CN115671394A - 一种负载植物外泌体的可注射型磷酸钙骨水泥的制备及其产品和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种负载植物外泌体的可注射型磷酸钙骨水泥的制备方法及其产品和应用，利用差速离心法提取植物外泌体；利用冻干法制备骨水泥粉末，与骨水泥固化液调和后，得到负载植物外泌体的可注射型磷酸钙骨水泥。本发明可应用于不同种类的植物外泌体提取，制备方法简单，通过冻干法负载至骨水泥粉末中干法保存，可延长其活性周期。利用骨水泥靶向局部给药的特点，提高植物外泌体针对骨科肿瘤、骨科炎症的治疗效率，为临床骨科靶向药物递送系统的制备提供新思路。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物医用材料技术领域的方法，具体是制备一种负载植物外泌体的可注射型磷酸钙骨水泥的制备方法及其产品和应用。
背景技术
骨水泥是临床上常用于治疗由癌症、骨质疏松症等引起的椎体骨缺损的一种植入材料，其中磷酸钙类骨水泥以其良好的生物相容性、骨传导性、骨诱导性和生物可降解性[Apelt D, Biomaterials, 2004]，作为临床骨修复替代材料受到了很大的关注。此外，磷酸钙类骨水泥由于其制备过程有利于药物在载体材料中分散，且无需加热，便于保持药物的稳定性，被证明是一种优秀的骨科药物载体[Ginebra M P, Journal of ControlledRelease, 2006]，载药骨水泥在肿瘤治疗、消除炎症方面具有良好的临床表现。
外泌体是一种细胞分泌的微小囊泡，具有在细胞之间传递信息的功能。不同来源的外泌体在调节基因转录翻译、影响细胞增殖与凋亡、调控细胞分化和代谢等方面具有不同的功能，在抗肿瘤、抗炎等领域发挥着重要作用，近年来受到了国内外学者的广泛研究和关注。其中，植物外泌体是一种来源于植物细胞的细胞外囊泡，具有来源广泛、种类丰富、免疫原性低的特点，在疾病治疗方面具有巨大的应用潜力。
基于以上背景，本发明制备了一种负载植物外泌体的可注射型磷酸钙骨水泥，利用骨水泥靶向局部给药的特点，提高植物外泌体针对骨科肿瘤、骨科炎症的治疗效率，具有潜在应用价值。
发明内容
本发明目的在于提供一种负载植物外泌体的可注射型磷酸钙骨水泥的制备方法。
本发明的再一目的在于：提供一种上述方法制备的负载植物外泌体的可注射型磷酸钙骨水泥产品。
本发明的又一目的在于：提供一种上述产品的应用。
本发明目的通过下述方案实现：一种负载植物外泌体的可注射型磷酸钙骨水泥的制备方法，其特征在于，利用差速离心法提取植物外泌体；利用冻干法制备骨水泥粉末，与骨水泥固化液调和后，得到负载植物外泌体的可注射型磷酸钙骨水泥；包括以下步骤：
（1）取鲜嫩植物组织去皮、切成小块，以PBS为介质，在高速均质机中搅拌1分钟，抽滤获得滤液；滤液经过差速离心法提取植物外泌体，用PBS重悬后稀释至合适浓度，制备得到植物外泌体分散液；
（2）采用固相反应法将原料磷酸氢钙与碳酸钙按摩尔比2:1充分混合后，在1250-1400℃煅烧2-4h并急速冷却至室温，制备α-TCP粉末；将α-TCP粉末按1g/2mL的比例加入质量分数为0.05-0.5%的明胶水溶液，加入1-10%（v/v）外泌体分散液，混合均匀，冷冻干燥，得到骨水泥粉末；
（3）将上述骨水泥粉末，与骨水泥固化液进行调和，即可得到负载植物外泌体的可注射型磷酸钙骨水泥。
步骤（1）所述的植物组织包括但不限于生姜、拟南芥、柠檬、葡萄。
步骤（1）所述的差速离心法为滤液在2500g离心力下离心10分钟，取上清液继续在4000g离心力下离心30分钟，取上清液过0.45μm滤膜；滤液在15000g离心力下超速离心30分钟，上清液过0.22μm滤膜；滤液在120000g离心力下超速离心1.5小时两次，中间用PBS洗涤沉淀；结束后弃去上清液，加入2mL PBS重悬沉淀，在NTA计数后，稀释至1E+10颗粒/mL数量级备用，制得植物外泌体分散液。
步骤（3）所述骨水泥固化液为2.5wt%的Na2HPO4溶液，固液比为1.5-2.5g/mL。
本发明提供一种负载植物外泌体的可注射型磷酸钙骨水泥，根据上述任一所述方法制备得到。
本发明提供一种负载植物外泌体的可注射型磷酸钙骨水泥在骨科靶向药物递送系统中的应用。
利用差速离心法提取植物外泌体；制备负载植物外泌体的可注射型磷酸钙骨水泥。
本发明可应用于不同种类的植物外泌体提取，制备方法简单，通过冻干法负载至骨水泥粉末中干法保存，可延长其活性周期。利用骨水泥靶向局部给药的特点，提高植物外泌体针对骨科肿瘤、骨科炎症的治疗效率，为临床骨科靶向药物递送系统的制备提供新思路。
本发明的优点在于：
1、可应用于不同种类的植物外泌体提取，制备方法简单，通过冻干法负载至骨水泥粉末中干法保存，可延长其活性周期。
2、利用骨水泥靶向局部给药的特点，提高植物外泌体针对骨科肿瘤、骨科炎症的治疗效率。
附图说明
附图1，提取生姜外泌体分散液的纳米颗粒跟踪分析（NTA）结果。
具体实施方式
以下实施例以发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于下述的实施例。
实施例1
一种负载植物外泌体的可注射型磷酸钙骨水泥，利用差速离心法提取植物外泌体；利用冻干法制备骨水泥粉末，与骨水泥固化液调和后，得到负载植物外泌体的可注射型磷酸钙骨水泥；按以下步骤制备：
（1）取新鲜生姜500g，去皮切成小块，以PBS为介质，加入100mL PBS在高速均质机中搅拌1分钟，抽滤获得滤液；滤液在2500g离心力下离心10分钟，取上清液继续在4000g离心力下离心30分钟，取上清液过0.45μm滤膜；滤液在15000g离心力下超速离心30分钟，上清液过0.22μm滤膜；滤液在120000g离心力下超速离心1.5小时两次，中间用PBS洗涤沉淀，结束后弃去上清液，加入2mL PBS重悬沉淀，在NTA计数后（结果如附图1所示），稀释至1E+10颗粒/mL数量级备用，制得植物外泌体分散液；
（2）采用固相反应法将原料磷酸氢钙与碳酸钙按摩尔比2:1充分混合后，在1400℃煅烧4h并急速冷却至室温，制备α-TCP粉末；将α-TCP粉末20g加入40mL质量分数为0.5%的明胶水溶液，加入4mL外泌体分散液，混合均匀，冷冻干燥，得到骨水泥粉末；
（3）将上述骨水泥粉末，与2.5wt%的Na2HPO4溶液调和，得到负载植物外泌体的可注射型磷酸钙骨水泥。
实施例2
一种负载植物外泌体的可注射型磷酸钙骨水泥，与实施例1相近，其中，步骤（1）和（3）相同，按以下步骤制备：
步骤（2）中，采用固相反应法将原料磷酸氢钙与碳酸钙按摩尔比2:1充分混合后，在1250-1400℃煅烧2-4h并急速冷却至室温，制备α-TCP粉末；将α-TCP粉末20g加入40mL质量分数为0.5%的明胶水溶液，加入1mL外泌体分散液，混合均匀，冷冻干燥，得到骨水泥粉末；
（3）将上述骨水泥粉末，与2.5wt%的Na2HPO4溶液调和，得到负载植物外泌体的可注射型磷酸钙骨水泥。
实施例3
一种负载植物外泌体的可注射型磷酸钙骨水泥，与实施例1步骤相近，其中步骤（2）和（3）与实施例相同，只是步骤（1）中鲜嫩植物为新鲜拟南芥叶片，按以下步骤制备：
步骤（1）中，取拟南芥叶片制备植物外泌体分散液；
步骤（2）中，将α-TCP粉末20g加入40mL质量分数为0.5%的明胶水溶液，加入4mL外泌体分散液，混合均匀，冷冻干燥，得到骨水泥粉末；
（3）将上述骨水泥粉末，与2.5wt%的Na2HPO4溶液调和，得到负载植物外泌体的可注射型磷酸钙骨水泥。
Claims (9)
1.一种负载植物外泌体的可注射型磷酸钙骨水泥的制备方法，其特征在于，利用差速离心法提取植物外泌体；利用冻干法制备骨水泥粉末，与骨水泥固化液调和后，得到负载植物外泌体的可注射型磷酸钙骨水泥；包括以下步骤：
（1）取鲜嫩植物组织去皮、切成小块，以PBS为介质，在高速均质机中搅拌1分钟，抽滤获得滤液；滤液经过差速离心法提取植物外泌体，用PBS重悬后稀释，得到植物外泌体分散液；
（2）采用固相反应法将原料磷酸氢钙与碳酸钙按摩尔比2:1充分混合后，在1250-1400℃煅烧2-4h并急速冷却至室温，制备α-TCP粉末；将α-TCP粉末按1g/2mL的比例加入质量分数为0.05-0.5%的明胶水溶液，加入1-10%（v/v）外泌体分散液，混合均匀，冷冻干燥，得到骨水泥粉末；
（3）将上述骨水泥粉末，与骨水泥固化液进行调和，即可得到负载植物外泌体的可注射型磷酸钙骨水泥。
2.根据权利要求1所述的一种负载植物外泌体的可注射型磷酸钙骨水泥的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述的植物组织包括但不限于生姜、拟南芥、柠檬、葡萄。
3.根据权利要求1所述的一种负载植物外泌体的可注射型磷酸钙骨水泥的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述的差速离心法为滤液在2500g离心力下离心10分钟，取上清液继续在4000g离心力下离心30分钟，取上清液过0.45μm滤膜；滤液在15000g离心力下超速离心30分钟，上清液过0.22μm滤膜；滤液在120000g离心力下超速离心1.5小时两次，中间用PBS洗涤沉淀；结束后弃去上清液，加入2mL PBS重悬沉淀，在NTA计数后，稀释至1E+10颗粒/mL数量级备用，制得植物外泌体分散液。
4.根据权利要求1所述的一种负载植物外泌体的可注射型磷酸钙骨水泥的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述骨水泥固化液为2.5wt%的Na2HPO4溶液，固液比为1.5-2.5g/mL。
5.根据权利要求1至4任一项所述的一种负载植物外泌体的可注射型磷酸钙骨水泥的制备方法，其特征在于，按以下步骤制备：
（1）取新鲜生姜500g，去皮切成小块，以PBS为介质，加入100mL PBS在高速均质机中搅拌1分钟，抽滤获得滤液；滤液在2500g离心力下离心10分钟，取上清液继续在4000g离心力下离心30分钟，取上清液过0.45μm滤膜；滤液在15000g离心力下超速离心30分钟，上清液过0.22μm滤膜；滤液在120000g离心力下超速离心1.5小时两次，中间用PBS洗涤沉淀，结束后弃去上清液，加入2mL PBS重悬沉淀，在NTA计数后（结果如附图1所示），稀释至1E+10颗粒/mL数量级备用，制得植物外泌体分散液；
（2）采用固相反应法将原料磷酸氢钙与碳酸钙按摩尔比2:1充分混合后，在1400℃煅烧4h并急速冷却至室温，制备α-TCP粉末；将α-TCP粉末20g加入40mL质量分数为0.5%的明胶水溶液，加入4mL外泌体分散液，混合均匀，冷冻干燥，得到骨水泥粉末；
（3）将上述骨水泥粉末，与2.5wt%的Na2HPO4溶液调和，得到负载植物外泌体的可注射型磷酸钙骨水泥。
6.根据权利要求5所述的一种负载植物外泌体的可注射型磷酸钙骨水泥的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，采用固相反应法将原料磷酸氢钙与碳酸钙按摩尔比2:1充分混合后，在1250-1400℃煅烧2-4h并急速冷却至室温，制备α-TCP粉末；将α-TCP粉末20g加入40mL质量分数为0.5%的明胶水溶液，加入1mL外泌体分散液，混合均匀，冷冻干燥，得到骨水泥粉末。
7.根据权利要求5所述的一种负载植物外泌体的可注射型磷酸钙骨水泥的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，取拟南芥叶片制备植物外泌体分散液；
步骤（2）中，将α-TCP粉末20g加入40mL质量分数为0.5%的明胶水溶液，加入4mL外泌体分散液，混合均匀，冷冻干燥，得到骨水泥粉末。
8.一种负载植物外泌体的可注射型磷酸钙骨水泥，其特征在于，根据权利要求1-7任一所述的方法制备得到。
9.根据权利要求8所述负载植物外泌体的可注射型磷酸钙骨水泥在骨科靶向药物递送系统中的应用。
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