CN112569254A - 金属-有机纳米复合物在制备治疗肿瘤的化学动力治疗剂中的用途 - Google Patents

金属-有机纳米复合物在制备治疗肿瘤的化学动力治疗剂中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明属药物制剂和肿瘤医学领域，具体涉及金属‑有机纳米复合物在制备治疗肿瘤的化学动力治疗剂中的用途，本发明治疗肿瘤的化学动力治疗剂用于PDAC的治疗，经细胞水平实验证明，本化学动力治疗剂通过Fenton反应放大氧化压，杀伤肿瘤细胞，且有效的诱导巨噬细胞表型极化，降低促纤维化细胞因子TGF‑β的分泌；体内药效学实验证明，本化学动力治疗剂到达肿瘤部位后，可同时重塑肿瘤微环境并杀伤肿瘤细胞，具有良好的抑瘤效果，与临床一线化疗药物吉西他滨相比，具有高效低毒的治疗作用。本发明提供了借助化学动力治疗剂同时调节肿瘤微环境并杀伤肿瘤细胞治疗肿瘤尤其是胰腺癌的新的策略。

Description

金属-有机纳米复合物在制备治疗肿瘤的化学动力治疗剂中 的用途
技术领域
本发明属药物制剂和肿瘤医学领域，具体涉及金属-有机纳米复合物在制备治疗肿瘤的化学动力治疗剂中的用途，本化学动力治疗剂到达肿瘤部位后，可同时重塑肿瘤微环境并杀伤肿瘤细胞，具有良好的抑瘤效果，与临床一线化疗药物吉西他滨相比，具有高效低毒的治疗作用。本发明提供了借助化学动力治疗剂同时调节肿瘤微环境并杀伤肿瘤细胞治疗肿瘤尤其是胰腺癌的新的策略。
背景技术
现有技术公开了胰腺导管腺癌(PDAC)是恶性程度最高的癌症之一，其五年生存率不足7％。研究显示，PDAC预后差的原因主要是目前临床上基于吉西他滨的一线化疗方案除严重的毒副作用外，总体响应率低且容易产生耐药性，因此，为克服以上问题，改善胰腺癌治疗，亟需开发新型的治疗策略以提高治疗效果。
目前临床实践标准化疗方案响应率不高的主要原因之一是肿瘤细胞对化疗药物的敏感性较差，这归因于肿瘤细胞的内源性凋亡抑制以及获得性耐药，其中，一方面，胰腺癌的发生大多是由KRAS(属于小GTP酶蛋白质家族)突变引起的，而肿瘤细胞中KRAS蛋白上调会激活下游通路提高细胞内活性氧(ROS)的水平，进而导致肿瘤细胞本身对化疗药物引起的凋亡不敏感；另一方面，多次用药后，长期暴露于化疗药物的肿瘤细胞会通过激活代偿性途径而产生耐药性，导致化疗缺乏持续性疗效。因此，积极寻求新的治疗策略用于抑制或杀伤胰腺癌细胞显得十分必要。
此外，由异常激活的肿瘤相关成纤维细胞(TAF)分泌基质蛋白，导致胰腺癌肿瘤微环境(TME)药物可及性差，是造成标准化疗方案响应率低的另一重要原因。相关的研究揭示了肿瘤相关巨噬细胞(TAM)在基质屏障形成中的关键作用，即在PDAC发生和进展过程中，TAM(主要为M2型巨噬细胞)通过释放细胞因子刺激微环境中的成纤维细胞异常活化，促使后者分泌大量胞外蛋白，形成基质屏障。近年来，有关体内和体外的研究表明M1表型巨噬细胞不仅可介导免疫应答抑制肿瘤生长，而且该表型的巨噬细胞不分泌促纤维化的细胞因子，如TGF-β。因此，诱导胰腺癌微环境中的TAM由M2表型极化为M1表型可能减少其对TAF的刺激，进而减少纤维蛋白沉积，重塑细胞外基质并改善药物递送；业内认为，能同时杀伤耐药肿瘤细胞并诱导促纤维化TAM表型极化的治疗策略将有益于提高PDAC的治疗效果。
作为新型的肿瘤治疗策略，化学动力疗法(CDT)可通过Fenton反应将ROS转化为高细胞毒性的羟基自由基(·OH)而对细胞内的核酸，蛋白质和脂质造成氧化损伤。鉴于KRAS突变可导致PDAC肿瘤细胞内ROS水平异常升高，因此借助CDT试剂将高水平的ROS转化为·OH有望克服胰腺癌细胞的内源性凋亡抑制和获得性耐药。此外，最近的研究证明CDT的催化剂--铁离子或亚铁离子可有效地刺激巨噬细胞表型由M2向M1极化；考虑到大量TAM损伤或死亡会导致肿瘤微环境中其他细胞代偿性分泌大量促癌因子，因此控制CDT试剂在TAM中只释放铁离子而不造成氧化损伤，可诱导表型极化，降低促纤维化细胞因子TGF-β释放，减少成纤维细胞活化而调节肿瘤微环境。
基于现有技术的基础与现状，本申请的发明人拟提供金属-有机纳米复合物在制备治疗肿瘤的化学动力治疗剂中的用途，进一步提供借助化学动力治疗剂同时调节肿瘤微环境并杀伤肿瘤细胞治疗肿瘤尤其是胰腺癌的新的策略。
发明内容
本发明的目的是基于现有技术的基础与现状，提供金属-有机纳米复合物在制备治疗肿瘤的化学动力治疗剂中的用途，进一步提供借助化学动力治疗剂同时调节肿瘤微环境并杀伤肿瘤细胞治疗肿瘤尤其是胰腺癌的新的策略。
本发明基于目前临床上针对胰腺导管腺癌(PDAC)的一线疗法仍然是以吉西他滨为基础的化疗，然而，现行的多种化疗方案均未能显著改善预后，延长患者的生存期，主要原因在于肿瘤细胞本身对化疗药物不敏感以及胰腺癌肿瘤微环境药物可及性极差，在PDAC发生和进展过程中，KRAS突变导致肿瘤细胞内源性地抑制化疗药物引起的凋亡；同时，微环境中肿瘤相关巨噬细胞(TAM)通过细胞因子刺激肿瘤相关成纤维细胞(TAF)分泌基质纤维，大量胞外蛋白沉积阻碍药物进入肿瘤微环境。
本发明提供了金属-有机纳米复合物制备的治疗肿瘤的化学动力治疗剂，将其应用于胰腺导管腺癌治疗，通过特异性响应的方式，在肿瘤细胞中驱动Fenton反应造成氧化损伤，同时无损伤地诱导肿瘤相关巨噬细胞表型向M1极化，进而降低促纤维化细胞因子TGF-β释放，减少成纤维细胞活化而调节肿瘤微环境；利用以上策略同时杀伤肿瘤细胞并调节肿瘤基质微环境，抑制胰腺癌进展。
本发明通过构建的金属-有机纳米复合物制备的治疗肿瘤的化学动力治疗剂作为靶向纳米递送系统应于PDAC的治疗，即通过亚铁离子介导的Fenton反应将细胞内H2O2转化为羟基自由基(·OH)造成肿瘤细胞氧化损伤，规避KRAS引起的内源性凋亡抑制；再通过铁离子介导的TAM表型极化，减少纤维化相关细胞因子分泌，降低对TAF的刺激，减少微环境中基质蛋白沉积；经细胞水平实验证明，本化学动力治疗剂可通过Fenton反应放大氧化压，杀伤肿瘤细胞，而且可有效的诱导巨噬细胞表型极化，降低促纤维化细胞因子TGF-β的分泌；体内药效学实验证明，本化学动力治疗剂到达肿瘤部位后，可同时重塑肿瘤微环境并杀伤肿瘤细胞，具有良好的抑瘤效果，与临床一线化疗药物吉西他滨相比，具有高效低毒的治疗作用。
本发明所采用的化学动力治疗剂为金属-有机纳米复合物，其可通过酸响应的方式释放铁离子，通过酸/GSH双响应驱动Fenton反应。
本发明所采用的化学动力治疗剂为表面修饰透明质酸的纳米粒，肿瘤细胞和巨噬细胞均可通过透明质酸-CD44介导的主动内吞摄取纳米粒。
本发明所采用的鼠源成纤维细胞NIH3T3、巨噬细胞RAW264.7和小鼠胰腺癌细胞KPC均为本领域所公认且可市购获得。
本发明所采用的雄性C57BL/6小鼠为本领域所公认且市购获得。
本发明描述了化学动力治疗剂在体内外杀伤肿瘤细胞调节肿瘤微环境的作用机制考察结果。
本发明通过免疫印迹(Western Blot)实验和流式细胞(Flow Cytometry)实验证明，基于构建的金属-有机纳米复合物，通过涉及的化学动力疗法显示，可诱导肿瘤相关巨噬细胞极化高效地抑制肿瘤相关成纤维细胞激活，减少基质蛋白表达；同时证明该过程的作用机制与TGF-β/smad通路有关；通过免疫荧光切片实验证明了所述的纳米药物在进入肿瘤微环境后，可选择性杀伤肿瘤细胞而不造成巨噬细胞氧化损伤；通过免疫组化实验证明化学动力治疗剂可显著减少纤维蛋白沉积，改善肿瘤基质微环境。
本发明提供了金属-有机纳米复合物制备的治疗肿瘤的化学动力治疗剂，该化学动力治疗剂用于PDAC的治疗，即通过亚铁离子介导的Fenton反应将细胞内H2O2转化为羟基自由基(·OH)造成肿瘤细胞氧化损伤，规避KRAS引起的内源性凋亡抑制；再通过铁离子介导的TAM表型极化，减少纤维化相关细胞因子分泌，降低对TAF的刺激，减少微环境中基质蛋白沉积；经细胞水平实验证明，本化学动力治疗剂通过Fenton反应放大氧化压，杀伤肿瘤细胞，且有效的诱导巨噬细胞表型极化，降低促纤维化细胞因子TGF-β的分泌；体内药效学实验证明，本化学动力治疗剂到达肿瘤部位后，可同时重塑肿瘤微环境并杀伤肿瘤细胞，具有良好的抑瘤效果，与临床一线化疗药物吉西他滨相比，具有高效低毒的治疗作用。本发明提供了借助化学动力治疗剂同时调节肿瘤微环境并杀伤肿瘤细胞治疗肿瘤尤其是胰腺癌的新的策略。
附图说明
图1是化学动力治疗剂的表征，其中，
图A是金属-有机纳米复合物的粒径分布图，
图B是金属-有机纳米复合物的透射电镜图，
图C是金属-有机纳米复合物在不同pH条件下释放铁离子曲线，
图D是金属-有机纳米复合物中GSH响应基团与GSH发生反应的核磁图谱。
图2是化学动力治疗剂的细胞毒性评价，其中，
图A是肿瘤细胞和巨噬细胞摄取金属-有机纳米复合物的流式定量结果，
图B是金属-有机纳米复合物刺激肿瘤细胞内氧化压升高的定性结果，
图C是金属-有机纳米复合物对肿瘤细胞的毒性评价，
图D是金属-有机纳米复合物对巨噬细胞的毒性评价。
图3是化学动力治疗剂体外降低基质蛋白表达的作用机制，其中，
图A是吉西他滨和金属-有机纳米复合物诱导巨噬细胞表型极化的流式结果，
图B是蛋白印记实验的操作流程，
图C是高低剂量纳米粒处理巨噬细胞后的条件培养基对于NIH3T3细胞中各蛋白表达情况的影响，
图D是纳米粒处理巨噬细胞后的条件培养基对NIH3T3细胞中TGF-β/smad通路相关蛋白的调节。
图4是化学动力治疗剂体内选择性杀伤肿瘤细胞并诱导巨噬细胞表型极化的结果，其中，
图A是金属-有机纳米复合物给药后肿瘤组织内氧化压的定性结果，
图B是金属-有机纳米复合物给药后肿瘤组织内制剂和巨噬细胞以及氧化压的定性结果，
图C是金属-有机纳米复合物给药后肿瘤组织中M2巨噬细胞数量的流式结果，
图D是金属-有机纳米复合物给药后肿瘤组织中CD206和CD80的免疫组化结果。
图5是化学动力治疗剂给药后肿瘤组织中基质相关蛋白的免疫组化结果。
具体实施方式：
实施例1：化学动力治疗剂的表征
通过纳米沉淀法制备得到目标金属-有机纳米复合物，即化学动力治疗剂。用Malvern粒径/Zeta电位测定仪测定纳米粒的粒径，同时用透射电镜观察纳米粒的实际形态。为证明纳米粒能够响应酸性环境释放铁离子，以邻菲罗啉为指示剂，采用分光光度法测定不同pH条件下金属-有机纳米复合物释放铁离子的量；为证明纳米粒能够响应肿瘤细胞中较高浓度的GSH，将制备纳米粒的材料单体和等摩尔量的GSH同时溶解于氘代DMSO和重水的混合溶液中，实时观察核磁谱图变化。
结果显示：金属-有机纳米复合物的粒径大约为150nm左右，从透射电镜图可以看到纳米粒无明显聚集现象，以及表面吸附的透明质酸网状结构层。在铁离子酸响应释放实验中，纳米粒在生理条件下(pH＝7.4)几乎不释放铁离子，而在当pH＝5.0时，24h后超过90％的铁离子从制剂中释放，说明纳米粒在生理条件下稳定，当摄取进入溶酶体后能够快速地响应酸环境释放铁离子。同时核磁图谱可以发现，材料单体可与GSH快速反应，证明了纳米粒良好的GSH响应活性。
实施例2：化学动力治疗剂的细胞毒性评价
证明化学动力治疗剂可通过透明质酸-CD44介导的内吞途径同时进入肿瘤细胞和巨噬细胞，采用细胞流式实验考察两种细胞对纳米粒的摄取情况：将KPC和RAW264.7细胞分别种于六孔板中培养24h，分别给予coumarin-6标记的纳米粒(或先用透明质酸预处理2h后，再给药)，继续培养4h后收集细胞，用流式仪评价摄取情况；为证明化学动力治疗剂在进入肿瘤细胞后，能够快速驱动Fenton反应，选用活性氧探针(DCFH-DA)测定纳米粒处理后的肿瘤细胞内的氧化压；KPC细胞种于共聚焦皿中孵育24h，随后每皿于不同时间点分别加入特定浓度的纳米制剂，放进培养箱孵育4h后。配制DCFH-DA探针稀释液，每皿各加1mL再孵育0.5h，取出，固定染核，激光共聚焦显微镜观察细胞内ROS水平。另外，用CCK-8实验对纳米制剂进行细胞毒性评价，将KPC细胞给药培养24h后(或在6h时加入不同浓度的铁死亡抑制剂，继续培养至24h)，按试剂盒说明操作，最后用酶标仪测定紫外吸收，计算细胞存活率；
结果显示：肿瘤细胞和巨噬细胞均可摄取金属-有机纳米复合物，并且这一过程可被透明质酸预处理抑制，证明纳米粒主要是是通过透明质酸-CD44介导的内吞途径进入两种细胞；共聚焦结果显示化学动力治疗剂处理后，肿瘤细胞中氧化压显著增高，并且升高的程度随作用时间的延长而增加，证明该纳米粒可以在肿瘤细胞中驱动Fenton反应升高氧化压；细胞活性实验结果显示，化学动力治疗剂作用于肿瘤细胞相较于巨噬细胞有更强的细胞毒性，因此证明该金属-有机纳米复合物可以选择性杀伤肿瘤细胞。
实施例3：化学动力治疗剂体外降低基质蛋白表达的作用机制
为验证化学动力治疗剂是否会诱导肿瘤相关巨噬细胞发生表型极化，考察了巨噬细胞在给药之后M2型所占比例的变化。未激活的RAW264.7细胞为阴性对照组，用10ng/mL的IL13刺激RAW264.7为M2型阳性对照组，对比吉西他滨游离药和纳米制剂对巨噬细胞表型的影响。具体操作如下，RAW264.7细胞种6孔板，除阴性对照组外每孔各加刺激因子IL1310ng/mL，置于培养箱孵育24h后分别给吉西他滨和纳米粒，12h后收集细胞，加荧光染料PE标记的M2型巨噬细胞标记物(CD206)或M1型巨噬细胞标记物(CD80)染色30min，PBS清洗后流式细胞术扫描阳性细胞所占比例；
另外，为考察不同表型的巨噬细胞条件培养基(CM)对TAF中标记蛋白的影响，NIH3T3细胞接种于6孔板孵育24h后，加含10ng/mL TGF-β的DMEM培养基刺激24h后，吸出培养基，分别用CM(低、高剂量纳米粒处理的巨噬细胞条件培养基)孵育24h。临床抗纤维化用药曲尼司特(Tranilast,100μM)作为阳性对照，给药时间同样为24h。吸除上清后，用PBS洗3遍，将6孔板置于冰上，每孔加入250μL的RIPA裂解液裂解30min，用细胞刮刀刮下细胞，将细胞碎片和裂解液加入1.5mL离心管，于4℃、12000rpm/min条件离心10min。将上清转移到新的预冷EP管中，弃去沉淀，用BCA试剂盒定量后加入适量的5x的上样缓冲液，涡旋混匀后于95℃干式加热器上加热5min，上样。采用Western Blot法继续考察CM孵育后TAF细胞中TGF-β/smad通路相关蛋白的表达情况。将10ng/mL的TGF-β刺激24h后的NIH3T3作为阳性对照，分别给予不同的条件培养基后，考察磷酸化和非磷酸化的smad2和smad3蛋白的变化情况。细胞裂解提取蛋白及定量和上样准备同上；
结果显示：当用IL13刺激RAW264.7细胞24h后，CD206阳性的细胞从1.40％提高到28.3％，提示巨噬细胞已经转变为M2型；当给纳米制剂之后M2型巨噬细胞所占比例明显下降同时M1型比例升高，而吉西他滨组无明显变化，说明纳米制剂可显著降低巨噬细胞M2表型所占比例，将其诱导为M1表型。蛋白印记实验结果表明，当用TGF-β刺激NIH3T3细胞24h后，成纤维细胞激活的蛋白肌动蛋白α(α-SMA)、成纤维细胞相关蛋白(FAP)以及纤维黏连蛋白(Fibronectin)的表达量大幅增加，提示成纤维细胞已经转变为激活态的肿瘤相关成纤维细胞；当给予不同剂量纳米粒治疗的巨噬细胞CM孵育24h后，与阳性对照组相比，纳米制剂给药后的CM能够显著降低α-SMA、FAP以及Fibronectin的表达量；进一步机制研究显示，给TGF-β刺激24h后，NIH3T3细胞中磷酸化蛋白pSmad2和pSmad3表达量显著提高，给纳米制剂治疗后的CM相较于无治疗的CM，两种蛋白的磷酸化水平显著下降。综上所述，化学动力治疗剂能有效降低肿瘤微环境中M2型巨噬细胞的比例，其治疗后的条件培养基能抑制TAF的激活和相关蛋白的表达，并且这一抑制结果可能是通过减少释放TGF-β实现的。
实施例4：化学动力治疗剂体内选择性杀伤肿瘤细胞并诱导巨噬细胞表型极化
皮下胰腺癌肿瘤模型的建立：取对数生长期的胰腺癌细胞KPC，用胰酶消化后离心，用适量的PBS重悬使总细胞浓度为1×106cells/mL。取4-6周、20g左右的雄性C57BL/6小鼠，在后肢皮下注射100μL的细胞悬液，14天后待肿瘤体积长至约200cm3，用于后续的实验；
原位胰腺癌动物模型的建立：取对数生长期的KPC细胞，用胰酶消化后离心，PBS清洗细胞两次后计数，将细胞的浓度调整为1×106cells/mL，置于冰盒备用。150μL 5％水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，医用胶带固定四肢，用碘酒涂腹部皮肤，用眼科剪于小鼠的左下腹脾脏附近剪开2-3cm的切口，翻至皮肤外，脾脏下即为胰脏。用移液枪重悬冰上的细胞，取50μL从胰脏尾端朝右前方向进针，可观察到胰腺明显充盈呈半透明状，慢慢移出针头，用蘸有生理盐水的棉签把胰脏、脾脏推回体内。在伤口处滴适量的抗生素，用生物可降解的缝合线先逐针缝合里面的肌肉层，再逐针缝合外层的皮肤，所有操作均在超净手术台中进行。接种后每天观察动物状态和伤口愈合情况，在接种后10天进行实验；
将荷皮下瘤的小鼠随机分为3组，每组6只，分别通过尾静脉注射给药生理盐水、吉西他滨注射液和化学动力治疗剂(或DiR标记的制剂)。12h后，瘤内注射DCFH-DA探针溶液，2h后处死小鼠，心脏灌流生理盐水及4％多聚甲醛后取瘤组织，随后包埋在OCT化合物中并在-20℃条件下冷冻后使用冷冻切片机进行切片。将0.25％Triton X-100(v/v)溶液滴加至切片表面孵育10分钟，PBS清洗切片后用含10％山羊血清(v/v)的PBS溶液室温封闭2小时，然后将切片与藻红蛋白(PE)标记的F4/80抗体稀释液在4℃下孵育过夜。用PBS溶液清洗切片后，使用DAPI对切片进行细胞核染色，PBS溶液清洗切片后将切片置于倒置荧光显微镜下进行分析；
将荷原位瘤的小鼠随机分为3组，每组6只，每两天通过尾静脉注射给药生理盐水、吉西他滨注射液和化学动力治疗剂，总共给药3次。给药周期结束后每组各取三只小鼠解剖取瘤，随后用DNase I、透明质酸酶和胶原酶的混合酶液消化组织4h，过筛收集细胞，加异硫氰酸荧光素标记的巨噬细胞标记物(FITC-F4/80)和用藻红蛋白标记的M2型巨噬细胞标记物CD206(PE-CD206)，用于筛选出M2型巨噬细胞在肿瘤组织中所占的比例。取各组剩余3只小鼠，取瘤组织进行免疫组化分析巨噬细胞标记物CD206和CD80，以及相关基质蛋白的表达情况；
结果显示：化学动力治疗剂进入肿瘤组织后，氧化压升高的区域与巨噬细胞区域不重叠，说明纳米粒可选择性地升高肿瘤细胞中的氧化压，相比之下，吉西他滨并不能显著升高氧化压；多次用药后，肿瘤组织流式结果表明纳米制剂较吉西他滨可显著降低肿瘤组织中M2型巨噬细胞的比例；同时免疫组化实验结果表明化学动力治疗剂可降低CD206的表达同时上调M1型巨噬细胞标记物CD80的表达，同时肿瘤微环境中TGF-β及相关基质蛋白表达量均下降。综上所述，基于本课题组前期设计构建的金属-有机纳米复合物，化学动力疗法可选择性的诱导肿瘤相关巨噬细胞表型极化，进而重塑肿瘤基质微环境；同时特异性地造成肿瘤细胞氧化损伤，可有效解决目前临床上胰腺癌一线疗法所面临的问题。

Claims (6)

1.金属-有机纳米复合物在制备治疗肿瘤的化学动力治疗剂中的用途；所述的金属-有机纳米复合物中含有谷胱甘肽(GSH)响应基团，所述化学动力治疗剂的表征如图1所示。
2.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述化学动力治疗剂特异性地在肿瘤细胞中响应高浓度的GSH，驱动Fenton反应，在被肿瘤细胞摄取后，仅铁离子释放，以无损地方式诱导表型极化。
3.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述化学动力治疗剂同时调节肿瘤微环境并杀伤肿瘤细胞。
4.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述化学动力治疗剂，当药物在肿瘤部位蓄积后，选择性的诱导肿瘤相关巨噬细胞表型极化，重塑肿瘤基质微环境；同时特异性地造成肿瘤细胞氧化损伤，抑制胰腺癌的进展。
5.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述化学动力治疗剂被肿瘤细胞摄取后，依次响应溶酶体酸环境和胞质中较高浓度的GSH，选择性地发生Fenton反应，产生大量·OH，特异性的造成肿瘤细胞氧化损伤。
6.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述化学动力治疗剂被肿瘤相关巨噬细胞摄取后，可响应溶酶体中的酸环境，释放铁离子，铁离子诱导TAM表型由M2向M1极化，降低促纤维化细胞因子TGF-β的释放，减少成纤维细胞活化，进而调节肿瘤微环境。
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