CN112604006A - 一种医用碳酸盐纳米材料的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种医用碳酸盐纳米材料的制备方法及其应用，包括将二价金属离子与能够与该二价金属离子发生配位的医用有机功能分子混合后，在室温下置于碳酸氢铵分散扩散的环境中进行反应，然后与聚丙烯胺盐酸盐反应而制成，该二价金属离子为Mn(II)或Ca(II)，该医用有机功能分子为吲哚菁绿或地塞米松磷酸钠。
Description
技术领域
本发明属于生物医用纳米材料技术领域，具体涉及一种医用碳酸盐纳米材料的制备方法及其应用。
背景技术
癌症仍然是全球威胁人类健康的重要原因之一，癌症治疗仍然是一项艰巨的挑战。目前临床常用的传统治疗手段包括手术治疗、放疗、化疗等，这些手段可以治愈局部肿瘤，延长患者生存期，但是无法抑制肿瘤的复发与转移。纳米技术与现代生物学和医学的结合，为肿瘤的治疗提供了更多机会。无机纳米材料具有合成简单、易于大规模生产、容易质量控制等优势，但是在临床转化中存在的相关安全与健康方面的因素限制了纳米材料的进一步发展，尤其是无机纳米材料的体内降解是迫切需要解决的难题。作为一个创新型无机纳米材料，一方面需要保留其治疗性的药理功能，另一方面需要具有良好的安全性和可代谢性，满足安全标准。碳酸盐类是自然界常见的一种无机材料，其具有生物安全性好、制作成本低等优势，但是作为生物医用纳米材料，对其在粒径控制、生物可降解性方面需要更高的要求。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种医用碳酸盐纳米材料的制备方法。
本发明的另一目的在于提供上述医用碳酸盐纳米材料的应用。
本发明的技术方案如下：
一种医用碳酸盐纳米材料的制备方法，包括将二价金属离子与能够与该二价金属离子发生配位的医用有机功能分子混合后，在室温下置于碳酸氢铵分散扩散的环境中进行反应，然后与聚丙烯胺盐酸盐反应而制成，该二价金属离子为Mn(II)或Ca(II)，该医用有机功能分子为吲哚菁绿或地塞米松磷酸钠。
在本发明的一个优选实施方案中，包括如下步骤：
(1)将四水合氯化锰与吲哚菁绿充分混合；
(2)室温下，将步骤(1)所得的物料置于碳酸氢铵分散扩散的环境反应1-4h；
(3)将步骤(2)所得的物料进行离心，获得沉淀；
(4)将步骤(3)所得的沉淀超声分散于无水乙醇中，充分离心洗涤，获得沉淀；
(5)将步骤(4)所得的沉淀分散于无水乙醇中，加入聚丙烯胺盐酸盐，于室温下搅拌反应，然后离心获得沉淀；
(6)将步骤(5)所得的沉淀超声分散于超纯水中，充分离心洗涤，即得所述医用碳酸盐纳米材料。
进一步优选的，所述四水合氯化锰与吲哚菁绿的质量比为50∶1-3。
进一步优选的，所述步骤(4)所得的沉淀与所述聚丙烯胺盐酸盐的质量比为1∶0.5-4。
在本发明的一个优选实施方案中，包括如下步骤：
(1)将二水合氯化钙与地塞米松磷酸钠充分混合；
(2)室温下，将步骤(1)所得的物料置于碳酸氢铵分散扩散的环境反应2-8h；
(3)将步骤(2)所得的物料进行离心，获得沉淀；
(4)将步骤(3)所得的沉淀超声分散于无水乙醇中，充分离心洗涤，获得沉淀；
(5)将步骤(4)所得的沉淀分散于无水乙醇中，再加入四水合氯化锰，超声分散后于室温下搅拌反应，然后离心获得沉淀；
(6)将步骤(5)所得的沉淀超声分散于无水乙醇中，充分离心洗涤，获得沉淀；
(7)将步骤(6)所得的沉淀分散于无水乙醇中，加入聚丙烯胺盐酸盐，于室温下搅拌反应，然后离心获得沉淀；
(8)将步骤(7)所得的沉淀超声分散于超纯水中，充分离心洗涤，即得所述医用碳酸盐纳米材料。
进一步优选的，所述二水合氯化钙与地塞米松磷酸钠的质量比为50∶1-6。
进一步优选的，所述步骤(4)所得的沉淀与所述四水合氯化锰的质量比为1∶0.5-2。
进一步优选的，所述步骤(6)所得的沉淀与所述聚丙烯胺盐酸盐的质量比为1∶1-4。
上述制备方法制备的医用碳酸盐纳米材料在制备肿瘤诊断药物中的应用。
上述制备方法制备的医用碳酸盐纳米材料在制备肿瘤治疗药物中的应用。
本发明的有益效果是：
1、本发明选择了临床使用的造影剂(ICG)或药物分子地塞米松磷酸钠(DEX)作为有机功能分子，使本发明制得的医用碳酸盐纳米材料具有成像或治疗效果，甚至通过磁共振或荧光成像，本发明合成的锰基碳酸盐纳米材料可以实时监测药物分布和在肿瘤部位的富集情况，为设计治疗方案(如光热治疗时间)或给药次数/剂量提供科学依据。
2、本发明制备的医用碳酸盐纳米材料可实现自供HCO3 -增强Mn(II)介导的化学动力治疗，可以有效刺激肿瘤细胞产生氧化应激反应，诱导肿瘤细胞的凋亡和坏死。
附图说明
图1为本发明实施例1通过改变ICG与MnCl2·4H2O投料比制得的Mn-ICG和 MnCO3-ICG的具体表征图，其中，a为Mn-ICG的TEM图像；b为MnCO3-ICG的TEM 图像。
图2为本发明实施例1通过改变反应时间制得的MnCO3-ICG的的具体表征图，其中，a为TEM图像；b为吸收光谱图。
图3为本发明实施例1通过改变MnCO3-ICG与PAH反应比例调整材料分散性与水溶性的具体表征图，其中，a为制得的MnCO3-ICG的TEM图像；b为MnCO3-ICG在不同分散介质中的稳定性；c为MnCO3-ICG在水溶液中孵育24h后，其水合粒径分布图。
图4为本发明实施例1制得的MnCO3-ICG的透射电镜表征图，其中，a为MnCO3-ICG 的TEM图像；b为MnCO3-ICG的高分辨TEM图像和STEM-mapping元素分布图。
图5为本发明实施例1制得的MnCO3-ICG在不同缓冲溶液中的响应性行为结果图，分别是：MnCO3-ICG在9.4T场强下的T1-MRI造影信号图(a)；pH 5.8+H2O2缓冲溶液中MnCO3-ICG释放CO2的超声(US)成像(b)和信号统计图(c)；MnCO3-ICG在pH 5.8 和pH 7.4缓冲溶液中反应不同时间后的TEM图像。
图6为本发明实施例1制得的MnCO3-ICG在溶液中的化学动力学行为结果图，其中，a为不同浓度HCO3-对MnCO3-ICG催化发生的类芬顿反应引起的MB降解行为的影响；b 为不同缓冲溶液对MnCO3-ICG催化发生的类芬顿反应引起的MB降解行为的影响；c为不同催化剂(MnCO3-ICG，Mn-ICG)在不同缓冲溶液中对类芬顿反应引起的MB降解行为的影响；d为MnCO3-ICG在酸性缓冲溶液中反应时间对催化发生的类芬顿反应引起的 MB降解行为的影响。
图7为本发明实施例2中鼠源乳腺癌(4T1)细胞对MnCO3-ICG的摄取情况图(标尺：50μm)，其中蓝色荧光表示细胞核，红色荧光表示MnCO3-ICG。
图8为本发明实施例2中MnCO3-ICG在4T1细胞内进行溶酶体逃逸情况图(标尺： 50μm)，其中蓝色荧光表示细胞核，红色荧光表示溶酶体，绿色荧光表示MnCO3-ICG。
图9为本发明实施例2中，使用DCFH-DA作为检测探针，检测细胞内·OH的产生，其中，a为MnCO3-ICG与4T1肿瘤细胞共孵育后·OH的产生(标尺：30μm)；b为Mn-ICG 与4T1肿瘤细胞共孵育后·OH的产生(标尺：50μm)；c为使用流式细胞仪检测不同材料与4T1细胞共孵育后产生的·OH与DCFH-DA探针反应产生的荧光。其中蓝色荧光表示为细胞核，绿色荧光表示为·OH。
图10为本发明实施例2中4T1细胞的脂质过氧化行为，使用BODIPY作为检测探针，检测细胞脂质过氧化程度图，其中a为MnCO3-ICG与4T1细胞共孵育后的脂质过氧化行为；b为Mn-ICG与4T1细胞共孵育后的脂质过氧化行为；标尺：50μm，其中蓝色荧光表示细胞核，红色荧光表示脂质过氧化现象；c为ImageJ统计结果；d为使用丙二醛试剂盒半定量检测的脂质过氧化水平。
图11为本发明实施例2中4T1细胞的乳酸脱氢酶(LDH)释放水平图，其中a为使用不同浓度MnCO3-ICG刺激细胞后LDH的释放；b为使用不同浓度Mn-ICG刺激细胞后 LDH的释放。
图12为本发明实施例2中4T1细胞线粒体膜电位的变化图，其中a为使用不同浓度MnCO3-ICG刺激细胞后线粒体膜电位的变化；b为使用不同浓度Mn-ICG刺激细胞后线粒体膜电位的变化，标尺：50μm，其中蓝色荧光表示细胞核，红色荧光表示高膜电位下 JC-1的聚合物，绿色荧光表示低膜电位下JC-1的单体。
图13为本发明实施例2中的肿瘤细胞和正常细胞杀伤效果评价图，其中，a为4T1细胞与不同浓度MnCO3-ICG孵育24h后，经过激光照射处理前后的存活率；b为活细胞 (绿色荧光)/死细胞(红色荧光)共染色荧光图像；c，d，e分别为HepG2细胞(c)， U87MG细胞(d)和正常细胞(3T3，L02)(e)的细胞杀伤效果。
图14为本发明实施例3中尾静脉注射MnCO3-ICG不同时间点后的生物分布图，其中，a为MnCO3-ICG在血液中的清除半衰期；b为MnCO3-ICG在主要器官(脑、心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏)和肿瘤中的生物分布图。图15为本发明实施例3中MnCO3-ICG 在9.4T场强下的T1-MRI造影信号图。
图16为本发明实施例3中尾静脉注射MnCO3-ICG的2、4、8和24h后，荷瘤实验鼠的MRI成像图(a)、对应的肿瘤部位的T1信号强度图(b)、体外组织荧光成像图(c) 以及对应的肿瘤部位的磁共振(d)/荧光信号(e)统计图。
图17为本发明实施例3中的光热效果评价图，其中，a为不同材料(ICG，Mn-ICG 和MnCO3-ICG)的吸收光谱图；b为荷瘤小鼠尾静脉注射MnCO3-ICG4 h后，使用808nm (0.5W/cm2)局部照射肿瘤区域，5min内肿瘤区域的红外热成像图；c为实时温度变化曲线图。
图18为本发明实施例3中经过不同方式治疗期间，治疗方案设计图(a)、荷瘤实验鼠的肿瘤生长曲线图(b)、治疗结束后各实验组小鼠肿瘤质量统计图(c)和照片(d)以及治疗结束后各实验组肿瘤切片的苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，H&E)染色图(e)。
图19为本发明实施例3中光热组(第5实验组)和光热/化学动力学联合治疗组(第6实验组)的T2-MRI成像图以及小鼠治疗期间照片。
图20为本发明实施例3中经过不同方式治疗期间，荷瘤实验鼠的体重变化曲线图。
图21为本发明实施例3中经过不同方式治疗后，实验鼠的主要脏器(心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏)切片的H&E染色分析图(标尺：100μm)。
图22为本发明实施例4中通过改变DEX与Ca(II)比例，反应时间和NH4HCO3环境中的反应时间，制备得到的CaCO3的表征结果，其中，a为DEX与Ca(II)搅拌时间制得的不同时间点(1h，2h，3h)的TEM图像；b为不同反应条件下的CaCO3的TEM 图像；c为不同反应条件下药物负载效率。
图23为本发明实施例4中CaCO3-DEX的TEM图像和STEM-mapping元素分布图。
图24为本发明实施例4中CaCO3-DEX的吸收光谱图。
图25为本发明实施例4中Mn：CaCO3-DEX的TEM图像和STEM-mapping元素分布图。
图26为本发明实施例4中Mn：CaCO3-DEX在不同缓冲溶液中的响应性行为图，分别是：DEX的释放曲线图(a)；在1.5T场强下的T1-MRI信号图(b)；在pH 6.5缓冲溶液中反应不同时间后的TEM图像(c)；pH 6.5+H2O2缓冲溶液对其释放CO2的超声成像(d) 和信号统计图(c)；通过MB作为检测探针，检测不同缓冲液中细胞内·OH的产生。
图27为本发明实施例5中人源恶性脑胶质瘤(U87MG)细胞对不同材料(PBS，Ca2+，Mn2+，CaCO3-DEX，Mn：CaCO3-DEX)的摄取情况图(标尺：50μm)，其中蓝色荧光表示细胞核，绿色荧光表示钙离子荧光探针(Fluo 4-AM)。
图28为本发明实施例5中U87MG细胞与不同浓度材料共孵育后的细胞的钙化情况图(标尺：100μm)，其中蓝色表示细胞核，橘红色表示钙化结节。
图29为本发明实施例5中Mn：CaCO3-DEX与U87MG肿瘤细胞共孵育后的实验结果图，使用DCFH-DA作为检测探针，检测细胞内·OH的产生(标尺：30μm)，其中蓝色荧光表示细胞核，绿色荧光表示·OH。
图30为本发明实施例5中U87MG细胞的脂质过氧化行为图，使用BODIPY作为检测探针，检测细胞脂质过氧化。其中a为不同浓度Mn：CaCO3-DEX与U87MG细胞共孵育后，脂质过氧化行为；b为通过ImageJ对不同组荧光强度的统计结果。
图31为本发明实施例5中U87MG细胞线粒体膜电位变化的研究图，其中a为使用不同浓度Mn：CaCO3-DEX刺激细胞后线粒体膜电位的变化；b为使用ImageJ统计结果， (标尺：50μm)，其中蓝色荧光表示细胞核，红色荧光表示高膜电位下JC-1的聚合物，绿色荧光表示低膜电位下JC-1的单体。
图32为本发明实施例5中以Raw264.7巨噬细胞为模型，研究Mn：CaCO3-DEX的抗炎症行为的实验结果图，其中为使用脂多糖(LPS)刺激巨噬细胞产生炎症后，使用ELISA 试剂盒对治疗前后细胞培养基内的炎症因子IL-6进行检测。
图33为本发明实施例5中的肿瘤细胞和正常细胞杀伤效果评价图，其中，a为U87MG细胞、L02正常肝细胞、3T3小鼠胚胎成纤维细胞用含不同浓度Mn：CaCO3-DEX孵育24h 后的存活率；b为活细胞(绿色荧光)/死细胞(红色荧光)共染色荧光图像。
图34为本发明实施例6中尾静脉注射Mn：CaCO3-DEX不同时间点后的生物分布图，其中图a为Mn：CaCO3-DEX在血液中的清除半衰期；b为Mn：CaCO3-DEX在主要器官(心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏)、肌肉和肿瘤中的生物分布图。
图35为本发明实施例6中尾静脉注射Mn：CaCO3-DEX不同时间点后，磁共振成像性能研究结果图，其中，a为Mn：CaCO3-DEX在9.4T场强下的T1-MRI造影信号图；b为肿瘤内注射Mn：CaCO3-DEX后的T1-MRI效果图；c为肿瘤内T1-MRI信号统计结果；d为尾静脉注射Mn：CaCO3-DEX后小鼠全身成像(肿瘤和肾脏)效果图；e，f分别为肿瘤和肾脏部位T1-MRI信号统计结果。
图36本发明实施例6中治疗效果评价图，其中，a为小鼠治疗方案设计图；b为荷瘤实验鼠的肿瘤生长曲线图；c为治疗结束后各实验组小鼠肿瘤质量统计图d为治疗结束后各实验组肿瘤切片的H&E染色图；e，f，g分别为PBS，Mn：CaCO3-DEX和 2×Mn：CaCO3-DEX实验组治疗结束后茜素红S染色试剂盒对小鼠肿瘤切片钙化情况的检测图(e)，环氧化酶(COX-2)免疫荧光染色图(f)，以及ELISA试剂盒对肿瘤内炎症因子IL-6含量检测结果(g)
图37为本发明实施例6中经过不同方式治疗后，实验鼠的主要脏器(心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏)切片的H&E染色分析图(标尺：100μm)。
图38为本发明实施例6中经过不同方式治疗期间，荷瘤实验鼠的体重变化曲线图。
图39为本发明实施例7中基于Mn：CaCO3-DEX材料对人源肝癌(HepG2)细胞和原位肝癌小鼠模型的治疗实验图，其中a为HepG2细胞的钙化情况图(标尺：100μm)；b 为HepG2细胞杀伤效果评价图；细胞与不同浓度材料孵育后，分别使用DCFH-DA(c)，BODIPY(d)和JC-1染色，对细胞氧化应激反应进行验证(标尺：50μm)；原位肝癌治疗期间的生物发光图像(g)、信号统计结果(f)，以及治疗结束后，肝组织照片(h)和含原位肝癌的肝组织的H&E切片，黑色箭头表示肝癌组织，红色箭头表示正常肝组织。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
以下各实施例中所有数据均表示为“平均值±标准偏差”。用Student′s t检验进行数据比较(*，P＜0.05；**，P＜0.01；***，P＜0.001)。
实施例1碳酸锰纳米颗粒的合成与表征
(1)将四水合氯化锰与吲哚菁绿按照50∶1-50∶3的质量比混合搅拌3h；
(2)将步骤(1)所得的物料(Mn-ICG)放置于碳酸氢铵(NH3HCO3)分解扩散的环境中，室温(30℃)下反应，反应时间可控制在1-4h；
(3)将步骤(2)所得的物料，经5000rpm离心10min，取沉淀；
(4)将步骤(3)所得的沉淀超声分散于20mL无水乙醇中，5000rpm离心洗涤10min，重复该步骤3次，获得沉淀；
(5)将步骤(4)所得的沉淀分散于50mL无水乙醇中，按照1∶0.5-1∶4的质量比加入聚丙烯胺盐酸盐(PAH，分子式为(C3H7N)n·xHCl，平均分子量在15000-20000)，室温下搅拌1h，10000rpm离心10min，取沉淀；
(6)将步骤(5)所得的沉淀超声分散于20mL超纯水中，10000rpm离心10min，重复该步骤3次，即得到所述医用碳酸盐纳米材料，记为MnCO3-ICG纳米材料。
利用透射电子显微镜(JEM-2100)对MnCO3-ICG纳米材料的形貌进行表征。使用紫外-可见分光光度计(Agilent Cary60)对MnCO3-ICG纳米材料的吸收光谱进行表征。使用Zeta-sizer纳米颗粒分析仪(Malvern Ltd.)对MnCO3-ICG纳米材料的水合粒径和表面电位进行测定。使用激光扫描共聚焦显微镜(Olympus FV1200)测定细胞内荧光信号。使用红外热成像仪对MnCO3-ICG纳米材料的光热转换性能进行测定。使用小动物荧光成像设备(IVISLumina II)和小动物9.4T MRI成像设备(Bruker)对MnCO3-ICG纳米材料的荧光和MRI信号以及材料在小动物体内的成像效果进行测定。
如图1a所示，Mn-ICG可以形成球形结构，随着ICG和MnCl2·4H2O(W/W)比例的增加，该球形结构逐渐由松散纳米结构形成致密的纳米球。将Mn-ICG置于含NH4HCO3封闭环境后，会形成形貌均一的纳米结构，该结构不会由于ICG和MnCl2·4H2O(W/W) 比例的改变而发生变化(图1b)。通过调整气体扩散的时间(0.5，1，2，4h)，可以调整材料形貌(图2a)及ICG含量(图2b)。为了改善材料的稳定性，提高生物应用的安全性，对材料进行了聚烯丙基胺盐酸盐(PAH)的修饰以提高其水溶性(图3)。如图3b所示， MnCO3-ICG纳米材料在水、盐溶液(PBS)、胎牛血清(FBS)、细胞培养基(DMEM) 中均表现出良好的溶解性。水合粒径(图3c)的结果表明24h后，材料的水合粒径没有明显的变化，再次证明了材料在水中具有良好的溶解性和分散性。根据TEM图像(图4a) 对粒径分析，材料的粒径大约为72nm。HRTEM和STEM-Mapping进行元素分析的结果 (图4b)表明，C、O、Mn、N、S元素在MnCO3-ICG纳米材料中均匀分布。通过ICP-MS 分析以及紫外可见吸收光谱定量计算可得到，该MnCO3-ICG纳米材料中Mn和ICG含量分别为20％(wt％)和18％(wt％)。
对材料的酸响应性能进行研究，设置了4个缓冲溶液(pH：7.4；pH：5.8；pH：5.8+H2O2； pH：5.8+GSH)。材料与各缓冲溶液孵育不同时间(0，0.5，1，2，4，8h)，离心取上清液，进行磁共振成像。图5结果表明，在酸性条件下，随着孵育时间延长，T1-MRI信号强度逐渐增强，证明了材料在酸性条件下存在分解并释放Mn2+的行为；H2O2或GSH的存在会加速材料的分解速率，并增加Mn2+的释放。同时，超声(US)成像图像和信号统计的结果(图5b，c)，证明MnCO3-ICG纳米材料与pH5.8+H2O2的缓冲液共孵育的过程中有气泡产生，证明了CO2气体的生成。为了进一步证明材料在分解过程中的形貌变化， MnCO3-ICG纳米材料在不同缓冲溶液孵育不同时间，离心后的沉淀进行TEM的表征(图 5d)，结果表明，在中性盐溶液(pH＝7.4)中，材料可基本保持形貌完整性；在酸性环境 (pH＝5.8)中，材料会逐渐降解，并发生重组。
对材料发生类芬顿反应的活性以及光热性能进行表征。MnCO3-ICG纳米材料在酸性缓冲液中发生分解后，释放Mn(II)和HCO3 -，可以与溶液中的H2O2发生类芬顿反应，产生羟基自由基(·OH)。以亚甲基蓝(MB)作为·OH检测探针，通过测定溶液中·OH的生成来评价化学动力学治疗(CDT)性能。实验设置了不同缓冲体系(图6a，b)、反应体系(图6c)和不同反应时间(图6d)，结果显示，MnCO3-ICG纳米材料在pH7.4(含 HCO3 -)和pH5.8(含HCO3 -)的缓冲条件下可以使MB的吸收迅速下降；而在pH5.8(不含HCO3 -)溶液中孵育时，也可以使MB吸收强度下降10.6％，证明MnCO3-ICG纳米材料可以产生大量羟基自由基，材料分解自供HCO3 -也可以增强类芬顿反应的效果。不同反应体系(图6c)和不同反应时间(图6d)的结果也证明了自供HCO3 -在发生类芬顿反应中的重要作用。
实施例2MnCO3-ICG纳米材料用于细胞实验
以鼠源乳腺癌4T1细胞为研究模型，进一步探究了实施例1制得的MnCO3-ICG纳米材料用于肿瘤的联合治疗的研究。同时还使用了人源恶性脑胶质瘤U87MG细胞，人源肝癌HepG2细胞验证了MnCO3-ICG纳米材料对肿瘤细胞的治疗效果。
(1)细胞摄取试验
将4T1细胞接种在玻璃底细胞培养皿(共聚焦皿)
中(105个细胞)，培养24h，待细胞贴壁后，与含有MnCO3-ICG的培养基([Mn]：5μg/mL)共孵育不同时间(2，4，8，12和24h)，PBS洗涤三次，使用Hoechst33342(5μg/mL)对细胞核染色后，洗涤三次，补充新鲜培养基，使用Olympus FV1200激光共聚焦显微镜检测ICG的荧光，判断细胞对材料的摄取情况。如图7所示，可以在细胞质中观察到明显的红色荧光信号，随着孵育时间的延长，荧光信号逐渐增强，证明细胞对材料可以实现有效的摄取。在细胞摄取对MnCO3-ICG效果最佳的24h孵育时间后，使用溶酶体红色荧光探针对溶酶体进行特异性荧光染色，使用激光共聚焦对溶酶体和材料在细胞内的分布进行共定位(图 8)，ImageJ分析结果显示皮尔森相关系数为0.46±0.050，证明材料具有有效的溶酶体逃逸能力。
细胞摄取的实验结果表明MnCO3-ICG纳米材料可以被细胞有效摄取，并实现溶酶体逃逸功能，进入细胞质中。
(2)羟基自由基(·OH)检测试验
将4T1细胞接种在玻璃底细胞培养皿
中(105个细胞)，培养24h，待细胞贴壁后，与含有Mn-ICG和MnCO3-ICG的培养基([Mn]：5，10，20μg/mL)共孵育24h。PBS洗涤三次后，使用DCFH-DA(5μM)和Hoechst33342(5μg/mL)对·OH 和细胞核进行染色。激光共聚焦显微镜可以检测DCFH-DA与·OH反应而产生绿色荧光 (DCF)的信号。结果表明，高浓度的MnCO3-ICG实验组(图9a)，可以观察到明显增强的绿色荧光信号，并且表现出浓度依赖性。相同锰(II)浓度的Mn-ICG实验组，产生了的微弱绿色荧光信号(图9b)。流式细胞仪对Mn-ICG(20μg/mL)和MnCO3-ICG (20μg/mL)的绿色荧光信号进行半定量，结果表明MnCO3-ICG实验组中DCF的荧光信号可以达到Mn-ICG实验组的20.4倍(图9c)。
激光共聚焦和流式细胞检测的结果证明Mn(II)可以通过类芬顿反应产生大量的·OH，MnCO3-ICG纳米材料分解，原位自供HCO3-可以加速Mn(II)对H2O2催化，再次增强·OH的产生能力。
(3)脂质过氧化水平检测试验
A.将4T1细胞接种在玻璃底细胞培养皿
中(105个细胞)，培养24h，待细胞贴壁后，与含有Mn-ICG和MnCO3-ICG的培养基([Mn]：5μg/mL)共孵育24h。 PBS洗涤三次后，使用BODIPY C11(5μM)和Hoechst33342(5μg/mL)对脂质过氧化水平和细胞核进行染色。激光共聚焦显微镜可以检测BODIPY C11氧化态的信号强度。结果表明MnCO3-ICG实验组(图10a)可以观察到比Mn-ICG实验组(图10b)更强的荧光信号。ImageJ分析结果表明MnCO3-ICG实验组的荧光信号强度分别是Mn-ICG实验组和单独细胞培养组的1.5倍和3倍(图10c)。
B.将4T1细胞接种在6孔板中(105个细胞/孔)，培养24h，待细胞贴壁后，与含有MnCO3-ICG的培养基([Mn]：20μg/mL)共孵育24h。PBS洗涤三次后，使用丙二醛 (MDA)试剂盒检测细胞内脂质过氧化水平。如图10d所示，根据试剂盒使用说明书进行计算，结果表明，MnCO3-ICG纳米材料([Mn]：20μg/mL)孵育后肿瘤细胞内脂质过氧化水平可增加至145.0±5.1％。
脂质过氧化水平的升高证明MnCO3-ICG纳米材料可通过类芬顿反应释放大量·OH，导致细胞氧化系统和抗氧化系统失衡，引起细胞发生氧化应激反应。
(4)乳酸脱氢酶(LDH)的释放
将4T1细胞接种在96孔板中(104个细胞/孔)，培养24h，待细胞贴壁后，根据试剂盒使用说明，设置不同实验组，分别为：无细胞的培养液孔(DMEM，背景空白对照孔)，未经药物处理的对照细胞孔(细胞+DMEM，样品对照孔)，未经药物处理的用于后续裂解的细胞孔(细胞+DMEM，样品最大酶活性对照孔)，以及药物处理的细胞孔(Mn-ICG 和MnCO3-ICG+DMEM([Mn]：5，10，20μg/mL)，药物处理样品孔)，孵育24h后，在“样品最大酶活性对照孔”中加入试剂盒提供的LDH释放试剂，孵育1h后，各实验组离心取上清，检测LDH释放情况。实验结果表明，实验组细胞内的活性酶LDH可以被释放至上清DMEM培养基中。MnCO3-ICG(20μg/mL)组的LDH释放量(图11a)接近 100％，远高于对照组和Mn-ICG实验组(图11b)。
LDH的释放证明通过化学动力学治疗引起了细胞损伤或坏死，细胞膜受损，细胞内的LDH可通过细胞膜被释放至细胞外。
(5)线粒体膜电位检测试验
将4T1细胞接种在玻璃底细胞培养皿
中(105个细胞)，培养24h，待细胞贴壁后，与含有Mn-ICG和MnCO3-ICG的培养基([Mn]：5，10，20μg/mL)共孵育24h。PBS洗涤三次后，使用JC-1(2.5μM)线粒体膜电位检测试剂盒，通过激光共聚焦观察荧光信号的变化，反映线粒体膜电位的变化。结果表明，随着材料浓度的增加，红色荧光(JC-1聚合物(J-aggregates)，线粒体膜电位较高)逐渐减弱，绿色荧光(JC-1 单体(monomer)，线粒体膜电位较低)逐渐增强。甚至在MnCO3-ICG实验组(图12a)，锰(II)浓度达到20μg/mL时，红色荧光几乎完全转变为绿色荧光。相同锰(II)浓度下，Mn-ICG实验组(图12b)的绿色荧光明显较弱。线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件，因此红色荧光向绿色荧光的转变可作为细胞早期凋亡的重要指标。 ImageJ分析结果显示MnCO3-ICG实验组红绿荧光相对比例的下降值高于Mn-ICG实验组 (图12c)。
线粒体膜电位在线粒体稳态中起重要作用，线粒体膜电位的降低是细胞凋亡、死亡等病理的重要指标。线粒体膜电位的变化证明了原位自供HCO3 -可以放大细胞的氧化应激反应，引起线粒体膜电位的变化，诱导细胞凋亡。
(6)肿瘤细胞杀伤效果评价
A.利用MTT试验评价了对4T1细胞的杀伤效果。将4T1细胞接种在96孔板中(104个细胞/孔)，培养24h，待细胞贴壁后，与含有不同浓度的Mn-ICG和MnCO3-ICG([Mn]： 0，1.56，3.13，6.25，12.5，25，50μg/mL)共孵育不同时间(24和48h)；使用标准MTT 试验测定细胞存活率。为了测试光热治疗对4T1细胞的杀伤效果，材料与细胞共孵育24h 后，给予808nm激光照射(0.5W·cm-2，5min)；继续培养24h后，使用标准MTT试验测定细胞存活率。如图13a所示，低浓度的MnCO3-ICG纳米材料对4T1细胞的损伤较低，随着浓度的升高，MnCO3-ICG纳米材料对4T1细胞的杀伤效果逐渐增强，808nm光的激光诱发的光热治疗进一步增强4T1细胞的治疗效果。4T1细胞的杀伤效果可以解释为大量活性氧的产生诱导的细胞氧化应激反应(化学动力学治疗，CDT)，联合光热治疗(PTT) 的协同治疗效果。
B.使用Calcein-AM/PI双染色试剂盒进行活/死细胞染色直观检测MnCO3-ICG纳米材料对4T1细胞的杀伤情况。将4T1细胞接种在6孔板中(105个细胞/孔)，培养24h，待细胞贴壁后，与含有不同浓度MnCO3-ICG的培养基([Mn]：5和20μg/mL)共孵育24 h。PBS洗涤三次后，分为激光照射组(808nm，0.5W·cm-2，5min)和非激光照射组。继续培养24h后，加入Calcein-AM/PI双染色试剂，在37℃下染色30min；PBS洗涤后，利用倒置荧光显微镜测定活/死细胞的荧光。如图13b所示，活/死细胞染色分析结果与 MTT试验结果一致，MnCO3-ICG纳米材料对4T1细胞的杀伤作用具有浓度依赖性。 MnCO3-ICG+L组的细胞密度低，且全部为PI(碘化吡啶)染色所呈现的红色荧光，直观地证明了MnCO3-ICG纳米材料的肿瘤细胞杀伤效果。而且联合治疗(CDT&PTT)比单一治疗(CDT)方法具有更好的疗效。
C.利用MTT试验评价了人源肝癌(HepG2)细胞(图13c)和恶性脑胶质瘤(U87MG) 细胞(图13d)的杀伤效果，以及正常人源肝细胞(L02)(图13e)以及小鼠胚胎成纤维细胞(3T3)(图13e)的耐受性。结果表明MnCO3-ICG纳米材料的肿瘤细胞杀伤效果不受肿瘤细胞类型的限制。但是正常细胞对MnCO3-ICG纳米材料耐受性明显高于肿瘤细胞。 MnCO3-ICG纳米材料对肿瘤细胞的特异性杀伤效果可以解释为在肿瘤内微环境可以加速材料的分解，同时，肿瘤细胞内过表达的H2O2也可以增强化学动力学治疗效果。
D.为了进一步比较治疗效果，使用GraphPad prism计算了Mn-ICG和MnCO3-ICG 实验组的半抑制浓度(IC50)。以4T1细胞为例，MnCO3-ICG实验组的IC50值(11.2±1.0 μg/mL)比Mn-ICG实验组(64.5±1.3μg/mL)低5.8倍。
肿瘤细胞杀伤效果的验证结果证明MnCO3-ICG在微酸环境中原位自供HCO3 -，是 Mn(II)介导的类芬顿反应必不可少的条件，可以诱导增强的化学动力学治疗效应。
实施例3MnCO3-ICG纳米材料用于动物实验
实验动物模型：由厦门大学实验动物中心自上海斯莱克实验动物中心代为购买的雌性 BALB/c小鼠(体重为16-18g)。
肿瘤模型：通过皮下注射100μL的4T1细胞(2×106)于实验鼠右后腿部，接种皮下4T1肿瘤。
所有动物实验都符合厦门大学实验动物使用委员会和实验动物伦理委员会批准的动物保护条例。
(1)MnCO3-ICG纳米材料在体内分布及代谢行为研究
A.荷4T1瘤雌性BALB/c小鼠在肿瘤达到80-100mm3时，通过静脉注射MnCO3-ICG 纳米材料([Mn]：2mg/kg)(n＝3)，在注射药物后不同时间点(0.5、1、2、4、8、12、24、 48h)，采集尾静脉丛血样，称重；加入适量浓HNO3-H2O2(体积比1∶3)进行消解；超纯水稀释后，通过ICP-MS测定组织样品中锰的含量。如图14a所示，血液循环遵循经典的双室模型，血液循环半衰期为：1.52±0.5h(t1/2α)和12.29±3.5h(t1/2β)。
B.在注射药物后不同时间点(0.5、1、2、4、8、12、24、48h)，断颈处死小鼠，解剖取出主要器官，包括：心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、腿部肌肉组织、肿瘤，称重；加入适量浓HNO3-H2O2(体积比1∶3)进行消解；超纯水稀释后，通过ICP-MS测定组织样品中锰的含量。图14b的结果表明，MnCO3-ICG纳米材料在肿瘤内的最大摄取量可以达到23.7±4.7％ID/g，并且，在注射药物8h后，材料在肿瘤位置的富集量仍然可以达到8.8±0.9％ID/g。
C.MnCO3-ICG纳米材料在酸性缓冲液中分解后，可以表现出良好的磁共振成像效果。如图15所示，MnCO3-ICG的纵向弛豫率(r1)可达到4.3mM-1·s-1。
D.荷4T1瘤的BALB/c小鼠，通过静脉注射MnCO3-ICG纳米材料([Mn]：2mg/kg) (n＝3)，分别在给药前(0h的时间点)和给药后的2、4、8、24h的时间点，使用IVIS Lumina II小动物荧光系统和9.4T小动物磁共振成像设备进行全身荧光成像和磁共振成像。如图16a和b所示，MnCO3-ICG纳米材料具有良好的被动靶向的能力，可以有效地富集于肿瘤区域，并在4h达到材料聚集最大值。小鼠进行荧光成像24h后，断颈处死，解剖取出主要器官，包括：心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、肿瘤，进行体外荧光成像，结果如图16c所示，在药物注射24h后，在肿瘤区域可以观察到明显的荧光信号，证明材料可以在肿瘤内滞留。磁共振成像和荧光成像的信号统计的结果(图16d和e)也证明， Mn(II)可以在肿瘤位置实现长期有效的积累，从而更好地发挥化学动力学的治疗效果。
MnCO3-ICG纳米材料在体内分布及代谢行为的研究结果表明，其可以在体内有较长的循环时间，从而有效聚集于肿瘤区域，并在注射药物4h后，达到最大聚集量。 MnCO3-ICG纳米材料还可以长时间滞留在肿瘤内部，以达到长期治疗的效果。
(2)MnCO3-ICG纳米材料对皮下4T1肿瘤的治疗效果
紫外可见分光光度计测试材料的光学吸收的结果(图17a)表明，MnCO3-ICG纳米材料相对于ICG，吸收峰变宽，在808nm波长下有较强的吸收。因此，以808nm的激光(0.5W/cm2)照射MnCO3-ICG纳米材料，使用红外热成像仪对不同浓度材料的温度上升情况进行记录，结果表明，利用808nm的激光(0.5W·cm-2)照射5min后，400μg/mL ([ICG]：72μg/mL)材料的温度可升高至53.3℃。
当MnCO3-ICG纳米材料在肿瘤摄取值达到最高时(即材料注射4h后)，使用808nm(0.5W/cm2)局部照射肿瘤区域5min，肿瘤温度在2min内可快速升高10℃，并在5min 内维持该温度(图17b，c)。
荷4T1瘤雌性BALB/c小鼠在肿瘤达到60mm3时，评估MnCO3-ICG纳米材料介导的化学动力学治疗和给予激光照射后诱导的光热治疗的联合作用对体内肿瘤的治疗效果。实验设计如图18a所示，将小鼠随机分成6组(n＝5)：(1)PBS(四次给药)；(2)MnCO3-ICG 纳米材料([Mn]：2mg/kg，四次给药，命名为CDT-1组)；(3)2×MnCO3-ICG纳米材料 ([Mn]：4mg/kg，四次给药，命名为CDT-2组)；(4)4×MnCO3-ICG纳米材料([Mn]： 8mg/kg，四次给药，命名为CDT-3组)；(5)MnCO3-ICG纳米材料([Mn]：2mg/kg+L (0.5W/cm2)，一次给药，命名为PTT组)；(6)MnCO3-ICG纳米材料([Mn]：2mg/kg+ L(0.5W/cm2)三次给药，命名为PTT+CDT组)，尾静脉内给药MnCO3-ICG纳米材料 4h后，激光照射组对实验鼠的肿瘤区域施加808nm激光(0.5W/cm2)照射5min。在相应治疗后的15天内，每隔一天记录一次实验鼠的体重和肿瘤体积。为了避免光热组结痂影响肿瘤体积的测定，第5和第6实验组小鼠进行了T2-MRI成像的监测，更精确地观察光热治疗组肿瘤体积的变化。如图19所示，第4(CDT)、5(CDT&PTT，单次给药)、6(CDT&PTT，多次给药)实验组小鼠的肿瘤都得到了明显抑制。第5实验组的小鼠，在治疗后期，出现了明显的肿瘤复发情况；而第6组小鼠，直到治疗后第21天，仍未发现肿瘤复发的迹象。该结果是因为多次打药可以使化学动力学治疗持续产生治疗效果。为了进一步评价治疗效果，第1-5组全部小鼠，和第6组随机两只小鼠，断颈处死，取肿瘤，拍照，称重。结果显示肿瘤重量和体积一致(图18c，d)，证明了化学动力学治疗和光热治疗对小鼠皮下瘤生长的抑制作用。如图18b肿瘤生长曲线所示，14天或21天小鼠肿瘤的体积变化显示，对照组(第1实验组)小鼠的肿瘤体积迅速增长，后期生长速度快。单一 CDT(第2，3，4实验组)可以起到一定的抑制效果，减缓肿瘤生长速度。通过数据分析，计算得到各组的肿瘤生长抑制率分别是：49.0％(第2实验组)、63.8％(第3实验组)、 76.3％(第4实验组)。第6实验组结果显示，化学动力学治疗与光热治疗的联合作用可以实现肿瘤的完全消融。光热组(第5实验组)和联合治疗组(第6实验组)的T2-MRI 监测结果(图19)直观地表明了，光热组的肿瘤复发，这也是传统光热治疗的常见问题，但是联合治疗组(第6实验组)未见到明显的实体肿瘤，这与肿瘤体积、离体肿瘤照片、体重结果相一致。肿瘤的苏木精和伊红(H&E)染色结果(图18e)，证明单一CDT(第 2，3，4实验组)，可以对肿瘤组织造成明显的细胞破坏效果，导致细胞密度降低；光热组(第5实验组)小鼠肿瘤可以保留完整的血管结构和肿瘤组织结构，为后续多次打药后材料能够进入肿瘤发挥化学动力学治疗作用提供了条件。
小鼠治疗期间的体重监测结果(图20)和治疗结束后主要器官的H&E染色结果(图21)表明，MnCO3-ICG纳米材料具有良好的生物相容性，不会对小鼠体重产生不良影响，各主要器官、脏器未见明显损伤。
荷4T1瘤雌性BALB/c小鼠的治疗结果表明，MnCO3-ICG纳米材料介导的放大的细胞氧化应激反应与光热联合治疗是一种有效的抗肿瘤策略。较低的生物学副作用也可以忽略不计。
实施例4碳酸钙纳米颗粒
(1)将二水合氯化钙与地塞米松磷酸钠按照50∶1-50∶6的质量比，混合搅拌1h；
(2)将步骤(1)所得的物料，放置于碳酸氢铵(NH3HCO3)分解扩散的环境中，室温(30℃)下反应，反应时间可控制在2-8h；
(3)将步骤(2)所得的物料，经5000rpm离心5min，取沉淀；
(4)将步骤(3)所得的沉淀超声分散于20mL无水乙醇中，5000rpm离心5min，重复该步骤3次，得沉淀；
(5)将步骤(4)所得的沉淀分散于100mL无水乙醇中，接着按照1：0.5-1：2的质量比加入四水合氯化锰，超声分散后搅拌3h，经5000rpm离心5min，取沉淀；
(6)将步骤(5)所得的沉淀超声分散于20mL无水乙醇中，5000rpm离心5min，重复该步骤3次，得沉淀；
(7)将步骤(6)所得的沉淀分散于50mL无水乙醇中，按照1∶1-1∶4的质量比加入聚丙烯胺盐酸盐(PAH))后，室温下搅拌1h，10000rpm离心10min，取沉淀；
(8)将步骤(7)所得的沉淀超声分散于20mL超纯水中，5000rpm离心洗涤5min，重复该步骤3次，得到所述所述医用碳酸盐纳米材料，记为Mn：CaCO3-DEX纳米材料。
利用透射电子显微镜(JEM-2100)对Mn：CaCO3-DEX纳米材料的形貌进行表征。使用紫外-可见分光光度计(Agilent Cary60)对Mn：CaCO3-DEX纳米材料的吸收光谱进行表征。使用激光扫描共聚焦显微镜(Olympus FV1200)测定细胞内荧光信号。使用小动物 9.4TMRI成像设备(Bruker)对Mn：CaCO3-DEX纳米材料的MRI信号以及小动物成像效果进行测定。
地塞米松磷酸钠(DEX)是一种合成糖皮质激素，可用于炎症疾病和恶性肿瘤的商业化药物，含有一个磷酸基团，钙(II)可以与其配位，形成丝状的Ca-DEX的纳米纤维网络状结构(图22a)。通过气体(CO2、NH3)扩散到Ca-DEX的无水乙醇溶液中，在密闭环境中可生成CaCO3球形颗粒，通过简单调节DEX与Ca2+的反应比例、NH4HCO3环境下的反应时间，形成的CaCO3材料的形貌、大小和载药能力可以被精确地调整(图22b，c)。最后选择制备碳酸钙-地塞米松磷酸钠(CaCO3-DEX)的配比为：DEX与CaCl2·2H2O 的投料比为6/50，反应时间为8h。透射电镜的结果(图23)表明CaCO3-DEX的粒径大约为150.4±20.2nm。根据扫描透射电子显微镜(STEM)对CaCO3-DEX的元素分析结果，P、F、Na均匀分布于材料内。紫外可见吸收光谱(图24)的结果表示，CaCO3-DEX 纳米材料的吸收光谱中有明显的DEX的特征峰。元素分布和DEX的特定吸收峰证明 CaCO3-DEX纳米材料内存在DEX。将CaCO3-DEX纳米材料与Mn(II)在无水乙醇中搅拌，可形成新的配位结构：Mn(II)与CaCO3-DEX中游离磷酸基团的配位，离心洗涤后，可得到Mn：CaCO3-DEX纳米材料。透射电镜的结果(图25a)表明锰掺杂后不会改变材料的粒径和形貌。根据扫描透射电子显微镜(STEM)对Mn：CaCO3-DEX的元素分析结果(图25b)表明，成功掺杂了Mn元素。
对材料的酸响应性能进行研究，设置了3个缓冲溶液(pH7.4；pH6.5；pH6.5+H2O2)。使材料与各缓冲溶液孵育不同时间(0，0.5，1，2，4，8，12，24，48h)，离心取上清液，通过吸收光谱测试释放的DEX含量。图26a的结果表明，材料在酸性条件下的药物释放速度快，释放量也明显高于中性缓冲液中的情况，在24h后达到释放稳定状态，在pH6.5 和pH6.5+H2O2反应条件下，药物释放量可达到60％以上。图26b结果表明，在酸性条件下，随着孵育时间延长，T1-MRI信号逐渐增强，证明了材料在酸性条件下的分解释放 Mn2+的行为。酸性环境和H2O2存在会加速材料的分解，增加Mn2+的释放。为了进一步证明材料在分解过程中的形貌变化，Mn：CaCO3-DEX纳米材料在不同缓冲溶液中孵育不同时间，离心，沉淀进行TEM表征(图26c)。结果表明，在酸性环境(pH＝5.8)中，材料会逐渐降解，粒径也会逐渐减小。同时，超声成像和信号统计的结果(图26d)证明， Mn：CaCO3-DEX纳米材料与pH6.5+H2O2的缓冲液共孵育的过程中有气泡的产生，证明了 CO2气体的生成。
对材料发生类芬顿反应的活性进行表征。以亚甲基蓝(MB)作为·OH检测探针，通过测定溶液中·OH的生成来评价CDT性能。实验设置了不同缓冲体系，结果显示(图26e)，Mn：CaCO3-DEX纳米材料在pH6.5(含HCO3 -)的缓冲条件下，可以使MB完全降解，值得注意的是，在pH6.5(不含HCO3 -)的缓冲条件下可以使MB的吸收产生明显的下降。结果也证明了自供HCO3 -在发生类芬顿反应中的重要作用。
实施例5Mn：CaCO3-DEX纳米材料用于细胞实验
以人源恶性脑胶质瘤U87MG细胞和肝癌HepG2细胞为研究模型，进一步探究了实施例4制得的Mn：CaCO3-DEX纳米材料用于多模态成像指导的肿瘤的联合治疗。
(1)细胞摄取试验
A.将U87MG细胞接种在玻璃底细胞培养皿
中(105个细胞)，培养24 h，待细胞贴壁后，与含有Ca2+、Mn2+、DEX-CaCO3、Mn：CaCO3-DEX的培养基([Ca]：25 μg/mL)共孵育24h，PBS洗涤三次，使用Fluo4-AM(2μM)和Hoechst33342(5μM) 对细胞内Ca(II)和细胞核分别染色后，洗涤三次，补充新鲜培养基，使用Olympus FV1200 激光共聚焦显微镜检测细胞对材料的摄取情况。如图27所示，可以在DEX-CaCO3、 Mn：CaCO3-DEX实验组的细胞质中观察到明显的绿色荧光信号，证明细胞与材料共孵育后，细胞内Ca2+浓度增加，而单独Ca2+组没有观察到明显的绿色荧光信号，这是由于细胞膜上的钙离子通道可以严格控制钙离子的运输，以维持细胞内Ca2+的稳定。
B.细胞内Ca2+浓度急速升高，可导致细胞发生钙过载，并伴随着细胞钙化的形成。将U87MG细胞接种在6孔板中(105个细胞/孔)，培养24h，待细胞贴壁后，与含有含有不同浓度的Mn：CaCO3-DEX([Ca]：12.5，25，50μg/mL)的培养基共孵育24h，PBS 洗涤三次，使用4％多聚甲醛固定。待细胞固定后，根据使用说明书，对钙化结节的形成进行染色：使用茜素红S染色液对钙化结节染色10min，PBS(不含钙盐)洗涤5次，使用倒置荧光显微镜在白光下观察和成像细胞钙化情况。茜素红S染色的结果(图28)表明，细胞内大量聚集的钙离子与茜素红S产生复合物，形成了橘红色沉淀沉积。并且随着Ca(II)浓度的增加，钙化结节更加明显，钙化范围明显增加。染色结果证明，材料引起的钙化具有浓度依赖性。
细胞摄取试验结果证明了细胞可以避开钙离子通道，通过胞吞的方式摄取材料，使得 Ca(II)可以在细胞内快速大量的聚集，引起钙过载，导致细胞钙化。
(2)细胞氧化应激反应
细胞内离子浓度异常增加，会破坏细胞原本维持的离子稳态，极大地影响细胞的功能，产生氧化应激、线粒体功能障碍等。
A.将U87MG细胞接种在玻璃底细胞培养皿
中(105个细胞)，培养24 h，待细胞贴壁后，与含有Mn2+(10μg/mL)和Mn：CaCO3-DEX([Mn]：10μg/mL)的培养基共孵育24h。PBS洗涤三次后，使用DCFH-DA(5μM)和Hoechst33342(5μg/mL) 对·OH和细胞核进行染色。激光共聚焦显微镜可以检测DCFH-DA与·OH反应而产生的绿色荧光(DCF)信号。如图29所示，在Mn2+和Mn：CaCO3-DEX实验组中都观察到了明显增强的荧光信号，证明了活性氧(ROS)的产生。在相同Mn浓度下，Mn：CaCO3-DEX 组荧光信号强度更高。HCO3 -可以增强ROS的产生能力，而大量ROS的产生破坏了原有的细胞稳定状态，使得Mn：CaCO3-DEX具有更强的氧化生物大分子能力，导致细胞不可逆转的坏死和凋亡。
B.将U87MG细胞接种在玻璃底细胞培养皿
中(105个细胞)，培养24 h，待细胞贴壁后，与含有不同浓度的Mn：CaCO3-DEX的培养基([Mn]：5、20μg/mL) 共孵育24h。PBS洗涤三次后，使用BODIPY C11(5μM)和Hoechst33342(5μg/mL) 对脂质过氧化水平和细胞核进行染色。激光共聚焦显微镜可以检测BODIPY C11氧化态的信号强度。图30a结果表明Mn：CaCO3-DEX可以产生较强的荧光信号，并表现出浓度依赖的性质。ImageJ分析结果表明Mn：CaCO3-DEX(20μg/mL)实验组的荧光信号强度分别比Mn：CaCO3-DEX(5μg/mL)和PBS实验组增加15.74％和8.31％(图30b)。
脂质过氧化检测的实验结果表明，活性氧的产生可以导致脂质发生氧化降解。
C.将U87MG细胞接种在玻璃底细胞培养皿
中(105个细胞)，培养24h，待细胞贴壁后，与含有不同浓度的Mn：CaCO3-DEX的培养基([Mn]：5、20μg/mL)共孵育24h。PBS洗涤三次后，使用JC-1(2.5μM)线粒体膜电位检测试剂盒，通过激光共聚焦观察荧光信号的变化，检测线粒体膜电位的变化。图31a结果表明，与对照组相比， Mn：CaCO3-DEX孵育后，红色荧光逐渐减弱，绿色荧光逐渐增强。ImageJ分析结果(图 31b)表明，绿色荧光与红色荧光信号强度比值升高，说明了线粒体膜电位紊乱，可导致细胞损伤。
线粒体可参与细胞的凋亡和死亡过程，也是细胞内Ca2+的主要存储位点之一。细胞内外离子水平的延长和升高会导致线粒体功能障碍，进而导致细胞死亡。
(3)材料对炎症水平的缓解
将Raw264.7巨噬细胞接种在共96孔板中(104个细胞/孔)，培养24h，待细胞贴壁后，使用脂多糖(LPS)(100ng/mL)与细胞共孵育24h。刺激巨噬细胞产生炎症后，使用DEX(50μg/mL)和Mn：CaCO3-DEX([DEX]：50μg/mL)与细胞共孵育24h。使用ELISA 试剂盒检测炎症因子白细胞介素-6(IL-6)表达水平的变化。结果表明，LPS可以有效刺激巨噬细胞产生炎症反应，增加炎症因子IL-6的产生，而使用DEX和Mn：CaCO3-DEX 后，可以有效降低IL-6的水平(图32)，Mn：CaCO3-DEX实验组对IL-6的中和作用，是 DEX实验组的1.74倍。
巨噬细胞在炎症反映着起关键作用，使用Mn：CaCO3-DEX在细胞水平证明了材料的抗炎作用。
(4)肿瘤细胞杀伤效果评价
A.利用MTT试验评价了对U87MG细胞的杀伤效果。将U87MG细胞接种在96孔板中(104个细胞/孔)，培养24h，待细胞贴壁后，与含有不同浓度的Mn：CaCO3-DEX([Mn]： 0、0.5、1、2、4、8、10、20、30μg/mL)共孵育24h。使用标准MTT试验测定细胞存活率。如图所示，低浓度的Mn：CaCO3-DEX纳米材料对U87MG细胞的损伤较低，随着浓度的升高，Mn：CaCO3-DEX纳米材料对U87MG细胞的杀伤效果逐渐增强。实验结果表明Mn：CaCO3-DEX纳米材料对肿瘤细胞的杀伤效果表现出浓度依赖性(图33a)。
利用MTT试验评价了正常人源肝细胞(L02)以及小鼠胚胎成纤维细胞(3T3)的耐受性。结果表明Mn：CaCO3-DEX纳米材料虽然对肿瘤细胞有显著的杀伤效果。但是正常细胞对Mn：CaCO3-DEX纳米材料耐受性明显高于肿瘤细胞(图33a)。
B.使用Calcein-AM/PI双染色试剂盒进行活/死细胞染色，直观检测DEX-CaCO3和Mn：CaCO3-DEX对U87MG细胞的杀伤情况。将U87MG细胞接种在6孔板中(105个细胞/孔)，培养24h，待细胞贴壁后，与含DEX-CaCO3和Mn：CaCO3-DEX的培养基共孵育 24h。PBS洗涤三次后，加入Calcein-AM/PI双染色试剂，在37℃下染色30min；PBS 洗涤后，利用倒置荧光显微镜测定活/死细胞的荧光。如图33b所示，活/死细胞染色分析结果与MTT试验结果一致，Mn：CaCO3-DEX纳米材料对U87MG细胞具有显著杀伤作用。 Mn：CaCO3-DEX的细胞密度低，而且被PI(碘化吡啶)染色所呈现的红色荧光的细胞数目过半，直观地证明了Mn：CaCO3-DEX纳米材料对肿瘤细胞的杀伤效果。
C.为了进一步比较治疗效果，使用GraphPad prism计算了Mn：CaCO3-DEX对不同细胞的半抑制浓度(IC50)。结果表明U87MG细胞的半抑制浓度为3.4μg/mL([Mn])，此浓度远小于3T3细胞(20.4μg/mL)，而正常肝细胞L02，在实验所用浓度范围内，无法计算。该结果进一步证明材料对肿瘤细胞的特异性杀伤效果。
细胞实验结果证明，Mn：CaCO3-DEX纳米材料可作为一种潜在的肿瘤靶向药物，通过自供HCO3 -增强的化学动力学治疗、钙过载引起的细胞钙化以及DEX的抗炎作用共同调节肿瘤微环境，诱导细胞死亡。
实施例6Mn：CaCO3-DEX纳米材料用于皮下瘤小鼠模型的成像与治疗实验
实验动物模型：由厦门大学实验动物中心自上海斯莱克实验动物中心代为购买的雌性 BALB/c裸小鼠(体重为16-18g)。
肿瘤模型：通过皮下注射100μL的U87MG细胞(2×106)于实验鼠右后腿部，接种皮下U87MG肿瘤。
所有动物实验都符合厦门大学实验动物使用委员会和实验动物伦理委员会批准的动物保护条例。
(1)Mn：CaCO3-DEX在体内的分布及代谢行为研究
A.荷U87MG瘤雌性BALB/c裸小鼠在肿瘤达到80-100mm3时，通过静脉注射 Mn：CaCO3-DEX([Mn]：2mg/kg)(n＝3)，在注射药物后不同时间点(0.5、1、2、4、8、 12、24、48h)，采集尾静脉丛血样，称重；加入适量浓HNO3-H2O2(体积比1∶3)进行消解；超纯水稀释后，通过ICP-MS测定组织样品中锰的含量。如图34a所示，血液循环半衰期为：3.32h(t1/2)。
B.在注射药物后不同时间点(0.5、1、2、4、8、12、24、48h)，断颈处死小鼠，解剖取出主要器官，包括：心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、腿部肌肉组织、肿瘤，称重；加入适量浓HNO3-H2O2(体积比1∶3)进行消解；超纯水稀释后，通过ICP-MS测定组织样品中锰的含量。图34b结果表明，Mn：CaCO3-DEX在肿瘤内的最大摄取量可以达到 15.0±1.4％ID/g，并且，在注射药物24h和48h后，材料在肿瘤位置的富集量仍然可以达到8.5±1.5％ID/g，和3.0±1.6％ID/g。
C.Mn：CaCO3-DEX纳米材料在酸性缓冲液中分解后，可以表现出良好的磁共振成像的效果。如图35a所示，Mn：CaCO3-DEX的纵向弛豫率(r1)可达到5.8mM-1·s-1。
D.荷U87MG瘤雌性BALB/c裸小鼠，通过肿瘤内注射Mn：CaCO3-DEX，使用9.4T 小动物磁共振成像设备对小鼠肿瘤区域进行成像。实验结果表明，随着时间的延长，材料在肿瘤内的T1-MRI信号逐渐增强，证明材料具有良好的磁共振成像效果(图35b，c)。因此，通过静脉注射Mn：CaCO3-DEX([Mn]：2mg/kg)(n＝3)，通过磁共振成像对材料在体内的分布进行实时监测。分别在给药前(0h的时间点)和给药后的2h、4h、8h、 24h、48h的时间点，使用9.4T小动物磁共振成像设备进行全身磁共振成像。如图35d 所示，Mn：CaCO3-DEX具有良好的靶向肿瘤的能力，可以有效地聚集于肿瘤区域，并逐渐释放Mn(II)，在8h达到材料在肿瘤内
富集的最大值。结果如图35e所示，在药物注射24h以及48h后，在肿瘤区域仍然可以观察到T1-MRI信号，证明材料可以在肿瘤内长时间滞留。肾脏的磁共振成像和统计结果(图35d，f)表明，Mn(II)可以通过肾脏代谢，排出体外。重复注射药物后，磁共振成像的结果(图35d)可以证明，材料可重复富集于肿瘤区域，持续产生CDT效果。
Mn：CaCO3-DEX在体内的分布及代谢行为研究结果表明，材料可以在体内有较长的循环时间，从而有效地聚集于肿瘤区域，并长时间滞留于肿瘤内部，以达到长期治疗的效果的作用。
(2)Mn：CaCO3-DEX对皮下U87MG肿瘤的治疗效果
当荷U87MG瘤雌性BALB/c裸小鼠在肿瘤达到60mm3时，评估了Mn：CaCO3-DEX 纳米材料的抗炎效果和该材料介导的化学动力学治疗效果。实验设计如图36a所示，将小鼠随机分成6组(n＝5)：(1)PBS(单次给药)；(2)DEX(4mg/kg，单次给药)；(3) DEX-CaCO3([DEX]：4mg/kg，单次给药)；(4)2×Mn：CaCO3-DEX([Mn]：4mg/kg，单次给药)；(5)Mn：CaCO3-DEX([Mn]：2mg/kg，四次给药)；(6)2×Mn：CaCO3-DEX([Mn]： 2mg/kg，四次给药)；在相应治疗后的21天内，每隔一天记录一次实验鼠的体重和肿瘤体积。
如图36b肿瘤生长曲线所示，对照组(1-3组)的肿瘤生长迅速，尤其在治疗后期，肿瘤体积迅速增长，CDT治疗组(4-6组)因Mn(II)在肿瘤内聚集量的不同，对肿瘤生长产生了不同程度的抑制效果。21天治疗期间小鼠肿瘤照片更客观地展现了治疗效果。根据肿瘤抑制率(TGI)计算公式：(1-实验组肿瘤体积/空白对照组肿瘤体积)×100％)，得到了不同实验组对肿瘤生长的抑制效果，第6实验组，通过增加药物注射剂量和注射次数，期肿瘤抑制率(75.2％)明显高于单次药物注射实验组(第4组，41.1％)和低剂量药物注射组(第5组，57.0％)。在治疗后的第21天，每组随机选择两只实验鼠，断颈处死，解剖取出肿瘤和主要组织器官：包括脑、心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏，进行离体肿瘤的拍照，重量记录以及包括主要器官在内的H&E染色分析。肿瘤质量(图36c)均证明了CDT治疗组最佳的肿瘤生长抑制作用，切片染色试验结果也显示，Mn：CaCO3-DEX 介导的CDT显著破坏了肿瘤组织结构，可见明显降低的肿瘤细胞密度(图36d)。
治疗结束后肿瘤组织分别使用COX-2抗体，ELISA试剂盒和茜素红S染色试剂盒对肿瘤内炎症因子(COX-2，IL-6)和钙化情况进行了测定，结果表明，治疗组肿瘤内炎症因子(COX-2，IL-6)的表达明显降低(图36e，f)，肿瘤切片组织也可以观察到肿瘤内已经发生严重钙化(图36g)。
如图37所示，所有实验组的主要器官没有发生明显损伤，说明治疗后没有对正常器官造成明显的损伤。治疗监测期间，所有实验组的实验鼠未显示出明显的体重下降(图38)，证实了本实施例中所使用的Mn：CaCO3-DEX治疗手段不会造成明显的生物毒性。
实施例7Mn：CaCO3-DEX纳米材料用于人源肝癌细胞和原位肝癌小鼠模型治疗实验
评估Mn：CaCO3-DEX纳米材料用于人源肝癌(HepG2)细胞的抗肿瘤效果和细胞氧化应激水平。实验方案同实施例5中细胞实验方案。茜红素染色的结果表明，材料与细胞共孵育后，细胞可发生明显的钙化，并表现出浓度依赖的性质(图39a)。DCFH-DA(图 39c)和BODIPY-C11(图39d)染色结果表明，材料可刺激细胞产生大量的活性氧，从而增强了细胞氧化能力，对脂质分子产生损伤，造成细胞的脂质过氧化。JC-1染色结果 (图39e)表明了线粒体的损伤。MTT的实验结果表明(图39b)，细胞通过多种方式刺激产生的氧化应激反应可有效诱导细胞凋亡或坏死。
如图39f-i所示，使用荧光素酶确认原位肝癌建模成功后，将建模成功的原位肝癌实验鼠随机分为3组(n＝5)：(1)PBS(四次给药)；(2)Mn：CaCO3-DEX([Mn]：2mg/kg，四次给药)；(6)2×Mn：CaCO3-DEX([Mn]：2mg/kg，四次给药)。药物分别在第0、2、7和 14天，通过尾静脉注射。在治疗期间，通过监测生物发光信号的强度，判断小鼠原位肝癌的生长情况，肿瘤区域的生物发光图和信号统计结果证明，CDT治疗组可以有效抑制原位肝癌的生长，药物使用剂量的增大，可以明显改善治疗效果。信号统计结果表明，高剂量药物注射组(第3组)的生物发光信号相对于治疗初期仅增强了1.9倍，肿瘤增长情况远低于低剂量组(第2组；增强8.8倍)和空白对照组(第2组；增强15.1倍)。治疗 24天结束后，所有实验鼠断颈处死，取出肝组织(包括正常肝组织和原位肝癌组织)，进行拍照和H&E染色，照片可以更直观地展示，治疗组实验鼠的原位肝癌的体积远小于对照组。H&E的染色结果表明，材料对正常肝组织无明显损伤，而肿瘤区域的细胞密度明显降低、细胞形态发生改变，证明材料对肿瘤细胞的特异性杀伤效果。治疗期间的体重监测结果也表明，材料对小鼠无明显的系统毒性。
综合该实施例中实验结果，证明Mn：CaCO3-DEX纳米材料具有良好的生物相容性，是潜在的可用于原位肝癌治疗的优良纳米药物。
综上所述，本发明使用临床上使用的有机染料吲哚菁绿(ICG)和抗炎药物地塞米松磷酸钠(DEX)分别与Mn(II)和Ca(II)发生配位反应，并通过气体扩散和生物矿化的方式合成了碳酸锰和碳酸钙纳米颗粒。碳酸钙纳米颗粒通过有机分子地塞米松与Mn (II)的螯合作用，制备得到了锰掺杂的碳酸钙纳米颗粒。本发明制备得到的锰基碳酸盐纳米材料具有肿瘤微环境响应的分解性能，并释放Mn(II)和HCO3 -，利用自供的HCO3 -引起细胞的氧化应激反应，产生增强的化学动力学治疗效果。本发明中所设计的两种锰基纳米材料均可通过释放的Mn(II)产生磁共振造影效果，对材料在肿瘤内的富集进行实时的监测。通过改变与金属配位的有机小分子，材料还可以产生不同的成像或治疗效果。在碳酸锰的合成中，选择ICG进行配位，可以利用其良好的荧光成像效果，通过双模态成像对材料在体内分布和肿瘤内的摄取再次进行验证。其在808nm处的吸收，也使其成为一类新型光热治疗剂，通过CDT&PTT的联合治疗，达到对肿瘤彻底治愈的效果。在碳酸钙的合成中，选择DEX进行配位，利用DEX良好的抗炎症性质，可以改善肿瘤的炎症环境，从而达到增强治疗效果的作用。该发明设计的两种锰基纳米材料在细胞实验中证明，可以诱导肿瘤细胞产生严重的氧化应激反应，造成细胞坏死和凋亡，并且不受肿瘤细胞类型的限制，而对正常细胞的毒性作用基本可以忽略不计。在小鼠实验中，分别选择了鼠源4T1细胞接种的皮下瘤模型，人源U87MG细胞接种的皮下瘤模型和人源HepG2 细胞接种的原位肝癌模型，对治疗效果进行验证。最终实现了抑制肿瘤生长、延长小鼠生存期的作用。利用光热和化学动力学的联合治疗，达到了完全治愈肿瘤的效果。合成该材料的选料，均为临床上批准使用的药物，合成方法绿色、安全，因此材料具有优良的生物相容性和生物应用安全性，具有广阔的临床转化应用前景。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
Claims (10)
1.一种医用碳酸盐纳米材料的制备方法，其特征在于：包括将二价金属离子与能够与该二价金属离子发生配位的医用有机功能分子混合后，在室温下置于碳酸氢铵分散扩散的环境中进行反应，然后与聚丙烯胺盐酸盐反应而制成，该二价金属离子为Mn(II)或Ca(II)，该医用有机功能分子为吲哚菁绿或地塞米松磷酸钠。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)将四水合氯化锰与吲哚菁绿充分混合；
(2)室温下，将步骤(1)所得的物料置于碳酸氢铵分散扩散的环境反应1-4h；
(3)将步骤(2)所得的物料进行离心，获得沉淀；
(4)将步骤(3)所得的沉淀超声分散于无水乙醇中，充分离心洗涤，获得沉淀；
(5)将步骤(4)所得的沉淀分散于无水乙醇中，加入聚丙烯胺盐酸盐，于室温下搅拌反应，然后离心获得沉淀；
(6)将步骤(5)所得的沉淀超声分散于超纯水中，充分离心洗涤，即得所述医用碳酸盐纳米材料。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述四水合氯化锰与吲哚菁绿的质量比为50∶1-3。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)所得的沉淀与所述聚丙烯胺盐酸盐的质量比为1∶0.5-4。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)将二水合氯化钙与地塞米松磷酸钠充分混合；
(2)室温下，将步骤(1)所得的物料置于碳酸氢铵分散扩散的环境反应2-8h；
(3)将步骤(2)所得的物料进行离心，获得沉淀；
(4)将步骤(3)所得的沉淀超声分散于无水乙醇中，充分离心洗涤，获得沉淀；
(5)将步骤(4)所得的沉淀分散于无水乙醇中，再加入四水合氯化锰，超声分散后于室温下搅拌反应，然后离心获得沉淀；
(6)将步骤(5)所得的沉淀超声分散于无水乙醇中，充分离心洗涤，获得沉淀；
(7)将步骤(6)所得的沉淀分散于无水乙醇中，加入聚丙烯胺盐酸盐，于室温下搅拌反应，然后离心获得沉淀；
(8)将步骤(7)所得的沉淀超声分散于超纯水中，充分离心洗涤，即得所述医用碳酸盐纳米材料。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述二水合氯化钙与地塞米松磷酸钠的质量比为50∶1-6。
7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)所得的沉淀与所述四水合氯化锰的质量比为1∶0.5-2。
8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(6)所得的沉淀与所述聚丙烯胺盐酸盐的质量比为1∶1-4。
9.如权利要求1至8中任一权利要求所述的制备方法制备的医用碳酸盐纳米材料在制备肿瘤诊断药物中的应用。
10.如权利要求1至8中任一权利要求所述的制备方法制备的医用碳酸盐纳米材料在制备肿瘤治疗药物中的应用。
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