CN115707698A - 5,7-二氯-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-甲酰胺类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了5,7‑二氯‑1,2,3,4‑四氢异喹啉‑6‑甲酰胺类化合物及其制备方法和应用。该类化合物具有通式(Ⅰ)所示的结构，式中各取代基的定义如权利要求书和说明书中所述。细胞水平的检测发现，本发明的化合物对Juckat T细胞中LFA‑1与ICAM‑1结合具有显著的抑制作用。干眼小鼠模型实验显示，本发明的化合物可显著性减少干眼小鼠的眼表上皮细胞的损伤，同时显著增加干眼小鼠的杯状细胞密度，改善干眼症状。这表明本发明的化合物可开发成预防和/或治疗由LFA‑1介导的疾病，尤其是由LFA‑1介导的眼科疾病。
Description
技术领域
本发明涉及药物化学和药物应用学领域，具体涉及一类5,7-二氯-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-甲酰胺类化合物、其制备方法、药物组合物和用途。该类化合物可用于制备治疗由LFA-1介导的干眼或其它炎症性疾病的药物。
背景技术
干眼是指由于泪液的质和量异常或分泌异常引起的泪膜不稳定和眼表损害，从而导致眼部不适症状的一类疾病。在我国，近年来随着视频终端技术包括智能手机、平板电脑和台式电脑等的普及以及环境因素的恶化，干眼的发病趋于年轻化，干眼的问题更为突出。
淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)，也称CD11a，为整合素家族分子，属于白细胞整合素亚家族，是粘附分子家族最活跃的成员之一，表达于T、B淋巴细胞、巨噬细胞、淋巴样细胞和骨髓成分中。细胞间粘附分子-1(ICAM-1)又称CD54，是免疫球蛋白超基因家族，它具有同Ig相似的结构特征，即具有1个或多个IgV样或C样结构域。ICAM-1为76-114KD的糖蛋白分子，主要表达于内皮细胞、及淋巴细胞和其他一些白细胞，还表达于被细胞因子诱导的上皮细胞。LFA-1与其同源配体ICAM-1的相互作用被认为在参与免疫反应和炎症的多种细胞相互作用中发挥重要作用。最近有研究表明LFA-1/ICAM-1相互作用在与干眼症有关的细胞介导的免疫反应和炎症产生中扮演了重要的角色，包括促进树突状细胞淋巴结的归位，树突细胞与T细胞和后T细胞激活/分化的相互作用，活化的CD4+T细胞从淋巴结向眼部表面的迁移，眼部表面常驻抗原呈递细胞对T细胞的再生，以及结膜上皮中LFA-1表达的T细胞的募集和留存。
立他司特(Lifitegrast)是由夏尔(Shire)制药公司研发，于2016年7月11日获美国食品药品管理局(FDA)批准在美国上市销售，商品名为
立他司特是LFA-1抑制剂，用于治疗干眼症。立他司特可以结合LFA-1，阻止LFA-1与其同源配体ICAM-1的结合。体外研究表明，立他司特可以抑制T细胞粘附ICAM-1，还可以抑制人类外周血单核细胞中炎性细胞因子的分泌。
但立他司特本身仍然存在很多不足之处，比如物化性质差，水溶性不好，药物浓度偏高等，同时还存在着一定的毒副作用，包括：滴注部位刺激、味觉障碍以及滴注部位反应。
因此本领域尚需对新型LFA-1抑制剂进行深入研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种5,7-二氯-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-甲酰胺类化合物，在分子水平、细胞水平均有很好活性的小分子LFA-1抑制剂。
本发明的第一方面，提供一种通式(Ⅰ)所示的5,7-二氯-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-甲酰胺类化合物，或其对映异构体、非对映异构体、外消旋体及其混合物，或其药学上可接受的盐，
式中，
X选自砜基、亚甲胺酰基、亚甲酰基和羰基。
R1选自氢、取代或未取代的3-10元杂芳基、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的C1-C6不饱和烷基、取代或未取代的C3-C6环烷基和取代或未取代的C6-C10芳基。
R2选自氢、取代或未取代的3-10元杂芳基、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的C3-C6环烷基、取代或未取代的C6-C10芳基、羟基、邻二羟基、邻羟基甲酰基、卤素、氰基、硝基和烷氧基。
上述所述取代是指具有选自C1-C6烷基、卤素、氰基、C1-C6烷氧基、硝基、-C(O)-3-10元杂环基、C3-C6环烷基、-O-(CH2)m-C6-C10芳基、-(CH2)m-3-10元杂芳基、-(CH2)m-3-10元杂环基和-C(O)OC1-C6烷基中的一个或二个以上的取代基；其中，C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C3-C6环烷基、C6-C10芳基、3-10元杂芳基和3-10元杂环基是取代或未取代的。
优选的，上述的5,7-二氯-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-甲酰胺类化合物，或其对映异构体、非对映异构体、外消旋体及其混合物，或其药学上可接受的盐，
R1选自取代或未取代的3-10元杂芳基和取代或未取代的C1-C6不饱和烷基。
R2选自取代或未取代的3-10元杂芳基、羟基、邻二羟基、邻羟基甲酰基、卤素、氰基、硝基和烷氧基。
更优选的，上述的5,7-二氯-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-甲酰胺类化合物，或其对映异构体、非对映异构体、外消旋体及其混合物，或其药学上可接受的盐，
R1选自呋喃基、三氮唑基和乙炔基；
R2选自吡啶基、环丁砜基、环己酰胺基、邻羟基甲酰基和邻二羟基。
更优选的，上述的5,7-二氯-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-甲酰胺类化合物，或其对映异构体、非对映异构体、外消旋体及其混合物，或其药学上可接受的盐，具有如下结构式：
本发明的第二方面，提供第一方面所述的通式(Ⅰ)所示的化合物的制备方法，包括以下步骤：
化合物A与化合物B溶于有机溶剂中，加入有机碱和缩合剂，于室温下搅拌发生缩合反应，再脱掉羧基保护基，分离纯化后，获得通式(Ⅰ)所示的化合物。
其中通式(Ⅰ)各取代基的定义与权利要求中相同。
所述有机溶剂为乙腈、N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、四氢呋喃、二氯甲烷和三氯甲烷的一种或两种以上的混合物。
所述有机碱为三乙胺(TEA)、三乙烯二胺、N,N-二异丙基乙胺、1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯、吡啶、N-甲基吗啉、四甲基乙二胺、甲醇钠、乙醇钾和叔丁醇钾中的一种或两种以上的混合物。
所述缩合剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、二环己基碳二亚胺、N,N’-二异丙基碳二亚胺和1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐中的一种或两种以上的混合物。
在另一优选例中，反应温度为10-30℃，较佳为20-25℃。
本发明的第三方面，提供一种药物组合物，包括：
如第一方面所述的通式(Ⅰ)所示的化合物，或其对映异构体、非对映异构体、外消旋体及其混合物，或其药学上可接受的盐，和
药学上可接受的载体。
本发明提供的新型化合物，可以单独使用，或者将其与可药用的辅料(例如增稠剂、渗透压调节剂、离子对试剂、金属离子螯合剂、pH调节剂和抑菌剂等)混合，配制成眼科用的水溶液剂、乳剂、凝胶剂、混悬剂、膏剂、植入剂和插入剂等。该药物组合物可以按照制药学上常规方法制得。
本发明的第四方面，提供第一方面所述的通式(Ⅰ)所示的化合物或第三方面所述的药物组合物用途。
用作LFA-1抑制剂；或者
用于制备预防和/或治疗由LFA-1介导的疾病的药物中的应用。
在另一优选例中，所述由LFA-1介导的疾病包括干眼症或其它炎症性疾病。
本发明的5,7-二氯-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-甲酰胺类化合物或其药学上可接受的盐，是在分子水平、细胞水平有很好活性的小分子LFA-1抑制剂，可开发成预防和/或治疗干眼症或其它炎症性疾病的药物。
应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以相互组合，从而构成新的或优选的技术方案。说明书中所揭示的各个特征，可以被任何提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。限于篇幅，在此不再一一累述。
本发明的有益效果：
本发明设计合成一类5,7-二氯-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-甲酰胺类化合物，通过对这类化合物进行的活性测试，发现该类化合物对本身有LFA-1表达的Juckat T细胞中LFA-1与ICAM-1的结合具有显著的抑制活性。干眼小鼠模型实验显示，该类化合物可显著性减少干眼小鼠的眼表上皮细胞的损伤，同时显著增加干眼小鼠的杯状细胞密度，改善干眼症状。说明该类化合物具有潜在的治疗由LFA-1介导的干眼症和其它炎症性疾病的用途。
附图说明
图1是化合物IC50曲线。
图2是化合物7b对干眼小鼠模型角膜上皮损伤的保护作用荧光染色；
其中，A：空白对照组；B：模型对照组；C：阳性药对照组；D：5％化合物7b给药组；E：7％化合物7b给药组；F：溶剂对照组。
图3是化合物7b对干眼小鼠模型角膜上皮损伤的保护作用柱形统计分析；
其中，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001，N：空白对照组；M：模型对照组；liftgrast：阳性药对照组；0％：溶剂对照组；5％：5％化合物7b给药组；7％：7％化合物7b给药组。
图4是化合物7b对干眼小鼠模型结膜杯状细胞的糖原染色；
其中，A：空白对照组；B：模型对照组；C：阳性药对照组；D：5％化合物7b给药组；E：7％化合物7b给药组；F：溶剂对照组。
图5是化合物7b对干眼小鼠模型结膜杯状细胞密度柱形统计分析；
其中，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001，N：空白对照组；M：模型对照组；liftgrast：阳性药对照组；0％：溶剂对照组；5％：5％化合物7b给药组；7％：7％化合物7b给药组。
图6是化合物7b对干眼小鼠模型角膜上皮细胞凋亡检测(TUNEL染色)；
其中，A：空白对照组；B：模型对照组；C：阳性药对照组；D：5％化合物7b给药组；E：7％化合物7b给药组；F：溶剂对照组。
图7是化合物7b对干眼小鼠模型角膜上皮细胞凋亡检测(TUNEL染色)柱形统计分析；
其中，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001，N：空白对照组；M：模型对照组；liftgrast：阳性药对照组；0％：溶剂对照组；5％：5％化合物7b给药组；7％：7％化合物7b给药组。
具体实施方式
本申请的发明人经过广泛而深入的研究，研发出一种5,7-二氯-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-甲酰胺类化合物或其药学上可接受的盐，具有通式(Ⅰ)所示的结构，能在细胞水平对LFA-1和ICAM-1的结合具有很好的抑制活性，表明本发明的化合物可开发成预防和/或治疗由LFA-1介导的干眼症或其它炎症性疾病的药物。在此基础上，完成了本发明。
术语：
在本发明中，LFA-1即淋巴细胞功能相关抗原-1(Lymphocyte Function-associated Antigen-1)。ICAM-1即细胞间黏附分子1(intercellular cell adhesionmolecule-1)。
在本发明中，所述卤素为F、Cl、Br或I。
在本发明中，除非特别指出，所用术语具有本领域技术人员公知的一般含义。
在本发明中，术语“C1-C6”是指具有1、2、3、4、5或6个碳原子，“C1-C8”是指具有1、2、3、4、5、6、7或8个碳原子，以此类推。“3-10元”是指具有3-10个环原子，以此类推。
在本发明中，术语“烷基”表示饱和的线性或支链烃部分，例如术语“C1-C6烷基”是指具有1至6个碳原子的直链或支链烷基，非限制性的包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基和己基等；优选乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。
在本发明中，术语“烷氧基”表示-O-(C1-6烷基)基团。例如术语“C1-C6烷氧基”是指具有1至6个碳原子的直链或支链烷氧基，非限制性的包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基和丁氧基等。
在本发明中，术语“烯基”表示包含至少一个双键的直链或支链烃基部分，例如术语“C2-C6烯基”是指具有2至6个碳原子的含有一个双键的直链或支链烯基，非限制性的包括乙烯基、丙烯基、丁烯基、异丁烯基、戊烯基和己烯基等。
在本发明中，术语“炔基”是指含有一个三键的直链或支链炔基，非限制性的包括乙炔基、丙炔基、丁炔基、异丁炔基、戊炔基和己炔基等。
在本发明中，术语“环烷基”表示饱和的环状烃基部分，例如术语“C3-C10环烷基”是指在环上具有3至10个碳原子的环状烷基，非限制性的包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基和环癸基等。术语“C3-C8环烷基”、“C3-C7环烷基”和“C3-C6环烷基”具有类似的含义。
在本发明中，术语“3-10元杂环基”是指具有3-7个环原子且包含1、2或3个杂原子(选自O、N、S)的环烷基，例如术语“3-7元含氧杂环”是指具有3-7个环原子且包含1、2或3个O原子的环烷基环，非限制性的包括环氧丙烷环、环氧丁烷环、环氧庚烷环等。
在本发明中，术语“C3-C10环烯基”是指在环上具有3至10个碳原子的环状烯基，非限制性的包括环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环己烯基、环庚烯基、环辛烯基和环癸烯基等。术语“C3-C7烯基”具有类似的含义。
在本发明中，术语“芳基”表示包含一个或多个芳环的烃基部分。例如术语“C6-C12芳基”是指在环上不含杂原子的具有6至12个碳原子的芳香环基，如苯基、萘基等。术语“C6-C10芳基”具有类似的含义。芳基的例子包括但不限于苯基(Ph)、萘基、芘基、蒽基和菲基。
在本发明中，术语“杂芳基”表示包含一个或多个具有至少一个杂原子(例如N,O或S)的芳环的部分，例如术语“3-12元杂环基”是指环上含有1-3个选自氧、硫和氮中的杂原子的饱和或不饱和的3-12元环基，例如二氧杂环戊基等。术语“3-7元杂环基”具有类似的含义。杂芳基的例子包括呋喃基、芴基、吡咯基、噻吩基、噁唑基、咪唑基、噻唑基、吡啶基、嘧啶基、喹唑啉基、喹啉基、异喹啉基和吲哚基。
在本发明中，术语“杂环基”表示包含至少一个环杂原子(例如N,O或S)的环状基团，例如呋喃基、吡咯基、噻吩基、噁唑基、咪唑基、噻唑基、吡啶基、喹啉基、异喹啉基、吲哚基、嘧啶基、四氢呋喃基、吡咯啉基、二氢吡啶基、二氢呋喃基、二氢噻吩基、吡喃基。
除非另外说明，本文所述的烷基、烷氧基、环烷基、杂环基和芳基为取代的和未取代的基团。烷基、烷氧基、环烷基、杂环基和芳基上可能的取代基包括，但不限于：羟基、氨基、硝基、睛基、卤素、C1-C6烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C3-C20环烷基、C3-C20环烯基、C1-C20杂环烷基、C1-C20杂环烯基、C1-C6烷氧基、芳基、杂芳基、杂芳氧基、C1-C10烷基氨基、C1-C20二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、C1-C10烷基氨磺酰基、芳基氨磺酰基、C1-C10烷基亚氨基、C1-C10烷基磺基亚氨基、芳基磺基亚氨基、巯基、C1-C10烷硫基、C1-C10烷基磺酰基、芳基磺酰基、酰基氨基、氨酰基、氨基硫代酰基、胍基、脲基、氰基、酰基、硫代酰基、酰氧基、羧基和羧酸酯基。另一方面，环烷基、杂环烷基、杂环烯基、芳基和杂芳基也可互相稠合。
在本发明中，术语“保护基”表示具体的官能团，如，O、S或N被临时封闭，使得可以在多官能团化合物的另一个活性部位选择性的进行反应。在优选实施方案中，保护基以良好收率选择性的反应，得到对于计划中的反应是稳定的被保护的底物；保护基必须通过容易得到的、优选无毒的、不进攻其它官能团的试剂以良好的收率选择性的除去；保护基形成容易分离的衍生物(更优选不产生新的立体中心)；保护基具有最少的另外的官能团，以避免另外的反应位置。如本文中详述的，可使用氧、硫、氮和碳保护基。例如，如本文中详述的，在某些实施方案中，使用某些示例性的氧保护基。这些氧保护基包括但不限于甲基醚、被取代的甲基醚(如，MOM(甲氧基甲基醚)、MTM(甲基硫基甲基醚)、BOM(苄基氧基甲基醚)、PMBM或MPM(对甲氧基苄基氧基甲基醚)，仅举几个例子)；被取代的乙基醚、被取代的苄基醚、甲硅烷基醚(如，TMS(三甲基甲硅烷基醚)、TES(三乙基甲硅烷基醚)、TIPS(三异丙基甲硅烷基醚)、TBDMS(叔丁基二甲基甲硅烷基醚)、三苄基甲硅烷基醚、TBDPS(叔丁基二苯基甲硅烷基醚)，仅举几个例子)；酯(如，甲酸酯、乙酸酯、苯甲酸酯(Bz)、三氟乙酸酯、二氯乙酸酯，仅举几个例子)、碳酸酯、环状缩醛和缩酮。在某些其它示例性实施方案中，使用氮保护基。这些氮保护基包括但不限于氨基甲酸酯(包括氨基甲酸甲酯、乙酯和被取代的氨基甲酸乙酯(如，Troc)，仅举几个例子)；酰胺、环状酰亚胺衍生物、N-烷基和N-芳基胺、亚胺衍生物和烯胺衍生物，仅举几个例子。某些其它示例性保护基在本文中详述，然而，应该理解，本发明不打算受限于这些保护基；相反的，使用上述的和本发明中使用的标准可以容易的确定多种另外的等价的保护基。
在本发明中，所述取代为单取代或多取代，所述多取代为二取代、三取代、四取代或五取代。所述二取代就是指具有两个取代基，以此类推。
本发明所述药学上可接受的盐可以是阴离子与通式(Ⅰ)化合物上带正电荷的基团形成的盐。合适的阴离子为氯离子、溴离子、碘离子、硫酸根、硝酸根、磷酸根、柠檬酸根、甲基磺酸根、三氟乙酸根、乙酸根、苹果酸根、甲苯磺酸根、酒石酸根、富马酸根、谷氨酸根、葡糖醛酸根、乳酸根、戊二酸根或马来酸根。类似的，可以有阳离子与通式(Ⅰ)化合物上的带负电荷的基团形成盐。合适的阳离子包括钠离子、钾离子、镁离子、钙离子和铵离子，例如四甲基铵离子。
在另一优选例中，“药学上可接受的盐”是指通式(Ⅰ)化合物同选自下组的酸形成的盐类：氢氟酸、盐酸、氢溴酸、磷酸、乙酸、草酸、硫酸、硝酸、甲磺酸、氨基磺酸、水杨酸、三氟甲磺酸、萘磺酸、马来酸、柠檬酸、醋酸、乳酸、酒石酸、琥珀酸、酢浆草酸、丙酮酸、苹果酸、谷氨酸、对甲苯磺酸、萘磺酸、乙磺酸、萘二磺酸、丙二酸、富马酸、丙酸、草酸、三氟乙酸、硬脂酸、扑酸、羟基马来酸、苯乙酸、苯甲酸、谷氨酸、抗坏血酸、对胺基苯磺酸、2-乙酰氧基苯甲酸和羟乙磺酸等；或者通式(Ⅰ)化合物与无机碱形成的钠盐、钾盐、钙盐、铝盐或铵盐；或者通式(Ⅰ)化合物与有机碱形成的甲胺盐、乙胺盐或乙醇胺盐。
在本发明中，术语“LFA-1介导的疾病”一般是指由牵涉淋巴细胞上的LFA-1受体的细胞粘着相互作用引起的病理状态。这种疾病的例子包括但不限于T细胞炎性应答如炎性皮肤病，包括银屑病；与炎症性肠病有关的应答(如克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)；成人型呼吸窘迫综合征；皮炎；脑膜炎；脑炎；眼色素层炎；变应性状况如湿疹和哮喘；和涉及T细胞的浸润和慢性炎性应答的其它状况；皮肤超敏反应(包括毒葛和槲叶毒葛)；动脉粥样硬化；白细胞粘着缺陷；自身免疫疾病如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、干眼症、糖尿病、多发性硬化、Reynaud′s综合症、自身免疫性甲状腺炎、实验性自身免疫性脑脊髓炎、舍格伦综合症、I型糖尿病、幼年型糖尿病；和典型地在肺结核、结节病、多肌炎、肉芽肿病和脉管炎中发现的由细胞因子和T淋巴细胞介导的迟发性过敏性有关的免疫应答；恶性贫血；涉及白细胞渗出的疾病；CNS炎性疾病、败血症或创伤继发的多器官损害综合症、自身免疫性溶血性贫血、重症肌无力(myethamia gravis)、抗原-抗体复合物介导的疾病、和所有类型的移植，包括移植抗宿主病或宿主抗移植病。
制备方法
本发明还提供通式(Ⅰ)化合物及其中间体的制备方法，具体合成策略分别如下。
策略1
具体步骤如下：
1)将化合物2溶于DMF中，室温下依次加入化合物1，HATU和TEA。混合物于20℃下，搅拌反应16小时。TLC监测反应完全后，将混合物倒入水中，然后用乙酸乙酯萃取2次，进行萃取，有机层用硫酸镁干燥并且旋干得到粗品。粗品经过柱层析纯化得到黄色胶状物中间体3。
2)将中间体3溶于乙酸乙酯中，室温下滴加盐酸与乙酸乙酯的混合液。混合物于20℃下搅拌反应3小时。TLC监测反应完全后，将反应液旋干得到白色固体中间体4。
策略2
具体步骤如下：
1)将中间体4溶解在有机溶剂中，依次向溶液中加入碱和缩合剂，混合液于20℃搅拌若干小时。将中间体5a-5e分批加入到反应液中，反应液在氮气保护下于20℃反应。LC-MS检测反应液中底物反应完。将反应液用水淬灭，并用二氯甲烷萃取3次。有机相用无水硫酸镁干燥后，将有机相减压旋干，得到中间体6a-6e。
2)中间体6a-6e溶解在有机溶剂中，在氮气保护下，向溶液中加入Raney-Ni/氢气或三甲基硅醇钾。反应液于25℃，反应若干小时。TLC监测反应完全。悬浮液用硅藻土过滤，滤饼用EtOH洗3次，将滤液旋干得到粗产物。粗品用HCl体系制备分离纯化得到化合物7a-7e。
策略3
具体步骤如下：
1)将化合物8溶于DMF中，溶液中依次加入EDCI，DMAP和三乙胺。同时将化合物9加到混合液中。反应液于25℃下搅拌反应15小时。TLC检测反应结束，将混合物倒入水中，用二氯甲烷萃取，有机相用柠檬酸，饱和碳酸氢钠和盐水洗涤，有机相中加入无水硫酸钠干燥后，旋干，得到黄色固体中间体10。
2)将中间体10溶于吡啶中，将碘化锂加到混合液中。反应液于100℃下搅拌反应3小时。TLC检测反应结束，将反应液浓缩旋干。用盐酸水溶液将浓缩后的反应液调到pH＝2，之后过滤，固体用水冲洗，旋干固体。粗品在15℃条件下，用石油醚与乙酸乙酯1:1混合液对粗品打浆纯化，搅拌1小时，过滤得到棕色固体中间体11。
策略4
具体步骤如下：
1)将中间体11溶于有机溶剂中，将三乙胺和缩合剂加入到混合液中，于20℃下搅拌0.5小时。将中间体12a-12c和DMAP加入到反应液中，于20℃下搅拌反应。TLC检测反应完全，将反应液倒入水中，用乙酸乙酯萃取，用硫酸钠干燥有机相，旋干得到粗品，粗品经柱层析纯化得到中间体13a-13c。
2)将中间体13a-13c溶于乙醇和四氢呋喃中，同时将氢氧化钠加入水中溶解，然后将氢氧化钠水溶液滴加到反应液中。混合物于20℃下搅拌反应2小时，TLC检测反应结束。将乙醇和四氢呋喃溶剂旋蒸掉，剩余水相用1mol/L的盐酸调pH＝4，此时固体析出，过滤得到粗品，粗品用石油醚/乙酸乙酯打浆，过滤，旋干，得到产品白色固体产品14a-14c。
策略5
具体步骤如下：
1)将中间体11加到氯化亚砜中，反应液加热到70℃，搅拌反应2小时，将反应液旋干得到中间体15。
2)将中间体15溶于有机溶剂中，将三乙胺加入到混合液中，于20℃下搅拌0.5小时。将中间体12d-12e加入到反应液中，于20℃下搅拌反应。TLC检测反应完全，将反应液倒入水中，用乙酸乙酯萃取，用硫酸钠干燥有机相，旋干得到粗品，粗品经柱层析纯化得到产品14d-14e。
根据上述制备方法的教导，本领域普通技术人员即可获得通式(Ⅰ)所包含的所有化合物。
药物组合物
本发明还提供了一种药物组合物，它包含安全有效量范围内的活性成分，以及药学上可接受的载体。
本发明所述的“活性成分”是指本发明所述的通式(Ⅰ)化合物。
本发明所述的“活性成分”和药物组合物可用作LFA-1抑制剂。在另一优选例中，用于制备预防和/或治疗LFA-1介导的治疗炎症的药物。在另一优选例中，所述LFA-1介导的炎症疾病为干眼症。
因此，在本发明的另一个方面中提供药学组合物，其包括任一种本文中所述的化合物(或其前药、可药用盐或其它可药用衍生物)，并且任选地包括可药用载体。在某些实施方案中，这些组合物任选地另外包括一种或多种另外的治疗剂。或者，可将本发明的化合物与一种或多种其它治疗剂的给药组合对有需要的患者给药。例如，用于在与本发明化合物的药学组合物中结合给药或包含在其中的另外的治疗剂可为批准的抗炎药，或者其可为经历National Medical Products Administration(国家药品监督管理局)批准并且最终获得批准用于治疗由LFA-1介导的任何疾病的许多药物中的任一种。还应该理解，某些本发明的化合物可以用于治疗的游离态存在，或者在适合时作为其可药用衍生物存在。
如上所述，本发明的药学组合物另外包括可药用载体，如本文中使用的，其包括任何和所有的溶剂、稀释剂、或其它液体介质、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等，只要适合于期望的具体剂型即可。除非任何常规的载体介质与本发明的化合物不相容，如生产任何不合需要的生物学作用或以有害的方式与药学组合物的任何其它组分相互作用，其应用被考虑在本发明的范围内。可用作可药用载体的材料的一些例子包括但不限于糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉状黄芪胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂如可可脂和栓剂用蜡；油类如花生油、棉子油、红花油、芝麻油、橄榄油、蓖麻油、玉米油和大豆油；二醇类，如丙二醇；酯类，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原的水；等渗盐水；Ringer′s溶液；乙醇、和磷酸盐缓冲液，以及其它无毒的相容的润滑剂如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、防粘剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和香料，根据配制设计师的判断，也可在组合物中存在防腐剂和抗氧化剂。
用于口服给药的液体剂型包括但不限于可药用的乳剂、微乳剂、溶液、悬浮液、糖浆剂和酏剂。除活性化合物之外，液体剂型可包含通常用于本领域中的惰性稀释剂，例如，水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油类(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨醇的脂肪酸酯、及其混合物。除惰性稀释剂之外，口服组合物还可以包括助剂如润湿剂、乳化剂和助悬剂、甜味剂、调味剂、和香料。
可使用适合的分散剂或润湿剂和助悬剂，根据本领域中已知的技术配制可注射制剂如无菌的可注射水性或油性悬浮液。无菌的可注射制剂也可为在非肠道可接受的无毒稀释剂或溶剂中的无菌的可注射的溶液、悬浮液或乳剂，例如为在1,3-丁二醇中的溶液。可采用的可接受的介质和溶剂为水、Ringer′s溶液、U.S.P.和等渗氯化钠溶液。另外，通常采用无菌的不挥发油作为溶剂或悬浮介质。为此，可采用任何温和的不挥发油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。另外，脂肪酸如油酸可用于制备可注射制剂。
可注射制剂可通过例如通过细菌滞留型过滤器过滤灭菌、或通过在使用之前结合可以溶解或分散在无菌水或其它灭菌的可注射介质中的灭菌固体组合物形式的灭菌剂而灭菌。
为了延长药物的作用，经常期望延缓药物从皮下注射或肌内注射的吸收。这可通过使用液体悬浮液或具有差的水溶性的结晶性或无定形物质实现。然后，药物的吸收速率取决于其溶解速度，溶解速度又可以取决于晶体大小和晶形。或者，可以通过将药物溶解或悬浮在油性介质中实现非肠道给药的药物形式的延迟吸收。通过形成药物在可生物降解的聚合物如聚交酯-聚乙醇酸中的微胶囊基质生产可注射的储库形式。取决于药物与聚合物的比例和采用的具体聚合物的性质，可以控制药物释放的速率。其它可生物降解的聚合物的例子包括(聚(原酸酯)和聚(酸酐)。还通过将药物截留在与身体组织相容的脂质体或微乳剂中制备储库型可注射制剂。
用于直肠或阴道给药的组合物优选为栓剂，其可通过将本发明的化合物与适合的无刺激性的赋形剂或载体混合制备，赋形剂或载体如可可脂、聚乙二醇、或栓剂用蜡，其在环境温度为固体但是在体温下为液体，因此其在直肠或阴道的腔中熔融并释放活性化合物。
本发明所述药物组合物是适合于药物用途的组合物。适用于药物用途的组合物可以是无菌的、均质的和/或等渗的。在某些实施例中，药物组合物能以水性形式制备，例如在预填充注射器或其他单剂量或多剂量容器中。在本发明的某些实施例中，药物组合物是眼科相容的并且适合于通过例如局部或其他已知的递送方法对动物受试者进行眼科给药。
可以将通式(Ⅰ)化合物或其药学上可接受的盐以各种方法并入配制品种用于递送。例如，可以使用局部配制品，并且可以包括眼科上可接受的抑菌剂如羟苯甲酯、羟苯乙酯、苯扎氯氨、苯扎溴铵、醋酸氯已定、硫柳汞中的一种或多种，粘度调节剂如羟丙甲纤维素、羟乙纤维素、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、泊洛沙姆中的一种或多种、pH调节剂如盐酸、氢氧化钠、硼酸、硼砂、磷酸一氢钠、磷酸二氢钠中的一种或多种，渗透压调节剂如氯化钠、甘油、葡萄糖、丙二醇、甘露醇中的一种或几种，增溶剂如聚山梨醇酯、环糊精、聚氧乙烯蓖麻油中的一种或两种和注射用水以形成水性眼科相容的溶液和混悬液。
选择的具体类型的配制品将取决于各种因素，如所用的化合物或其盐、剂量频率和所治疗疾病的位置。局部眼科相容的水溶液、悬浮液、软膏和凝胶是治疗眼前部的眼部疾病(角膜、虹膜、小梁网)或者眼后部疾病(若该化合物可以配制成使得可以局部递送并且能够穿透眼睛前部的组织)的优选剂型。通式(Ⅰ)化合物通常在这些配制品种的含量为按重量计从约0.01％至约10.0％(重量)。因此，对于局部给药，这些配制品每天一至六次(这取决于熟练的临床医生的常规判断)递送至眼睛表面。
除非另有说明，否则本文所述的特定化合物(例如7a-7e、14a-14e)的重量或剂量是化合物本身(而不是其盐或其前药)的重量或剂量，该重量或剂量对于实现预期的治疗效果可以是不同的。例如，适合于本文披露的方法、组合物或组合的化合物的相应盐的重量或剂量可以基于盐和化合物本身的分子量的比率来计算。
优选将通式(Ⅰ)化合物和/或其药学上可接受的盐掺入眼科相容的配制品中用于递送至眼睛。化合物可以与眼科学上可接受的抑菌剂、表面活性剂、粘度调节剂、pH调节剂、渗透压调节剂或水组合以便形成一种水性、无菌眼科用悬浮液或溶液。可以通过化合物溶解在生理学上可接受的等渗的水性缓冲液来制备眼科用溶液配制品。此外，该眼科用溶液可含有增加粘度的试剂(如羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等)以改善配制品在结膜囊中的保留。也可以使用凝胶剂，这些凝胶剂包括但不限于结冷胶和黄原胶。为了制备无菌眼科用软膏配制品，将活性成分与防腐剂在合适的运载体(如矿物油、液体羊毛脂或白凡士林)中组合。无菌眼科用凝胶配制品可以通过将化合物悬浮在亲水性机制中来制备，根据公开的类似眼科用配制品的配方，该亲水性基质由例如卡波姆-974等的组合制备；可以掺入防腐剂和张力剂。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。实施例中的所有参数以及其余的说明，除另有说明外，都是以质量(克)为单位。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
薄层分子(TLC)板型号为HSGF-254(厚度0.15-0.2mm,国药集团化学试剂有限公司)；柱层析硅胶为青岛海洋化工厂生产200-300目商业化硅胶；1H NMR，13C NMR使用BrukerAscend 400、Varian S 400MHz型核磁共振仪，以CDCl3、DMSO-d6、CH3OD为溶剂，内标为四甲基硅烷(TMS)；化学位移为(ppm,δ)，质子偶合标记为单重峰(s)，双重峰(d)，三重峰(t)，四重峰(q)，多重峰(m)，宽峰(br)；Shimadzu LC-20AB型HPLC；Agilent Technologies1200series型LCMS；Agilent 6210time-of-fight LC/MS；Agela-FL-H600G型Pre-HPLC。实验所用药品均为市售分析纯或化学纯，除特别说明所有试剂使用前均未经纯化处理。
实施例1中间体3(S)-2-(2-叔丁氧羰基-5,7-二氯-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-甲酰基氨基)-3-(3-(甲磺酰基)苯基)丙酸苄酯的制备
将(S)-2-氨基-3-(3-(甲磺酰基)苯基)丙酸苄酯(化合物2)(4.50g,13.5mmol)溶于DMF中，室温下依次加入2-叔丁氧羰基-5,7-二氯-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-羧酸(化合物1)(5.61g,16.2mmol)，HATU(7.70g,20.2mmol)和三乙胺(2.05g,20.25mmol)。反应液于20℃下，搅拌反应16小时。TLC监测反应完全后，将混合物倒入水(30mL)中，然后用乙酸乙酯萃取2次(30.0mL×2)，有机层用硫酸镁干燥并且旋干得到粗品。粗品经过柱层析纯化得到中间体3(2.20g,2.83mmol,收率25.2％)，黄色胶状物。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝7.84(s,2H),7.47-7.31(m,6H),7.10-7.07(m,1H),6.43-6.35(m,1H),5.33-5.23(m,1H),5.22-5.16(m,2H),4.57-4.49(m,2H),3.64(br t,J＝6.0Hz,2H),3.40(s,1H),3.34-3.24(m,1H),2.99(s,3H),2.81-2.75(m,2H),1.48(s,9H).
实施例2中间体4(S)-2-(5,7-二氯-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-甲酰基氨基)-3-(3-(甲磺酰基)苯基)丙酸苄酯的制备
将中间体3(2.20g,3.33mmol)溶于乙酸乙酯中，室温下滴加盐酸与乙酸乙酯(4M,15mL)的混合液。反应液于20℃下搅拌反应3小时。TLC监测反应完全后，将反应液旋干得到中间体4(1.80g,盐酸盐粗品)，白色固体。1H NMR(400MHz,MeOD)δ＝7.91(s,1H),7.82(d,J＝7.8Hz,1H),7.64(d,J＝7.8Hz,1H),7.58-7.51(m,1H),7.42-7.29(m,6H),5.22(d,J＝4.4Hz,2H),5.16(td,J＝4.8,9.6Hz,1H),4.36(s,2H),3.56-3.50(m,2H),3.49-3.41(m,1H),3.21-3.12(m,1H),3.07(s,3H),3.01(t,J＝6.4Hz,2H),2.82(s,4H).
实施例3中间体6a(S)-2-(2-(苯并呋喃-6-基磺酰基)-5,7-二氯-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-甲酰基氨基)-3-(3-(甲磺酰基)苯基)丙酸苄酯的制备
将中间体4(0.300g,501umol,HCl)溶解在DCM(3.00mL)中，依次向溶液中加入三乙胺(152mg,1.51mmol)和HATU(286mg,752umol)，混合液于20℃搅拌3小时。将苯并呋喃-6-磺酰氯(中间体5a)(108mg,501umol)分批加入到反应液中，反应液在氮气保护下于20℃反应2小时。LC-MS检测反应液中底物反应完。将反应液用水(3.00mL)淬灭，并用二氯甲烷(3mL)萃取3次。有机相用无水硫酸镁干燥后，将有机相减压旋干，得到中间体6a(0.260g,350umol,收率69.8％)，棕色固体。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝8.01(s,1H),7.81-7.85(m,2H),7.77-7.81(m,1H),7.75(s,1H),7.67-7.71(m,1H),7.40-7.43(m,2H),7.36-7.39(m,3H),7.31-7.36(m,2H),7.27(s,1H),7.02(s,1H),6.88(d,J＝1.6Hz,1H),6.39(d,J＝7.6Hz,1H),5.22-5.29(m,1H),5.19(d,J＝6.0Hz,1H),4.20(s,2H),3.35-3.39(m,2H),3.24-3.31(m,1H),2.93-3.01(m,3H),2.86(br t,J＝6.0Hz,2H),2.18(s,2H).
实施例4化合物7a(S)-2-(2-(苯并呋喃-6-基磺酰基)-5,7-二氯-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-甲酰基氨基)-3-(3-(甲磺酰基)苯基)丙酸的制备
将中间体6a(0.260g,350umol)溶解在MeOH(1.00mL)中。在氮气保护下，向溶液中加入Raney-Ni(30.0mg,350umol)，用H2抽换气3次后，在25℃，H2(15psi)氛围中搅拌反应3小时。TLC监测反应完全。悬浮液用硅藻土过滤，滤饼用EtOH(2.00mL)洗3次，将滤液旋干得到粗产品，粗产品用HCl体系制备分离纯化得到产品化合物7a(0.022g,33.0umol,收率9.42％,纯度97.7％)，白色固体。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝12.88(br s,1H),9.02(d,J＝8.4Hz,1H),8.29(d,J＝2.4Hz,1H),8.09(s,1H),7.93(d,J＝8.0Hz,1H),7.85(s,1H),7.76(d,J＝7.6Hz,1H),7.63-7.72(m,2H),7.53-7.59(m,1H),7.33(s,1H),7.15(d,J＝1.2Hz,1H),4.72-4.81(m,1H),4.22(br s,2H),3.28(br dd,J＝14.4,4.4Hz,3H),3.14(s,3H),3.00(dd,J＝14.0,10.6Hz,1H),2.73(br s,2H)；13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ:ppm 172.514(s,1C),163.885(s,1C),153.768(s,1C),150.431(s,1C),141.065(s,1C),139.534(s,1C),136.104(s,1C),135.129(s,1C),134.905(s,1C),132.240(s,1C),131.886(s,1C),131.497(s,1C),130.991(s,1C),129.720(s,1C),128.731(s,1C),128.211(s,1C),126.218(s,1C),125.503(s,1C),122.824(s,1C),122.412(s,1C),111.710(s,1C),107.608(s,1C),53.490(s,1C),47.395(s,1C),44.066(s,1C),43.474(s,1C),36.765(s,1C),26.951(s,1C)；LCMS[M+H]+＝651.0；HR-MS calcd.for C28H24Cl2N2O8S2[M+H]+:651.0,found:651.0436[M+H]+.
实施例5中间体6b(S)-2-(2-((苯并呋喃-6-亚甲基)氨基甲酰基)-5,7-二氯-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-甲酰基氨基)-3-(3-(甲磺酰基)苯基)丙酸苄酯的制备
将CDI(220mg,1.36mmol)溶解在DCM(3.00mL)中，并将溶液降至0℃。苯并呋喃-6-基甲胺(中间体5b)(0.20g,1.36mmol)和DIEA(193mg,1.49mmol)溶解在DCM(3.00mL)中，然后加入到上述溶液中，混合溶液在25℃下搅拌0.5小时。将中间体4(763mg,1.28mmol,HCl)和DIEA(176mg,1.36mmol)溶解在DCM(5.00mL)中，然后加入到上述混合溶液中。反应液在25℃下搅拌反应0.5小时。LC-MS检测到产物MASS值。反应液用1M aq.Na2CO3溶液(25.0mL)洗2遍，有机相无水硫酸镁干燥，过滤后旋蒸得到中间体6b(0.022g,33.0umol,收率9.42％,纯度97.7％)，亮黄色固体。1H NMR(400MHz,CH3OD)δ＝7.93(s,1H),7.84(d,J＝7.8Hz,1H),7.72(d,J＝2.0Hz,1H),7.67-7.63(m,1H),7.58-7.52(m,2H),7.44(s,1H),7.42-7.34(m,5H),7.23-7.17(m,2H),6.81(d,J＝1.4Hz,1H),5.23(d,J＝3.4Hz,2H),5.20-5.12(m,1H),4.58(s,2H),4.50(s,2H),3.70(br t,J＝5.8Hz,2H),3.45(dd,J＝5.4,14.2Hz,1H),3.38(s,1H),3.40-3.36(m,1H),3.22-3.11(m,1H),3.08(s,3H),2.80(br t,J＝5.8Hz,2H).
实施例6化合物7b(S)-2-(2-((苯并呋喃-6-亚甲基)氨基甲酰基)-5,7-二氯-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-甲酰基氨基)-3-(3-(甲磺酰基)苯基)丙酸的制备
将中间体6b(0.200g,272umol)溶解在MeOH(5.00mL)中。在N2保护下，向溶液中加入Raney-Ni(46.6mg,544umol)。用H2抽换气3次后，在25℃，H2(15psi)下，搅拌1小时。TLC监测反应完全。悬浮液用硅藻土过滤，滤饼用EtOH(2.00mL)洗3次，将滤液旋干后得到粗产物。粗品用HCl体系制备分离纯化得到产品化合物7b(0.025g,37.8umol,收率13.8％,纯度97.4％)，白色固体。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝9.02(br d,J＝8.4Hz,1H),7.93(d,J＝2.0Hz,1H),7.87(s,1H),7.77(br d,J＝7.6Hz,1H),7.67(br d,J＝7.6Hz,1H),7.54-7.59(m,2H),7.45(s,1H),7.35(br s,1H),7.26(s,1H),7.17(d,J＝8.0Hz,1H),6.90(d,J＝1.2Hz,1H),4.74-4.83(m,1H),4.53(br s,2H),4.35(br d,J＝4.0Hz,2H),3.63(br s,2H),3.29(br dd,J＝14.0,4.2Hz,1H),3.15(s,3H),3.01(br dd,J＝13.6,10.8Hz,1H),2.66(brs,2H)；13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ:ppm 172.518(s,1C),164.076(s,1C),157.670(s,1C),154.940(s,1C),146.260(s,1C),141.103(s,1C),139.558(s,1C),138.770(s,1C),138.106(s,1C),134.914(s,1C),134.770(s,1C),132.394(s,1C)131.614(s,1C),129.721(s,1C),128.595(s,1C),128.219(s,1C),126.183(s,1C),125.937(s,1C),125.518(s,1C),122.832(s,1C),121.243(s,1C),110.223(s,1C),106.987(s,1C),53.531(s,1C),49.075(s,1C),45.739(s,1C),44.092(s,1C),41.225(s,1C),36.820(s,1C),26.420(s,1C)；LCMS[M+H]+＝644.1；HR-MS calcd.for C30H27Cl2N3O7S[M+H]+:644.0,found:644.1075[M+H]+.
实施例7中间体6c(S)-2-(2-((苯并呋喃-5-亚甲基)甲酰基)-5,7-二氯-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-甲酰基氨基)-3-(3-(甲磺酰基)苯基)丙酸苄酯的制备
将中间体4(0.200g,334umol,HCl)溶解在DCM(2.00mL)中，向溶液中加入三乙胺(101mg,1.00mmol,)和HATU(191mg,502umol)，混合液于20℃下搅拌1小时。将2-(苯并呋喃-5-基)乙酸(中间体5c)(58.9mg,334umol)分批加入到反应液中，反应液在N2保护下20℃反应2小时。LC-MS检测底物反应完，并检测到产物MASS值。将反应液用水(2.00mL)淬灭，并用DCM(2mL)萃取3次。将有机相减压旋干，得到中间体6c(0.210g,292umol,收率87.2％)，棕色固体。
实施例8化合物7c(S)-2-(2-((苯并呋喃-5-亚甲基)甲酰基)-5,7-二氯-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-甲酰基氨基)-3-(3-(甲磺酰基)苯基)丙酸的制备
将中间体6c(97.9mg,136umol)溶解在MeOH(1.00mL)中。在N2保护下，向溶液中加入Raney-Ni(11.6mg,136umol)。用H2抽换气3次后，在25℃，H2(15psi)下，搅拌3反应小时。TLC监测显示底物反应完全。悬浮液用硅藻土过滤，滤饼用EtOH(2.00mL)洗3次，将滤液旋干得到粗产物。粗品用HCl体系制备分离纯化得到产品化合物7c(0.030g,45.5umol,收率33.4％,纯度95.4％)，为白色固体。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝8.79(br d,J＝7.6Hz,1H),7.90(d,J＝1.6Hz,1H),7.86(s,1H),7.77(br d,J＝7.6Hz,1H),7.65(br d,J＝7.2Hz,1H),7.46-7.59(m,3H),7.31(br s,1H),7.19(br d,J＝8.4Hz,1H),6.88(s,1H),4.62-4.85(m,3H),3.88(br s,2H),3.77(br s,2H),3.30(br dd,J＝14.0,4.7Hz,1H),3.12(s,3H),2.67(br s,2H)；13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ:ppm 172.512(s,1C),170.113(s,1C),169.982(s,1C),164.002(s,1C),153.663(s,1C),146.721(s,1C),141.099(s,1C),139.546(s,1C),137.643(s,1C),134.909(s,1C),134.843(s,1C),130.680(s,1C),129.724(s,1C),128.798(s,1C),127.814(s,1C),126.013(s,1C),125.889(s,1C),125.524(s,1C),122.003(s,1C),121.857(s,1C),111.473(s,1C),111.379(s,1C),107.062(s,1C),53.512(s,1C),44.077(s,1C),43.756(s,1C),42.779(s,1C),38.973(s,1C),36.807(s,1C),27.262(s,1C)；LCMS[M+H]+＝629.1；HR-MS calcd.for C30H26Cl2N2O7S[M+H]+:629.0,found:629.0922[M+H]+.
实施例9中间体6d(S)-2-(2-([1,2,4]三唑酮[1,5-a]吡啶-6-羰基)-5,7-二氯-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-甲酰基氨基)-3-(3-(甲磺酰基)苯基)丙酸苄酯的制备
将中间体4(0.200g,334umol,HCl)溶解在DCM(2.00mL)中。向溶液中加入三乙胺(101mg,1.00mmol)和HATU(190mg,502umol)，混合液于20℃搅拌1小时。将[1,2,4]三唑酮[1,5-a]吡啶-6-甲酸(中间体5d)(54.6mg,334umol)分批加入到反应液中，反应液在N2保护下20℃反应2小时。LC-MS显示底物反应完，并检测到产物MASS值。将反应液用水(2.00mL)淬灭，并用DCM(2mL)萃取3次。将有机相减压旋干，得到中间体6d(0.220g,crude)，为棕色固体。
实施例10化合物7d(S)-2-(2-([1,2,4]三唑酮[1,5-a]吡啶-6-羰基)-5,7-二氯-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-甲酰基氨基)-3-(3-(甲磺酰基)苯基)丙酸的制备
将中间体6d(0.200g,283umol)溶解在THF(2.00mL)中。向溶液中加入三甲基硅醇钾(109mg,849umol)，反应液在70℃下反应1小时。LC-MS显示底物反应完，并检测到产物MASS值。反应液用水(2.00mL)淬灭后，用1N HCl调至pH＝3。将溶液用EtOAc(2.00mL)萃取3次后，有机相旋干得到粗品。粗品用HCl体系制备分离后得到产品化合物7d(0.04g,62.4umol,收率22.0％,纯度96.3％)，为白色固体。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝9.20(s,1H),9.03(br d,J＝8.0Hz,1H),8.62(s,1H),7.93(d,J＝9.2Hz,1H),7.86(s,1H),7.77(brd,J＝7.6Hz,1H),7.72(br d,J＝7.6Hz,1H),7.67(br d,J＝7.6Hz,1H),7.54-7.60(m,1H),4.74-4.82(m,4H),3.74(br s,2H),3.30(br dd,J＝14.0,4.2Hz,1H),3.15(s,3H),3.02(brdd,J＝14.0,10.6Hz,1H),2.80(br s,2H)；13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ:ppm 172.526(s,1C),164.002(s,1C),155.034(s,1C),150.221(s,1C),141.099(s,1C),139.561(s,1C),137.220(s,1C),135.018(s,1C),134.931(s,1C),132.109(s,1C),131.525(s,1C),130.133(s,1C),129.724(s,1C),129.061(s,1C),128.820(s,1C),128.193(s,1C),126.217(s,1C),125.524(s,1C),123.337(s,1C),116.643(s,1C),53.519(s,1C),44.084(s,1C),36.800(s,1C)；LCMS[M+H]+＝616.0；HR-MS calcd.for C27H23Cl2N5O6S[M+H]+:616.0,found:616.0825[M+H]+.
实施例11中间体6e(S)-2-(2-(3-乙炔基苯甲酰基)-5,7-二氯-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-甲酰基氨基)-3-(3-(甲磺酰基)苯基)丙酸苄酯的制备
将中间体4(0.200g,334umol,HCl)溶解在DCM(2.00mL)中。向溶液中加入三乙胺(101mg,1.00mmol)和HATU(190mg,501umol)，混合液于20℃下搅拌1小时。将3-乙炔基苯甲酸(中间体5e)(48.9mg,334umol)分批加入到反应液中，反应液在N2保护下20℃反应2小时。LC-MS显示底物反应完，并检测到产物MASS值。将反应液用水(2.00mL)淬灭，并用DCM(2mL)萃取3次。将有机相减压旋干，得到中间体6e(0.200g,290umol,收率86.7％)，棕色固体。
实施例12化合物7e(S)-2-(2-(3-乙炔基苯甲酰基)-5,7-二氯-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-甲酰基氨基)-3-(3-(甲磺酰基)苯基)丙酸的制备
将中间体6e(0.200g,290umol)溶解在THF(2.00mL)中。向溶液中加入三甲基硅醇钾(111mg,870umol)，反应液在70℃下反应1小时。LCMS显示底物反应完，并检测到产物MASS值。反应液用水(2.00mL)淬灭后，用1N HCl调至pH＝3。将溶液用EtOAc(2.00mL)萃取3次后，有机相旋干得到粗品。粗品用HCl体系机分分离纯化得到产品化合物7e(0.040g,64.4umol,收率22.2％,纯度96.6％)，白色固体。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝9.04(br d,J＝7.6Hz,1H),7.86(s,1H),7.77(d,J＝7.6Hz,1H),7.67(br d,J＝7.6Hz,1H),7.54-7.61(m,2H),7.45-7.54(m,2H),7.40-7.54(m,1H),4.73-4.82(m,2H),4.30(s,1H),3.52-3.69(m,4H),3.29(br dd,J＝14.0,4.5Hz,1H),3.15(s,3H),3.02(br dd,J＝14.0,10.6Hz,1H),2.75(brs,2H)；13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ:ppm 172.534(s,1C),164.010(s,1C),141.114(s,1C),139.554(s,1C),137.300(s,1C),136.659(s,1C),134.923(s,1C),133.458(s,1C),132.072(s,1C),131.576(s,1C),130.410(s,1C),129.732(s,1C),129.564(s,1C),128.879(s,1C),128.193(s,1C),127.821(s,1C),125.532(s,1C),122.549(s,1C),83.196(s,1C),82.183(s,1C),53.512(s,1C),44.084(s,1C),36.814(s,1C)；LCMS[M+H]+＝599.1；HR-MScalcd.for C29H24Cl2N2O6S[M+H]+:599.0,found:599.0801[M+H]+.
实施例13中间体10 2-(苯并呋喃-6-羰基)-5,7-二氯-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-甲酸甲酯的制备
将5,7-二氯-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-甲酸甲酯(化合物8)(5.00g,16.8mmol,HCl)，EDCI(3.56g,18.5mmol)，DMAP(164mg,1.35mmol)和三乙胺(5.12g,50.58mmol)溶于DMF(30.0mL)中，将苯并呋喃-6-甲酸(化合物9)(2.73g,16.8mmol)加到反应液中，反应液在25℃下搅拌反应15小时。TLC显示原料被完全消耗，将混合物倒入水(120mL)中，用二氯甲烷(100mL)萃取，有机相用柠檬酸(50.0mL)，饱和碳酸氢钠(50.0mL)和盐水(100mL)洗过后，有机相中加入无水硫酸钠干燥后，过滤，旋干，得到中间体10(4.00g，9.90mmol，收率58.6％)，黄色固体。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝8.12(d,J＝2.4Hz,1H),7.78-7.71(m,2H),7.68-7.47(m,1H),7.35(br d,J＝7.6Hz,1H),7.05(d,J＝1.6Hz,1H),4.79(br s,2H),3.91(s,3H),3.79-3.55(m,1H),2.93-2.79(m,2H).
实施例14中间体11 2-(苯并呋喃-6-羰基)-5,7-二氯-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-甲酸的制备
将中间体10(4.00g,9.90mmol)溶于吡啶(24.0mL)中，将碘化锂(5.30g,39.5mmol,1.52mL)加到反应液中，反应液在100℃下搅拌3小时。TLC显示原料已被完全消耗，将反应液浓缩旋干。用盐酸水溶液(3M,40.0mL)将浓缩后的反应液调到pH＝2，之后过滤，固体用水冲洗，旋干固体，得到粗品。粗品在15℃条件下，用石油醚与乙酸乙酯1:1混合液(20.0mL)对粗品打浆纯化，搅拌1小时，过滤得到中间体11(2.00g，4.77mmol，收率48.1％)，棕色固体。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝8.12(d,J＝2.4Hz,1H),7.78-7.70(m,2H),7.64-7.45(m,1H),7.35(br d,J＝7.2Hz,1H),7.05(d,J＝1.6Hz,1H),4.78(br d,J＝1.2Hz,2H),4.01-3.71(m,2H),2.85(br t,J＝5.6Hz,2H).
实施例15中间体13a 2-(2-(苯并呋喃-6-羰基)-5,7-二氯-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-甲酰基氨基)-3-(喹啉-6-基)丙酸乙酯的制备
将中间体11(0.300g,768umol)溶于二氯甲烷(3.00mL)中，将三乙胺(23.3mg,2.31mmol)和HATU(438mg,1.15mmol)加入到混合液中，混合液于20℃下搅拌0.5小时。将2-氨基-3-(喹啉-6-基)丙酸乙酯(中间体12a)(187mg,768umol)和DMAP(75.1mg,615umol)加入到反应液中，反应液于20℃下搅拌反应2小时，TLC显示原料被完全消耗。将反应液倒入水(10mL)中，用乙酸乙酯(10mL)萃取两遍，用硫酸钠干燥有机相，旋干得到粗品。粗品经过柱层析纯化(梯度：石油醚/乙酸乙酯＝10/1到1/1)得到中间体13a(0.200g,291umol,收率37.9％,纯度90.0％)，白色固体。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ＝8.88(br d,J＝3.2Hz,1H),8.10(d,J＝8.0Hz,1H),8.02(d,J＝8.8Hz,1H),7.73(d,J＝1.6Hz,2H),7.65(d,J＝8.0Hz,1H),7.62-7.56(m,2H),7.40(dd,J＝4.0,8.3Hz,1H),7.31(br d,J＝7.6Hz,1H),6.83(d,J＝1.2Hz,1H),6.59(br s,1H),5.34-5.19(m,1H),4.75(br s,2H),4.22(q,J＝7.2Hz,2H),3.89-3.58(m,2H),3.49(d,J＝5.8Hz,2H),2.98-2.83(m,2H),1.31-1.17(m,4H).
实施例16化合物14a 2-(2-(苯并呋喃-6-羰基)-5,7-二氯-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-甲酰基氨基)-3-(喹啉-6-基)丙酸的制备
将中间体13a(200mg,324umol)溶于乙醇(2.00mL)和四氢呋喃(1.00mL)中，将氢氧化钠(38.9mg,973umol)加入水(1.00mL)中溶解，将氢氧化钠水溶液滴加到反应液中，反应液于20℃下搅拌反应2小时，TLC显示原料被完全消耗。将反应液中乙醇和四氢呋喃旋走，水相用1mol/L的盐酸调pH＝4，固体析出。把固体过滤得到粗品，固体用石油醚/乙酸乙酯＝10:1(20mL)打浆。过滤，旋干，得到产品化合物14a(25.0mg,41.6umol,收率12.8％,纯度98.0％)，白色固体。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝12.86(br s,1H),9.09(br s,1H),8.91(brs,1H),8.37(br d,J＝6.0Hz,1H),8.12(br s,1H),7.97(br d,J＝7.6Hz,1H),7.90(br s,1H),7.84-7.66(m,3H),7.58(br s,1H),7.32(br s,1H),7.04(br s,1H),4.84(br s,1H),4.71(br s,2H),3.66(br s,2H),3.38(br d,J＝11.6Hz,1H),3.16-3.07(m,1H),2.75(brs,2H)；13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ:ppm172.698(s,1C),164.029(s,1C),154.114(s,1C),149.783(s,1C),148.209(s,1C),145.927(s,1C),137.477(s,1C),136.806(s,1C),135.027(s,1C),132.461(s,1C),132.133(s,1C),132.046(s,1C),131.623(s,1C),129.151(s,1C),128.852(s,1C),128.495(s,1C),128.262(s,1C),128.028(s,1C),126.206(s,1C),122.480(s,1C),121.992(s,1C),121.897(s,1C),110.801(s,1C),107.316(s,1C),53.701(s,1C),49.072(s,1C),37.137(s,1C)；LCMS[M+H]+＝588.1；HR-MS calcd.for C31H23Cl2N3O5[M+H]+:588.1,found:588.1070[M+H]+.
实施例17中间体13b 2-(2-(苯并呋喃-6-羰基)-5,7-二氯-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-甲酰基氨基)-3-(1,1-二氧化物-2,3-二氢苯并[b]噻吩-6-基)丙酸乙酯的制备
将中间体11(300mg,768umol)溶于二氯甲烷(5.00mL)中，将三乙胺(23.3mg,2.31mmol)和HATU(438mg,1.15mmol)加入到混合液中，混合液于20℃下搅拌0.5小时。将2-氨基-3-(1,1-二氧化物-2,3-二氢苯并[b]噻吩-6-基)丙酸乙酯(中间体12b)(217mg,768umol)和DMAP(75.1mg,615umol)加入到反应液中。反应液于20℃下搅拌反应2小时，TLC显示原料被完全消耗。将反应液倒入水(10mL)中，用乙酸乙酯(20mL)萃取一遍，有机相用0.5mol/L盐酸(10mL),碳酸氢钠水溶液(10mL),食盐水(10mL)各洗一遍，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，旋干得到粗品。粗品经过柱层析纯化(梯度：石油醚/乙酸乙酯＝10/1到1/1)得到中间体13b(0.200g,289umol,收率37.7％,纯度95.0％)，白色固体。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ＝7.73(d,J＝2.4Hz,1H),7.69-7.49(m,4H),7.32(d,J＝8.0Hz,2H),6.83(dd,J＝0.8,2.1Hz,1H),6.57-6.44(m,1H),6.57-6.44(m,1H),6.50(br d,J＝7.6Hz,1H),6.57-6.44(m,1H),5.18-5.09(m,1H),4.89-4.62(m,2H),4.29-4.16(m,2H),3.88-3.62(m,2H),3.52-3.39(m,2H),3.39-3.28(m,4H),2.90(br s,2H),1.31-1.27(m,3H).
实施例18化合物14b 2-(2-(苯并呋喃-6-羰基)-5,7-二氯-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-甲酰基氨基)-3-(1,1-二氧化物-2,3-二氢苯并[b]噻吩-6-基)丙酸的制备
将中间体13b(0.200g,305umol)溶于乙醇(2.00mL)和四氢呋喃(1.00mL)中。将氢氧化钠(36.6mg,915umol)加入水(1.00mL)中溶解，将氢氧化钠水溶液滴加到反应液中，反应液于20℃下搅拌反应2小时。TLC显示原料被完全消耗，将反应液中乙醇和四氢呋喃旋走，水相用1mol/L的盐酸调pH＝4，固体析出。过滤得到粗品，粗品用石油醚/乙酸乙酯＝10:1(20mL)打浆，过滤，旋干，得到产品化合物14b(24.0mg,36.6umol,收率12.0％,纯度95.7％)，白色固体。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝12.85(br s,1H),9.02(br d,J＝8.8Hz,1H),8.11(d,J＝2.0Hz,1H),7.81-7.66(m,2H),7.64-7.55(m,2H),7.43(br d,J＝7.6Hz,1H),7.32(br s,1H),7.03(s,1H),4.69(br s,3H),3.87-3.59(m,2H),3.54(br t,J＝6.8Hz,2H),3.30-3.16(m,3H),3.07-2.94(m,1H),2.77(br s,2H)；13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ:ppm 172.522(s,1C),164.116(s,1C),154.114(s,1C),148.221(s,1C),139.209(s,1C),139.029(s,1C),137.505(s,1C),136.682(s,1C),134.999(s,1C),132.146(s,1C),132.081(s,1C),131.735(s,1C),129.142(s,1C),128.940(s,1C),127.857(s,1C),126.225(s,1C),122.484(s,1C),121.906(s,1C),121.668(s,1C),110.800(s,1C),107.319(s,1C),53.750(s,1C),51.056(s,1C),36.512(s,1C),25.081(s,1C)；LCMS[M+H]+＝627.0；HR-MScalcd.for C30H24Cl2N2O7S[M+H]+:627.0,found:627.0760[M+H]+.
实施例19中间体13c 2-(2-(苯并呋喃-6-羰基)-5,7-二氯-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-甲酰基氨基)-3-(2-羰基-1,2,3,4-四氢喹啉-7-基)丙酸乙酯的制备
将中间体11(300mg,768umol)溶于二氯甲烷(5.00mL)中，将三乙胺(23.3mg,2.31mmol)和HATU(438mg,1.15mmol)加入到混合液中，混合液于20℃下搅拌0.5小时。将2-氨基-3-(2-羰基-1,2,3,4-四氢喹啉-7-基)丙酸乙酯(化合物12c)(201mg,768umol)和DMAP(75.1mg,615umol)加入到反应液中，反应液于20℃下搅拌反应2小时，TLC显示原料被完全消耗。将反应液倒入水(10mL)中，用乙酸乙酯(20mL)萃取一遍。有机相用0.5mol/L盐酸(10mL),碳酸氢钠水溶液(10mL),食盐水(10mL)各洗一遍。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，旋干得到粗品。粗品经过柱层析纯化(梯度：石油醚/乙酸乙酯＝10/1到1/1)得到中间体13c(0.200g,299umol,收率38.9％,纯度95.0％)，白色固体。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ＝8.13(brs,1H),7.74(d,J＝2.0Hz,1H),7.67(d,J＝8.0Hz,1H),7.69-7.65(m,1H),7.63(s,1H),7.33(br d,J＝8.0Hz,1H),7.08(d,J＝7.6Hz,1H),6.89-6.82(m,2H),6.65(s,1H),6.38(br d,J＝8.0Hz,1H),5.23-5.09(m,1H),4.80(br s,2H),4.23(q,J＝7.2Hz,2H),3.94-3.69(m,2H),3.29-3.14(m,1H),3.29-3.14(m,1H),3.00-2.85(m,4H),2.69-2.55(m,2H),1.36-1.20(m,4H).
实施例20化合物14c 2-(2-(苯并呋喃-6-羰基)-5,7-二氯-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-甲酰基氨基)-3-(2-羰基-1,2,3,4-四氢喹啉-7-基)丙酸的制备
将中间体13c(0.200g,315umol)溶于乙醇(2.00mL)和四氢呋喃(1.00mL)中，将氢氧化钠(37.8mg,945umol)加入水(1.00mL)中溶解，将氢氧化钠水溶液滴加到反应液中，反应液于20℃下搅拌反应2小时，TLC显示原料被完全消耗。将反应液中乙醇和四氢呋喃旋走，水相用1mol/L的盐酸调pH＝4，固体析出。将固体过滤得到粗品，粗品用石油醚/乙酸乙酯＝10:1(20mL)打浆。过滤，旋干，得到产品化合物14c(24.0mg,37.9umol,收率12.0％,纯度96％)，白色固体。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝12.76(br s,1H),10.05(s,1H),9.00(br d,J＝8.4Hz,1H),8.13(d,J＝2.0Hz,1H),7.83-7.65(m,2H),7.50-7.26(m,2H),7.14-7.00(m,2H),6.83(br d,J＝7.6Hz,1H),6.75(s,1H),4.75(br s,1H),4.66-4.57(m,1H),3.65(brs,2H),3.04(br dd,J＝5.2,13.6Hz,1H),2.89-2.74(m,5H),2.39(t,J＝7.6Hz,2H)；13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ:ppm 172.731(s,1C),170.724(s,1C),163.957(s,1C),154.121(s,1C),148.214(s,1C),138.574(s,1C),137.447(s,1C),136.739(s,1C),135.114(s,1C),132.110(s,1C),132.074(s,1C),131.713(s,1C),129.157(s,1C),128.962(s,1C),127.907(s,1C),126.196(s,1C),123.358(s,1C),122.499(s,1C),122.159(s,1C),121.906(s,1C),116.274(s,1C),110.807(s,1C),107.319(s,1C),54.017(s,1C),37.155(s,1C),31.067(s,1C),24.973(s,1C)；LCMS[M+H]+＝606.0；HR-MS calcd.for C31H25Cl2N3O6[M+H]+:606.0,found:606.1202[M+H]+.
实施例21化合物14d 2-(2-(苯并呋喃-6-羰基)-5,7-二氯-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-甲酰基氨基)-3-(2-羟基苯乙酮-5-基)丙酸的制备
将中间体11(0.300g,768umol)加到氯化亚砜(3.00mL)中，反应液加热到70℃，搅拌反应2小时。取样用甲醇淬灭，TLC显示原料已消耗完。将反应液旋干得到中间体15。
将3-(2-羟基苯乙酮-5-基)-2-氨基丙酸(中间体12d)(188mg,845umol)和三乙胺(233mg,2.31mmol)加入到DMF(3mL)中溶解，将上步所得中间体15慢慢加入到反应液中，反应液于20℃下搅拌2反应小时，TLC显示原料被完全消耗。将反应液倒入柠檬酸(10mL)中，用乙酸乙酯(20mL)萃取一遍，有机相旋干得到粗品。粗品经过制备分离纯化得到产品化合物14d(0.025g,39.8umol,收率5.19％,纯度95.0％)，黄色固体。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝12.82(br s,1H),11.84(s,1H),9.01(br d,J＝8.2Hz,1H),8.13(d,J＝2.0Hz,1H),7.83(d,J＝1.2Hz,1H),7.78-7.63(m,2H),7.46(br dd,J＝1.6,8.5Hz,1H),7.33(br d,J＝7.2Hz,1H),7.05(dd,J＝0.8,2.0Hz,1H),6.87(d,J＝8.8Hz,1H),4.83-4.60(m,3H),3.64(br s,1H),3.12(br dd,J＝4.4,13.9Hz,1H),2.89(br dd,J＝10.4,13.9Hz,1H),2.79(br s,2H),2.61(s,2H),2.63(br s,1H)；13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ:ppm 205.022(s,1C),172.752(s,1C),167.452(s,1C),164.025(s,1C),160.030(s,1C),154.124(s,1C),148.211(s,1C),137.843(s,1C),137.501(s,1C),135.109(s,1C),132.630(s,1C),132.193(s,1C),132.157(s,1C),132.084(s,1C),131.646(s,1C),129.153(s,1C),128.883(s,1C),128.373(s,1C),122.482(s,1C),121.906(s,1C),120.331(s,1C),117.779(s,1C),110.794(s,1C),107.316(s,1C),53.838(s,1C),36.208(s,1C),30.273(s,1C),28.830(s,1C),27.933(s,1C),22.858(s,1C)；LCMS[M+H]+＝595.0；HR-MS calcd.for C30H24Cl2N2O7[M+H]+:595.0,found:595.0844[M+H]+.
实施例22化合物14e 2-(2-(苯并呋喃-6-羰基)-5,7-二氯-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-甲酰基氨基)-3-(1,2-二羟基苯-4-基)丙酸的制备
将中间体11(0.300g,768umol)加到氯化亚砜(3.00mL)中，将反应液升温至70℃，搅拌反应2小时，取样用甲醇淬灭，TLC显示原料被完全消耗。反应液旋干得到中间体15。
将3-(1,2-二羟基苯-4-基)-2-氨基丙酸(中间体12e)(166mg,845umol)和三乙胺(233mg,2.31mmol)加入到DMF(3mL)中溶解，将中间体15慢慢加入到反应液中，反应液于20℃下搅拌反应2小时，TLC显示原料被完全消耗。将反应液倒入柠檬酸(10mL)中，用乙酸乙酯(20mL)萃取一遍，有机相旋干得到粗品。粗品经过制备分离纯化得到产品化合物14e(0.025g,41.7umol,收率5.43％,纯度95％)，白色固体。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝8.92(br d,J＝7.2Hz,1H),8.69(d,J＝13.2Hz,2H),8.13(d,J＝1.6Hz,1H),7.79-7.64(m,2H),7.34(br s,1H),7.05(s,1H),6.64(s,1H),6.60(br d,J＝8.0Hz,1H),6.51(br d,J＝7.6Hz,1H),4.76(br s,2H),4.59-4.47(m,1H),3.66(br s,2H),2.92(br dd,J＝4.8,13.9Hz,1H),2.84-2.71(m,3H)；13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ:ppm 172.935(s,1C),163.974(s,1C),154.131(s,1C),148.211(s,1C),145.339(s,1C),144.252(s,1C),137.391(s,1C),132.084(s,1C),131.756(s,1C),129.145(s,1C),132.110(s,1C),128.489(s,1C),126.200(s,1C),122.496(s,1C),121.913(s,1C),120.425(s,1C)116.999(s,1C),115.701(s,1C),110.801(s,1C),107.316(s,1C),54.421(s,1C),36.872(s,1C)；LCMS[M+H]+＝569.2；HR-MScalcd.for C28H22Cl2N2O7[M+H]+:569.2,found:569.0673[M+H]+.
化合物活性测试实施例
采用细胞粘附实验，检测化合物在细胞水平对LFA-1/ICAM-1结合活性的影响。
ICAM-1蛋白包被黑色96孔荧光酶标板，12.5ug/ml，100ul/孔，37℃作用至少1h。Juckat细胞标记BCECF荧光探针：Juckat细胞1000r离心5min，细胞计数，2.5*106cell/ml，加入等体积8uM BCECF溶液，37℃作用15min。标记好的Juckat细胞1000r离心5min，弃上清，PBS洗两次，细胞培养基悬起计数，5*105cell/孔(70ul/孔)加入96孔细胞培养板内。化合物及阳性药稀释：10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11M，每个药物浓度设三个复孔，将稀释好的药物70ul/孔加入到细胞内，37℃作用30min。将包含不同浓度药物的细胞悬液加入到包被ICAM-1蛋白的板孔内(100ul/孔)，37℃作用1h。弃去细胞上清，洗去未贴壁细胞，荧光酶标仪检测。
IC50值活性测试结果如表1和图1所示
活性测试结果表明化合物7b的IC50达到了百级纳摩尔水平，具有较好的LFA-1抑制活性；化合物7c、14a、14c的IC50也达到了几个微摩尔水平，其中14a和14c为外消旋体，其S构型的活性会进入百级纳摩尔水平。因此，本申请保护的该类化合物对LFA-1在细胞水平的抑制活性都较好，具有潜在的治疗由LFA-1介导的干眼症或其它炎症性疾病的医疗用途。
表1活性测试结果
aLFA-1细胞性数据为三个复孔测定
n.a.:无活性
滴眼液制备实施例
配方：
(1)5％化合物7b滴眼液的配方
工艺：处方量称取化合物7b，用5mL 1M NaOH溶液全部溶解，另外称取处方量的甘油和苯扎氯氨用30mL注射用水溶解后，加入到化合物7b的NaOH溶液中，混合均匀后，用HCl调节pH至8.5，最后用注射用水稀释至100ml即得5％化合物7b滴眼液。
(2)7％化合物7b滴眼液的配方
工艺：处方量称取化合物7b，用7mL 1M NaOH溶液全部溶解，另外称取处方量的甘油和苯扎氯氨用30mL注射用水溶解后，加入到化合物7b的NaOH溶液中，混合均匀后，用HCl调节pH至8.5，最后用注射用水稀释至100ml即得7％化合物7b滴眼液。
干眼小鼠模型建立及给以化合物7b的方法
试验动物：8周龄的C57/BL6雄性小鼠30只，购自辽宁长生生物技术有限公司。取8周龄的C57/BL6雄性小鼠30只，试验分为空白对照组、模型对照组、化合物7b给药组(5％、7％W/V)、溶剂对照组、阳性药对照组立他司特(Lifitegrast)。
主要药品与仪器：东莨菪碱(0.5mg/0.2mL,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)；7b；立他司特(5％Lifitegrast,USA)；Oregon Green Dextran 488(OGD-70,00MW,USA)；OCT(VWR,Suwanee,GA,USA)；TUNEL(ApopTag；Intergen Co.,Purchase,NY,USA)；正置荧光显微镜(Nikon Eclipse Ni-U,Japan)；体视荧光显微镜(Nikon SMZ1500,Japan)；冰冻切片机(LEIKA CM1860UV,Germany)；智能干燥箱(ZD-890c；Ouyi Company,Hangzhou,China)；
东莨菪碱诱导的小鼠干眼模型的创建：本研究采用智能干燥环境控制系统结合药物诱导创建的小鼠干眼模型。环境控制系统制作方法：采用两阶梯除湿法控制环境湿度，可调温工业除湿机初步降低房间湿度至40±5％，再利用智能除湿主机(除湿范围RH 10％-80％)进一步降低箱体湿度。智能除湿机应用一种新型的分子材料——分子筛作为吸湿剂。分子筛无毒，可在设计的控制系统调控下加热再生、动态除湿，反馈调控环境湿度在所要求的实验水平。同时在箱内距鼠笼20cm处放置可调速(风速范围0-5m/s)、无噪音风扇，风扇和小鼠保持同一平面，利用风速计(测量范围0-30m/s,准确度±5％)检测风速。通过以上措施，使湿度、温度和气体流量都得到有效调控。
将C57/BL6小鼠暴露于干燥环境(RH＝15；WV＝2m/s；T＝21-23℃)14天，每天3次(上午9:00，下午1:00,4:00)皮下注射0.5mg/0.2mL东莨菪碱，连续给药14天构建干眼模型；给药组双眼同时滴入化合物7b滴眼液5μL，阳性药组双眼同时滴入立他司特(Lifitegrast)滴眼液5μL，溶剂对照组双眼滴入7b滴眼液空白溶剂5μL。
冰冻切片制备：本研究应用冰冻切片进行免疫荧光与TUNEL染色实验。将动物处死，手术切除眼球与附属器(n＝10眼/组)后，OCT(VWR,Suwanee,GA,USA)包埋。眼球中心矢状面以6μm厚度切片，-80℃保存备用。
角膜荧光素染色检查角膜屏障功能
在小鼠动物模型基础上，用毛细吸管将2μL 0.5μg/mL OGD溶液滴入小鼠结膜囊，1分钟后在体式荧光显微镜下观察小鼠角膜染色情况。染色的程度运用体式荧光显微镜进行活体检测照相并用NIS Elements软件分析角膜上皮表面的平均荧光强度。
图2为5％化合物7b、7％化合物7b滴眼液对干眼小鼠模型角膜上皮损伤的保护作用。图3为由荧光染色照片和对荧光斑点进行统计后的柱形图，可以看出，模型组与空白组比较，眼表损伤的荧光染色斑点明显增多，与模型组比较，给与化合物7b滴眼液后，荧光斑点区域变小，表明眼表损伤显著减少。立他司特(Lifitegrast)滴眼液组与对照组相比，眼表损伤有显著性减少，作用较化合物7b强，并且具有统计学意义。由图3的结果可知，化合物7b可显著性减少干眼小鼠的眼表上皮细胞的损伤。
组织学糖原染色检测杯状细胞密度
将各组眼球组织冰冻切片，使用过碘酸-希夫(PAS)染色试剂盒将6μm切片进行糖原染色，观察切片并用Nikon Eclipse Ni-U拍照计数。然后在各组别10只眼的上方和下方结膜处检测杯状细胞的密度。
图4为结膜杯状细胞的糖原染色。模型组较空白组杯状细胞显著减少。与模型组比较，给予化合物7b后，杯状细胞显著增多，给予立他司特(Lifitegrast)后，杯状细胞显著增多，但化合物7b的作用较立他司特(Lifitegrast)弱。杯状细胞密度的统计柱状图如图5所示。由图5统计结果可知，7b显著增加干眼小鼠的杯状细胞密度，改善干眼症状。
TUNEL法检测细胞凋亡
TUNEL染色依据试剂盒说明进行(ApopTag；Intergen Co.,Purchase,NY,USA)。将小鼠动物模型中的冰冻切片复温后，2:1乙醇：乙酸破膜。TdT酶与11-digoxigenin dUTP37℃孵育2h。PBS冲洗后，终止液终止。FITC标记二抗室温下孵育60分钟，DAPI(0.5μg/mL)染核，5分钟。荧光显微下400×观察、拍照。选择角膜上皮中央部200μm视野区域，统计TUNEL阳性细胞数并记录。
图6为5％化合物7b、7％化合物7b对干眼模型小鼠角膜上皮细胞凋亡的影响。由图6可见，干眼模型组的角膜和结膜中绿色荧光阳染的凋亡细胞较空白组明显增多。给予7b后，角膜、结膜中的凋亡细胞明显减少，但7b的作用较立他司特(Lifitegrast)的抗凋亡作用弱。凋亡细胞统计柱形图见图7。由图7可知，7b对干眼小鼠的眼表细胞凋亡中具有保护作用，但作用较立他司特(Lifitegrast)弱。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种通式(Ⅰ)所示的5,7-二氯-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-甲酰胺类化合物、或其对映异构体、非对映异构体、外消旋体及其混合物，或其药学上可接受的盐，
式中，
X选自砜基、亚甲胺酰基、亚甲酰基和羰基；
R1选自氢、取代或未取代的3-10元杂芳基、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的C1-C6不饱和烷基、取代或未取代的C3-C6环烷基和取代或未取代的C6-C10芳基；
R2选自氢、取代或未取代的3-10元杂芳基、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的C3-C6环烷基、取代或未取代的C6-C10芳基、羟基、邻二羟基、邻羟基甲酰基、卤素、氰基、硝基和烷氧基；
所述取代是指具有选自C1-C6烷基、卤素、氰基、C1-C6烷氧基、硝基、-C(O)-3-10元杂环基、C3-C6环烷基、-O-(CH2)m-C6-C10芳基、-(CH2)m-3-10元杂芳基、-(CH2)m-3-10元杂环基和-C(O)OC1-C6烷基中的一个或二个以上的取代基；其中，C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C3-C6环烷基、C6-C10芳基、3-10元杂芳基和3-10元杂环基是取代或未取代的。
2.如权利要求1所述的5,7-二氯-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-甲酰胺类化合物，或其对映异构体、非对映异构体、外消旋体及其混合物，或其药学上可接受的盐，其特征在于，
R1选自取代或未取代的3-10元杂芳基和取代或未取代的C1-C6不饱和烷基；
R2选自取代或未取代的3-10元杂芳基、羟基、邻二羟基、邻羟基甲酰基、卤素、氰基、硝基和烷氧基。
3.如权利要求2所述的5,7-二氯-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-甲酰胺类化合物，或其对映异构体、非对映异构体、外消旋体及其混合物，或其药学上可接受的盐，其特征在于，
R1选自呋喃基、三氮唑基和乙炔基；
R2选自吡啶基、环丁砜基、环己酰胺基、邻二羟基和邻羟基甲酰基。
4.如权利要求1所述的5,7-二氯-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-甲酰胺类化合物，或其对映异构体、非对映异构体、外消旋体及其混合物，或其药学上可接受的盐，其特征在于，具有如下结构式：
5.一种药物组合物，其特征在于，包含以权利要求1-4任意一项所述的5,7-二氯-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-甲酰胺类化合物，或其对映异构体、非对映异构体、外消旋体及其混合物，或其药学上可接受的盐作为活性成分。
6.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，还包含药学上可接受的载体。
7.权利要求1-4任意一项所述的5,7-二氯-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-甲酰胺类化合物，或其对映异构体、非对映异构体、外消旋体及其混合物，或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗由LFA-1介导的疾病的药物中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述由LFA-1介导的疾病包括干眼症或其它炎症性疾病。
9.如权利要求5或6所述的药物组合物在制备预防和/或治疗由LFA-1介导的疾病的药物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述由LFA-1介导的疾病包括干眼症或其它炎症性疾病。
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| CN202110946596.4A CN115707698A (zh) | 2021-08-18 | 2021-08-18 | 5,7-二氯-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-甲酰胺类化合物及其制备方法和应用 |
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-
2021
- 2021-08-18 CN CN202110946596.4A patent/CN115707698A/zh active Pending
Cited By (2)
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| CN117286192A (zh) * | 2023-11-27 | 2023-12-26 | 欣雅利华生物技术(上海)有限公司 | 酰胺合成酶在制备立他司特中间体和/或立他司特中的用途 |
| CN117286192B (zh) * | 2023-11-27 | 2024-02-23 | 欣雅利华生物技术(上海)有限公司 | 酰胺合成酶在制备立他司特中间体和/或立他司特中的用途 |
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