CN115702889A - 具有肿瘤免疫微环境调节功能的纳米药物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有肿瘤免疫微环境调节功能的纳米药物及其制备方法与应用。本发明的纳米药物包括：由碳酸钙纳米颗粒和包覆在碳酸钙纳米颗粒表面的复合物形成的纳米药物颗粒，以及，用于负载纳米药物颗粒的脂质体载体；其中，复合物由免疫调控小分子和金属离子通过配位作用形成。本发明公开的纳米药物通过静脉注射，在肿瘤部位具有高效的富集行为，并且其具有相当长的血液循环时间。该纳米药物在肿瘤部位可实现快速的质子中和，调节肿瘤的微酸环境；同时，释放的免疫调控小分子可有效地调节肿瘤微环境，逆转免疫抑制肿瘤微环境。通过联合放射治疗，激起强大的抗肿瘤免疫反应，有效地抑制肿瘤的生长，且抑制肿瘤的转移和复发，增强了放射治疗的疗效。

Description

具有肿瘤免疫微环境调节功能的纳米药物及其制备方法与 应用
技术领域
本发明涉及一种具有肿瘤免疫微环境调节功能的纳米药物及其制备方法与应用，属于肿瘤治疗纳米药物技术领域。
背景技术
截至目前，肿瘤仍然是威胁人类健康首要的疾病。随着人们对肿瘤生物学及其代谢的深入了解，研究者发现代谢重编程是肿瘤的典型特征之一，也是作为研究肿瘤治疗的重要潜在靶点。癌细胞代谢通路的改变被认为是肿瘤发生、转移以及治疗失败的主要原因之一。越来越多的研究表明，癌细胞通过低效的糖酵解方式来快速产生ATP和其它代谢中间体，以此来维持肿瘤细胞的快速增殖。乳酸，作为糖酵解代谢的一种副产物，其在肿瘤内的积聚导致了肿瘤微环境的酸化，使得免疫细胞的功能障碍，促进了肿瘤的不断恶化。除此之外，为了适应肿瘤的快速生长，肿瘤微环境内的不同细胞也表达了高水平的营养消耗相关外酶，比如吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO1)、胞外-5’-核苷酸酶(CD73)。其中吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO1)是色氨酸(Trp)沿犬尿氨酸(Kyn)途径代谢的关键酶，其催化生成的犬尿氨酸抑制了T细胞的活化。肿瘤微环境的酸化和犬尿氨酸的生成导致了免疫抑制微环境的产生，从而使得肿瘤细胞逃避了免疫细胞的监测，促使了肿瘤的增殖。虽然目前有多种小分子抑制剂，比如吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO1)抑制剂，被用来抑制肿瘤细胞内相关酶的活性以逆转免疫抑制性微环境，从而协同增效传统的肿瘤治疗，但是这些小分子抑制剂在实际的临床转化应用中遇到了重重困难，例如，分子水溶性较差、容易产生耐药性、缺乏肿瘤选择性和靶向性等。鉴于纳米医学的快速发展，开发一种具有高装载率的药物载体有望实现这些小分子抑制剂的肿瘤靶向递送，进而重塑免疫抑制代谢肿瘤微环境，有效提高肿瘤治疗的疗效。
此外，放射治疗(radiotherapy，RT)是一种利用高能量射线产生活性氧(reactiveoxygen species，ROS)从而杀死癌细胞的治疗手段，是目前临床肿瘤治疗中使用最多的治疗方式。但是，大量的研究表明，放射治疗的疗效在很大程度上受到了肿瘤微环境的影响，其临床治疗结果远远不尽人意。鉴于氧气是放疗过程中产生活性氧的来源，研究者们设计了各种策略来试图改善肿瘤部位的乏氧，并且获得了积极的疗效。有研究发现肿瘤细胞的微酸环境会使得其对射线更加耐受，且碱性条件下的细胞对射线的耐受程度会降低。尽管相关的pH依赖性放疗耐受机制没有详细的解释，但是已经有相关研究表明，中和肿瘤微环境内的微酸将会增强射线对肿瘤细胞的杀伤能力。因此，开发一种能够快速中和质子和实现肿瘤微环境的有效调节，协同增效肿瘤放射治疗的纳米药物是非常有必要的。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种制备简单，并且能够高效富集到肿瘤部位，快速中和质子，且释放的免疫调控小分子能够有效地调节肿瘤微环境，逆转肿瘤细胞代谢导致的免疫抑制性微环境的纳米药物。其与放疗联用，能够高效地抑制肿瘤的生长，同时通过激起机体的免疫反应，能够抑制肿瘤的转移和复发。
本发明的第一个目的是提供一种具有肿瘤免疫微环境调节功能的纳米药物，所述纳米药物包括：由碳酸钙纳米颗粒和包覆在碳酸钙纳米颗粒表面的复合物形成的纳米药物颗粒，以及，用于负载所述纳米药物颗粒的脂质体载体；其中，所述的复合物由免疫调控小分子和金属离子通过配位作用形成。
进一步地，所述的碳酸钙纳米颗粒得粒径为60～300nm。优选80～160nm。
进一步地，所述的免疫调控小分子为吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂、转化生长因子-β(TGF-β)抑制剂、白介素受体抑制剂、氧化磷酸化抑制剂、PD-1/PD-L1相互作用抑制剂中的一种或多种。
进一步地，所述的吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂为4-苯基咪唑(4PI)或那伏莫德(NLG919)。
进一步地，所述的转化生长因子-β(TGF-β)抑制剂为SB431542、LY364947、SB505124或SB525334。
进一步地，所述的白介素受体抑制剂为地塞米松磷酸钠。
进一步地，所述的氧化磷酸化抑制剂为4-甲基-2-氧代戊酸。
进一步地，所述的PD-1/PD-L1相互作用抑制剂为BMS-1001、BMS-1166或BMS-1。
进一步地，所述的金属离子为锌离子、锰离子、铁离子、镍离子、铜离子中的一种或多种。
本发明的第二个目的是提供一种所述的纳米药物的制备方法，包括如下步骤：
S1、将碳酸钙纳米颗粒、免疫调控小分子和金属离子溶于无水乙醇中，搅拌反应，离心洗涤后，得到纳米药物颗粒；
S2、将纳米药物颗粒溶于无水乙醇中，与磷脂酸系列磷脂的氯仿溶液混合，超声处理后离心，得到包裹有磷脂酸系列磷脂的纳米药物颗粒；
S3、将包裹有磷脂酸系列磷脂的纳米药物颗粒溶于氯仿，与胆固醇、胆碱系列磷脂和磷酸乙醇胺系列磷脂混合搅拌处理10～30小时，去除氯仿后得到所述的纳米药物。
进一步地，所述的碳酸钙纳米颗粒、免疫调控小分子和金属离子的质量比为1:(1～8):(0.1～4)。优选质量比为1:(2～2.5):(0.1～1.2)。
进一步地，所述的纳米药物颗粒、磷脂酸系列磷脂、胆固醇、胆碱系列磷脂、磷酸乙醇胺系列磷脂的质量比为(5～20)：1：1：(1～4)：(2～8)。优选质量比为(10～12):1:1:(2～3):(4～6)。
进一步地，所述的磷脂酸系列磷脂主要包括1,2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸(钠盐)(DOPA)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸(钠盐)(DSPA)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸(钠盐)(DPPA)或1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸(钠盐)(DMPA)中的一种或多种。
进一步地，所述的胆碱系列磷脂主要包括1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1-十八烷酰-2-棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(SOPC)、1-豆蔻酰-2-棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)或1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)中的一种或多种。
进一步地，所述的磷酸乙醇胺系列磷脂主要包括1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(甲氧基(聚乙二醇)(DSPE-PEG)、1,2-二癸酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(甲氧基(聚乙二醇)(DDPE-PEG)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(甲氧基(聚乙二醇)(POPE-PEG)、1-硬脂酰-2-亚油酸-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(甲氧基(聚乙二醇)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(甲氧基(聚乙二醇)(DPPE-PEG)、1,2-二豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(甲氧基(聚乙二醇)(DMPE-PEG)或1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(甲氧基(聚乙二醇)(DOPE-PEG)中的一种或多种。
进一步地，在S2步骤中，超声处理的时间为15～25分钟。
进一步地，所述的纳米药物可加水超声水化处理，得到溶于水的纳米药物溶液。
本发明的第三个目的是提供所述的具有肿瘤免疫微环境调节功能的纳米药物在制备增强肿瘤放射治疗的药物中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种具有肿瘤代谢微环境调节功能的纳米药物制备，其合成方法简单易操作。在静脉注射后，其能够高效地富集到肿瘤部位，快速地中和肿瘤中的质子，缓解肿瘤微酸缓解；同时释放的免疫调控小分子，可以有效调节肿瘤微环境，逆转了免疫抑制肿瘤微环境。
本发明还公开了纳米药物用于增强肿瘤放疗的用途。静脉注射纳米药物，同时联合放疗，能够有效调控肿瘤免疫抑制微环境，减少肿瘤中免疫抑制性细胞的含量，如调节性T细胞(regulatory T cells,Tregs)，M2巨噬细胞，髓系来源的抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)；增加能够杀伤肿瘤的免疫细胞的含量，如M1巨噬细胞，自然杀伤细胞(natural killer cells,NKs)，CD8+T淋巴细胞。有效扭转肿瘤免疫抑制微环境，激活机体的免疫反应，抑制肿瘤的转移和复发。
附图说明：
图1为含有4PI和锌离子的纳米药物紫外吸收谱图和透射电镜图；
图2为含有4PI和铁离子的纳米药物紫外吸收谱图和透射电镜图；
图3为含有NLG919和锰离子的纳米药物紫外吸收谱图和透射电镜图；
图4为含有NLG919和铁离子的纳米药物紫外吸收谱图和透射电镜图；
图5为纳米药物性质的测试结果；
图6为纳米药物抑制细胞内IDO活性的测定；
图7为纳米药物联合射线引起细胞内DNA damage的能力测定；
图8为静脉注射纳米药物后在肿瘤部位的富集情况，以及其血液循环时间；
图9为静脉注射纳米药物后调节肿瘤免疫微环境的结果；
图10为不同分组的小鼠结肠癌皮下肿瘤和乳腺癌皮下肿瘤在治疗后的肿瘤生长曲线；
图11为纳米药物用于治疗小鼠双边结肠癌模型示意图、不同分组的小鼠结肠癌右侧肿瘤在静脉注射纳米药物治疗后的生长曲线、小鼠结肠癌左侧肿瘤的生长曲线；
图12为不同分组的小鼠在第二次接种小鼠结肠癌肿瘤后肿瘤的生长曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1：纳米药物的制备方法
实施例1.1：含有4PI和锌离子的纳米药物制备方法：
S1：称取12mg的4PI溶于1mL的乙醇中，然后将其加入到2mL的纳米碳酸钙乙醇溶液中(3mg mL-1)，常温搅拌5min；
S2：称取一定质量的硝酸锌(Zn：6mg)，溶于1mL的乙醇中，然后将其加入到含有纳米碳酸钙和4PI的混合溶液中，继续搅拌反应4h；
S3：14800rpm离心，用无水乙醇洗涤三次，重悬于1mL的乙醇中备用。
获得的纳米药物的相关表征如图1所示，其中图1a为含有4PI和锌离子纳米药物的紫外吸收曲线，图1b为其透射电镜图。从紫外吸收曲线可以看出，获得的纳米药物具有4PI的特征吸收峰，且从透射电镜图可以看出，碳酸钙颗粒表明包裹了很薄的一层复合物，这些数据表明4PI被成功包覆在碳酸钙纳米颗粒表面。
实施例1.2：含有4PI和铁离子的纳米药物制备方法：
S1：称取12mg的4PI溶于1mL的乙醇中，然后将其加入到2mL的纳米碳酸钙乙醇溶液中(3mg mL-1)，常温搅拌5min；
S2：称取一定质量的六水合氯化铁(Fe：0.6mg)，溶于1mL的乙醇中，然后将其加入到含有纳米碳酸钙和4PI的混合溶液中，继续搅拌反应4h；
S3：14800rpm离心，用无水乙醇洗涤三次，重悬于1mL的乙醇中备用。
获得的纳米药物的相关表征如图2所示，其中图2a为含有4PI和铁离子纳米药物的紫外吸收曲线，图2b为其透射电镜图。从紫外吸收曲线可以看出，获得的纳米药物具有4PI的特征吸收峰，且从透射电镜图可以看出，碳酸钙颗粒表明包裹了很薄的一层复合物，这些数据表明4PI被成功包覆在碳酸钙纳米颗粒表面。
实施例1.3：含有NLG919和锰离子的纳米药物制备方法：
S1：称取12mg的NLG919溶于1mL的乙醇中，然后将其加入到2mL的纳米碳酸钙乙醇溶液中(3mg mL-1)，常温搅拌5min；
S2：称取一定质量的氯化锰(Mn：3mg)，溶于1mL的乙醇中，然后将其加入到含有纳米碳酸钙和NLG919的混合溶液中，继续搅拌反应4h；
S3：14800rpm离心，用无水乙醇洗涤三次，重悬于1mL的乙醇中备用。
获得的纳米药物的相关表征如图3所示，其中图3a为含有NLG919和锰离子纳米药物的紫外吸收曲线，图3b为其透射电镜图。从紫外吸收曲线可以看出，获得的纳米药物具有NLG919的特征吸收峰，且从透射电镜图可以看出，碳酸钙颗粒表明包裹了很薄的一层复合物，这些数据表明NLG919被成功包覆在碳酸钙纳米颗粒表面。
实施例1.4：含有NLG919和铁离子的纳米药物制备方法：
S1：称取12mg的NLG919溶于1mL的乙醇中，然后将其加入到2mL的纳米碳酸钙乙醇溶液中(3mg mL-1)，常温搅拌5min；
S2：称取一定质量的硝酸锌(Fe：1.2mg)，溶于1mL的乙醇中，然后将其加入到含有纳米碳酸钙和NLG919的混合溶液中，继续搅拌反应4h；
S3：14800rpm离心，用无水乙醇洗涤三次，重悬于1mL的乙醇中备用。
获得的纳米药物的相关表征如图4所示，其中图4a为含有NLG919和铁离子纳米药物的紫外吸收曲线，图4b为其透射电镜图。从紫外吸收曲线可以看出，获得的纳米药物具有NLG919的特征吸收峰，且从透射电镜图可以看出，碳酸钙颗粒表明包裹了很薄的一层复合物，这些数据表明NLG919被成功包覆在碳酸钙纳米颗粒表面。
对以上制备得到的纳米药物进行修饰。将纳米药物和DOPA按照一定的质量比分别溶于乙醇和氯仿中，然后将其混合，超声20min，离心，得到表面包裹有DOPA的纳米药物复合物；称取一定质量的胆固醇、DPPC、DSPE-PEG，和包裹有DOPA的纳米药物一起分散到氯仿中，混合搅拌过夜，旋蒸去除氯仿，加水超声水化，最终得到修饰后分散在水相中的纳米药物溶液。
以下关于纳米药物的实施例均是基于含有4PI和锌离子的纳米药物进行的实施例。
实施例2：纳米药物性质的检测
对实施例1制得的纳米药物进行定性检测，分别进行透射电镜检测、稳定性检测、质子中和能力检测、酸响应药物释放能力检测。
对实施例1制得的乙醇相纳米药物进行透射电镜检测，如图5a，结果显示，实施例1制得的纳米药物的粒径均一、形貌均一。
对实施例1制得修饰后的纳米药物进行稳定性检测，将其分散于不同溶剂中(H2O，PBS，0.9％NaCl，RPMI 1640)，通过检测纳米药物在不同溶液中的粒径变化来判断其稳定性。如图5b所示，实施例1制得修饰后的纳米药物在不同的溶液中均保持稳定的粒径，且24h之内没有显著的粒径变化，表明实施例1制得修饰后的纳米药物具有良好的稳定性。
对实施例1制得修饰后的纳米药物进行质子中和能力检测，如图5c，结果显示，实施例1制得的修饰后纳米药物具有和碳酸钙相似的质子中和能力，能够快速地中和酸性溶液中的质子。
对实施例1制得修饰后的纳米药物进行酸响应药物释放能力检测。将纳米药物转移到透析袋中，室温下浸入到不同pH缓冲溶液中(即pH 7.4溶液、pH 6.5溶液、pH 5.5溶液)。在预定的时间点，收集外部溶液，用紫外-可见分光光度计测定4PI浓度。测试结果如图5d所示，结果显示，实施例1制得修饰后的纳米药物在酸性条件下显示出更好的药物释放能力。
实施例3：纳米药物中4PI的IDO抑制性质检测
由于实施例1制得修饰后的纳米药物中存在吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO1)抑制剂4PI，其能够抑制IDO1酶的活性，因此检测实施例1制得修饰后的纳米药物的IDO1抑制效果。将4PI与实施例1制得修饰后的纳米药物分别与IFN-γ同时加入结肠癌细胞中孵育48h，再加入30％三氯乙酸，在50℃下孵育6h，将甲酰犬尿氨酸水解为犬尿氨酸。最后加入埃利希试剂，室温显色10min，测490nm波长处吸收。
测试结果如图6所示，结果显示，实施例1制得修饰后的纳米药物具有与单独4PI相似的IDO1抑制性能。
实施例4：纳米药物联合射线引起的细胞DNA damage能力检测
由于实施例1制得修饰后的纳米药物具有良好的质子中和能力，因此我们检测了纳米药物对逆转酸性辐射耐药的能力。我们通过将细胞在pH 6.5和pH 7.4的培养基中培养，然后对细胞进行纳米药物的处理，一段时间后，暴露于X射线，之后通过γ-H2AX免疫荧光染色检测X射线暴露诱导的DNA双链断裂。
测试结果如图7所示，结果显示，经纳米药物、pH 6.5培养基和X射线照射处理的细胞，其胞内γ-H2AX信号与仅受pH 7.4培养基和X射线照射处理的细胞相当，但远高于仅受pH6.5培养基和X射线照射处理的细胞。因此，经所制备得的纳米药物处理，在暴露于X射线后可以诱导更多的DNA双链断裂，可以逆转酸性辐射耐药的影响。
实施例5：纳米药物尾静脉注射后在小鼠的体内行为
为了了解实施例1制得修饰后的纳米药物通过静脉注射后在小鼠体内的行为，我们将纳米药物标记上荧光小分子，通过活体荧光成像来了解其在小鼠体内的行为。简单来说，将标记有荧光小分子DiR的纳米药物复合物通过静脉注射到带有结肠癌肿瘤的小鼠体内，在不同的时间点，用小动物活体成像系统对小鼠进行实时图片采集，观察纳米药物在肿瘤部位的富集量。测试结果如图8a所示，结果显示，随着时间的迁移，肿瘤部位的荧光信号逐渐变强，在48h时间点仍然保持较高的荧光信号，表明该纳米药物具有很好的肿瘤富集行为。
除此之外，为了了解纳米药物在小鼠体内的血液循环行为，将标记有DiR荧光分子的纳米药物通过静脉注射到小鼠体内，在特定的时间点取血，通过裂解测定血液中药物的荧光信号值，然后计算出纳米药物的血液循环半衰期。测试结果如图8b所示，结果显示，该纳米药物复合物具有相当长的血液循环时间。
实施例6:纳米药物调节肿瘤免疫抑制性微环境能力检测
为了检测实施例1制得修饰后的纳米药物调节肿瘤内酸性微环境的能力，将纳米药物通过静脉注射到带有结肠癌肿瘤的小鼠体内。在注射前(0h)和注射后(24h)这两个时间点，使用微电极探针监测小鼠肿瘤内pH值在静脉注射材料前后的变化。测试结果如图9a所示，结果显示，小鼠肿瘤内的pH值在静脉注射材料后24h表现出明显的增加，表明该纳米药物可以作为有效的肿瘤酸性调节剂。
同时，为了检测纳米药物抑制肿瘤内IDO1活性的能力，将纳米药物通过静脉注射到带有结肠癌肿瘤的小鼠体内。24小时之后，将肿瘤取下，通过匀浆裂解，使用HPLC测定肿瘤内的色氨酸(Trp)和犬尿氨酸(Kyn)的含量。测试结果如图9b所示，结果显示，经该纳米药物处理后的肿瘤内Kyn/Trp的比值表现出明显的下降，说明IDO1的活性受到了显著性的抑制。
实施例7：不同分组的小鼠结肠癌皮下肿瘤、小鼠皮下乳腺癌肿瘤的治疗
在以上结果的基础上，本发明还探究了静脉注射纳米药物联合放疗对于不同肿瘤的治疗情况。
将带有结肠癌皮下肿瘤模型的小鼠分为六组，其中包括：第一组，对照组(仅注射生理盐水)；第二组，放疗治疗组；第三组，静脉注射碳酸钙联合放疗治疗组；第四组，静脉注射4PI-Zn联合放疗治疗组；第五组，静脉注射纳米药物治疗组；第六组，静脉注射纳米药物联合放疗治疗组。静脉注射材料后24小时，对小鼠的肿瘤部位照射线，射线的剂量为5Gy，之后测量肿瘤的生长，结果见图10。图10b为不同治疗组小鼠肿瘤的生长曲线，图10c为不同治疗组的生存曲线。结果表明，相比较于第一、二、三、四、五组，第六组的肿瘤生长得到了有效的抑制，表明纳米药物联合放疗治疗能够实现对肿瘤的高效治疗。
为了验证上述治疗能对免疫原性弱的肿瘤也有效果，将带有乳腺癌皮下肿瘤模型的小鼠分为六组，其中包括：第一组，对照组(仅注射生理盐水)；第二组，放疗治疗组；第三组，静脉注射碳酸钙联合放疗治疗组；第四组，静脉注射4PI-Zn联合放疗治疗组；第五组，静脉注射纳米药物治疗组；第六组，静脉注射纳米药物联合放疗治疗组。静脉注射材料后24小时，对小鼠的肿瘤部位照射线，射线的剂量为5Gy，之后测量肿瘤的生长，结果见图10。图10e为不同治疗组小鼠肿瘤的生长曲线，图10f为不同治疗组的生存曲线。结果表明，相比较于第一、二、三、四、五组，第六组的肿瘤生长得到了轻微的抑制，表明纳米药物联合放疗治疗不仅能够实现对免疫原性强的肿瘤的高效治疗，还能够实现免疫原性弱的肿瘤的治疗。
实施例8：纳米药物联合放疗用于小鼠结肠癌双边瘤的治疗
将双边结肠癌皮下肿瘤的小鼠随机分为四组，其中包括：第一组，对照组(仅注射生理盐水)；第二组，放疗治疗组；第三组，静脉注射纳米药物治疗组；第四组，静脉注射纳米药物联合放疗治疗组。对小鼠进行相应的治疗后，测量其肿瘤的生长，结果见图11。图11a、11b分别为不同治疗组小鼠原发肿瘤、远端肿瘤的生长曲线。结果表明，与对照组相比，静脉注射纳米药物联合放疗治疗组小鼠左侧肿瘤生长被有效的抑制，表明纳米药物复合物联合放疗能够实现对远端转移瘤的抑制。
实施例9：不同分组的小鼠结肠癌皮下肿瘤模型在治疗后免疫记忆的情况
将实施例7中结肠癌皮下肿瘤模型的小鼠治愈的小鼠(第六组，纳米药物联合放疗治疗组)，再次接种同样数量的结肠癌细胞构建肿瘤。测量其肿瘤的生长，结果见于图12。图12为不同治疗组小鼠的生长曲线，相比对照组，第六组治愈的小鼠肿瘤的生长得到了明显的抑制。表明纳米药物联合放疗能够激起很强的免疫记忆抑制肿瘤的复发。同时对血液中免疫细胞的检测我们发现，相比于对照组，治愈组的免疫记忆细胞处于较高水平，且TNF-α与IFN-γ在再次接种肿瘤的刺激下，相比于对照组处于较高的水平，实现对复发肿瘤的杀伤作用。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (10)

1.一种具有肿瘤免疫微环境调节功能的纳米药物，其特征在于，所述纳米药物包括：由碳酸钙纳米颗粒和包覆在碳酸钙纳米颗粒表面的复合物形成的纳米药物颗粒，以及，用于负载所述纳米药物颗粒的脂质体载体；其中，所述的复合物由免疫调控小分子和金属离子通过配位作用形成。
2.根据权利要求1所述的纳米药物，其特征在于，所述的碳酸钙纳米颗粒得粒径为60～300nm。
3.根据权利要求1所述的纳米药物，其特征在于，所述的免疫调控小分子为吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂、转化生长因子-β抑制剂、白介素受体抑制剂、氧化磷酸化抑制剂、PD-1/PD-L1相互作用抑制剂中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的纳米药物，其特征在于，所述的金属离子为锌离子、锰离子、铁离子、镍离子、铜离子中的一种或多种。
5.一种权利要求1～4任一项所述的具有肿瘤免疫微环境调节功能的纳米药物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将碳酸钙纳米颗粒、免疫调控小分子和金属离子溶于无水乙醇中，搅拌反应，离心洗涤后，得到纳米药物颗粒；
S2、将纳米药物颗粒溶于无水乙醇中，与磷脂酸系列磷脂的氯仿溶液混合，超声处理后离心，得到包裹有磷脂酸系列磷脂的纳米药物颗粒；
S3、将包裹有磷脂酸系列磷脂的纳米药物颗粒溶于氯仿，与胆固醇、胆碱系列磷脂和磷酸乙醇胺系列磷脂混合搅拌处理10～30小时，去除氯仿后得到所述的纳米药物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的碳酸钙纳米颗粒、免疫调控小分子和金属离子的质量比为1:(1～8):(0.1～4)。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的纳米药物颗粒、磷脂酸系列磷脂、胆固醇、胆碱系列磷脂、磷酸乙醇胺系列磷脂的质量比为(5～20)：1：1：(1～4)：(2～8)。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的磷脂酸系列磷脂主要包括1,2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸、1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸、1,2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸或1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸中的一种或多种；所述的胆碱系列磷脂主要包括1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-十八烷酰-2-棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-豆蔻酰-2-棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱或1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱中的一种或多种；所述的磷酸乙醇胺系列磷脂主要包括1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(甲氧基(聚乙二醇)、1,2-二癸酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(甲氧基(聚乙二醇)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(甲氧基(聚乙二醇)、1-硬脂酰-2-亚油酸-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(甲氧基(聚乙二醇)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(甲氧基(聚乙二醇)、1,2-二豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(甲氧基(聚乙二醇)或1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(甲氧基(聚乙二醇)中的一种或多种。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的纳米药物可加水超声水化处理，得到溶于水的纳米药物溶液。
10.权利要求1～4任一项所述的具有肿瘤免疫微环境调节功能的纳米药物在制备增强肿瘤放射治疗的药物中的应用。
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