CN115684141A - 缩短唾液葡萄糖检测时间的试纸条及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种缩短唾液葡萄糖检测时间的试纸条，所述试纸条包括酶、显色剂、显色促进剂、PH调节剂、非酶激活剂、涂覆在所述试纸上的保护膜、酶激活剂、液体扩散控制剂和/或酶稳定剂。还提供了该试纸条的制备方法和应用。本发明的目的是提供一中用于快速检测唾液中葡萄糖含量的试纸条，重点在于加入非酶类物质缩短测试时间。所合成的唾液糖试纸对于糖尿病和口腔疾病的早期预防、初步判断、治疗等均具有重要的临床意义。
Description
技术领域
本发明属于医疗器械领域，具体涉及一种缩短唾液葡萄糖检测时间的试纸条及其制备方法和应用。
背景技术
唾液葡萄糖(唾液糖)水平检测可以为高血糖人群(特别是二型重症糖尿病患者)提供新型无创血糖监测方案，还在糖尿病早期筛查和口腔健康管理等场景具有巨大的应用潜力。目前，进口血糖仪试纸测试时间最快为5s，比如拜尔、罗氏、雅培；国产血糖仪试纸测试时间最快基本在10s左右，比如鱼跃、怡成、三诺。唾液糖试纸作为一类结构更简单的功能产品，如何提高测试时间是相关领域力争取得但较为困难的现实问题。
一般利用加入变旋酶或者增加葡萄糖氧化酶的用量增加反应的速率，但是成本提高，而且变旋酶容易失活，稳定性较差。因此，本产品利用非酶类物质提高检测唾液葡萄糖的反映速率。经过研究，采用非酶类物质显著增加了酶促反应速率，使其由原来30-50s完成测定缩短为5s显色完全，同时保持了酶法测糖特异性较高、条件温和等优点。
发明内容
因此，本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种缩短唾液葡萄糖检测时间的试纸条及其制备方法和应用，所合成的可以缩短唾液葡萄糖检测时间的试纸条对于糖尿病和口腔疾病的早期预防、初步判断、治疗等均具有重要的临床意义。
为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种缩短唾液葡萄糖检测时间的试纸条，所述试纸条包括酶、显色剂、显色促进剂、PH调节剂、非酶激活剂、涂覆在所述试纸上的保护膜、酶激活剂、液体扩散控制剂和/或酶稳定剂；
优选地，所述非酶激活剂选自以下一种或多种：卤代间苯二酚、羟基苯磺酸钠或其盐、吐温20、苯甲酸、苯酚，更优选为卤代间苯二酚和/或羟基苯磺酸钠或其盐；其中，
所述卤代间苯二酚优选选自以下一种或多种：4-氯间苯二酚、4-溴间苯二酚、5-碘间苯二酚、5-氟间苯二酚，更优选为4-氯间苯二酚、4-溴间苯二酚、5-碘间苯二酚，最优选为4-氯间苯二酚；
所述羟基苯磺酸钠或其盐优选选自以下一种或多种：3，5-二氯-2-羟基苯磺酸钠、3-醛基-4-羟基苯磺酸钠、对羟基苯磺酸钠，更优选为3，5-二氯-2-羟基苯磺酸钠、对羟基苯磺酸钠，最优选为3，5-二氯-2-羟基苯磺酸钠；和/或
所述试纸条的显色响应时间优选为1s～20s，进一步优选为1s～15s，更优选为1s～10s，最优选为5s。
根据本发明第一方面的缩短唾液葡萄糖检测时间的试纸条，其中，所述酶包括葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、维生素C氧化酶；
所述显色剂选自以下一种或多种：2，4，6-三溴-3-羟基苯甲酸、4-氨基安替比林、2,4-二氯苯酚、3,3',5,5'-四甲基联苯胺，优选为2，4，6-三溴-3-羟基苯甲酸、4-氨基安替比林；
所述显色促进剂选自以下一种或多种：壳聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、杂多糖、纤维素和聚乙烯醇，优选为壳聚糖；
所述pH调节剂选自以下的一种或多种：盐酸、磷酸、醋酸、硫酸，优选为醋酸；
所述涂覆在试纸上的保护膜选自以下一种或多种材料：聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、壳聚糖、甲基纤维素、海藻酸钠、木质素，优选为聚乙烯醇、甲基纤维素、海藻酸钠；
所述酶激活剂选自以下一种或多种：柠檬醛、谷胱甘肽、乙二胺四乙酸；优选为柠檬醛；
所述液体扩散控制剂选自以下一种或多种：聚乙二醇200、聚乙二醇600、聚乙烯醇；优选为聚乙二醇200；和/或
所述酶稳定剂为牛血清白蛋白。
根据本发明第一方面的缩短唾液葡萄糖检测时间的试纸条，其中，所述过氧化物酶选自以下一种或多种：辣根过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶、具有过氧化物酶功能的纳米酶，所述纳米酶包括但不限于：金纳米颗粒纳米酶、Fe3O4纳米颗粒纳米酶、Co3O4纳米颗粒纳米酶、CuO纳米颗粒纳米酶。
根据本发明第一方面的缩短唾液葡萄糖检测时间的试纸条，其中，所述非酶激活剂的质量浓度为10mg/L～100mg/L，优选为10mg/L～50mg/L，进一步优选为10mg/L～30mg/L，更优选为20mg/L。
本发明的第二方面提供了第一方面所述的缩短唾液葡萄糖检测时间的试纸条的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将酶试剂注入到培养皿中，再依次加入包括酶、显色剂以及非酶激活剂的各原料，混匀；
(2)向步骤(1)中加入明胶，浸泡试纸并烘干；
(3)涂覆保护膜材料并烘干，即得到所述试纸条。
根据本发明第二方面的制备方法，其中，步骤(1)中，所述原料包括葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、维生素C氧化酶、显色剂2，4，6-三溴-3-羟基苯甲酸和4-氨基安替比林、显色促进剂、PH调节剂、非酶激活剂、液体扩散控制剂和/或酶激活剂和酶稳定剂；
优选地，所述葡萄糖氧化酶的浓度为700～1300U，更优选为800～1200U，进一步优选为900～1100U，最优选为1000U；
优选地，所述过氧化物酶的浓度为1100～1900U，更优选为1200～1800U，进一步优选为1400～1600U，最优选为1500U；
优选地，所述维生素C氧化酶的浓度为10～40U，更优选为10～30U，进一步优选为15～25U，最优选为20U；
优选地，所述2，4，6-三溴-3-羟基苯甲酸的添加量为20～60mg，更优选为30～60mg，进一步优选为40～60mg，最优选为50mg；
优选地，所述4-氨基安替比林的添加量为100～350mg，更优选为100～300mg，进一步优选为100～200mg，最优选为150mg；
优选地，所述显色促进剂的质量分数为0.001-0.05％，最优选为0.02％；
优选地，所述pH调节剂的体积分数为1-5％，最优选为3％；
优选地，所述液体扩散控制剂的添加量为0.1～3mL，更优选为0.1～2mL，进一步优选为0.1～1mL，最优选为0.5mL；
优选地，所述酶激活剂的添加量为为1～15μL，更优选为1～12μL，进一步优选为1～8μL，最优选为5μL；和/或
优选地，所述酶稳定剂的添加量为10～250mg，更优选为10～200mg，进一步优选为10～100mg，最优选为50mg。
根据本发明第二方面的制备方法，其中，步骤(2)中，明胶的制备方法如下：向明胶中加入蒸馏水，浸泡过夜，使用前煮沸；
优选地，步骤(2)中加入明胶的量为0.1～3mL，更优选为0.1～2mL，进一步优选为0.5～2mL，最优选为1mL；和/或
优选地，明胶溶液的浓度为0.1～0.6g/mL，优选为0.1～0.5g/mL，更优选为0.1～0.4g/mL，进一步优选为0.2～0.4g/mL，最优选为0.3g/mL。
根据本发明第二方面的制备方法，其中，步骤(2)中，
所述滤纸的浸泡时间为20～30小时，优选为20～25小时，最优选为24小时；
所述烘干温度为20～35℃，优选为25～35℃，最优选为30℃；和/或
所述烘干时间为10～60分钟，优选为20～50分钟，最优选为30分钟。
根据本发明第二方面的制备方法，其中，步骤(3)中，
所述涂覆保护膜的溶液质量分数为0.5％～5％，优选为0.5％～4％，更优选为0.5％～3％，进一步优选为0.5％～2％，最优选为1％；
优选地，试纸浸泡时间为30s-30min，更优选为1-20min，进一步优选为1-10min，更进一步优选为1-5min，最优选为2min；和/或
优选地，所述烘干温度为20～35℃，优选为25～35℃，最优选为30℃。
本发明的第三方面提供了一种缩短唾液葡萄糖检测时间的检测方法，所述方法包括使用第一方面所述的试纸条或按照第二方面所述方法制备的试纸条进行唾液葡萄糖的检测。
本发明涉及一款用于快速检测唾液中葡萄糖含量的试纸条，重点在于加入非酶类物质缩短测试时间。所合成的唾液糖试纸对于糖尿病和口腔疾病的早期预防、初步判断、治疗等均具有重要的临床意义。
本发明的工作原理：在葡萄糖氧化酶的催化作用下，样品中的葡萄糖与氧气反应生成过氧化氢，然后在过氧化物酶的作用下，过氧化氢与显色剂反应生成肉眼可见的红色亚胺物质。通过在试纸外层涂覆保护膜，可以延长试纸的保存时间。
根据本发明一个具体的实施方案，本发明提供了一种缩短唾液葡萄糖检测时间的试纸条及其制备方法，具体步骤如下：
用移液枪取5mL酶试剂注入培养皿中，向培养皿中依次添加1000U葡萄糖氧化酶，1500U辣根过氧化物酶，20U维生素C氧化酶，500μL聚乙二醇-200，500μL 0.02％壳聚糖溶液(壳聚糖溶解于3％的醋酸水溶液中)，5μL柠檬醛，20mg/L非酶激活剂(4-氯间苯二酚和3，5-二氯-2-羟基苯磺酸钠)，50mg牛血清白蛋白，50mg 2，4，6-三溴-3-羟基苯甲酸，150mg 4-氨基安替比林混匀，然后再加入1mL明胶(3g明胶加入10mL蒸馏水，浸泡过夜，使用前煮沸)；滤纸的浸泡时间为24小时，再30℃烘干30分钟。配置质量分数为1％的聚乙烯醇，将上述试纸浸于聚乙烯醇溶液中2分钟后取出，30℃烘干。
本发明的缩短唾液葡萄糖检测时间的试纸条可以具有但不限于以下有益效果：
1、本发明的缩短唾液葡萄糖检测时间的试纸条通过采用非酶类物质，显著增加了酶促反应速率，使其由原来30-50s完成测定缩短为5s显色完全，同时保持了酶法测糖特异性较高、条件温和等优点。
2.本发明通过在试纸外层涂覆保护膜，可以延长试纸的保存时间。
3、本发明所合成的可以缩短唾液葡萄糖检测时间的试纸条对于糖尿病和口腔疾病的早期预防、初步判断、治疗等均具有重要的临床意义。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1示出了试验例1中不同时间加入不同浓度葡萄糖溶液的试纸条颜色对比图。
图2示出了试验例1中当萄糖浓度为20mg/L时RGB强度与反应时间的关系。
图3示出了对比例1中未加入非酶激活剂与加入非酶激活剂的试纸条5s时颜色对比图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。
以下实施例中使用的材料、试剂和仪器如下：
材料：
滤纸Whatman 3号，购自Whatman公司。
试剂：
酶试剂(血糖测定试剂盒，应用型，编号1003)，购自保定长城临床试剂有限公司；葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶、聚乙二醇-200、4-氨基安替比林、2，4，6-三溴-3-羟基苯甲酸、柠檬醛购自Macklin公司；牛血清白蛋白购自北京克尔慧科技有限公司；明胶购自Sigma公司；维生素C氧化酶购自上海源叶生物科技有限公司；聚乙烯醇购自上海迈瑞尔化学技术有限公司；壳聚糖(95％)购自山东澳康生物科技有限公司；醋酸，购自Macklin公司；4-氯间苯二酚，购自Macklin公司；3，5-二氯-2-羟基苯磺酸钠，购自Macklin公司。
实施例1
本实施例用于说明本发明的缩短唾液葡萄糖检测时间的试纸条的制备方法。
本发明的制备方法依次包括以下步骤：
(1)配置试纸条浸泡液：用移液枪取5mL酶试剂注入培养皿中，向培养皿中依次添加1000U葡萄糖氧化酶，1500U辣根过氧化物酶，20U维生素C氧化酶，500μL聚乙二醇-200，500μL质量分数为0.02％壳聚糖溶液，体积分数为3％的醋酸水溶液、5μL柠檬醛，100μL非酶激活剂(配置1000mg/L 4-氯间苯二酚和3，5-二氯-2-羟基苯磺酸钠混合溶液)，50mg牛血清白蛋白，50mg 2，4，6-三溴-3-羟基苯甲酸，150mg 4-氨基安替比林混匀，然后再加入1mL明胶(3g明胶加入10mL蒸馏水，浸泡过夜，使用前煮沸)。
(2)配置保护膜浸泡液：配置质量分数为1％的聚乙烯醇。
(3)浸泡烘干：将滤纸裁剪成4cm*4cm的正方形，浸入步骤(1)配制的试纸条浸泡液中室温浸泡24小时，再30℃烘干30分钟。
(4)保护膜的涂覆：将上述试纸浸于聚乙烯醇溶液中2分钟后取出，30℃烘干，最后将滤纸裁剪成合适大小即得所述试纸条。
试验例1
本试验例用于说明前述实施例1制得的缩短唾液葡萄糖检测时间的试纸条对唾液葡萄糖的检验效果。
具体步骤如下：
(1)利用唾液采集管(Salivette)采集受试者的空腹唾液。混合唾液是将几组人的唾液混合到一起，经离子色谱测试，混合唾液几乎没有葡萄糖。
(2)向混合唾液中加入葡萄糖，配置成20mg/L葡萄糖溶液，其中“0”点是加入人工唾液作为对比。采用实施例1制备的试纸条对其进行检测。
从图1可以看出，5s时，裸眼就可以较清晰地观察到葡萄糖浓度在20mg/L时试纸的颜色。同时，本发明人研究了RGB强度与反应时间的关系。从图2可以看出，当葡萄糖浓度为20mg/L时，随着反应时间的延长，RGB强度基本保持不变，证明在5s时，样本中的葡萄糖基本反应完全。
对比例1
本试验例用于说明前述实施例1制得的缩短唾液葡萄糖检测时间的试纸条对唾液葡萄糖的检验效果。
本对比例分两组按照实施例1所述的方法制备试纸条，区别仅在于第一组中各试纸条为未加入非酶激活剂；第二组中各试纸条为加入非酶激活剂。
采用试验例1所述的方法对对比例1制备的试纸条进行测试，第一组未加入非酶激活剂，第二组加入非酶激活剂，结果如图3所示。
图3示出了对比例1中未加入非酶激活剂与加入非酶激活剂的试纸条5s时颜色对比图。具体地：
由图3可以看出，无非酶激活剂时，在5s时试纸无法显色。而当添加非酶激活剂时，5s时可以看出试纸呈红色。表明非酶活性剂可以加速试纸的显色反应。
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。
Claims (10)
1.一种缩短唾液葡萄糖检测时间的试纸条，其特征在于，所述试纸条包括酶、显色剂、显色促进剂、PH调节剂、非酶激活剂、涂覆在所述试纸上的保护膜、酶激活剂、液体扩散控制剂和/或酶稳定剂；其中：
所述非酶激活剂优选选自以下一种或多种：卤代间苯二酚、羟基苯磺酸钠或其盐、吐温20、苯甲酸、苯酚，更优选为卤代间苯二酚和/或羟基苯磺酸钠或其盐；
所述卤代间苯二酚优选选自以下一种或多种：4-氯间苯二酚、4-溴间苯二酚、5-碘间苯二酚、5-氟间苯二酚，更优选为4-氯间苯二酚、4-溴间苯二酚、5-碘间苯二酚，最优选为4-氯间苯二酚；
所述羟基苯磺酸钠或其盐优选选自以下一种或多种：3，5-二氯-2-羟基苯磺酸钠、3-醛基-4-羟基苯磺酸钠、对羟基苯磺酸钠，更优选为3，5-二氯-2-羟基苯磺酸钠、对羟基苯磺酸钠，最优选为3，5-二氯-2-羟基苯磺酸钠；和/或
所述试纸条的显色响应时间优选为1s～20s，进一步优选为1s～15s，更优选为1s～10s，最优选为5s。
2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，
所述酶包括葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、维生素C氧化酶；
所述显色剂选自以下一种或多种：2，4，6-三溴-3-羟基苯甲酸、4-氨基安替比林、2,4-二氯苯酚、3,3',5,5'-四甲基联苯胺，优选为2，4，6-三溴-3-羟基苯甲酸、4-氨基安替比林；
所述显色促进剂选自以下一种或多种：壳聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、杂多糖、纤维素和聚乙烯醇，优选为壳聚糖；
所述pH调节剂选自以下的一种或多种：盐酸、磷酸、醋酸、硫酸，优选为醋酸；
所述涂覆在试纸上的保护膜选自以下一种或多种材料：聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、壳聚糖、甲基纤维素、海藻酸钠、木质素，优选为聚乙烯醇、甲基纤维素、海藻酸钠；
所述酶激活剂选自以下一种或多种：柠檬醛、谷胱甘肽、乙二胺四乙酸；优选为柠檬醛；
所述液体扩散控制剂选自以下一种或多种：聚乙二醇200、聚乙二醇600、聚乙烯醇；优选为聚乙二醇200；和/或
所述酶稳定剂为牛血清白蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的试纸条，其特征在于，所述过氧化物酶选自以下一种或多种：辣根过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶、具有过氧化物酶功能的纳米酶，所述纳米酶包括但不限于：金纳米颗粒纳米酶、Fe3O4纳米颗粒纳米酶、Co3O4纳米颗粒纳米酶、CuO纳米颗粒纳米酶。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的试纸条，其特征在于，所述非酶激活剂的质量浓度为10mg/L～100mg/L，优选为10mg/L～50mg/L，进一步优选为10mg/L～30mg/L，更优选为20mg/L。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的缩短唾液葡萄糖检测时间的试纸条的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将酶试剂注入到培养皿中，再依次加入包括酶、显色剂以及非酶激活剂的各原料，混匀；
(2)向步骤(1)中加入明胶，浸泡试纸并烘干；
(3)涂覆保护膜材料并烘干，即得到所述试纸条。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述原料包括葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、维生素C氧化酶、显色剂2，4，6-三溴-3-羟基苯甲酸和4-氨基安替比林、显色促进剂、PH调节剂、非酶激活剂、液体扩散控制剂和/或酶激活剂和酶稳定剂；
优选地，所述葡萄糖氧化酶的浓度为700～1300U，更优选为800～1200U，进一步优选为900～1100U，最优选为1000U；
优选地，所述过氧化物酶的浓度为1100～1900U，更优选为1200～1800U，进一步优选为1400～1600U，最优选为1500U；
优选地，所述维生素C氧化酶的浓度为10～40U，更优选为10～30U，进一步优选为15～25U，最优选为20U；
优选地，所述2，4，6-三溴-3-羟基苯甲酸的添加量为20～60mg，更优选为30～60mg，进一步优选为40～60mg，最优选为50mg；
优选地，所述4-氨基安替比林的添加量为100～350mg，更优选为100～300mg，进一步优选为100～200mg，最优选为150mg；
优选地，所述显色促进剂的质量分数为0.001-0.05％，最优选为0.02％；
优选地，所述pH调节剂的体积分数为1-5％，最优选为3％；
优选地，所述液体扩散控制剂的添加量为0.1～3mL，更优选为0.1～2mL，进一步优选为0.1～1mL，最优选为0.5mL；
优选地，所述酶激活剂的添加量为为1～15μL，更优选为1～12μL，进一步优选为1～8μL，最优选为5μL；和/或
优选地，所述酶稳定剂的添加量为10～250mg，更优选为10～200mg，进一步优选为10～100mg，最优选为50mg。
7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，明胶的制备方法如下：向明胶中加入蒸馏水，浸泡过夜，使用前煮沸；
优选地，步骤(2)中加入明胶的量为0.1～3mL，更优选为0.1～2mL，进一步优选为0.5～2mL，最优选为1mL；和/或
优选地，明胶溶液的浓度为0.1～0.6g/mL，优选为0.1～0.5g/mL，更优选为0.1～0.4g/mL，进一步优选为0.2～0.4g/mL，最优选为0.3g/mL。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，
所述滤纸的浸泡时间为20～30小时，优选为20～25小时，最优选为24小时；
所述烘干温度为20～35℃，优选为25～35℃，最优选为30℃；和/或
所述烘干时间为10～60分钟，优选为20～50分钟，最优选为30分钟。
9.根据权利要求5至8中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，
所述涂覆保护膜的溶液质量分数为0.5％～5％，优选为0.5％～4％，更优选为0.5％～3％，进一步优选为0.5％～2％，最优选为1％；
优选地，试纸浸泡时间为30s-30min，更优选为1-20min，进一步优选为1-10min，更进一步优选为1-5min，最优选为2min；和/或
优选地，所述烘干温度为20～35℃，优选为25～35℃，最优选为30℃。
10.一种缩短唾液葡萄糖检测时间的检测方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1至4中任一项所述的试纸条或根据权利要求5至9中任一项所述方法制备的试纸条进行唾液葡萄糖的检测。
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|---|---|---|---|---|
| CN117783103A (zh) * | 2023-12-28 | 2024-03-29 | 无锡嘉润诊断技术有限公司 | 一种高灵敏度钙定性检测试纸条及其制作方法 |
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2021
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