个红细胞/L。
段落AK：根据段落AH所述的方法，其中与未接受该组合物的对照受试者相比，受试者的红细胞分布宽度减小约15％至20％、约20％至25％、约25％至30％、约30％至35％，或约35％至40％。
段落AL：根据段落AK所述的方法，其中对照受试者的红细胞分布宽度大于15％。
段落AM：根据段落AH所述的方法，其中与未接受该组合物的对照受试者相比，受试者的网织红细胞计数减少至少约5％、至少约10％、至少约15％或至少约20％。
段落AN：根据段落AM所述的方法，其中对照受试者的网织红细胞计数大于红细胞总数的5％。
段落AO：一种治疗和/或预防对其有需要的受试者的溶血性贫血的方法，该方法包括向受试者施用最多约8g包含15-HEPE的组合物，其中15-HEPE按重量计占该组合物中所有脂肪酸的至少约90％。
段落AP：根据段落AO所述的方法，其中溶血性贫血是遗传性溶血性贫血或获得性溶血性贫血。
段落AQ：根据段落AP所述的方法，其中遗传性溶血性贫血选自由以下项组成的组：镰状细胞病、镰状细胞贫血、β-地中海贫血和遗传性球形红细胞增多症。
段落AR：根据段落AP所述的方法，其中获得性溶血性贫血选自由以下项组成的组：继发于感染、药物治疗、血液恶性肿瘤、自身免疫疾病、脾功能亢进、机械心脏瓣膜和输血。
段落AS：根据段落AQ所述的方法，其中镰状细胞病和镰状细胞贫血与镰状细胞危象、血管闭塞危象和/或脾隔离危象相关联。
段落AT：根据前述段落YY至AS中任一者所述的方法，其中15-HEPE为乙酯形式(15-HEPE EE)，或者15-HEPE为光学活性酯形式(15(S)-HEPE EE)。
段落AU：根据段落AE至AN中任一者所述的方法，其中血红蛋白异常和/或红细胞异常选自由以下项组成的组：遗传性溶血性贫血、获得性溶血性贫血、范科尼贫血、缺铁性贫血、叶酸缺乏症、B12缺乏症和骨髓增生异常综合征。
段落AV：根据段落YY至AG或AO至AT中任一者所述的方法，其中受试者表现出红细胞计数增加、网织红细胞计数减少和红细胞分布宽度减小。
段落AW：一种治疗和/或预防对其有需要的受试者的血液系统异常和/或血液异常的方法，该方法包括向受试者施用最多约8g包含15-HEPE的组合物，其中15-HEPE按重量计占该组合物中所有脂肪酸的至少约90％。
段落AX：根据段落AW所述的方法，其中15-HEPE为乙酯形式(15-HEPE EE)，或者15-HEPE为光学活性酯形式(15(S)-HEPE EE)。
段落AY：根据段落AW所述的方法，其中血液系统异常和/或血液异常选自由以下项组成的组：遗传性溶血性贫血、获得性溶血性贫血、范科尼贫血、缺铁性贫血、叶酸缺乏症、B12缺乏症和骨髓增生异常综合征。
段落AZ：根据段落AY所述的方法，其中溶血性贫血是遗传性溶血性贫血或获得性溶血性贫血。
段落BA：根据段落AZ所述的方法，其中遗传性溶血性贫血选自由以下项组成的组：镰状细胞病、镰状细胞贫血、β-地中海贫血和遗传性球形红细胞增多症。
段落BC：根据段落AZ所述的方法，其中获得性溶血性贫血选自由以下项组成的组：继发于感染、药物治疗、血液恶性肿瘤、自身免疫疾病、脾功能亢进、机械心脏瓣膜和输血。
段落BD：根据段落BA所述的方法，其中镰状细胞病和镰状细胞贫血与镰状细胞危象、血管闭塞危象和/或脾隔离危象相关联。
段落BE：根据段落AW至BD中任一者所述的方法，其中受试者表现出红细胞计数增加、网织红细胞计数减少和红细胞分布宽度减小。
段落BF：一种治疗和/或预防对其有需要的受试者的血栓形成倾向异常的方法，该方法包括向受试者施用15-羟基二十碳五烯酸(15-HEPE)或包含15-HEPE的组合物。
段落BG：一种治疗和/或预防对其有需要的受试者的血栓形成倾向的方法，该方法包括向受试者施用最多约8g包含15-HEPE的组合物，其中15-HEPE按重量计占该组合物中所有脂肪酸的至少约90％。
段落BH：一种治疗和/或预防对其有需要的受试者的血栓形成倾向的方法，该方法包括向受试者施用最多约8g包含15-HEPE的组合物，其中15-HEPE按重量计占该组合物中所有脂肪酸的至少约90％，并且其中受试者表现出一种或多种下列现象：
(a)凝血酶原时间延长；
(b)活化部分凝血活酶时间延长；以及/或者
(c)纤维蛋白原浓度降低。
段落BI：一种治疗和/或预防对其有需要的受试者的静脉血栓栓塞的方法，该方法包括向受试者施用最多约8g包含15-HEPE的组合物，其中15-HEPE按重量计占该组合物中所有脂肪酸的至少约90％。
段落BJ：一种治疗和/或预防对其有需要的受试者的动脉血栓形成的方法，该方法包括向受试者施用最多约8g包含15-HEPE的组合物，其中15-HEPE按重量计占该组合物中所有脂肪酸的至少约90％。
段落BK：一种预防对其有需要的受试者的栓塞的方法，该方法包括向受试者施用最多约8g包含15-羟基二十碳五烯酸(15-HEPE)的组合物，其中15-HEPE按重量计占该组合物中所有脂肪酸的至少约90％。
段落BL：根据段落BI至BK所述的方法，其中第一阶段是形成血栓。
段落BM：根据段落BF至BG或BI至BL中任一者所述的方法，其中受试者表现出凝血酶原时间延长、活化部分凝血活酶时间延长和纤维蛋白原浓度降低。
段落BN：根据段落YY至BM中任一者所述的方法，其中15-HEPE口服施用。
段落BO：根据段落YY至BN中任一者所述的方法，其中该组合物以每天1至8粒胶囊施用。
段落BP：根据段落YY至BO中任一者所述的方法，其中15-HEPE为游离酸形式、酯化形式或盐形式。
段落BQ：根据段落YY至BP中任一者所述的方法，其中该组合物包含约1g至约2g的15-HEPE。
段落BR：根据段落YY至BQ中任一者所述的方法，其中该组合物包含约2g至更多的15-HEPE。
段落BS：根据段落YY至BR中任一者所述的方法，其中该组合物包含约5mg/kg、约50mg/kg、约250mg/kg或约500mg/kg的15-HEPE。
Figure IDA0003977255650000011
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Claims (33)

1.一种治疗和/或预防对其有需要的受试者的血液系统异常的方法，所述方法包括向所述受试者施用15-羟基二十碳五烯酸(15-HEPE)或包含15-HEPE的组合物。
2.一种治疗和/或预防对其有需要的受试者的血红蛋白异常的方法，所述方法包括向所述受试者施用15-HEPE或包含15-HEPE的组合物。
3.一种治疗和/或预防对其有需要的受试者的红细胞异常的方法，所述方法包括向所述受试者施用15-HEPE或包含15-HEPE的组合物。
4.一种治疗和/或预防对其有需要的受试者的溶血性贫血的方法，所述方法包括向所述受试者施用最多约8g包含15-HEPE的组合物。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述血液系统异常选自由以下项组成的组：贫血、血癌和凝血缺陷。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述贫血是营养性贫血、非营养性贫血、或它们的组合。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述血癌选自由以下项组成的组：淋巴瘤、白血病和骨髓瘤。
8.根据权利要求5所述的方法，其中所述凝血缺陷选自由以下项组成的组：血栓形成倾向、血友病、血管性血友病和血小板减少症。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中与未接受所述15-HEPE或所述组合物的对照受试者相比，所述受试者的红细胞计数增加、红细胞分布宽度减小以及/或者网织红细胞计数减少。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中与未接受所述15-HEPE或所述组合物的对照受试者相比，所述受试者的红细胞计数增加至少10％、至少15％、至少20％、至少25％或至少30％。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中与未接受所述15-HEPE或所述组合物的对照受试者相比，所述受试者的红细胞分布宽度减小约15％至约20％、约20％至约25％、约25％至约30％、约30％至约35％，或约35％至约40％。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的方法，其中所述对照受试者的红细胞分布宽度大于15％。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中与未接受所述15-HEPE或所述组合物的对照受试者相比，所述受试者的网织红细胞计数减少至少约5％、至少约10％、至少约15％或至少约20％。
14.根据权利要求9至13中任一项所述的方法，其中所述对照受试者的网织红细胞计数大于红细胞总数的5％。
15.根据权利要求2至14中任一项所述的方法，其中所述血红蛋白异常和/或所述红细胞异常选自由以下项组成的组：遗传性溶血性贫血、获得性溶血性贫血、范科尼贫血、缺铁性贫血、叶酸缺乏症、B12缺乏症和骨髓增生异常综合征。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述遗传性溶血性贫血选自由以下项组成的组：镰状细胞病、镰状细胞贫血、β-地中海贫血和遗传性球形红细胞增多症。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述获得性溶血性贫血是从选自由以下项组成的组的异常或病症获得的：继发于原发感染、药物治疗、血液恶性肿瘤、自身免疫疾病、脾功能亢进、放置机械心脏瓣膜和输血的病症。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述镰状细胞病和镰状细胞贫血与镰状细胞危象、血管闭塞危象和/或脾隔离危象相关联。
19.一种治疗和/或预防对其有需要的受试者的血栓形成倾向异常的方法，所述方法包括向所述受试者施用15-HEPE或包含15-HEPE的组合物。
20.一种治疗和/或预防对其有需要的受试者的血栓形成倾向的方法，所述方法包括向所述受试者施用15-HEPE或最多约8g包含15-HEPE的组合物。
21.一种治疗和/或预防对其有需要的受试者的静脉血栓栓塞的方法，所述方法包括向所述受试者施用15-HEPE或最多约8g包含15-HEPE的组合物。
22.一种治疗和/或预防对其有需要的受试者的动脉血栓形成的方法，所述方法包括向所述受试者施用15-HEPE或最多约8g包含15-HEPE的组合物。
23.一种预防对其有需要的受试者的栓塞的方法，所述方法包括向所述受试者施用15-HEPE或最多约8g包含15-HEPE的组合物。
24.根据权利要求19至23中任一项所述的方法，其中与未接受所述组合物的对照受试者相比，所述受试者的凝血酶原时间延长、活化部分凝血活酶时间延长，以及/或者纤维蛋白原浓度降低。
25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述15-HEPE为游离酸形式、酯化形式、缀合物形式或盐形式。
26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述15-HEPE按重量计占所述组合物中所有脂肪酸的至少约90％。
27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组合物包含最多约2g的15-HEPE。
28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组合物以每天1至8粒胶囊施用。
29.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组合物包含至少2g的15-HEPE。
30.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组合物被配制为向所述受试者提供约5mg每kg体重(mg/kg)、约50mg/kg、约250mg/kg或约500mg/kg的15-HEPE。
31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述15-HEPE或所述包含15-HEPE的组合物口服施用。
32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述15-HEPE为游离酸形式、酯化形式、缀合物形式或盐形式。
33.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述酯化形式的15-HEPE为甲酯、乙酯、或它们的组合。
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