CN115671048A - 一种去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药制剂技术领域，具体涉及一种去甲斑蝥素脂质体‑乳剂复合体注射液制剂处方及其制备方法。本发明提供的去甲斑蝥素脂质体‑乳剂复合体注射液包括：去甲斑蝥素0.4～0.8份，表面活性剂3～7.5，助膜流动剂1～1.5份，稳定剂0.09～0.25份，油相溶媒20～30份，脂质体膜材1.5～5份，辅助乳化剂0.1～1.5份，渗透压调节剂3～7.5份，水150～200份。本发明采用上述组分在上述质量份数范围内形成了去甲斑蝥素的脂质体‑乳剂复合体注射液包封率较高，可达80％以上；此外，本发明采用过滤除菌加低温补充灭菌的方法，保证制剂在灭菌后物理化学性质稳定，灭菌稳定性好。

Description

一种去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液及其制备方法

技术领域

本发明属于医药制剂技术领域，具体涉及一种去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液及其制备方法。

背景技术

去甲斑蝥素(Norcantharidin，NCTD)是斑蝥素(Cantharidin，CTD)的去甲基化衍生物。NCTD不仅可以从中药Mylabris(西班牙苍蝇)中提取，也可以由呋喃和马来酸酐通过Diels-Alder反应合成。NCTD在治疗肿瘤方面有其独特的优势。NCTD可以通过下调NF-κB信号通路激活水平，起到细胞凋亡、抑制细胞分泌炎症因子的作用，NCTD也可以抑制肿瘤细胞增殖，升高白细胞，调节免疫反应且不产生骨髓抑制。NCTD是治疗肝癌、食管癌、胃癌和贲门癌等多种消化道癌症的首选辅助药物，其中以原发性肝癌为主。NCTD还可以改善肝功能，用于治疗肝炎、肝硬化及乙肝病毒。这些优势使NCTD有着广阔的应用前景。

目前，去甲斑蝥素主要以片剂和注射剂应用于临床。去甲斑蝥素片在临床上推荐用法用量为：口服。一次5～15mg，一日3次。去甲基斑蝥素虽然明显减轻了斑蝥素的毒性，但并未完全消除。临床使用时部分患者口服每日超过30mg时即出现不良反应，口服不良反应主要表现为恶心、呕吐、头晕等症状。现临床上应用的去甲斑蝥素注射液多为钠盐(5mg·mL^-1，2mL)，临床上推荐用法用量为：静脉注射。用5％葡萄糖注射液稀释后，缓慢静脉推注。一次10～30mg，pH约9.0，但较高的pH使去甲斑蝥素钠注射液在应用时有较大的刺激性，影响药物在临床上正常使用。

中国专利CN 200710062957.9制备了一种含有去甲斑蝥酸钠的微乳注射剂，但其载药量最高只有10μg/mL。中国专利CN 201110267058.9制备出了一种去甲基斑蝥酸钠磷脂复合物脂质微球注射液，在一定程度上降低了去甲斑蝥素酸钠对血管壁的刺激性，提高疗效。但本发明人前期进行了处方重现，并且对该专利采用的高压蒸汽灭菌(121℃/15min)进行考察：发现高温灭菌后制剂发生严重破乳现象，油相析出，包封率仅为36.78％。中国专利CN 201010563619.5公开的去甲斑蝥酸钠药物组合物未能将药物包埋，与血管内壁直接接触的游离药物浓度较高，血管刺激性较大，与已上市的去甲斑蝥酸钠注射液相比，其血管刺激性无明显实质性改善。本发明人前期对CN 201010563619.5公开的去甲斑蝥酸钠注射液血管刺激性进行了考察，耳缘静脉给予新西兰兔受试物去甲斑蝥酸钠注射液1mL/kg(给药浓度均为2mg/mL，相当于临床静脉给药浓度)，给药速度约1mL/分钟，每天给药一次，共7天。实验结果显示：去甲斑蝥酸钠注射液组末次给药后48小时剖检动物的肉眼观察可见2/3例动物给药部位增厚；镜检可见3/3例参比制剂组动物左耳给药部位可见静脉管腔稍扩张、血管内皮细胞轻度肿胀以及血管周围组织排列稍疏松等现象。

综上，上述专利中虽然公开了多种不同剂型的去甲斑蝥素制剂，但这些制剂未对去甲斑蝥素包埋时仍存在血管刺激性，对去甲斑蝥素包埋时包埋低，且上述专利中尚未陈述制剂的药动学数据及有益的药效数据，无法考证进一步开发生产的可行性。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液及其制备方法。本发明提供的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液包埋率高，有效降低去甲斑蝥素的毒性、对血管的刺激，并有效提高注射液灭菌和贮存过程的稳定性。

本发明提供一种去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液，包括以下质量份数的组分：去甲斑蝥素0.4～0.8份，表面活性剂3～7.5，助膜流动剂1～1.5份，稳定剂0.09～0.25份，油相溶媒20～30份，脂质体膜材1.5～5份，辅助乳化剂0.1～1.5份，渗透压调节剂3～7.5份，水150～200份。

优选的，所述表面活性剂包括磷脂、吐温、司盘和普郎尼克中的一种或多种。

优选的，所述助膜流动剂包括胆固醇和/或胆固醇类似物。

优选的，所述稳定剂包括油酸和/或碱金属油酸盐。

优选的，所述油相溶媒包括注射用合成油、注射用植物油和注射用精油中的一种或多种。

优选的，所述脂质体膜材包括大豆磷脂和/或蛋黄卵磷脂。

优选的，所述辅助乳化剂包括普郎尼克F68和/或普郎尼克F127。

优选的，所述渗透压调节剂包括甘油、山梨醇、甘露醇和葡萄糖中的一种或多种。

本发明提供上述技术方案所述去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液的制备方法，包括以下步骤：

(1)将去甲斑蝥素、表面活性剂、助膜流动剂、稳定剂和油相溶媒混合，得到油相；

(2)将脂质体膜材、辅助乳化剂、渗透压调节剂和水混合，得到水相；

(3)将所述油相和所述水相依次进行混合、剪切和均质，得到混合乳液；

(4)将所述混合乳液依次进行过滤除菌和低温补充灭菌，得到所述去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液；

所述步骤(1)和步骤(2)之间没有时间顺序的限制。

优选的，所述步骤(4)中，所述过滤除菌包括依次进行第一过滤除菌和第二过滤除菌，所述第一过滤除菌用滤膜的直径为0.45μm，所述第二过滤除菌用滤膜的直径为0.22μm；

所述低温补充灭菌的温度为100℃，所述低温补充灭菌的保温时间为20～40min。

本发明采用上述组分在上述质量份数范围内形成了去甲斑蝥素的脂质体-乳剂复合体注射液，即表面活性剂在助膜流动剂和稳定剂的辅助调节作用下将去甲斑蝥素稳定装载于油相溶媒中形成去甲斑蝥素油相乳化体系；同时，脂质体膜材在辅助乳化剂和渗透压调节剂的辅助调节作用下包覆于去甲斑蝥素油相乳化体系表面，形成脂质体双分子层、脂质体内水相、油水界面和油相的脂质体-乳剂复合体系，去甲斑蝥素不同形式在复合体内分布位置不同，其中酯型分布在油相内、油水界面和磷脂双分子层中，开环型分布在脂质体内水相中，相较于脂质体或乳剂单独使用时包封效果差，包封率低，本发明大大提高去甲斑蝥素的包封率，因此，本发明提供的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液静脉注射后可以显著降低注射时地血管刺激性，延长去甲斑蝥素体内作用时间，提高去甲斑蝥素的吸收效果，达到提高治疗疗效并降低毒副作用的效果。

同时，本发明提供的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液通过上述组分和质量份数调整得到的脂质体-乳剂复合体的包封结构，脂质体囊泡具有变形而不破裂的结构特性，过滤时该脂质体-乳剂复合体会根据滤膜孔径大小，自动变形调节通过滤膜，乳剂部分作为内芯粒径较小，过滤不会对乳剂内芯造成影响。因此，本发明提供的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液能够采用过滤除菌和低温补充灭菌的协同灭菌方法：先将终乳用滤膜过滤，充氮，灌封，再进行低温补充灭菌，上述灭菌方法在保证无菌水平的前提下，保障去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液结构不被破坏，显著性地提高了去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液的灭菌稳定性，兼顾去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液无菌性和灭菌稳定性。

本发明提供的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液可单用或联合用药，用于治疗肝癌、食管癌、肺癌、乳腺癌、胃和贲门癌等，亦可作为癌症术前用药或用于联合化疗中。本发明提供的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液与PD-1/PD-L1阻断剂联用，可以发挥出更优的抗肿瘤活性和肿瘤抑制率，并且降低PD-L1抑制剂单独使用的毒副作用；本发明提供的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液与其它化疗药，例如5-氟尿嘧啶、阿霉素、丝裂霉素等联合应用治疗晚期肝癌，可起到相加和协同作用，并且降低毒副作用。

附图说明

图1为本发明实施例制备去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液的准备流程图和去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液的结构示意图；

图2为本发明去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液的脂质体-乳剂复合体结构示意图；

图3为本发明实施例1制备去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液的粒径分布图；

图4为本发明实施例1制备去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液的电位图；

图5为本发明实施例1制备去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液的透射电镜图；

图6为本发明实施例1制备去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液药物累计释放曲线，图6中的1代表实施例1制备的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液，图6中的2代表去甲斑蝥素溶液；

图7为本发明实施例1制备的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液对肝癌H22瘤株荷瘤小鼠给药后肿瘤组织分布结果图；

图8为本发明实施例1制备的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液联合给药性能测试结果；

图9为本发明实施例1制备的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液用H22细胞测定NCTD溶液和NCTD脂质体-乳剂复合体给药系统(NLEH)的48小时细胞存活率；

图10为本发明实施例1制备的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液静脉注射NCTD脂质体-乳剂复合体注射液(NLEH)和NCTD溶液后NCTD的血浆浓度-时间曲线(n＝6)；

图11为本发明实施例1制备的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液静脉注射的药效学研究结果。

具体实施方式

本发明提供一种去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液，包括以下质量份数的组分：

去甲斑蝥素0.4～0.8份，表面活性剂3～7.5，助膜流动剂1～1.5份，稳定剂0.09～0.25份，油相溶媒20～30份，脂质体膜材1.5～5份，辅助乳化剂0.1～1.5份，渗透压调节剂3～7.5份，水150～200份。

在本发明中，若无特殊说明，所用原料均为本领域技术人员熟知的市售产品。

以质量分数计，本发明提供的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液包括0.4～0.8份的去甲斑蝥素，优选为0.42～0.79份。

在本发明的具体实施例中，所述去甲斑蝥素的质量份数具体优选为：0.4份、0.5份、0.6份或0.8份。

以所述去甲斑蝥素的质量份数为基准，本发明提供的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液包括3～7.5份表面活性剂，优选为3.2～7.4份。

在本发明的具体实施例中，所述表面活性剂的质量份数具体优选为：3份、3.5份、5份、6份或7.5份。

在本发明中，所述表面活性剂优选包括磷脂、吐温、司盘和普郎尼克中的一种或多种，更优选为磷脂。

在本发明中，所述表面活性剂优选为磷脂时，所述磷脂优选为大豆磷脂和/或蛋黄卵磷脂。所述大豆磷脂优选包括PC50、PC60、PC70、PC80、S75和S100中的一种或多种。所述蛋黄卵磷脂优选包括E80、PL-100M和PC-98T中的一种或多种。

在本发明的具体实施例中，所述表面活性剂具体优选为蛋黄卵磷脂E80、大豆磷脂PC70、大豆磷脂PC80或大豆磷脂S100。

以所述去甲斑蝥素的质量份数为基准，本发明提供的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液包括1～1.5份助膜流动剂，优选为1.2～1.4份。

在本发明的具体实施例中，所述助膜流动剂的质量份数具体优选为：1.25份。

在本发明中，所述助膜流动剂优选包括胆固醇和/或胆固醇类似物。

在本发明中，所述胆固醇类似物优选包括7-脱氢胆固醇、25-羟基胆固醇、麦角甾醇和胆固醇半琥珀酸酯中的一种或多种。

在本发明中的具体实施例中，所述助膜流动剂具体优选为胆固醇。

在本发明中，所述胆固醇为注射用胆固醇。

在本发明中，所述胆固醇类似物为注射用胆固醇类似物。

在本发明中，所述有机溶剂为无水乙醇、三氯甲烷、甲醇、丙酮其中的一种或多种，更优选为无水乙醇。

以所述去甲斑蝥素的质量份数为基准，本发明提供的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液包括0.09～0.25份稳定剂，优选为0.095～0.24份。

在本发明的具体实施例中，所述稳定剂的质量份数具体优选为：0.15份、0.1份、0.2份、0.25份或0.09份。

在本发明中，所述稳定剂优选包括油酸和/或碱金属油酸盐，更优选为油酸。

在本发明中，所述碱金属油酸盐具体优选为油酸钠。

以所述去甲斑蝥素的质量份数为基准，本发明提供的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液包括20～30份油相溶媒，优选为21.5～28份。

在本发明的具体实施例中，所述油相溶媒的质量份数具体优选为：25份。

在本发明中，所述油相溶媒优选包括注射用合成油、注射用植物油和注射用精油中的一种或多种。

在本发明中，所述注射用合成油具体优选为注射用中链甘油三酸酯。

在本发明中，所述注射用植物油具体优选为注射用亚麻籽油和/或注射用大豆油。

在本发明中，所述注射用精油具体优选为注射用甜杏仁油和/或注射用荷荷芭油。

在本发明的具体实施例中，所述油相溶媒具体优选为注射用中链甘油三酸酯。

以所述去甲斑蝥素的质量份数为基准，本发明提供的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液包括1.5～5份脂质体膜材，优选为1.55～4.8份。

在本发明的具体实施例中，所述脂质体膜材的质量份数具体优选为：2份、4份、1.5份或5份。

在本发明中，所述脂质体膜材优选包括大豆磷脂和/或蛋黄卵磷脂。

在本发明中，所述大豆磷脂优选包括PC50、PC60、PC70、PC80、S75和S100中的一种或多种，更优选为PC70、PC80和S100中的一种或多种。

在本发明中，所述蛋黄卵磷脂优选包括E80、PL-100M和PC-98T中的一种或多种，更优选为E80和/或PL-100M。

在本发明的具体实施例中，所述脂质体膜材具体优选为蛋黄卵磷脂PL-100M。

以所述去甲斑蝥素的质量份数为基准，本发明提供的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液包括0.1～1.5份辅助乳化剂，优选为0.15～1.45份。

在本发明的具体实施例中，所述辅助乳化剂的质量份数具体优选为：1份。

在本发明中，所述辅助乳化剂优选包括普郎尼克F68和/或普郎尼克F127，更优选为普郎尼克F68。

以所述去甲斑蝥素的质量份数为基准，本发明提供的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液包括3～7.5份渗透压调节剂，优选为3.2～7.2份。

在本发明的具体实施例中，所述渗透压调节剂的质量份数具体优选为：3份、4.5份、5份、5.5份、5.5份、6.25份或7.5份。

在本发明中，所述渗透压调节剂优选包括甘油、山梨醇、甘露醇和葡萄糖中的一种或多种，更优选为甘油。

在本发明中，所述甘油为注射用甘油。

以所述去甲斑蝥素的质量份数为基准，本发明提供的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液包括150～200份水，优选为160～185份。

在本发明的具体实施例中，所述水的质量份数具体优选为：180份。

在本发明中，所述水为注射用水。

在本发明中，所述去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液的平均粒径优选＜180nm。

在本发明中，所述去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液的D(90)优选＜250nm。

在本发明中，所述去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液的含量为其标示量的95％以上。

在本发明中，所述去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液的包封率＞80％。

在本发明中，所述去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液的PDI≤0.200。

本发明提供的在本发明中，所述去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液的粒径小，均匀度好。

本发明提供的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液能够形成脂质体双分子层、脂质体内水相、油水界面和油相的脂质体-乳剂复合体系，去甲斑蝥素分布在油相，油水界面，脂质体内水相和磷脂双分子层中(如图1和图2所示)，相较于脂质体或乳剂单独使用时包封效果差，包封率低，本发明大大提高去甲斑蝥素的包封率。

本发明提供的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液静脉注射后能提高去甲斑蝥素的吸收和延长去甲斑蝥素在体内作用时间，降低了注射时血管刺激性，达到了提高治疗疗效并降低毒副作用的效果；本发明提供的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液与化疗药物或者免疫药物联用后会促进去甲斑蝥素抗癌药效。

本发明提供上述技术方案所述去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液的制备方法，包括以下步骤：

(1)将去甲斑蝥素、表面活性剂、助膜流动剂、稳定剂和油相溶媒混合，得到油相；

(2)将脂质体膜材、辅助乳化剂、渗透压调节剂和水混合，得到水相；

(3)将所述油相和所述水相依次进行混合、剪切和均质，得到混合乳液；

(4)将所述混合乳液依次进行过滤除菌和低温补充灭菌，得到所述去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液；

所述步骤(1)和步骤(2)之间没有时间顺序的限制。

本发明将去甲斑蝥素、表面活性剂、助膜流动剂、稳定剂和油相溶媒混合(以下称为第一混合)，得到油相。

在本发明中，所述第一混合优选包括以下步骤：

将去甲斑蝥素、表面活性剂、助膜流动剂和有机溶剂混合，形成复合体系溶液；

将所述复合体系溶液进行脱溶剂，得到复合体系；

将所述复合体系、稳定剂和油相溶媒混合，得到油相。

本发明将去甲斑蝥素、表面活性剂、助膜流动剂和有机溶剂混合(以下称为第二混合)，形成复合体系溶液，所述复合体系溶液包括去甲斑蝥素-表面活性剂-助膜流动剂复合体。

在本发明中，所述第二混合优选包括以下步骤：

将所述表面活性剂、助膜流动剂和部分有机溶剂第三混合，得到第三混合液；

将所述第三混合液、所述去甲斑蝥素和剩余所述有机溶剂第四混合。

在本发明中，所述第三混合优选在保护气体中进行，所述保护气体优选为惰性气体或氮气，更优选为氮气。

在本发明中，所述第三混合的温度优选为45℃。

在本发明中，所述第三混合优选在搅拌的条件下进行，本发明对所述搅拌的转速没有特殊要求。

在本发明中，所述第三混合的时间优选以所述第三混合液变为澄清透明为准。

在本发明中，所述第四混合优选在保护气体中进行，所述保护气体优选为惰性气体或氮气，更优选为氮气。

在本发明中，所述第四混合的温度优选为40℃。

在本发明中，所述第四混合优选在搅拌的条件下进行，本发明对所述搅拌的转速没有特殊要求。

在本发明中，所述表面活性剂具体优选为磷脂时，所述助膜流动剂具体优选为胆固醇和/或胆固醇类似物时，所述复合体系溶液优选包括去甲斑蝥素-磷脂-胆固醇和/或胆固醇类似物复合体，所述去甲斑蝥素-磷脂-胆固醇和/或胆固醇类似物复合体为去甲斑蝥素的酸酐环开环后与所述磷脂、胆固醇和/或胆固醇类似物通过氢键相互作用形成的复合物，反应原理如图1所示。

得到复合体系溶液后，本发明将所述复合体系溶液进行脱溶剂，得到复合体系。

在本发明中，所述脱溶剂优选为加热脱溶剂。

在本发明中，所述表面活性剂具体优选为磷脂时，所述助膜流动剂具体优选为胆固醇和/或胆固醇类似物时，所述复合体系包括去甲斑蝥素-磷脂-胆固醇和/或胆固醇类似物复合体和独立存在的去甲斑蝥素，如图1所示。

得到复合体系后，本发明将所述复合体系、稳定剂和油相溶媒混合(以下称为第五混合)，得到油相。

在本发明中，所述第五混合的温度优选为40℃。

在本发明中，所述第五混合优选在搅拌的条件下进行，本发明对所述搅拌的转速没有特殊要求。

在本发明中，所述第五混合的时间优选以所述油相变为澄清透明为准。

本发明将脂质体膜材、辅助乳化剂、渗透压调节剂和水混合(以下称为第六混合)，得到水相。

在本发明中，所述第六混合时，所述水优选为部分水。

在本发明中，所述部分水的体积优选为所述去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液中水的总体积的5/9。

在本发明中，所述第六混合的温度优选为40℃。

在本发明中，所述第六混合优选在搅拌的条件下进行，本发明对所述搅拌的具体实施过程没有特殊要求。

在本发明中，所述第六混合的时间优选以所述水相变为澄清透明为准。

得到油相和水相后，本发明将所述油相和所述水相依次进行混合(以下称为第七混合)、剪切和均质，得到所述去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液。

在本发明中，所述第七混合优选为将所述水相加入所述油相中。

在本发明中，所述第七混合优选在高速组织分散机中进行。

在本发明中，所述第七混合优选在搅拌的条件下进行。

在本发明中，所述第七混合的温度优选为40℃。

在本发明中，所述第七混合的时间优选为10min。

在本发明中，本发明优选将第七混合得到的初乳进行剪切。

在本发明中，所述剪切优选在剪切机中进行。

在本发明中，所述剪切的转速优选为5000～20000rpm，更优选为10000～20000rpm，进一步优选为16000rpm。

在本发明中，所述剪切的时间优选为1～10min，更优选为2～5min。

在本发明中，本发明优选将所述剪切得到的剪切初乳进行均质。

在本发明中，所述均质优选为将所述剪切初乳依次进行第一均质、第二均质、第三均质和第四均质。在本发明中，所述第一均质的压力具体优选为0bar，所述第二均质的压力具体优选为100bar，所述第三均质的压力具体优选为300bar，所述第四均质的压力具体优选为500bar。在本部发明中，所述第一均质、第二均质、第三均质和第四均质的次数均优选为1～3次，更优选为3次。

在本发明中，所述第四均质得到第四均质初乳，本发明优选将所述第四均质初乳与剩余的水进行第五均质。

在本发明中，所述第五均质的压力具体优选为900bar，所述第五均质的次数优选为1～3次，更优选为3次。

在本发明中，所述第五均质后得到混合乳液。

得到混合乳液后，本发明将所述混合乳液依次进行过滤除菌和低温补充灭菌，得到所述去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液。

在本发明中，进行所述过滤除菌之前，本发明优选调节所述混合乳液的的pH值。

在本发明中，调节pH值优选为采用pH值调节剂。在本发明中，所述pH值调节剂优选为氢氧化钠溶液。在本发明中，调节pH值后，所述混合乳液的pH值优选为8～9。

在本发明中，所述过滤除菌优选包括依次进行第一过滤除菌和第二过滤除菌。

在本发明中，所述第一过滤除菌用滤膜的直径优选为0.45μm，所述第二过滤除菌用滤膜的直径优选为0.22μm。

在本发明中，进行所述低温补充灭菌之前，本发明优选对过滤除菌后的混合乳液进行罐封，对所述罐封后的混合乳液进行低温补充灭菌。

在本发明中，所述灌封优选为向所述过滤除菌后的混合乳液中冲入氮气后灌封。

在本发明中，所述低温补充灭菌的温度优选为100℃，所述低温补充灭菌的保温时间优选为20～40min。

在本发明中，所述低温补充灭菌后得到终乳，本发明优选对所述终乳进行后处理，得到所述去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液。在本发明中，所述后处理优选包括：检测和包装。在本发明中，所述检验优选为灯检。

本发明优选采用的过滤除菌加低温补充灭菌方法，保证去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液在灭菌后物理化学性质稳定，灭菌稳定性好。

本发明在保证所述去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液无菌水平的前提下，保障去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液结构不被破坏，显著性地提高了去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液的灭菌稳定性，兼顾去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液无菌性和灭菌稳定性。

本发明提供的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液与传统纯乳剂相比，本发明的脂质体-乳剂复合体过滤较为顺畅，所受阻力较小，其原因在于本发明特有的脂质体包封乳剂结构，脂质囊泡具有变形而不破裂的结构特性，过滤时该脂质体-乳剂复合体会根据滤膜孔径大小，自动变形调节通过滤膜，乳剂部分作为内芯粒径较小，过滤不会对其造成影响。在本发明中，所述过滤对去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液的包封率和含量无显著影响。

在本发明中，所述去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液优选在4～10℃条件下保存。

本发明提供的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液具有脂质体-乳剂复合体给药系统，在脂质体-乳剂复合体给药体系中去甲斑蝥素能分布在油相，油水界面，脂质体内水相和磷脂分子层，去甲斑蝥素包封率80％以上。

本发明采用过滤除菌加低温补充灭菌的灭菌方法，先将终乳用滤膜过滤除菌；充氮灌封，再进行低温补充灭菌。本发明提供的灭菌方法在保证无菌水平的前提下，显著性地提高了去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液的灭菌稳定性。

本发明制备的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液可单用或联合用药，用于治疗肝癌、食管癌、肺癌、乳腺癌、胃和贲门癌等，亦可作为癌症术前用药或用于联合化疗中。本发明提供的甲斑蝥素注射液与PD-1/PD-L1阻断剂联用，可以发挥出更优的抗肿瘤活性和肿瘤抑制率。

本发明制备的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体给药系统，静脉注射后提高药物的吸收和延长药物体内作用时间，降低了注射时地血管刺激性,达到了提高治疗疗效并降低毒副作用的效果，因而具有一定的创新性和较强的实用性。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

实施例1处方如表1所示：

表1实施例1原料和各原料质量

去甲斑蝥素(NCTD)	0.5g
		精制蛋黄卵磷脂(E-80)	5.0g
胆固醇(供注射用)	1.25g
		无水乙醇	30.0mL
蛋黄卵磷脂(PL-100M)	2.0g
		注射用中链甘油三酸酯	25.0g
普郎尼克F68	1.0g
		油酸	0.15g
甘油(供注射用)	6.25g
		加注射用水至	180mL

制备方法：

(1)称取处方量的E-80和胆固醇至烧杯中，加入20mL无水乙醇，在45℃条件下搅拌至澄清溶液，加入NCTD和剩余无水乙醇，将得到的药物-辅料混悬液于40℃在氮气环境下搅拌，搅拌速率为100r/min(液体有轻微的漩涡)的条件下反应4小时。反应结束后，在40℃加热条件下，旋蒸除乙醇。

(2)称取处方量的油酸和中链甘油三酸酯和步骤(1)产物至油相罐中，在40℃氮气条件下加热并搅拌至溶液澄明。

(3)称取处方量的蛋黄卵磷脂PL-100M、F68、甘油至水相罐中，加入处方量约100mL注射用水，在40℃条件下加热并搅拌至溶液澄明。

(4)直接将水相迅速加入到油相中于40℃剧烈搅拌10min。完全加入后，在剪切机中16000rpm转速条件下剪切2.0min，剪切结束后冷水迅速冷却。

(5)在高压均质机下：依次于0bar均质1次，100、300、500bar各均质3次，根据初乳中药物的浓度及最终载药量加入剩余量的注射用水约80mL，然后900bar均质3次。

(6)使用1mol/L氢氧化钠调节pH值至8.20。

(7)依次过0.45和0.22μm的滤膜后，充氮气，灌封。

(8)100℃旋转水浴灭菌30min。

本实施例得到的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液的粒径分布如图3所示。本实施例制备的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液的电位图如所示；本实施例制备的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液的透射电镜图如图5所示。

本实施例得到的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液制剂参数如表2所示：

表2实施例1制备得到的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液参数

外观

粒径(nm)

PdI

电位(mV)

含量

包封率

D(90)(nm)

均一良好

155.3

0.115

-34.20±2.69

100.3％

88.7％

230

实施例2

实施例2处方如表3所示：

表3实施例2原料和各原料质量

去甲斑蝥素	0.8g
		大豆磷脂(S-100)	6.0g
胆固醇(供注射用)	1.25g
		无水乙醇	30.0mL
蛋黄卵磷脂(PL-100M)	2.0g
		注射用中链甘油三酸酯	25.0g
普郎尼克F68	1.0g
		油酸	0.10g
甘油(供注射用)	6.25g
		加注射用水至	180mL

制备方法：

(1)称取处方量的S-100和胆固醇至烧杯中，加入20mL无水乙醇，在45℃条件下搅拌至澄清溶液，加入NCTD和剩余无水乙醇，将得到的药物-辅料混悬液于40℃在氮气环境下搅拌，搅拌速率为100r/min(液体有轻微的漩涡)的条件下反应4小时。反应结束后，在40℃加热条件下，旋蒸除乙醇。

(2)称取处方量的油酸和中链甘油三酸酯和步骤(1)产物至油相罐中，在40℃氮气条件下加热并搅拌至溶液澄明。

(3)称取处方量的蛋黄卵磷脂PL-100M、F68、甘油至水相罐中，加入处方量约100mL注射用水，在40℃条件下加热并搅拌至溶液澄明。

(4)直接将水相迅速加入到油相中于40℃剧烈搅拌10min。完全加入后，在剪切机中12000rpm转速条件下剪切7.0min，剪切结束后冷水迅速冷却。

(5)在高压均质机下：依次于0bar均质1次，100、300、500bar各均质3次，根据初乳中药物的浓度及最终载药量加入剩余量的注射用水约80mL，然后900bar均质3次。

(6)使用1mol/L氢氧化钠调节pH值至8.20。

(7)依次过0.45和0.22μm的滤膜后，充氮气，灌封。

(8)100℃旋转水浴灭菌35min。

本实施例得到的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液制剂参数如表4所示：

表4实施例2制备得到的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液参数

外观

粒径(nm)

PdI

电位(mV)

含量

包封率

D(90)(nm)

均一良好

163.6

0.109

-32.90±6.86

98.6％

83.2％

244

实施例3

实施例3处方如表5所示：

表5实施例3原料和各原料质量

去甲斑蝥素(NCTD)	0.5g
		精制蛋黄卵磷脂(E-80)	3.5g
无水乙醇	30.0mL
		蛋黄卵磷脂(PL-100M)	4.0g
注射用中链甘油三酸酯	25.0g
		普郎尼克F68	1.0g
油酸	0.20g
		甘油(供注射用)	6.25g
加注射用水至	180mL

制备方法：

(1)称取处方量的E-80和胆固醇至烧杯中，加入20mL无水乙醇，在45℃条件下搅拌至澄清溶液，加入NCTD和剩余无水乙醇，将得到的药物-辅料混悬液于40℃在氮气环境下搅拌，搅拌速率为100r/min(液体有轻微的漩涡)的条件下反应4小时。反应结束后，在40℃加热条件下，旋蒸除乙醇。

(2)称取处方量的油酸和中链甘油三酸酯和步骤(1)产物至油相罐中，在40℃氮气条件下加热并搅拌至溶液澄明。

(3)称取处方量的蛋黄卵磷脂PL-100M、F68、甘油至水相罐中，加入处方量约100mL注射用水，在40℃条件下加热并搅拌至溶液澄明。

(4)直接将水相迅速加入到油相中于40℃剧烈搅拌10min。完全加入后，在剪切机中14000rpm转速条件下剪切6.0min，剪切结束后冷水迅速冷却。

(5)在高压均质机下：依次于0bar均质1次，100、300、500bar各均质3次，根据初乳中药物的浓度及最终载药量加入剩余量的注射用水约80mL，然后900bar均质3次。

(6)使用1mol/L氢氧化钠调节pH值至8.20。

(7)依次过0.45和0.22μm的滤膜后，充氮气，灌封。

(8)100℃旋转水浴灭菌30min。

本实施例得到的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液制剂参数如表6所示：

表6实施例3制备得到的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液参数

外观

粒径(nm)

PdI

电位(mV)

含量

包封率

D(90)(nm)

均一良好

164.2

0.082

-41.10±6.52

101.2％

86.3％

249

实施例4

实施例4处方如表7所示：

表7实施例4原料和各原料质量

去甲斑蝥素(NCTD)	0.5g
		大豆磷脂(PC70)	7.5g
胆固醇(供注射用)	1.25g
		无水乙醇	30.0mL
蛋黄卵磷脂(PL-100M)	1.5g
		注射用中链甘油三酸酯	25.0g
普郎尼克F68	1.0g
		油酸	0.25g
甘油(供注射用)	5.5g
		加注射用水至	180mL

制备方法：

(1)称取处方量的PC70和胆固醇至烧杯中，加入20mL无水乙醇，在45℃条件下搅拌至澄清溶液，加入NCTD和剩余无水乙醇，将得到的药物-辅料混悬液于40℃在氮气环境下搅拌，搅拌速率为100r/min(液体有轻微的漩涡)的条件下反应4小时。反应结束后，在40℃加热条件下，旋蒸除乙醇。

(2)称取处方量的油酸和中链甘油三酸酯和步骤(1)产物至油相罐中，在40℃氮气条件下加热并搅拌至溶液澄明。

(3)称取处方量的蛋黄卵磷脂PL-100M、F68、甘油至水相罐中，加入处方量约100mL注射用水，在40℃条件下加热并搅拌至溶液澄明。

(4)直接将水相迅速加入到油相中于40℃剧烈搅拌10min。完全加入后，在剪切机中20000rpm转速条件下剪切2.0min，剪切结束后冷水迅速冷却。

(5)在高压均质机下：依次于0bar均质1次，100、300、500bar各均质3次，根据初乳中药物的浓度及最终载药量加入剩余量的注射用水约80mL，然后900bar均质3次。

(6)使用1mol/L氢氧化钠调节pH值至8.20。

(7)依次过0.45和0.22μm的滤膜后，充氮气，灌封。

(8)100℃旋转水浴灭菌40min。

本实施例得到的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液制剂参数如表8所示：

表8实施例4制备得到的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液参数

外观

粒径(nm)

PdI

电位(mV)

含量

包封率

D(90)(nm)

均一良好

170.5

0.143

-44.80±6.97

97.5％

85.2％

233

实施例5

实施例5处方如表9所示：

表9实施例5原料和各原料质量

去甲斑蝥素(NCTD)	0.5g
		大豆磷脂(PC80)	5.0g
胆固醇(供注射用)	1.25g
		无水乙醇	30.0mL
蛋黄卵磷脂(PL-100M)	2.0g
		注射用中链甘油三酸酯	25.0g
普郎尼克F68	1.0g
		油酸	0.15g
甘油(供注射用)	6.25g
		加注射用水至	180mL

制备方法：

(1)称取处方量的PC80和胆固醇至烧杯中，加入20mL无水乙醇，在45℃条件下搅拌至澄清溶液，加入NCTD和剩余无水乙醇，将得到的药物-辅料混悬液于40℃在氮气环境下搅拌，搅拌速率为100r/min(液体有轻微的漩涡)的条件下反应4小时。反应结束后，在40℃加热条件下，旋蒸除乙醇。

(2)称取处方量的油酸和中链甘油三酸酯和步骤(1)产物至油相罐中，在40℃氮气条件下加热并搅拌至溶液澄明。

(3)称取处方量的蛋黄卵磷脂PL-100M、F68、甘油至水相罐中，加入处方量约100mL注射用水，在40℃条件下加热并搅拌至溶液澄明。

(4)直接将水相迅速加入到油相中于40℃剧烈搅拌10min。完全加入后，在剪切机中11000rpm转速条件下剪切8.0min，剪切结束后冷水迅速冷却。

(5)在高压均质机下：依次于0bar均质1次，100、300、500bar各均质3次，根据初乳中药物的浓度及最终载药量加入剩余量的注射用水约80mL，然后900bar均质3次。

(6)使用1mol/L氢氧化钠调节pH值至8.20。

(7)依次过0.45和0.22μm的滤膜后，充氮气，灌封。

(8)100℃旋转水浴灭菌30min。

本实施例得到的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液制剂参数如表10所示：

表10实施例5制备得到的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液参数

外观

粒径(nm)

PdI

电位(mV)

含量

包封率

D(90)(nm)

均一良好

166.9

0.114

-41.20±5.19

98.1％

84.2％

235

实施例6

实施例6处方如表11所示：

表11实施例6原料和各原料质量

制备方法：

(1)称取处方量的E-80和胆固醇至烧杯中，加入20mL无水乙醇，在45℃条件下搅拌至澄清溶液，加入NCTD和剩余无水乙醇，将得到的药物-辅料混悬液于40℃在氮气环境下搅拌，搅拌速率为100r/min(液体有轻微的漩涡)的条件下反应4小时。反应结束后，在40℃加热条件下，旋蒸除乙醇。

(2)称取处方量的油酸和中链甘油三酸酯和步骤(1)产物至油相罐中，在40℃氮气条件下加热并搅拌至溶液澄明。

(3)称取处方量的蛋黄卵磷脂PL-100M、F68、甘油至水相罐中，加入处方量约100mL注射用水，在40℃条件下加热并搅拌至溶液澄明。

(4)直接将水相迅速加入到油相中于40℃剧烈搅拌10min。完全加入后，在剪切机中100000rpm转速条件下剪切10.0min，剪切结束后冷水迅速冷却。

(5)在高压均质机下：依次于0bar均质1次，100、300、500bar各均质3次，根据初乳中药物的浓度及最终载药量加入剩余量的注射用水约80mL，然后900bar均质3次。

(6)使用1mol/L氢氧化钠调节pH值至8.20后。

(7)依次过0.45和0.22μm的滤膜后，充氮气，灌封。

(8)100℃旋转水浴灭菌20min。

本实施例得到的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液制剂参数如表12所示：

表12实施例6制备得到的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液参数

外观

粒径(nm)

PdI

电位(mV)

含量

包封率

D(90)(nm)

均一良好

165.2

0.113

-40.40±6.79

99.7％

88.5％

242

实施例7

实施例7处方如表13所示：

表13实施例7原料和各原料质量

制备方法：

(1)称取处方量的E-80和胆固醇至烧杯中，加入20mL无水乙醇，在45℃条件下搅拌至澄清溶液，加入NCTD和剩余无水乙醇，将得到的药物-辅料混悬液于40℃在氮气环境下搅拌，搅拌速率为100r/min(液体有轻微的漩涡)的条件下反应4小时。反应结束后，在40℃加热条件下，旋蒸除乙醇。

(2)称取处方量的油酸、中链甘油三酸酯、大豆油和步骤(1)产物至油相罐中，在40℃氮气条件下加热并搅拌至溶液澄明。

(3)称取处方量的蛋黄卵磷脂PL-100M、F68、甘油至水相罐中，加入处方量约100mL注射用水，在40℃条件下加热并搅拌至溶液澄明。

(4)直接将水相迅速加入到油相中于40℃剧烈搅拌10min。完全加入后，在剪切机中16000rpm转速条件下剪切2.0min，剪切结束后冷水迅速冷却。

(5)在高压均质机下：依次于0bar均质1次，100、300、500bar各均质3次，根据初乳中药物的浓度及最终载药量加入剩余量的注射用水约80mL，然后900bar均质3次。

(6)使用1mol/L氢氧化钠调节pH值至8.20后。

(7)依次过0.45和0.22μm的滤膜后，充氮气，灌封。

(8)100℃旋转水浴灭菌30min。

本实施例得到的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液制剂参数如表14所示：

表14实施例7制备得到的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液参数：

外观

粒径(nm)

PdI

电位(mV)

含量

包封率

D(90)(nm)

均一良好

172.1

0.112

-39.20±5.37

101.6％

87.9％

247

实施例8

实施例8处方如表15所示：

表15实施例8原料和各原料质量

制备方法：

(1)称取处方量的S-100和胆固醇至烧杯中，加入20mL无水乙醇，在45℃条件下搅拌至澄清溶液，加入NCTD和剩余无水乙醇，将得到的药物-辅料混悬液于40℃在氮气环境下搅拌，搅拌速率为100r/min(液体有轻微的漩涡)的条件下反应4小时。反应结束后，在40℃加热条件下，旋蒸除乙醇。

(2)称取处方量的油酸、中链甘油三酸酯大豆油和步骤(1)产物至油相罐中，在40℃氮气条件下加热并搅拌至溶液澄明。

(3)称取处方量的蛋黄卵磷脂PL-100M、F68、甘油至水相罐中，加入处方量约100mL注射用水，在40℃条件下加热并搅拌至溶液澄明。

(4)直接将水相迅速加入到油相中于40℃剧烈搅拌10min。完全加入后，在剪切机中16000rpm转速条件下剪切2.0min，剪切结束后冷水迅速冷却。

(5)在高压均质机下：依次于0bar均质1次，100、300、500bar各均质3次，根据初乳中药物的浓度及最终载药量加入剩余量的注射用水约80mL，然后900bar均质3次。

(6)使用1mol/L氢氧化钠调节pH值至8.20后。

(7)依次过0.45和0.22μm的滤膜后，充氮气，灌封。

(8)100℃旋转水浴灭菌25min。

本实施例得到的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液制剂参数如表16所示：

表16实施例8制备得到的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液参数：

外观

粒径(nm)

PdI

电位(mV)

含量

包封率

D(90)(nm)

均一良好

167.2

0.144

-37.9±4.32

97.4％

83.7％

238

实施例9

实施例9处方如表17所示：

表17实施例9原料和各原料质量

制备方法：

(1)称取处方量的PC70和胆固醇至烧杯中，加入20mL无水乙醇，在45℃条件下搅拌至澄清溶液，加入NCTD和剩余无水乙醇，将得到的药物-辅料混悬液于40℃在氮气环境下搅拌，搅拌速率为100r/min(液体有轻微的漩涡)的条件下反应4小时。反应结束后，在40℃加热条件下，旋蒸除乙醇。

(2)称取处方量的油酸、中链甘油三酸酯和大豆油和步骤(1)产物至油相罐中，在40℃氮气条件下加热并搅拌至溶液澄明。

(3)称取处方量的蛋黄卵磷脂PL-100M、F68、甘油至水相罐中，加入处方量约100mL注射用水，在40℃条件下加热并搅拌至溶液澄明。

(4)直接将水相迅速加入到油相中于40℃剧烈搅拌10min。完全加入后，在剪切机中13000rpm转速条件下剪切6.0min，剪切结束后冷水迅速冷却。

(5)在高压均质机下：依次于0bar均质1次，100、300、500bar各均质3次，根据初乳中药物的浓度及最终载药量加入剩余量的注射用水约80mL，然后900bar均质3次。

(6)使用1mol/L氢氧化钠调节pH值至8.20。

(7)依次过0.45和0.22μm的滤膜后，充氮气，灌封。

(8)100℃旋转水浴灭菌30min。

本实施例得到的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液制剂参数如表18所示：

表18实施例9制备得到的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液参数：

外观

粒径(nm)

PdI

电位(mV)

含量

包封率

D(90)(nm)

均一良好

175.1

0.103

-40.2±4.43

97.3％

85.2％

241

实施例10

实施例10处方如表19所示：

表19实施例10原料和各原料质量

去甲斑蝥素(NCTD)	0.4g
		大豆磷脂(PC80)	5.0g
胆固醇(供注射用)	1.25g
		无水乙醇	30.0mL
蛋黄卵磷脂(PL-100M)	2.0g
		注射用中链甘油三酸酯	20.0g
大豆油	5g
		普郎尼克F68	1.0g
油酸	0.15g
		甘油(供注射用)	7.5g
加注射用水至	180mL

制备方法：

(1)称取处方量的PC80和胆固醇至烧杯中,加入20mL无水乙醇，在45℃条件下搅拌至澄清溶液，加入NCTD和剩余无水乙醇，将得到的药物-辅料混悬液于40℃在氮气环境下搅拌，搅拌速率为100r/min(液体有轻微的漩涡)的条件下反应4小时。反应结束后，在40℃加热条件下，旋蒸除乙醇。

(2)称取处方量的油酸、中链甘油三酸酯和大豆油和步骤(1)产物至油相罐中，在40℃氮气条件下加热并搅拌至溶液澄明。

(3)称取处方量的蛋黄卵磷脂PL-100M、F68、甘油至水相罐中，加入处方量约100mL注射用水，在40℃条件下加热并搅拌至溶液澄明。

(4)直接将水相迅速加入到油相中于40℃剧烈搅拌10min。完全加入后，在剪切机中16000rpm转速条件下剪切2.0min，剪切结束后冷水迅速冷却。

(5)在高压均质机下：依次于0bar均质1次，100、300、500bar各均质3次，根据初乳中药物的浓度及最终载药量加入剩余量的注射用水约80mL，然后900bar均质3次。

(6)使用1mol/L氢氧化钠调节pH值至8.20。

(7)依次过0.45和0.22μm的滤膜后，充氮气，灌封。

(8)100℃旋转水浴灭菌30min。

本实施例得到的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液制剂参数如表20所示：

表20实施例10制备得到的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液参数：

外观

粒径(nm)

PdI

电位(mV)

含量

包封率

D(90)(nm)

均一良好

178.3

0.106

-39.2

98.4％

84.1％

240

测试例1

测试本发明制备的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液的灭菌稳定性(所用制剂为实施例1制备)

试验方法：本试验分别采用灭菌方式1：湿热灭菌(121℃/15min)和灭菌方式2：过滤除菌(依次过0.45μm和0.22μm滤膜)加低温补充灭菌(100℃/30min)两种方式考察制剂的灭菌稳定性。结果如表21所示：

表21实施1制备的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液的灭菌稳定性

	粒径(nm)	PDI	电位(mV)	含量(％)	包封率(％)
						灭菌前	155.3±2.399	0.115	-34.20±2.69	100.3％	88.7％
灭菌方式1	179.8±4.210	0.144	-41.6±4.48	97.36％	69.59％
						灭菌方式2	157.7±3.190	0.068	-41.7±5.25	98.83％	86.7％

采用过滤除菌加低温补充灭菌方法进行灭菌后，本发明实施例1制备的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液制剂的物理化学稳定性良好，提高灭菌稳定性。

继续考察考察灭菌方式对实施例1制备的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液包封率和含量影响，灭菌方式为：121℃/15min，121℃/8min，100℃/30min，每种灭菌方式进行三组平行实验，结果见表22。

表22灭菌方式对实施例1制备的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液包封性能考察

由表22可以得出：灭菌温度对本发明制备的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液制剂含量无太大影响；实施1制备的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液在121℃/15min和121℃/8min条件下灭菌后包封率较低，分别在69.15％和73.8％；在100℃/30min条件下灭菌后包封率较高，可以达到86.37％。高温灭菌使药物包封率变化较大原因可能是由于在高温条件下，脂质体部分破裂，而使药物泄露。

测试例2

考察过滤对本发明制备的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液包封率和含量影响，过滤方式为：方式1：依次使用0.45μm和0.22μm滤膜过滤。结果如表23所示。

表23过滤对实施例1制备的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液的影响

组号	含量	包封率
			1(过滤前)	99.38％	90.17％
1(过滤后)	102.5％	90.8％
			2(过滤前)	100.5％	90.1％
2(过滤后)	97.5％	89.6％
			3(过滤前)	98.76％	89.2％
3(过滤后)	100.3％	89.4％

由表23可以得出：过滤操作对本发明制备的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液包封率和含量无明显影响。

由测试例1和测试例2可以得出：采用过滤除菌加低温补充灭菌方法，先将终乳用滤膜过滤，充氮，灌封，再进行低温补充灭菌，过滤除菌加低温补充灭菌方法在保证无菌水平的前提下，保障制剂结构不被破坏，显著性地提高了制剂的灭菌稳定性，兼顾制剂无菌性和灭菌稳定性；使用0.22μm滤膜过滤时，与传统纯乳剂相比，本发明提供的脂质体-乳剂复合体过滤较为顺畅，所受阻力较小，其原因在于本发明特有的脂质体包封乳剂结构，脂质囊泡具有变形而不破裂的结构特性，过滤时该脂质体-乳剂复合体会根据滤膜孔径大小，自动变形调节通过滤膜，乳剂部分作为内芯粒径较小，过滤不会对其造成影响。前期研究也表明过滤对制剂的包封率和含量无显著影响。该制剂静脉注射后可以显著提高药物的吸收效果，延长药物体内作用时间，降低注射时地血管刺激性，达到提高治疗疗效并降低毒副作用的效果。

测试例3

本测试例考察实施例1制备的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液给药系统的体外释放性能。

试验方法：本测试例采用透析法考察制剂的体外释放特性。具体方法为：将1mL本品直接添加到透析袋(MWCO 3500)中，然后浸入释放介质(pH 7.4PBS磷酸盐缓冲液，30mL)中，置于37℃，100rpm的摇床中。以预定的间隔(5min、15min、30min、45min、60min、120min和240min)取出2mL试样，并用新鲜释放液替换。样品溶液通过0.22μm的聚酰胺滤膜，然后通过HPLC分析。每个样品进行三次重复分析。结果如图6所示，表6中的1为实施例1制备的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液，表6中的2为去甲斑蝥素溶液。

在体外累计释放中研究中，去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体在4h内累计释放为14.57％，去甲斑蝥素溶液在4h内累计释放为86.83％。去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体具有缓释释放行为。

测试例4

本测试例考察实施例1制备的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液对肝癌H22瘤株荷瘤小鼠给药后肿瘤组织分布。

先建立肝癌H22瘤株荷瘤小鼠模型。待肿瘤体积增至100mm³以上，分两组分别注射NCTD溶液和实施1制备的去甲斑蝥素脂质体-乳剂混合给药系统(NCTD liposome-emulsionhybrid delivery system，NLEH)，给药剂量为2.7mg/kg，于尾静脉给药后0.5h、1h、2h、4h、6h、12h、24h，摘眼球取血后，立即断头处死，每组每个时间点3只；立即解剖取心，肝，脾，肺，肾，和肿瘤，用生理盐水洗去内容物或血液，并用滤纸吸干水分，于-80℃冰箱保存待测。

按照NCTD含量测定方法，结果如图7所示，图7中的A为在H22荷瘤C57BL/6小鼠中静脉注射NCTD溶液和NLEH(2.7mg kg-1)后不同时间肿瘤中的组织分布(n＝3)；图7中的B和图7中的C分别为不同时间血浆和不同时间心脏中药物浓度(n＝3)；图7中的D为NCTD不同时间肝脏、肾脏、脾脏和肺组织分布的含量结果，(n＝3)；图7中的E为NLEH不同时间肝脏、肾脏、脾脏和肺组织分布的含量结果，(n＝3)。

静脉注射后，NCTD组的NCTD浓度在4h时在肿瘤内达到最大值，然后下降，而NLEH组从0.5～24h逐渐升高。24h后，NLEH组肿瘤中NCTD浓度是对照溶液组的7.43倍(如图7中的A)。血浆浓度-时间曲线的结果与大鼠一致，对照组给药后迅速分布到每个器官。在30分钟时观察到，在肾脏中的最大浓度(7215±760.988ng·g^-1)，并在1小时后迅速下降至3088±546.193ng·g^-1，表明大量NCTD被在短时间内消除，这可能会导致肾毒性(图7中的D)。与NCTD相比，试验组在更大程度上降低了肾毒性。并且NLEH在心脏中的浓度低于NCTD组。肿瘤、肝脏和脾脏的靶向效率(AUC_0-24)增加，分别比NCTD高1.19、1.40和1.21倍。对肾脏和心脏的靶向效率降低，分别为0.77和0.73倍。因此，与NCTD组相比，NLEH的应用可以降低肾毒性和心脏毒性，达到一定的肿瘤靶向能力。

NLEH显着增强的肿瘤靶向性和降低的毒性可归因于脂质体-乳剂复合体的独特结构和特性，体内肿瘤靶向积累的增加可归因于延长的血液循环、减少的清除、改善的吸收以及增强的渗透性和保留(EPR)效应。在NLEH组中，超过80％的NCTD被封装在制剂中，这在很大程度上避免了分布到心脏中。因此，去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液可以降低肾毒性和心脏毒性，提高肿瘤靶向能力。

测试例5

本测试例考察实施例1制备的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液联合给药性能。

先建立肝癌H22瘤株荷瘤小鼠模型。待肿瘤体积生长到50mm³以上时，根据瘤体积大小并且按组间一致性原则，将荷瘤小鼠随机分为8组，A：生理盐水组(iv)；B：去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体组(NLEH)(iv)；D：PD-1抑制剂组(ip)；E：罗氏PD-L1抑制剂组(ip)；H：PD-L1抑制剂组(ip)；I：去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体(iv)+PD-1抑制剂(ip)；M：去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体(iv)+罗氏PD-L1抑制剂(ip)；Y：去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体(iv)+PD-L1抑制剂(ip),每组5只。剂量如下：去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体给药剂量为2.7mg/kg，每周两次,连续静脉给药三周；PD-1/PD-L1抑制剂给药剂量为10mg/kg,每周两次，连续腹腔注射给药三周。

实验结果如图8所示：图8中的A为肿瘤细胞注射后不同组的肿瘤体积变化曲线，图8中的B为相对肿瘤体积变化曲线，图8中的C为肿瘤重量变化曲线，图8中的D为生存变化曲线，具体为第12天给药(NCTD 2.7mg·kg^-1，静脉给药，α-PD-1/PD-L110 mg kg-1腹腔给药)(n＝5)图8中的E为第12天、第15天和第32天不同组的白细胞(WBC)数目(n＝3)，图8中的F为第12天、第15天和第32天不同组的中性粒细胞与淋巴细胞的比值(NLR)(n＝3)。

由图8可以得出：生理盐水组的肿瘤生长最快，而其他组对肿瘤生长有一定的抑制作用。α-PD-L1组在使用单一疗法时表现出最好的抗肿瘤活性。联合组的抗肿瘤活性优于任何单组，NLEH和α-PD-L1组显示出最佳的肿瘤抑制作用。所有组的平均体重均增加。在肿瘤重量方面，联合治疗组与单一PD-1/PD-L1抑制剂组之间存在明显差异。因此，具有高抗肿瘤效率的NLEH可以增强PD-1/PD-L1抑制剂，其中NLEH和α-PD-1联合疗法具有最好的抗肿瘤活性。

白细胞(WBC)是身体对抗疾病的“卫士”。NLEH组的WBC数目逐渐增加。此外，与生理盐水组相比，所有组的WBC均显著增加，这表明免疫力提高。中性粒细胞与淋巴细胞比率(NLR)是全身炎症的生物标志物，升高表明癌症患者的预后较差，生存时间较短。生理盐水组NLR逐渐升高，H、I组逐渐降低，B、Z组平稳。在第15天和第32天，所有给药组的NLR均低于生理盐水组,没有给药组导致更差的预后，α-PD-L1组和NLEH与α-PD-1联合给药组似乎是最好的治疗方法。由试验得出，NLEH促进抗肿瘤免疫力，能够加强PD-1/L1抑制剂的活性。

测试例6

本测试例考察实施例1制备的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液对肿瘤细胞的抑制作用。

试验方法：取对数生长期的H22细胞，1×10⁴cells/孔接种在96孔板中，10μL不同浓度的含药培养液分别加入到每孔中，同时加入不含药物的细胞培养液作为对照组(Control)，不加细胞只加PBS作为空白组(Blank),每个浓度设定6个复孔。继续在培养箱中培养24h、48h或72h，每孔加入CCK-8溶液10μL，继续于培养箱中孵育4h后，酶标仪测定450nm处吸光度。按照公式1计算细胞存活率，并计算抑制50％细胞生长时的药物浓度，即IC₅₀值。

测试结果如表24和图9所示，图9为用H22细胞测定NCTD溶液和NCTD脂质体-乳剂复合体给药系统(NLEH)的48小时细胞存活率(n＝6)。

表24 NCTD溶液和NCTD脂质体-乳剂复合体给药系统(NLEH)IC₅₀值.

表24和图9结果表明，去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体给药系统对肿瘤细胞具有较好的杀伤作用。

测试例7

本测试例考察实施例1制备的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液的药动学研究实验。

临床推荐给药剂量为一日一次10～30mg。参照《化学药物非临床药代动力学研究技术指导原则》剂量选择项下确定大鼠中剂量组为2.7mg/kg。SD大鼠15只，体重180±20g，分为NLEH组、溶液组，每组6只以及空白组3只。按2.7mg·kg^-1的剂量于尾静脉注射给药后5,15,30,45,60,120,240,360,480,720,1440min眼眶取血采集血浆样品，将采集的血浆样品置于用肝素润洗过的EP管中，4000rpm离心10min，吸取上层血浆于-20℃冷冻保存。处理后，通过LC-MS/MS测定药物浓度。

测试结果如表25和图10所示，图10为静脉注射NCTD脂质体-乳剂复合体注射液(NLEH)和NCTD溶液后NCTD的血浆浓度-时间曲线(n＝6)。

表25 NCTD脂质体-乳剂复合体注射液(NLEH)和NCTD溶液的药代动力学参数。(n＝6)

NCTD脂质体-乳剂复合体的曲线下面积(AUC)值是NCTD溶液的1.93倍；t1/2值比溶液增加了208.11％，表明血液循环延长；清除率(CL)值比溶液高59.09％，这表明其可以更大程度地降低网状内皮系统(RES)的清除率。

测试例8

本测试例考察实施例1制备的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液的药效学研究。

试验方案：将患有肝癌(H22)(约100mm³)的雄性C57BL/6小鼠(20±2g，4-6周)随机分为三组(n＝5)，包括NTCD溶液组、NCTD脂质体-乳剂混合给药系统(NLEH)组和生理盐水组。第12天，通过尾静脉给药。并在三周内(每周两次)对小鼠给药，记录体重和肿瘤大小。第32天处死小鼠，记录最终体重、肿瘤重量和肿瘤体积。此外，在第12、15和32天，每天早上取100μL小鼠血液进行血常规检查(n＝3)。肿瘤体积由公式2计算：

测试结果如图11所示，图11中的A为H22异位荷瘤C57BL/6小鼠肿瘤细胞注射后不同组的肿瘤体积，第12天给药(NCTD 2.7mg kg-1，静脉给药)(n＝5)，*P<0.05vs生理盐水；图11中的B为第32天不同组的肿瘤重量(n＝5)，**P<0.01，***P<0.001；图11中的C为注射肿瘤细胞后不同组的体重变化(n＝5)；图11中的D为第12、15和32天不同组的白细胞(WBC)数目(n＝3)。

由图11所示：与NCTD组相比，NLEH注射液组具有更好的抗肿瘤效率。NLEH组的平均肿瘤重量是NCTD溶液和生理盐水组的57.76％和30.27％。所有这些都证明了NLEH在体内取得了更好的抗肿瘤效果。此外，NLEH组和NCTD组的平均体重与对照组没有显着差异，证实NCTD对正常细胞的影响很小。白细胞(WBC)是身体对抗疾病的“卫士”。NLEH和NCTD组的WBC计数逐渐增加，NLEH组的升白作用效果最好。

测试例9

本测试例考察实施例1制备的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液对小鼠急性毒性试验考察。

本测试例以ICR小鼠为实验动物，对去甲斑蝥酸钠注射液和去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液进行了小鼠尾静脉给药急性毒性试验。经过预实验结果，最终确定去甲斑蝥酸钠注射液组给药方案为：剂量设计为5.00mg/kg、6.58mg/kg、8.66mg/kg、11.40mg/kg、15.00mg/kg。共5个剂量组，每组20只动物，雌雄各半。分别一次性尾静脉注射给予0.25mg/mL、0.33mg/mL、0.43mg/mL、0.57mg/mL、0.75mg/mL去甲斑蝥酸钠注射液，注射体积为0.2mL/10g。给药后持续观察14天，记录动物中毒症状和死亡时间，称量死亡实验动物体重及定期称量存活实验动物体重，所有试验动物均进行大体解剖及肉眼观察。用Bliss法计算LD₅₀。

实施例1制备的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液组给药方案为：剂量设计为11.95mg/kg、14.22mg/kg、16.93mg/kg、20.16mg/kg、24.00mg/kg。共5个剂量组，每组20只动物，雌雄各半。分别一次性尾静脉注射给予0.60mg/mL、0.71mg/mL、0.85mg/mL、1.01mg/mL、1.20mg/mL去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液，注射体积为0.2mL/10g。给药后持续观察14天，记录动物中毒症状和死亡时间，称量死亡实验动物体重及定期称量存活实验动物体重，所有试验动物均进行大体解剖及肉眼观察。用Bliss法计算LD₅₀。

去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液(NLEH)对小鼠急性静脉给药半数致死(LD₅₀)为：

雄性大鼠：15.67mg/kg(LD₅₀95％的可信限13.61—17.58mg/kg)

雌性大鼠：16.64mg/kg(LD₅₀95％的可信限15.14—18.25mg/kg)

去甲斑蝥酸钠注射液对小鼠急性静脉给药半数致死量(LD₅₀)为：

雄性大鼠：10.10mg/kg(LD₅₀95％的可信限8.33—13.10mg/kg)

雌性大鼠：8.93mg/kg(LD₅₀95％的可信限6.92—11.77mg/kg)

结果表明，将去甲斑蝥素制备成脂质体-乳剂复合体注射液后，其LD₅₀约为普通注射液的2倍，说明去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液能够在一定程度上降低药物本身的毒性，扩大了治疗窗，提高药物临床使用安全性。

测试例10

本测试例考察实施例1制备的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液新西兰兔血管刺激性试验研究考察。

受试物去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液及其参比制剂去甲斑蝥酸钠注射液的给药浓度均为2mg/mL(相当于临床静脉给药浓度)，空白基质组动物给予空白脂质体-乳剂复合体注射液，上述三组动物的给药体积均为1mL/kg，给药速度约1mL/min，每天给药一次，共7天。

结果显示，在本试验条件下，受试物去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液(给药浓度为2mg/mL)及空白脂质体-乳剂复合体注射液均未见引起新西兰兔血管刺激性反应；参比制剂去甲斑蝥酸钠注射液(给药浓度为2mg/mL)引起新西兰兔血管极轻度刺激性反应是可逆的。试验结果平行比较，受试物去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液和空白脂质体-乳剂复合体注射液未见明显差异；参比制剂去甲斑蝥酸钠注射液可引起新西兰兔血管极轻度刺激性反应，且可逆。由此可见，受试物去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液的血管刺激性低于参比制剂去甲斑蝥酸钠注射液。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液，其特征在于，包括以下质量份数的组分：去甲斑蝥素0.4～0.8份，表面活性剂3～7.5，助膜流动剂1～1.5份，稳定剂0.09～0.25份，油相溶媒20～30份，脂质体膜材1.5～5份，辅助乳化剂0.1～1.5份，渗透压调节剂3～7.5份，水150～200份。

2.根据权利要求1所述的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液，其特征在于，所述表面活性剂包括磷脂、吐温、司盘和普郎尼克中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液，其特征在于，所述助膜流动剂包括胆固醇和/或胆固醇类似物。

4.根据权利要求1所述的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液，其特征在于，所述稳定剂包括油酸和/或碱金属油酸盐。

5.根据权利要求1所述的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液，其特征在于，所述油相溶媒包括注射用合成油、注射用植物油和注射用精油中的一种或多种。

6.根据权利要求1所述的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液，其特征在于，所述脂质体膜材包括大豆磷脂和/或蛋黄卵磷脂。

7.根据权利要求1所述的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液，其特征在于，所述辅助乳化剂包括普郎尼克F68和/或普郎尼克F127。

8.根据权利要求1所述的去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液，其特征在于，所述渗透压调节剂包括甘油、山梨醇、甘露醇和葡萄糖中的一种或多种。

9.权利要求1～8任一项所述去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将去甲斑蝥素、表面活性剂、助膜流动剂、稳定剂和油相溶媒混合，得到油相；

(2)将脂质体膜材、辅助乳化剂、渗透压调节剂和水混合，得到水相；

(3)将所述油相和所述水相依次进行混合、剪切和均质，得到混合乳液；

(4)将所述混合乳液依次进行过滤除菌和低温补充灭菌，得到所述去甲斑蝥素脂质体-乳剂复合体注射液；

所述步骤(1)和步骤(2)之间没有时间顺序的限制。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述过滤除菌包括依次进行第一过滤除菌和第二过滤除菌，所述第一过滤除菌用滤膜的直径为0.45μm，所述第二过滤除菌用滤膜的直径为0.22μm；

所述低温补充灭菌的温度为100℃，所述低温补充灭菌的保温时间为20～40min。

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