CN115677862A - 多特异性单域抗体嵌合抗原受体及t细胞衔接体及其用途 - Google Patents

多特异性单域抗体嵌合抗原受体及t细胞衔接体及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明是关于一种多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体、核酸、其表达细胞、其用途及治疗癌症的医药组合物。多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体包含HLA‑G单域抗体嵌合抗原受体和双特异性T细胞衔接体，其中HLA‑G单域抗体嵌合抗原受体包含HLA‑G单域抗体单元、跨膜域和CD3z信息传递域，双特异性T细胞衔接体包含PD‑L1单域抗体单元和CD3e单域抗体。多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体可诱导肿瘤细胞死亡且具有优异的抑制肿瘤生长的效果，藉此，可用于制备诱导哺乳类动物的肿瘤细胞死亡的药物以及作为治疗癌症的医药组合物。

Description

多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体及其用途
【技术领域】
本发明是有关于一种含有抗原或抗体的医药制品，特别是一种多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体(Tcell engager)、核酸、其表达细胞、治疗癌症的医药组合物以及多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体表达细胞的用途。
【背景技术】
常规的肿瘤治疗方法包括手术治疗、放射线治疗、化学治疗及标靶治疗等。肿瘤免疫疗法为上述治疗方法以外的另一种治疗肿瘤的方法，系通过激活患者自身免疫系统，利用肿瘤细胞或肿瘤抗原物质诱导机体的特异性细胞免疫和体液免疫反应，增强机体的抗癌能力，阻止肿瘤的生长、扩散和复发，以达到清除或控制肿瘤的目的。
近年来免疫系统在治疗癌症的角色越来越受到重视，目前主要的肿瘤免疫疗法包含两大类，一种为免疫检查点阻断疗法，通过阻断免疫检查点的活化来恢复自身T细胞对肿瘤细胞的攻击力；另一种为嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)，通过对T细胞进行基因修饰以提高其对肿瘤细胞的抗原辨识和杀伤能力。此外，另一种新的免疫疗法-双特异性T细胞衔接体(bispecific Tcell engager,BiTE)也值得关注，BiTE是一种由2种单株抗体的单链可变结构域(single-chain fragment variables,scFvs)组成的抗体分子，其具有2个分子钩，可分别特异性地辨识靶细胞表面的抗原和T细胞表面的CD3分子，因此可同时激活T细胞并辨识癌细胞。
根据肿瘤的存在方式，可以分为实体瘤和非实体瘤。实体瘤临床上常有明确的肿块，主要应用以外科为主的综合治疗；而非实体瘤大多为血液系统恶性肿瘤，通常表现为无明确的肿块，以化疗为主。目前应用于临床上CAR免疫细胞和BiTE的肿瘤免疫疗法在血液系统恶性肿瘤方面治疗比较有效，但对实体肿瘤的作用有限，肿瘤相关靶点蛋白的选择对治疗效果非常关键，是以如何提高CAR免疫细胞或BiTE在实体瘤中的治疗效果是值得研究的问题。
【发明内容】
本发明的目的是在提供一种多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体、核酸、多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体表达细胞、其用途以及治疗癌症的医药组合物。所述多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体包含与肿瘤细胞具有优异的特异性结合能力的HLA-G单域抗体嵌合抗原受体，以及可以特异性辨识T细胞表面的CD3分子以及肿瘤细胞表面的PD-L1的双特异性T细胞衔接体。所述核酸编码所述多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体。所述多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体表达细胞包含所述核酸，其表达所述多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体，可以特异性的靶向肿瘤细胞，避免脱靶效应，并可以同时激活的T细胞并阻断免疫检查点活化，进而有效地毒杀肿瘤细胞，是以可用于制备诱导哺乳类动物的肿瘤细胞死亡的药物。而所述治疗癌症的医药组合物包含所述多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体表达细胞，可有效地毒杀肿瘤细胞进而治疗癌症。
本发明的一方面的一实施方式是提供一种多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体，其从N端至C端依序包含HLA-G单域抗体嵌合抗原受体和双特异性T细胞衔接体。HLA-G单域抗体嵌合抗原受体包含HLA-G单域抗体单元、跨膜域和CD3z信息传递域。HLA-G单域抗体单元与人类白细胞抗原G(humanleukocyte antigen G,HLA-G)特异性结合，而HLA-G单域抗体单元包含至少一HLA-G单域抗体，且至少一HLA-G单域抗体的氨基酸序列如SEQ IDNO:1及/或SEQ ID NO:2所示。跨膜域的氨基酸序列如SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:23或SEQ ID NO:29所示，CD3z信息传递域的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示。双特异性T细胞衔接体连接于HLA-G单域抗体嵌合抗原受体的C端，且包含PD-L1单域抗体单元和CD3e单域抗体。PD-L1单域抗体单元与程式性死亡-配体1(programmed death-ligand 1,PD-L1)特异性结合，PD-L1单域抗体单元包含至少一PD-L1单域抗体，且至少一PD-L1单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:5及/或SEQ ID NO:6所示。CD3e单域抗体与CD3e分子特异性结合，且CD3e单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
依据前述的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体，可更包含第一信号肽，其连接于HLA-G单域抗体嵌合抗原受体的N端，且第一信号肽的氨基酸序列如SEQ IDNO:11所示。
依据前述的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体，可更包含CD8铰链区，其串接HLA-G单域抗体单元和跨膜域。
依据前述的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体，可更包含P2A肽，其串接HLA-G单域抗体嵌合抗原受体和双特异性T细胞衔接体。
依据前述的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体，可更包含第二信号肽，其连接于双特异性T细胞衔接体的N端，且第二信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示。
依据前述的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体，其中HLA-G单域抗体单元可阻断HLA-G与HLA-G受体的相互作用及/或结合。
依据前述的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体，其中HLA-G受体可为KIR2DL4及/或LILRB1。
依据前述的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体，其中PD-L1单域抗体单元可阻断PD-L1与PD-L1受体的相互作用及/或结合。
依据前述的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体，其中PD-L1受体可为细胞程式性死亡蛋白-1(programmed cell death protein-1,PD-1)。
依据前述的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体，其中CD3e单域抗体可激活及/或招募T细胞。
本发明的一方面的另一实施方式是提供一种核酸，其系编码如前段所述的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体，所述核酸从5’端至3’端依序包含编码HLA-G单域抗体嵌合抗原受体片段和编码双特异性T细胞衔接体片段。编码HLA-G单域抗体嵌合抗原受体片段包含编码HLA-G单域抗体单元片段、编码跨膜域片段和编码CD3z信息传递域片段。编码HLA-G单域抗体单元片段包含至少一编码HLA-G单域抗体片段，且至少一编码HLA-G单域抗体片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:3及/或SEQ ID NO:4所示。编码跨膜域片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:30所示，编码CD3z信息传递域片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示。编码双特异性T细胞衔接体片段连接于编码HLA-G单域抗体嵌合抗原受体片段的3’端，且包含编码PD-L1单域抗体单元片段和编码CD3e单域抗体片段。编码PD-L1单域抗体单元片段包含至少一编码PD-L1单域抗体片段，且至少一编码PD-L1单域抗体片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:7及/或SEQ ID NO:8所示。编码CD3e单域抗体片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。
本发明的一方面的又一实施方式是提供一种多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体表达细胞，其包含一免疫细胞以及如前段所述的核酸，其中多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体表达细胞为将所述核酸转染至所述免疫细胞而得。
依据前述的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体表达细胞，其中免疫细胞可为自然杀伤细胞或γδT细胞。
本发明的一方面的又一实施方式是提供一种治疗癌症的医药组合物，包含如前段所述的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体表达细胞以及医药上可接受载剂(carrier)。
本发明的另一方面的一实施方式是提供一种如前段所述的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体表达细胞的用途，其系用于制备诱导哺乳类动物的肿瘤细胞死亡的药物。
上述发明内容旨在提供本揭示内容的简化摘要，以使阅读者对本揭示内容具备基本的理解。此发明内容并非本揭示内容的完整概述，且其用意并非在指出本发明实施例的重要/关键元件或界定本发明的范围。
【附图说明】
为让本发明的上述和其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，附图的说明如下：
图1系绘示本发明的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体的结构及作用机制示意图；
图2A和图2B系绘示本发明的核酸的构建示意图；
图3A和图3B为本发明的HLA-G单域抗体的结合亲和力的分析结果图；
图4为本发明的HLA-G单域抗体的LILRB1阻断活性的分析结果图；
图5为本发明的HLA-G单域抗体的KIR2DL4阻断活性的分析结果图；
图6A和图6B为本发明的HLA-G单域抗体增强自然杀伤(NK)细胞介导的细胞毒性对MDA-MB-231细胞影响的分析结果图；
图7为本发明的PD-L1单域抗体的PD-L1/PD-1生物阻断活性的分析结果图；
图8A和图8B为本发明的PD-L1单域抗体的结合亲和力的分析结果图；
图9为本发明的PD-L1单域抗体增强γδT细胞介导的细胞毒性对MDA-MB-231细胞影响的分析结果图；
图10为本发明的CD3e单域抗体对周边血液单核细胞(PBMC)和γδT细胞中CD3+T细胞增殖影响的分析结果图；
图11系绘示本发明的核酸及比较例的核酸的构建示意图；
图12A和图12B为本发明的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体表达细胞表达HLA-G单域抗体嵌合抗原受体的分析结果图；
图13A、图13B、图14A、图14B、图15A、图15B、图16A、图16B和图17为本发明的实施例4的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体表达细胞对肿瘤细胞特异性裂解的分析结果图；
图18系绘示本发明的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体表达细胞分泌多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体的作用机制示意图；
图19为本发明的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体表达细胞分泌双特异性T细胞衔接体的分析结果图；
图20A、图20B和图20C为本发明的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体表达细胞的条件培养基增强PBMC诱导的细胞毒性对多形性胶质母细胞瘤细胞影响的分析结果图；
图21A系绘示本发明的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体表达细胞于动物治疗试验策略的示意图；以及
图21B、图21C和图21D为本发明的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体表达细胞对于肿瘤小鼠的肿瘤生长抑制影响的分析结果图。
【具体实施方式】
本说明书揭露内容提出一种多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体、编码所述多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体的核酸、包含所述核酸的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体表达细胞、其用途以及包含多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体表达细胞的治疗癌症的医药组合物。说明书以肿瘤细胞的细胞试验，证明本发明的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体可以增强免疫细胞对于肿瘤细胞的细胞毒性，因而可使表达本发明的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体表达细胞对于肿瘤细胞具有优异的特异性裂解能力。说明书中亦以动物试验证明本发明的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体表达细胞具有优异的抑制肿瘤生长效果，是以可用于制备诱导哺乳类动物的肿瘤细胞死亡的药物。而所述本发明的治疗癌症的医药组合物，包含本发明的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体表达细胞，可有效地毒杀肿瘤细胞进而治疗癌症。
本说明书中所述的「单域抗体(single domain antibody,sdAb)」是指缺失抗体轻链而只有重链可变区的一类抗体。因为完整抗体包含2条免疫球蛋白轻链和2条重链，完整抗体的分子量大约150-160kDa。相比之下单域抗体的分子量大约只有12-15kDa，因单域抗体的分子量小，也被称为纳米抗体(nanobody)。单域抗体虽然结构简单，但仍然可以达到与完整抗体相当甚至更高的特异抗原结合亲和力。
本说明书中所述的「人类白细胞抗原G(human leukocyte antigen G,HLA-G)」是由HLA-G基因所编码，为非典型第一类主要组织相容性复合体(major histocompatibilitycomplex,MHC)，重链大约45kDa。HLA-G在胎儿来源的胎盘细胞上表达，在免疫应答的负调节中十分活跃，其主要作用在于抑制细胞毒性免疫细胞功能。
本说明书中所述的「程式性死亡-配体1(programmed death-ligand 1,PD-L1)」是大小为40kDa的第一型跨膜蛋白，是由CD274基因编码，PD-L1可与其受体-细胞程式性死亡蛋白-1(programmed cell death protein-1,PD-1)结合。目前研究发现，肿瘤细胞表面的PD-L1表达增加可与免疫细胞上的PD-1结合，抑制宿主免疫细胞失去功能导致细胞凋亡，藉此可使肿瘤细胞逃过免疫监控。
本说明书中所述的「CD3e分子(又称为CD3E)」是一种T细胞表面的第一型跨膜蛋白，是由CD3E基因所编码，CD3e分子在T细胞发育中起重要作用。CD3e分子与CD3γ、CD3δ和CD3ζ以及T细胞受体α/β和γ/δ异二聚体一起形成T细胞受体-CD3复合物。CD3复合物在将抗原识别与几种细胞内信号转导途径偶联中起重要作用。
兹以下列具体试验例进一步示范说明本发明，用以有利于本发明所属技术领域通常知识者，可在不需过度解读的情形下完整利用并实践本发明，而不应将这些试验例视为对本发明范围的限制，但用于说明如何实施本发明的材料及方法。
一、本发明的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体以及核酸
1.1.多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体
请参照图1，绘示本发明的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体的结构及作用机制示意图。本发明的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体，其从N端至C端依序包含HLA-G单域抗体嵌合抗原受体和双特异性T细胞衔接体。
HLA-G单域抗体嵌合抗原受体包含HLA-G单域抗体单元、跨膜域和CD3z信息传递域。HLA-G单域抗体单元与HLA-G特异性结合，而HLA-G单域抗体单元包含至少一HLA-G单域抗体，且至少一HLA-G单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1及/或SEQ ID NO:2所示。跨膜域的氨基酸序列如SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:29所示，CD3z信息传递域的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示。HLA-G单域抗体嵌合抗原受体可组成的肿瘤靶向受体复合物，使本发明的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体与肿瘤细胞表面上特异性识别的人类白细胞抗原G结合后触发信号转导，产生信号级联导致本发明的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体表达细胞的活化和增殖，进而引发溶解颗粒的胞吐作用并杀死标靶的肿瘤细胞。
于HLA-G单域抗体嵌合抗原受体的N端可更包含第一信号肽，其氨基酸序列如SEQID NO:11所示。而HLA-G单域抗体嵌合抗原受体可更包含CD8铰链区，串接HLA-G单域抗体单元和跨膜域，CD8铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示。
双特异性T细胞衔接体连接于HLA-G单域抗体嵌合抗原受体的C端，且包含PD-L1单域抗体单元和CD3e单域抗体。PD-L1单域抗体单元与PD-L1特异性结合，PD-L1单域抗体单元包含至少一PD-L1单域抗体，且至少一PD-L1单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:5及/或SEQ ID NO:6所示。CD3e单域抗体与CD3e分子特异性结合，且CD3e单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
于双特异性T细胞衔接体的N端可更包含第二信号肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示。此外，本发明的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体可更包含P2A肽，其串接HLA-G单域抗体嵌合抗原受体和双特异性T细胞衔接体，P2A肽的氨基酸序列如SEQ IDNO:27所示。P2A肽可使经表达后的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体于HLA-G单域抗体嵌合抗原受体和双特异性T细胞衔接体进行自切割，进而剪切双特异性T细胞衔接体，并将其分泌于细胞外。
1.2.核酸
本发明的核酸，其系编码如前段所述的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体，所述核酸从5’端至3’端依序包含编码HLA-G单域抗体嵌合抗原受体片段和编码双特异性T细胞衔接体片段。
编码HLA-G单域抗体嵌合抗原受体片段包含编码HLA-G单域抗体单元片段、编码跨膜域片段和编码CD3z信息传递域片段。编码HLA-G单域抗体单元片段包含至少一编码HLA-G单域抗体片段，且至少一编码HLA-G单域抗体片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:3及/或SEQID NO:4所示。编码跨膜域片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:30所示，编码CD3z信息传递域片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示。
于编码HLA-G单域抗体嵌合抗原受体片段的5’端可更包含编码第一信号肽片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。而编码HLA-G单域抗体嵌合抗原受体片段可更包含编码CD8铰链区片段，串接编码HLA-G单域抗体单元片段和编码跨膜域片段，编码CD8铰链区片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。
编码双特异性T细胞衔接体片段连接于编码HLA-G单域抗体嵌合抗原受体片段的3’端，且包含编码PD-L1单域抗体单元片段和编码CD 3e单域抗体片段。编码PD-L1单域抗体单元片段包含至少一编码PD-L1单域抗体片段，且至少一编码PD-L1单域抗体片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:7及/或SEQ ID NO:8所示。编码CD3e单域抗体片段的核苷酸序列如SEQID NO:10所示。
于编码双特异性T细胞衔接体片段的5’端可更包含编码第二信号肽片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示。本发明的核酸可更包含编码P2A肽片段，其串接编码HLA-G单域抗体嵌合抗原受体片段和编码双特异性T细胞衔接体片段，编码P2A肽片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示。
请参照图2A和图2B，图2A为本发明的实施例1的核酸的构建示意图，其为利用体外转录(in vitro transcription,IVT)mRNA技术进行构建；图2B为本发明的实施例2的核酸的构建示意图，其为利用慢病毒载体进行构建。其中图2A和图2B中的标示为其编码后的蛋白质。
于实施例1的核酸和实施例2的核酸，编码第一信号肽片段的核苷酸序列如SEQ IDNO:12所示，编码HLA-G单域抗体单元片段中包含2个编码HLA-G单域抗体片段，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3(HLA-G Nb#1)和SEQ ID NO:4(HLA-G Nb#109)所示，编码跨膜域片段为SEQ ID NO:30所示的编码4-1BB/TYK片段，编码CD3z信息传递域片段的核苷酸序列如SEQID NO:26所示。编码第二信号肽片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示，编码PD-L1单域抗体单元片段包含2个编码PD-L1单域抗体片段，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:8(PD-L1Nb#15)和SEQ ID NO:7(PD-L1 Nb#3)所示，编码CD3e单域抗体片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。于实施例1和实施例2中的G-S接头(linker)的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。此外，本发明的核酸可依据构建的系统选择5’端的启动子。于实施例1的核酸，其启动子可为T7启动子，而实施例2的核酸，其启动子可为EF-1a启动子。
1.3.HLA-G单域抗体
试验上先制备HLA-G单域抗体，再以表面电浆共振(surface plasmon resonance,SPR)分析进行动力学分析和其与HLA-G重组蛋白(Origene,CAT#:TP305216)的结合亲和力分析。于本试验例中所制备的HLA-G单域抗体包含如SEQ ID NO:1(HLA-G Nb#1)及SEQ IDNO:2(HLA-G Nb#109)所示的HLA-G单域抗体。
请参照图3A、图3B和下表一，图3A为HLA-G Nb#1的结合亲和力的分析结果图，图3B为HLA-G Nb#109的结合亲和力的分析结果图，表一为HLA-G Nb#1(表中简称#1)和HLA-GNb#109(表中简称#109)的动力学分析结果。
表一
Figure BDA0003670448520000131
由图3A、图3B和表一的结果显示，本发明的HLA-G单域抗体与HLA-G具有优异的结合亲和力，其中HLA-G Nb#1的KD可达0.11nM，HLA-G Nb#109的KD可达2.6nM。
试验上进一步测试本发明的HLA-G单域抗体是否可以阻断HLA-G与HLA-G受体的相互作用及/或结合，试验上测试的HLA-G受体为KIR2DL4和LILRB1，所使用的HLA-G单域抗体为HLA-G Nb#1，并通过竞争性ELISA测试HLA-G Nb#1是否能阻断生物素化的KIR2DL4(SinoBiological,CAT#:13052-H02S)和生物素化的LILRB1(Sino Biological,CAT#:16014-H08H)与HLA-G重组蛋白(Origene,CAT#:TP305216)的相互作用及/或结合。试验上另包含市售的HLA-G单株抗体(87G,Thermo Fisher)做为对照组。
请参照图4和图5，图4为本发明的HLA-G单域抗体的LILRB1阻断活性的分析结果图，图5为本发明的HLA-G单域抗体的KIR2DL4阻断活性的分析结果图。图4的结果显示，87G对于LILRB1阻断活性的IC50为大于1μM，而HLA-G Nb#1对于LILRB1阻断活性的IC50约为70nM。图5的结果显示，87G对于KIR2DL4阻断活性的IC50约为104nM，而HLA-G Nb#1对于KIR2DL4阻断活性的IC50约为22nM。上述结果显示本发明的HLA-G单域抗体具有优异的阻断HLA-G与LILRB1/KIR2DL4相互作用和结合的能力。
试验上另测试本发明的HLA-G单域抗体增强自然杀伤(NK)细胞介导的细胞毒性对肿瘤细胞的影响。于本试验中进行测试的肿瘤细胞为MDA-MB-231细胞，测试的HLA-G单域抗体为HLA-G Nb#1和HLA-G Nb#109。试验上将细胞密度为1×105个/孔的MDA-MB-231细胞接种于12孔盘中，培养隔夜后，将3×105个/孔或5×105个/孔的初代NK细胞加到含有MDA-MB-231细胞的孔中，再分别加入1mg/ml的HLA-G Nb#1及/或HLA-G Nb#109，或是10mg/ml的87G，48小时后，利用流式细胞术进行LIVE/DEAD细胞介导的细胞毒性测定，来确定初代NK细胞对MDA-MB-231细胞的特异性裂解。
请参照图6A和图6B，为本发明的HLA-G单域抗体增强自然杀伤(NK)细胞介导的细胞毒性对MDA-MB-231细胞影响的分析结果图，于图6B中，*表示p<0.05，**表示p<0.01。图6A的结果显示，单独处理HLA-G Nb#1或HLA-G Nb#109的组别与未处理的组别相比，本发明的HLA-G单域抗体皆可增强初代NK细胞对MDA-MB-231细胞的特异性裂解，而同时处理HLA-GNb#1和HLA-G Nb#109的组别，更能增强初代NK细胞对MDA-MB-231细胞的特异性裂解。图6B的结果显示，处理HLA-G Nb#1或HLA-G Nb#109的组别与未处理的组别相比，本发明的HLA-G单域抗体增强初代NK细胞对MDA-MB-231细胞的特异性裂解具有统计上的显著差异(p<0.01)，而与HLA-G单株抗体-87G相比，在换算成相同抗体浓度下，本发明的HLA-G单域抗体更能增强初代NK细胞对MDA-MB-231细胞的特异性裂解。
1.4.PD-L1单域抗体
试验上先制备PD-L1单域抗体，再测试本发明的PD-L1单域抗体是否可阻断PD-L1与PD-L1受体的相互作用及/或结合。于本试验例中所制备的PD-L1单域抗体包含如SEQ IDNO:5(PD-L1 Nb#3)和SEQ ID NO:6(PD-L1 Nb#15)所示的PD-L1单域抗体。
阻断测试为利用PD-1/PD-L1 Blockade Bioassay试剂盒(Promega)进行测试，所使用的PD-L1单域抗体为PD-L1 Nb#3和PD-L1 Nb#15，测试的PD-L1受体为PD-1。试验上将细胞密度为1×104个/孔的PD-L1 aAPC/CHO-K1细胞接种于96孔盘中，培养隔夜后，将1×104个/孔的PD-1效应细胞加到含有PD-L1 aAPC/CHO-K1细胞的孔中，再分别加入不同浓度的PD-L1 Nb#3、PD-L1 Nb#15或阿替利珠单抗(atezolizumab)，6小时后，加入Bio-GloTM试剂并使用Glo
Figure BDA0003670448520000161
Discover系统测量发光。并利用Sigmaplot软体将数据绘制4PL曲线。其中阿替利珠单抗为市售的PD-L1单株抗体，用以作为对照组。
请参照图7，为本发明的PD-L1单域抗体的PD-L1/PD-1生物阻断活性的分析结果图。结果显示，阿替利珠单抗对于PD-1阻断活性的IC50约为41nM，而PD-L1 Nb#15对于PD-1阻断活性的IC50约为0.48nM，PD-L1 Nb#3对于PD-1阻断活性的IC50约为37.7nM。显示本发明的PD-L1单域抗体具有优异的阻断PD-L1与PD-1相互作用和结合的能力。
试验上再以SPR分析进行本发明的PD-L1单域抗体的动力学分析和其与PD-L1重组蛋白(Sino Biological,CAT#:10084-H05H)的结合亲和力分析。请参照图8A、图8B和下表二，为本发明的PD-L1单域抗体的结合亲和力的分析结果图。图8A为PD-L1 Nb#15的结合亲和力的分析结果图，图8B为PD-L1 Nb#3的结合亲和力的分析结果图，表二为PD-L1 Nb#15(表中简称#15)和PD-L1 Nb#3(表中简称#3)的动力学分析结果。
表二
K<sub>on</sub>(1/Ms) K<sub>off</sub>(1/s) K<sub>D</sub>(nM) R<sub>max</sub>(RU) Chi<sup>2</sup>
#15 1.03E+6 9.361E-4 0.91 317.3 33.0
#3 6.045E+6 5.21E-3 0.86 331.9 7.65
由图8A、图8B和表二的结果显示，本发明的PD-L1单域抗体与PD-L1具有优异的结合亲和力，其中PD-L1 Nb#15的KD可达0.91nM，PD-L1 Nb#3的KD可达0.86nM。
试验上另测试本发明的PD-L1单域抗体增强γδT细胞介导的细胞毒性对肿瘤细胞的影响。于本试验中进行测试的肿瘤细胞为MDA-MB-231细胞，测试的PD-L1单域抗体为PD-L1 Nb#15和PD-L1 Nb#3。试验上将细胞密度为1×105个/孔的MDA-MB-231细胞接种于12孔盘中，培养隔夜后，将3×105个/孔的初代γδT细胞加到含有MDA-MB-231细胞的孔中，再分别加入1mg/ml的PD-L1 Nb#15或PD-L1 Nb#3，或是10mg/ml的阿替利珠单抗，48小时后，利用流式细胞术进行LIVE/DEAD细胞介导的细胞毒性测定，来确定初代γδT细胞对MDA-MB-231细胞的特异性裂解。
请参照图9，为本发明的PD-L1单域抗体增强γδT细胞介导的细胞毒性对MDA-MB-231细胞影响的分析结果图，其中*表示p<0.05。结果显示，处理PD-L1Nb#15或PD-L1 Nb#3的组别与未处理的组别相比，本发明的PD-L1单域抗体增强初代γδT细胞对MA-MB-231细胞的特异性裂解具有统计上的显著差异(p<0.05)，而与阿替利珠单抗相比，在换算成相同抗体浓度下，本发明的PD-L1单域抗体更能增强初代γδT细胞对MDA-MB-231细胞的特异性裂解。
1.5.CD3e单域抗体
试验上先制备CD3e单域抗体，再测试本发明的CD3e单域抗体对于周边血液单核细胞(PBMC)和γδT细胞中CD3+T细胞增殖的影响，于本试验例中所制备的CD3e单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:9(CD3eNb)所示。试验上先预备涂覆1mg/ml的CD3eNb、10mg/ml的OKT3(Invitrogen,CAT#:MA1-10175)或未处理的12孔盘，其中OKT3为市售的CD3单株抗体。再将1×106个/孔的PBMC或γδT细胞分别接种于前述12孔盘中，再于每孔中加入50IU/ml的IL-2(Gibco,CAT#:PHC0021)和2mg/ml的IL-15(Sino Biological,CAT#:10360-H07E)，7天后记录总细胞数，再以偶联FITC的OKT3(eBioscience,CAT#:11-0037-42)进行染色，并以流式细胞术分析，用显微镜在40×下拍照并计算CD3阳性T细胞(CD3+T细胞)的数量，其计算方式为CD3+T细胞的百分比×总细胞数。
请参照图10，为本发明的CD3e单域抗体对PBMC和γδT细胞中CD3+T细胞增殖影响的分析结果图，其中*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001。结果显示，在PBMC的部分，处理本发明的CD3e单域抗体和OKT3皆可增强PBMC中CD3+T细胞的增殖，然本发明的CD3e单域抗体不论是与未处理的组别或是处理OKT3的组别相比，其增强PBMC中CD3+T细胞增殖的效果皆具有统计上的差异(分别为p<0.001和p<0.05)。而在γδT细胞的部分，处理本发明的CD3e单域抗体和OKT3皆可增强γδT细胞中CD3+T细胞的增殖且差异具有统计上的意义(分别为p<0.001和p<0.01)，且本发明的CD3e单域抗体与处理OKT3的组别相比，其增强效果更加显著。综上所述，本发明的CD3e单域抗体具有优异地增强PBMC和γδT细胞中CD3+T细胞增殖的能力。
二、本发明的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体表达细胞、其用途以及治疗癌症的医药组合物
请参照图11，系绘示本发明的实施例的核酸及比较例的核酸的构建示意，其中的标示为其编码后的蛋白质。其中实施例1的核酸(以下简称实施例1)为利用IVTmRNA技术进行构建，实施例2的核酸(以下简称实施例2)为利用慢病毒载体进行构建，而构建细节如前所述，在此不在赘述。而比较例1的核酸为利用IVT mRNA技术进行构建的HLA-G单域抗体嵌合抗原受体，其不包含靶向PD-L1和CD3e的双特异性T细胞衔接体。比较例1的核酸中编码第一信号肽片段为SEQ ID NO:12所示的编码CD8a信号肽片段，编码HLA-G单域抗体单元片段中包含2个编码HLA-G单域抗体片段，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3(HLA-G Nb#1)和SEQID NO:4(HLA-G Nb#109)所示，编码跨膜域片段为SEQ ID NO:30所示的编码4-1BB/TYK片段，编码CD3z信息传递域片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示。
试验上分别将2μg的实施例1的核酸或比较例1的核酸电穿孔至1×106个γδT细胞中，以得到实施例3的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体表达细胞(以下简称实施例3)和比较例2的HLA-G单域抗体嵌合抗原受体表达细胞(以下简称比较例2)。此外，利用慢病毒将实施例2的核酸转导至γδT细胞中，以得到实施例4的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体表达细胞(以下简称实施例4)。再将1×106个比较例2、实施例3、实施例4和亲代γδT细胞(以下简称为亲代细胞)以iFluor 647偶联的抗VHH抗体(GenScript)进行染色。再用含有1％BSA的PBS洗涤两次后，以流式细胞术并使用亲代细胞作为背景对照，测定比较例2、实施例3和实施例4在第1天至第7天每天的HLA-G单域抗体嵌合抗原受体的表达状况，以确定实施例1和实施例2在γδT细胞中的转导率。
本发明的治疗癌症的医药组合物包含本发明的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体表达细胞。较佳地，所述治疗癌症的医药组合物可更包含另一治疗癌症的制剂，例如化疗药物、靶向治疗药物、抗体药物、免疫调节剂或其组合。
请参照图12A和图12B，为比较例2、实施例3和实施例4表达HLA-G单域抗体嵌合抗原受体的分析结果图，其中图12A为第1天至第4天的分析结果图，图12B为第5天至第7天的分析结果图。图12A和图12B的结果显示，比较例2在第1天的HLA-G单域抗体嵌合抗原受体的表达量最高，可达59.8％，但表达量逐日递减，在第7天的表达量仅剩13.5％。实施例3的HLA-G单域抗体嵌合抗原受体的表达量也是在第1天最高，可达56.1％，表达量也是逐日递减，但在第7天的表达量仍有26.1％。而实施例4在第1天的HLA-G单域抗体嵌合抗原受体仅有10.3％，但逐日递增至第6天的表达量最高，可达74％，至第7天降至54.8％的表达量。上述结果显示本发明的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体表达细胞可以稳定表达转导于其中的HLA-G单域抗体嵌合抗原受体。
试验上进一步测试本发明的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体表达细胞对肿瘤细胞的细胞毒性。于此试验中所使用的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体表达细胞为实施例4，所测试的细胞包含三阴性乳腺癌(Triple-negative breastcancer,TNBC)细胞、多形性胶质母细胞瘤细胞、肺癌细胞、卵巢癌细胞和胰腺癌细胞，其中TNBC细胞包含MDA-MB-231细胞和MDA-MB-231HLA-Gov细胞，多形性胶质母细胞瘤细胞包含GBM-8901细胞和DBTRG-05MG细胞，肺癌细胞包含A549细胞和H1975细胞，卵巢癌细胞包含SKOV3细胞和SKOV3HLA-Gov细胞，胰腺癌细胞为AsPC1细胞。其中MDA-MB-231 HLA-Gov细胞为稳定过表达HLA-G的MDA-MB-231细胞株，SKOV3 HLA-Gov细胞为稳定过表达HLA-G的SKOV3细胞株，其系利用Lipofectamine 3000(Invitrogen)分别将可编码HLA-G的pCMV1质粒转染至MDA-MB-231细胞株和SKOV3细胞株中而得到的细胞株。
试验上将实施例4或亲代细胞作为效应细胞，在37℃下以效应细胞/肿瘤细胞(E:T)比例为1:1、2:1、3:1、6:1和10:1的条件下，将效应细胞和肿瘤细胞共培养。所有肿瘤细胞在共培养前，以带有绿色萤光的钙黄绿素-AM染色，在共培养48小时后以带有红色萤光的碘化丙啶染色，并利用流式细胞术进行LIVE/DEAD细胞介导的细胞毒性测定，来确定实施例4对肿瘤细胞的特异性裂解。
请参照图13A至图17，为本发明的实施例4对肿瘤细胞特异性裂解的分析结果图，其中图13A和图13B分析的肿瘤细胞为MDA-MB-231细胞和MDA-MB-231HLA-Gov细胞，图14A和图14B分析的肿瘤细胞为GBM-8901细胞和DBTRG-05MG细胞，图15A和图15B分析的肿瘤细胞为A549细胞和H1975细胞，图16A和图16B分析的肿瘤细胞为SKOV3细胞和SKOV3 HLA-Gov细胞，图17分析的肿瘤细胞为AsPC1细胞。图13A至图17中，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001。
由图13A和图13B的结果显示，与亲代细胞相比，实施例4在E:T比例为1:1、2:1、3:1、6:1和10:1的条件下皆可增强其对于MDA-MB-231细胞和MDA-MB-231 HLA-Gov细胞的特异性裂解，且差异具有统计上的意义。图14A和图14B的结果显示，与亲代细胞相比，实施例4在E:T比例为1:1、2:1、3:1、6:1和10:1的条件下皆可增强其对于GBM-8901细胞和DBTRG-05MG细胞的特异性裂解，且差异具有统计上的意义。图15A和图15B的结果显示，与亲代细胞相比，实施例4在E:T比例为1:1、2:1、3:1、6:1和10:1的条件下皆可增强其对于A549细胞和H1975细胞的特异性裂解，且差异具有统计上的意义。图16A和图16B的结果显示，与亲代细胞相比，实施例4在E:T比例为1:1、2:1、3:1、6:1和10:1的条件下皆可增强其对于SKOV3细胞和SKOV3 HLA-Gov细胞的特异性裂解，且差异具有统计上的意义。图17的结果显示，与亲代细胞相比，实施例4在E:T比例为1:1、2:1、3:1、6:1和10:1的条件下皆可增强其对于AsPC1细胞的特异性裂解，且差异具有统计上的意义。上述结果显示，本发明的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体表达细胞对于不论是TNBC细胞、多形性胶质母细胞瘤细胞、肺癌细胞、卵巢癌细胞或胰腺癌细胞皆具有优异的细胞毒杀作用。
请参照图18及图1，图18系绘示本发明的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体表达细胞分泌多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体的作用机制示意图。因本发明的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体于HLA-G单域抗体嵌合抗原受体和双特异性T细胞衔接体之间具有P2A肽可进行自切割，是以当多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体表达细胞表达多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体后，可剪切双特异性T细胞衔接体，并将其分泌于细胞外。
为测试本发明的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体表达细胞中双特异性T细胞衔接体的分泌状况，试验上将亲代细胞、实施例3或实施例4与MDA-MB-231细胞以E:T比例为3:1接种于涂覆PD-L1的12孔盘中，在共培养48小时后，以抗CD3的抗体检测双特异性T细胞衔接体的分泌量。
请参照图19，为本发明的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体表达细胞分泌双特异性T细胞衔接体的分析结果图。结果显示，与共培养前的数据相比不论是实施例3或是实施例4，在与MDA-MB-231细胞共培养后，皆能使双特异性T细胞衔接体的分泌量增加，显示本发明的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体表达细胞所分泌双特异性T细胞衔接体是可检测的。
本试验进一步利用细胞不可穿透的transwell膜(孔径为0.4μm)评估本发明的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体表达细胞所释放的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体对于肿瘤细胞的细胞毒杀作用。试验上将效应细胞(PBMC)和/或肿瘤细胞(GBM-8901细胞或DBTRG-05MG)以E:T比例为5:1接种于12孔盘的底部，然后在含有或不含细胞不可穿透的transwell膜的上部空间加入5×105的实施例3、亲代细胞或比较例2。并在指定的时间点，并对底部细胞进行LIVE/DEAD细胞介导的细胞毒性测定，再通过流式细胞术进行分析。
请参照图20A、图20B和图20C，为实施例3、亲代细胞或比较例2的条件培养基增强PBMC诱导的细胞毒性对多形性胶质母细胞瘤细胞影响的分析结果图，其中图20A为显微照片图，图20B和图20C为图20A的统计结果图，且*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001。图20A和图20B的结果显示，与未处理的空白对照组相比，亲代细胞、比较例2和实施例3的条件培养基皆能增强PBMC诱导的细胞毒性，进而引发对于GBM-8901细胞的特异性裂解，但实施例3的条件培养基所增强的PBMC诱导的细胞毒性显著地优于其他组别，不论是和亲代细胞或比较例2相比，差异皆具有统计上的意义(分别为p<0.001和p<0.05)。而图20A和图20C的结果显示，与未处理的空白对照组相比，亲代细胞、比较例2和实施例3的条件培养基皆能增强PBMC诱导的细胞毒性，进而引发对于DBTRG-05MG细胞的特异性裂解，但实施例3的条件培养基所增强的PBMC诱导的细胞毒性显著地优于其他组别，不论是和亲代细胞或比较例2相比，差异皆具有统计上的意义(分别为p<0.05和p<0.05)。上述结果显示，本发明的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体表达细胞确实可分泌双特异性T细胞衔接体至细胞培养基中，进而增强效应细胞对于肿瘤细胞的细胞毒性而引发特异性裂解。
进一步地，为测试本发明的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体表达细胞是否具有治疗癌症的功效，请参照图21A，系绘示本发明的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体表达细胞于动物治疗试验策略的示意图。在试验前10天(第-10天)先建立原位异种移植乳腺肿瘤PBMC-huNGS小鼠模型，系于雌性NGS小鼠的左侧第4乳腺皮下注射1×106个MDA-MB-231-luc细胞，植入7天后(第-3天)，以尾静脉注射注射5×106个huPBMC细胞至NGS小鼠中，以建立完成原位异种移植乳腺肿瘤PBMC-huNGS小鼠模型(以下简称为肿瘤小鼠)。再3天后(第0天)开始进行治疗，治疗方式为以尾静脉注射1×107个亲代细胞或实施例4至肿瘤小鼠中，并于每周追加注射1次1×107个亲代细胞或实施例4至肿瘤小鼠中，追加次数为3次(第7天、第14天和第21天)。肿瘤小鼠在治疗过程中，每周使用活体影像系统(IVIS Spectrum,PerkinElmer)进行监测肿瘤的生长情况，监测时间点为第0天、第7天、第14天、第21天、第28天、第35天、第42天、第49天、第56天、第63天、第70天、第77天和第84天。此外，肿瘤小鼠的存活率系以Kaplan-Meier存活曲线进行分析。
请参照图21B、图21C和图21D，为本发明的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体表达细胞对于肿瘤小鼠的肿瘤生长抑制影响的分析结果图。其中图21B为IVIS的影像图，照片下的号码为肿瘤小鼠在试验组别中的编号。图21C为各组肿瘤小鼠于各监测时间点的生物发光量，生物发光量与肿瘤的大小成正比。图21D为各组肿瘤小鼠的Kaplan-Meier存活曲线图。
结果显示，未经治疗的肿瘤小鼠(以下简称载体组)的肿瘤于第0天开始逐渐生长，并在第63天全数的载体组肿瘤小鼠(n＝6)皆已死亡。以亲代细胞治疗的肿瘤小鼠(以下简称亲代细胞组)与载体组相比，其肿瘤的生长速度虽然较慢，但从第0天开始肿瘤的大小也随着时间增加，并在第81天全数的亲代细胞组肿瘤小鼠(n＝6)皆已死亡。而以实施例4治疗的肿瘤小鼠(以下简称实施例4组)，其肿瘤大小被控制，甚至6只实施例4组中的2只肿瘤小鼠在第84天未增测到肿瘤残留的信号，而其中1只的存活天数可以延长至第128天。上述结果显示，本发明的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体表达细胞能增加肿瘤抑制的效果，并有效延长原位异种移植乳腺肿瘤PBMC-huNGS小鼠的生存时间。
综上所述，本发明的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体，特别是与肿瘤细胞的细胞膜上所表达的HLA-G特异性结合，因而可使表达本发明的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体表达细胞特异性的靶向肿瘤细胞，避免脱靶效应。此外，本发明的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体可以特异性辨识T细胞表面的CD3分子以及肿瘤细胞表面的PD-L1的双特异性T细胞衔接体，并可以同时激活的T细胞并阻断免疫检查点活化，进而有效地毒杀肿瘤细胞，是以可用于制备诱导哺乳类动物的肿瘤细胞死亡的药物。本发明的治疗癌症的医药组合物，包含本发明的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体表达细胞，可有效地毒杀肿瘤细胞进而治疗癌症。并经由实验数据证实，本发明的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体表达细胞在动物模型上具有优异抑制肿瘤进展的效果，具有运用于生医保健市场的潜能。
然本发明已以实施方式揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的权利要求所界定者为准。
序列表
<110> 长圣国际生技股份有限公司
<120> 多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体及其用途
<130> CP-5346-CN
<160> 30
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HLA-G Nb #1
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Asp Ala Ser Lys Tyr Thr Tyr Phe Arg Asn
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Ala Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Thr Ile Asp Ser Ala Gly Gly Thr Ser Tyr Ala Asp Phe Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Ala Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Phe
85 90 95
Gly Gly Ser Trp Tyr Lys Gly Ser Cys Ile Tyr Glu Tyr Asn Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Val Asp
115 120
<210> 2
<211> 154
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HLA-G Nb #109
<400> 2
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
1 5 10 15
Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Asp Ala
35 40 45
Ser Lys Tyr Thr Tyr Phe Arg Asn Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Val
50 55 60
Pro Gly Ala Glu Arg Glu Gly Val Ala Thr Ile Asp Ser Ala Gly Gly
65 70 75 80
Thr Ser Tyr Ala Asp Phe Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
85 90 95
Asn Ala Lys Thr Ala Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu
100 105 110
Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Phe Gly Gly Ser Trp Tyr Lys Gly Ser
115 120 125
Cys Ile Tyr Glu Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
130 135 140
Ser Ser Leu Glu His His His His His His
145 150
<210> 3
<211> 408
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码HLA-G Nb #1片段
<400> 3
atgggaagat ctgagctcga agttcagctg gttgaaagtg gtggcggtag cgtgcaggca 60
ggtggtagcc tgcgcctgag ttgtgatgcc agtaaatata cctacttccg taattgtatg 120
ggttggttcc gtcaggttcc gggcgccgaa cgcgaaggtg ttgcaaccat tgatagtgca 180
ggcggcacca gttatgccga cttcgttaaa ggtcgcttca ccattagccg tgataatgcc 240
aaaaccgcac tgtatctgca gatgaatagt ctgaaaccgg aagataccgc aatgtattat 300
tgcttcggcg gcagttggta taaaggtagc tgtatctatg aatataacta ctggggtcag 360
ggtacccagg tgaccgttag cagcgtcgac catcatcatc atcatcat 408
<210> 4
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码HLA-G Nb #109片段
<400> 4
atgggcgaag tgcagctggt tgaaagcggt ggtggcagcg ttcaggcagg tggcagtctg 60
cgcctgagtt gcgatgccag taaatatacc tacttccgca attgtatggg ctggttccgt 120
caggtgccgg gcgccgaacg cgaaggtgtg gcaaccattg atagcgccgg tggtaccagc 180
tatgccgact tcgtgaaagg tcgcttcacc attagccgcg ataatgccaa aaccgcactg 240
tatctgcaga tgaatagcct gaaaccggaa gataccgcca tgtattattg cttcggcggc 300
agctggtata aaggcagctg catctatgaa tataattatt ggggccaggg cacccaggtg 360
accgttagta gtctcgag 378
<210> 5
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD-L1 Nb #3
<400> 5
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ile
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Leu Asn Pro Val Gly Ser His Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu His
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gln Arg Gly Tyr Thr Cys Ser Gly Asp Leu Cys Glu Arg Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 6
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD-L1 Nb #15
<400> 6
His Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Lys
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Asn Ser Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Cys Ser Asp Ile Tyr Cys Gly Gly Gln Tyr Thr Tyr Arg Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 7
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码PD-L1 Nb #3片段
<400> 7
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgtag cctctggatt caccttcagt agcattggca tgagttgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctcgagtg ggtctcaggt ctgaatcctg ttggtagtca cacaggctat 180
gcagactccg taaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa tacgctgcat 240
ctgcagttga acagcctgaa aactgaggac acggccatgt attactgtca aagaggttat 300
acttgtagcg gtgatttgtg cgaaaggggt caggggaccc aggtcactgt ctcctca 357
<210> 8
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码PD-L1 Nb #15片段
<400> 8
catgtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agcaaggcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gactcgactg ggtctcaacc attaatagtg gtggtggtaa cacatactat 180
tcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaattga acagcctgaa aactgaggac acggccatgt attactgttc ccgttgtagc 300
gatatttact gcggagggca atatacgtat cggggccagg ggaccctggt cactgtctcc 360
tca 363
<210> 9
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3e Nb
<400> 9
His Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Val Ser Gly Val Ile Phe Lys Asn Glu
20 25 30
Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Ala Ala Ser Pro Gly Gly Thr Ile Thr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Arg Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Leu Asp Pro Ser Thr Thr Ser Trp Ser Ile Ile Arg His Gly Pro
100 105 110
Ser Leu Trp Arg Tyr Ser Gly Arg Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 10
<211> 384
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码CD3e Nb片段
<400> 10
catgtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tcggtgcagg ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtacag tgtctggagt catctttaag aacgagtaca tgggctggtt ccgccaggcc 120
ccagggaagg agcgcgaggg ggtcgcagca gcttcgcctg gtggaacgat tacatactat 180
ggggactccg tgaagggccg attcaccatc tcccgagaca atgccaagaa cacggtgtat 240
ctgcaaatga accgcctgaa acctgaggac actgccatgt actactgtgc gttggatccc 300
tcgactacgt catggtctat catccgccac ggtccatcgc tttggcgtta tagcggccgg 360
gggacccagg tcaccgtctc ctca 384
<210> 11
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第一信号肽
<400> 11
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 12
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码第一信号肽片段
<400> 12
atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60
ccc 63
<210> 13
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> G-S接头
<400> 13
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 14
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码G-S接头片段
<400> 14
ggaggcggag gttctggagg cggaggttct ggaggcggag gttct 45
<210> 15
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第二信号肽
<400> 15
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser
20
<210> 16
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码第二信号肽
<400> 16
atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacaaacagt 60
<210> 17
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8铰链区
<400> 17
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
35 40 45
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
50 55 60
Ile Thr Leu Tyr Cys
65
<210> 18
<211> 207
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码CD8铰链区片段
<400> 18
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgatatcta catttgggcc cctctggctg gtacttgcgg ggtcctgctg 180
ctttcactcg tgatcactct ttactgt 207
<210> 19
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IFNAR1 /4-1BB
<400> 19
Lys Val Phe Leu Arg Cys Ile Asn Tyr Val Phe Phe Pro Ser Leu Lys
1 5 10 15
Pro Ser Ser Ser Ile Asp Glu Tyr Phe Ser Glu Gln Pro Leu Lys Asn
20 25 30
Leu Leu Leu Ser Thr Ser Glu Glu Gln Ile Glu Arg Cys Phe Ile Ile
35 40 45
Glu Asn Ile Ser Thr Ile Ala Thr Val Glu Glu Thr Asn Gln Thr Pro
50 55 60
Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu
65 70 75 80
Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Asp Glu Asp His Lys Lys Tyr Ser
85 90 95
Ser Gln Thr Ser Gln Asp Ser Gly Asn Tyr Ser Asn Glu Asp Glu Ser
100 105 110
Glu Ser Lys Thr Ser Glu Glu Leu Gln Leu Val Leu Asp Ser
115 120 125
<210> 20
<211> 377
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码IFNAR1 /4-1BB片段
<400> 20
aagtcttctt gagatgcatc aattatgtct tctttccatc acttaaacct tcttccagta 60
tagatgagta tttctctgaa cagccattga agaatcttct gctttcaact tctgaggaac 120
aaatcgaaag atgtttcata attgaaaata taagcacaat tgctacagta gaagaaacta 180
atcaaactcc agtacaaact actcaagagg aagatggctg tagctgccga tttccagaag 240
aagaagaagg aggatgtgaa ctggatgaag atcataaaaa atacagttcc caaactagcc 300
aagattcagg aaattattct aatgaagatg aaagcgaaag taaaacaagt gaagaactac 360
agctggtctt ggactcc 377
<210> 21
<211> 170
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Myd88/CD40
<400> 21
Met Ala Ala Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Ala Ala Pro Val Ser Ser
1 5 10 15
Thr Ser Ser Leu Pro Leu Ala Ala Leu Asn Met Arg Val Arg Arg Arg
20 25 30
Leu Ser Leu Phe Leu Asn Val Arg Thr Gln Val Ala Ala Asp Trp Thr
35 40 45
Ala Leu Ala Glu Glu Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn Lys Ala
50 55 60
Pro His Pro Lys Met Asp Phe Glu Tyr Leu Glu Ile Arg Gln Leu Glu
65 70 75 80
Thr Gln Ala Asp Pro Thr Gly Arg Leu Leu Asp Ala Trp Gln Gly Arg
85 90 95
Pro Gly Ala Ser Val Gly Arg Leu Leu Glu Leu Leu Thr Lys Leu Gly
100 105 110
Cys Asp Asp Val Leu Leu Glu Leu Gly Pro Ser Ile Glu Glu Asp Cys
115 120 125
Gln Lys Tyr Ile Leu Lys Gln Gln Gln Glu Glu Ala Glu Lys Pro Leu
130 135 140
Gln Val Ala Ala Val Asp Ser Ser Val Pro Arg Thr Ala Glu Leu Ala
145 150 155 160
Gly Ile Thr Thr Leu Asp Asp Pro Leu Gly
165 170
<210> 22
<211> 510
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码Myd88/CD40片段
<400> 22
atggctgcag gaggtcccgg cgcggggtct gcggccccgg tctcctccac atcctccctt 60
cccctggctg ctctcaacat gcgagtgcgg cgccgcctgt ctctgttctt gaacgtgcgg 120
acacaggtgg cggccgactg gaccgcgctg gcggaggaga aaaaggtggc caagaagcca 180
accaataagg ccccccaccc caagatggac tttgagtact tggagatccg gcaactggag 240
acacaagcgg accccactgg caggctgctg gacgcctggc agggacgccc tggcgcctct 300
gtaggccgac tgctcgagct gcttaccaag ctgggctgcg acgacgtgct gctggagctg 360
ggacccagca ttgaggagga ttgccaaaag tatatcttga agcagcagca ggaggaggct 420
gagaagcctt tacaggtggc cgctgtagac agcagtgtcc cacggacagc agagctggcg 480
ggcatcacca cacttgatga ccccctgggg 510
<210> 23
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Myd88/IFNAR1
<400> 23
Met Ala Ala Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Ala Ala Pro Val Ser Ser
1 5 10 15
Thr Ser Ser Leu Pro Leu Ala Ala Leu Asn Met Arg Val Arg Arg Arg
20 25 30
Leu Ser Leu Phe Leu Asn Val Arg Thr Gln Val Ala Ala Asp Trp Thr
35 40 45
Ala Leu Ala Glu Glu Lys Val Phe Leu Arg Cys Ile Asn Tyr Val Phe
50 55 60
Phe Pro Ser Leu Lys Pro Ser Ser Ser Ile Asp Glu Tyr Phe Ser Glu
65 70 75 80
Gln Pro Leu Lys Asn Leu Leu Leu Ser Thr Ser Glu Glu Gln Ile Glu
85 90 95
Arg Cys Phe Ile Ile Glu Asn Ile Ser Thr Ile Ala Thr Val Glu Glu
100 105 110
Thr Asn Gln Thr Met Asp Phe Glu Tyr Leu Glu Ile Arg Gln Leu Glu
115 120 125
Thr Gln Ala Asp Pro Thr Gly Arg Leu Leu Asp Ala Trp Gln Gly Arg
130 135 140
Pro Gly Ala Ser Val Gly Arg Leu Leu Glu Leu Leu Thr Lys Leu Gly
145 150 155 160
Cys Asp Asp Val Leu Leu Glu Leu Gly Pro Ser Ile Glu Glu Asp Cys
165 170 175
Gln Lys Tyr Ile Leu Lys Gln Gln Gln Glu Glu Ala Glu Lys Pro Leu
180 185 190
Gln Val Ala Ala Val Asp Ser Ser Val Pro Arg Thr Ala Glu Leu Ala
195 200 205
Gly Ile Thr Thr Leu Asp Asp Pro Leu Gly
210 215
<210> 24
<211> 654
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码Myd88/IFNAR1片段
<400> 24
atggctgcag gaggtcccgg cgcggggtct gcggccccgg tctcctccac atcctccctt 60
cccctggctg ctctcaacat gcgagtgcgg cgccgcctgt ctctgttctt gaacgtgcgg 120
acacaggtgg cggccgactg gaccgcgctg gcggaggaga aagtcttctt gagatgcatc 180
aattatgtct tctttccatc acttaaacct tcttccagta tagatgagta tttctctgaa 240
cagccattga agaatcttct gctttcaact tctgaggaac aaatcgaaag atgtttcata 300
attgaaaata taagcacaat tgctacagta gaagaaacta atcaaactat ggactttgag 360
tacttggaga tccggcaact ggagacacaa gcggacccca ctggcaggct gctggacgcc 420
tggcagggac gccctggcgc ctctgtaggc cgactgctcg agctgcttac caagctgggc 480
tgcgacgacg tgctgctgga gctgggaccc agcattgagg aggattgcca aaagtatatc 540
ttgaagcagc agcaggagga ggctgagaag cctttacagg tggccgctgt agacagcagt 600
gtcccacgga cagcagagct ggcgggcatc accacacttg atgaccccct gggg 654
<210> 25
<211> 145
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3z信息传递域
<400> 25
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
50 55 60
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
65 70 75 80
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
85 90 95
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Tyr Phe Leu Arg
100 105 110
Lys Gln Arg Ile Thr Glu Thr Glu Ser Pro Tyr Gln Glu Leu Gln Gly
115 120 125
Gln Arg Ser Asp Val Tyr Ser Asp Leu Asn Thr Gln Ala Leu Pro Pro
130 135 140
Arg
145
<210> 26
<211> 435
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码CD3z信息传递域片段
<400> 26
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgcag agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 180
aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 240
cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 300
acctacgacg cccttcacat gcagtacttc ctgcggaaac agcgtatcac tgagaccgag 360
tcgccttatc aggagctcca gggtcagagg tcggatgtct acagcgacct caacacacag 420
gccctgcccc ctcgc 435
<210> 27
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2A肽
<400> 27
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 28
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码P2A肽片段
<400> 28
gccacaaatt tcagcctgct gaaacaggcc ggcgacgtgg aagagaaccc tggacct 57
<210> 29
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BB/TYK
<400> 29
Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu
1 5 10 15
Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys
20 25 30
Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Lys Val Phe Leu
35 40 45
Arg Cys Ile Asn Tyr Val Phe Phe Pro Ser Leu Lys Pro Ser Ser Ser
50 55 60
Ile Asp Glu Tyr Phe Ser Glu Gln Pro Leu Lys Asn Leu Leu Leu Ser
65 70 75 80
Thr Ser Glu Glu Gln Ile Glu Arg Cys Phe Ile Ile Glu Asn Ile Ser
85 90 95
Thr Ile Ala Thr Val Glu Glu Thr Asn Gln Thr Pro Val Gln Thr Thr
100 105 110
Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly
115 120 125
Gly Cys Glu Leu
130
<210> 30
<211> 396
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码4-1BB/TYK片段
<400> 30
atcatctcct tctttcttgc gctgacgtcg actgcgttgc tcttcctgct gttcttcctc 60
acgctccgtt tctctgttgt taaacggggc agaaagaaac tcctgtatat attcaaacaa 120
ccatttatga gaaaagtctt cttgagatgc atcaattatg tcttctttcc atcacttaaa 180
ccttcttcca gtatagatga gtatttctct gaacagccat tgaagaatct tctgctttca 240
acttctgagg aacaaatcga aagatgtttc ataattgaaa atataagcac aattgctaca 300
gtagaagaaa ctaatcaaac tccagtacaa actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc 360
cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt gaactg 396

Claims (15)

1.一种多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体，其特征在于，从N端至C端依序包含：
一HLA-G单域抗体嵌合抗原受体，包含：
一HLA-G单域抗体单元，其与人类白细胞抗原G(HLA-G)特异性结合，该HLA-G单域抗体单元包含至少一HLA-G单域抗体，且该至少一HLA-G单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1及/或SEQ ID NO:2所示；及
一跨膜域，该跨膜域的氨基酸序列如SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:29所示；
一CD3z信息传递域，该CD3z信息传递域的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示；以及
一双特异性T细胞衔接体，连接于该HLA-G单域抗体嵌合抗原受体的C端，该双特异性T细胞衔接体包含；
一PD-L1单域抗体单元，其与程式性死亡-配体1(PD-L1)特异性结合，该PD-L1单域抗体单元包含至少一PD-L1单域抗体，且该至少一PD-L1单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:5及/或SEQ ID NO:6所示；及
一CD3e单域抗体，其与CD3e分子特异性结合，该CD3e单域抗体的氨基酸序列如SEQ IDNO:9所示。
2.如权利要求1所述的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体，其特征在于，更包含一第一信号肽，该第一信号肽连接于该HLA-G单域抗体嵌合抗原受体的N端，且该第一信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。
3.如权利要求1所述的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体，其特征在于，更包含一CD8铰链区，该CD8铰链区串接该HLA-G单域抗体单元和该跨膜域。
4.如权利要求1所述的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体，其特征在于，更包含一P2A肽，该P2A肽串接该HLA-G单域抗体嵌合抗原受体和该双特异性T细胞衔接体。
5.如权利要求1所述的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体，其特征在于，更包含一第二信号肽，该第二信号肽连接于该双特异性T细胞衔接体的N端，且该第二信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示。
6.如权利要求1所述的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体，其特征在于，该HLA-G单域抗体单元阻断HLA-G与一HLA-G受体的相互作用及/或结合。
7.如权利要求6所述的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体，其特征在于，该HLA-G受体为KIR2DL4及/或LILRB1。
8.如权利要求1所述的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体，其特征在于，该PD-L1单域抗体单元阻断PD-L1与一PD-L1受体的相互作用及/或结合。
9.如权利要求8所述的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体，其特征在于，该PD-L1受体为细胞程式性死亡蛋白-1(PD-1)。
10.如权利要求1所述的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体，其特征在于，该CD3e单域抗体激活及/或招募T细胞。
11.一种核酸，其系编码如权利要求1所述的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体，其特征在于，该核酸从5’端至3’端依序包含：
一编码HLA-G单域抗体嵌合抗原受体片段，包含：
一编码HLA-G单域抗体单元片段，该编码HLA-G单域抗体单元片段包含至少一编码HLA-G单域抗体片段，且该至少一编码HLA-G单域抗体片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:3及/或SEQ ID NO:4所示；及
一编码跨膜域片段，该编码跨膜域片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:30所示；
一编码CD3z信息传递域片段，该编码CD3z信息传递域片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示；以及
一编码双特异性T细胞衔接体片段，连接于该编码HLA-G单域抗体嵌合抗原受体片段的3’端，该编码双特异性T细胞衔接体片段包含；
一编码PD-L1单域抗体单元片段，该编码PD-L1单域抗体单元片段包含至少一编码PD-L1单域抗体片段，且该至少一编码PD-L1单域抗体片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:7及/或SEQ ID NO:8所示；及
一编码CD3e单域抗体片段，该编码CD3e单域抗体片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。
12.一种多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体表达细胞，其特征在于，包含：
一免疫细胞；以及
如权利要求11所述的核酸；
其中该多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体表达细胞为将该核酸转染至该免疫细胞而得。
13.如权利要求12所述的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体表达细胞，其特征在于，该免疫细胞为自然杀伤细胞或γδT细胞。
14.一种治疗癌症的医药组合物，其特征在于，包含：
如权利要求12所述的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体表达细胞；以及
一医药上可接受载剂。
15.一种如权利要求12所述的多特异性单域抗体嵌合抗原受体及T细胞衔接体表达细胞的用途，其特征在于，系用于制备诱导哺乳类动物的一肿瘤细胞死亡的药物。
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