CN115623986A - 一种鉴定芹菜愈伤组织完全胚性化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴别芹菜愈伤组织完全胚性化的方法。包括：芹菜愈伤组织的准备、芹菜愈伤组织的染色、染色后的愈伤组织在载玻片上直接盖上盖玻片，用压片机进行压片，使得愈伤组织细胞均匀分散开；将制作好的压片放到显微镜下进行观察，根据镜检结果判断芹菜愈伤组织胚性化程度；鉴别芹菜愈伤组织完全胚性化的标准、验证判断芹菜愈伤组织完全胚性化标准可靠性的方法等步骤。本发明公开的鉴别芹菜愈伤组织完全胚性化的方法，在体细胞诱变育种、遗传转化和植物组织脱毒培养方面都有良好的应用前景，并存在较强的技术优势。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，特别是一种涉及鉴别芹菜胚性愈伤组织完全胚性化的方法。
背景技术
芹菜（Apium graveolens L.）作为我国常见的蔬菜之一，种植历史悠久、地区广泛。芹菜在我国种植历史悠久、地区分布广泛，并且芹菜富含维生素和纤维素，对人体有益，近年来，逐渐成为我国餐桌上常见的蔬菜之一。植物的体细胞胚发生指离体的植物细胞或组织在适当的诱导条件下，通过与合子胚相似的途径，经过球形胚、鱼雷胚、心形胚和子叶胚四个阶段，形成胚状体从而发育成完整植株。诱导体细胞胚发生能够极大地发挥植物细胞的分化潜力，具有较高的遗传稳定性。然而只有愈伤组织完全胚性化，才能进行体细胞胚发生诱导出胚状体进而再生出完整植株。传统的判断愈伤组织是否胚性化的依据是通过观察细胞的形态结构特征来判断，一般根据细胞核大小和细胞的形态特征，这些都是以描述性的语言进行判断，在实际操作中无法依照量化的标准执行，因此导致愈伤组织胚性化程度不够，再生的植株数量少，质量差，无法满足试验的要求。虽然可以根据愈伤组织再生的情况进行判断，但往往要反复试验多次，浪费大量的时间和成本，而本方法采用显微镜检技术，通过显微观察计算细胞分裂频度和核占比来鉴定别愈伤组织是否完全胚性化，从而使得操作者能够精确判定芹菜愈伤组织是否完全胚性化，提高了试验效率，为进一步利用芹菜胚性愈伤组织研究与应用奠定了基础。
发明内容
本发明提供一种用显微镜检技术，通过观察计算细胞分裂频度及核占比来鉴别芹菜愈伤组织完全胚性化的方法。
为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：
一种鉴别芹菜愈伤组织完全胚性化的方法，其特征在于按如下的步骤进行：
（1）芹菜愈伤组织的准备：将诱导出的芹菜愈伤组织从培养中的器皿中取出，挑取1-2mm的小块放到载玻片上，滴2-3滴卡诺氏固定液进行固定，固定时间5-10分钟；
（2）芹菜愈伤组织的染色：用滤纸将放在载玻片上的愈伤组织周围的固定液吸干，滴1滴事先配制好的卡宝品红或醋酸洋红染色液进行染色。染色时间为10-15分钟，染色温度为25-28℃；所述的事先配制好的卡宝品红或醋酸洋红染色液进行染色。
其中卡宝品红配制方法：先配成三种原液,再配成染色液；原液A:3 g碱性品红溶于100 ml 70%酒精中；原液B:取原液A 10 ml加入到90 ml 5%石炭酸水溶液中；原液C:取原液B 55 ml,加入6 ml 冰醋酸和6 ml福尔马林(38%的甲醛)；染色液:取C液10—20 m1,加45%冰醋酸80～90 ml,再加山梨醇1.8 g,配成10%～20%浓度的石炭酸品红液,放置两周后使用,效果显著。
醋酸洋红配制方法：将洋红粉末1g倒入煮沸的100mL45%醋酸溶液中，边煮边搅拌，时间不超过30s，快速冷却，加入1%～2%铁明矾水溶液5-10滴，至此液变为暗红色而不发生沉淀为止，滤纸过滤，棕色瓶中室温保存备。
（3）染色后的愈伤组织在载玻片上直接盖上盖玻片，用压片机进行压片，使得愈伤组织细胞均匀分散开。将制作好的压片放到显微镜下进行观察，根据镜检结果判断芹菜愈伤组织胚性化程度；
（4）鉴别芹菜愈伤组织完全胚性化的标准：在显微观察的视野下，以能够看清细胞的细胞核和细胞基本轮廓为前提，一般在放大200-400倍的条件下进行观察计数。判断愈伤组织细胞完全胚性化的依据是分别选取不同视野下统计细胞的总数量在500-1000个，当被统计的细胞中处于分裂期的细胞占被观察的全部细胞的百分数达到1-2%以上时，就可以判定此时的芹菜愈伤组织细胞达到完全胚性化。另外，为了使得鉴别结果的可靠性，在计算细胞的分裂频度的同时，再引入一个参数-核占比作为判定依据，具体计算方法是统计100-200个细胞，用测微尺分别测量被观测细胞核与细胞的直径，计算它们的比值。当这一比值达到40-60%时，就可以基本判断这些细胞处于完全胚性化状态。将上述两个指标相结合，二者同时达到相应的标准时，就可以判定芹菜愈伤组织已经达到了完全胚性化。
（5）验证判断芹菜愈伤组织完全胚性化标准可靠性的方法：将判定为完全胚性化的芹菜愈伤组织转接到无激素的培养基上进行培养，培养温度为25-28℃，1000 Lx连续光照，经过50-60 d后就可以看到通过胚性化再生出的完整植株，而且每块愈伤组织上都能看到数量不等的再生苗长出。再经过移栽培养获得生长正常的芹菜植株，此时就可以判断此鉴别标准是可靠的。
本发明进一步公开了鉴别芹菜愈伤组织完全胚性化的方法在有效提高芹菜愈伤组织胚性再生效率的应用。试验结果显示通过此方法获取的芹菜体细胞胚和再生植株显著增多。
本发明加详细的描述如下：
（1）芹菜外植体的制备：选取饱满的芹菜种子，先用70%无水酒精浸泡30s,放入无菌水1min,接下来用次氯酸钠溶液（不同芹菜品种的浓度不同）进行表面消毒，再用无菌水冲洗3次，最后放到带滤纸的培养皿将表面的水吸干，将其播种到1/2MS培养基上，在培养室中进行培养。经过10-20 d时间，带种子子叶完全展开后，取下胚轴为外植体，进行愈伤组织的诱导。培养条件为：24 h连续光照，光照强度为1000 Lx，培养温度为25℃。
（2）芹菜愈伤组织的快速培养：芹菜愈伤组织用解剖刀从外植体上切下，并切成直径3 mm大小的小块，将其接种到提前配制好的培养基上。培养基的配置过程与前一步骤相同，采用MS+0.5-2 mg/LKT+0-0.2 mg/L NAA+1-2 mg/L2,4-D+30g/L蔗糖的培养基。培养条件与前面一致。
（3）芹菜松散型愈伤组织的诱导：将诱导出的芹菜愈伤组织转接到MS+0.5-1 mg/LKT+0-0.2 mg/L NAA+0.5-1 mg/L2,4-D+30g/L蔗糖的培养基上。愈伤组织培养条件调整为2000 Lx光照，24 h光周期，培养温度在23℃。每次继代时间为15 d，继代培养要选择结构松散，质地较硬，颜色为黄绿色的愈伤组织。经过3-5次继代培养获得芹菜松散型愈伤组织。
（4）芹菜松散型胚性愈伤组织的诱导：将诱导出的芹菜松散型愈伤组织转接到MS+0.1-0.5 mg/LKT+0.5-1 mg/L2,4-D+30g/L蔗糖的培养基上。培养条件与前面一致。每次继代时间为15 d，经过3-5次继代培养获得芹菜松散型胚性愈伤组织。松散型胚性愈伤组织颜色为黄绿色，结构松散，质地较硬。
（5）芹菜愈伤组织的准备：将诱导出的芹菜愈伤组织从培养中的器皿中取出，挑取1-2mm的小块放到载玻片上，滴2-3滴卡诺氏固定液进行固定，固定时间5-10分钟；
（6）芹菜愈伤组织的染色：用滤纸将放在载玻片上的愈伤组织周围的固定液吸干，滴1滴事先配制好的卡宝品红或醋酸洋红染色液进行染色。染色时间为10-15分钟，染色温度为25-28℃；
（7）染色后的愈伤组织在载玻片上直接盖上盖玻片，用压片机进行压片，使得愈伤组织细胞均匀分散开。将制作好的压片放到显微镜下进行观察，根据镜检结果判断芹菜愈伤组织胚性化程度；
（8）鉴别芹菜愈伤组织完全胚性化的标准：在显微观察的视野下，以能够看清细胞的细胞核和细胞基本轮廓为前提，一般在放大200-400倍的条件下进行观察计数。判断愈伤组织细胞完全胚性化的依据是分别选取不同视野下统计细胞的总数量在500-1000个，当被统计的细胞中处于分裂期的细胞占被观察的全部细胞的百分数达到1-2%以上时，就可以判定此时的芹菜愈伤组织细胞达到完全胚性化。另外，为了使得鉴别结果的可靠性，在计算细胞的分裂频度的同时，再引入一个参数-核占比作为判定依据，具体计算方法是统计100-200个细胞，用测微尺分别测量被观测细胞核与细胞的直径，计算它们的比值。当这一比值达到40-60%时，就可以基本判断这些细胞处于完全胚性化状态。将上述两个指标相结合，二者同时达到相应的标准时，就可以判定芹菜愈伤组织已经达到了完全胚性化。
（9）验证判断芹菜愈伤组织完全胚性化标准可靠性的方法：将判定为完全胚性化的芹菜愈伤组织转接到无激素的培养基上进行培养，培养温度为25-28℃，1000 Lx连续光照，经过50-60d后就可以看到通过胚性化再生出的完整植株，而且每块愈伤组织上都能看到数量不等的再生苗长出。再经过移栽培养获得生长正常的芹菜植株，此时就可以判断此鉴别标准是可靠的。
本发明的创新点在于采用显微镜检技术，通过计算显微观察下细胞分裂频度和核占比的多少来判定芹菜愈伤组织是否完全胚性化。
本发明公开的鉴别芹菜愈伤组织完全胚性化技术与现有技术相比所具有的积极效果在于：通过计算显微观察下细胞分裂频度和核占比的多少来判定芹菜愈伤组织是否完全胚性化时，试验可操作性加强，获得芹菜完全胚性化的愈伤组织效率大大提高，同时降低了再生苗的畸形率，获得大量生长正常的完整植株。
附图说明
图1为松散型胚性愈伤组织显微镜图；
图2为松散型胚性愈伤组织带有分裂相显微镜图；
图3为体细胞胚；
图4为再生植株。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂例如卡诺氏固定液、配制卡宝品红和醋酸洋红等试剂原料均有市售。
实施例1
材料
本试验采用的芹菜（Apium graveolens L.）2号品种的种子由天津津润益农农业科技有限公司提供（对于进行科学研究的单位和个人，对外可以免费为提供）。该材料是一种杂交亲本，并经过筛选出的健康、饱满的种子。
方法
（1）芹菜外植体的制备：选取饱满的芹菜2号种子，采用70%浓度的酒精浸泡30 s,用无菌水浸泡1 min,再用5%浓度次氯酸钠溶液浸泡7min,最后用无菌水换洗3次，最后放到带滤纸的培养皿将表面的水吸干。将其播种到1/2MS培养基上，在培养室中进行培养。经过20 d时间，带种子子叶完全展开后，取下胚轴为外植体，进行愈伤组织的诱导。培养条件为：24 h连续光照，光照强度为1000 Lx，培养温度为25℃。
（2）芹菜愈伤组织的快速培养：芹菜愈伤组织从外植体上切下，并切成直径3 mm大小的小块，将其接种到提前配制好的培养基上。培养基的配置过程与前一步骤相同，采用MS+0.5 mg/LKT+0.2 mg/L NAA+1 mg/L2,4-D+30 g/L蔗糖的培养基。培养条件与前面一致。
（3）芹菜松散型愈伤组织的诱导：将诱导出的芹菜愈伤组织转接到MS+0.5 mg/LKT+0.5 mg/L2,4-D+30 g/L蔗糖的培养基上。培养条件调整为2000 Lx光照，24 h光周期，培养温度在23℃。每次继代时间为15 d，经过3次继代培养获得芹菜松散型愈伤组织。
（4）芹菜松散型胚性愈伤组织的诱导：将诱导出的芹菜松散型愈伤组织转接到MS+0.1 mg/LKT+0.5 mg/L2,4-D+30 g/L蔗糖的培养基上。培养条件与前面一致。每次继代时间为15 d，经过3次继代培养获得芹菜松散型胚性愈伤组织。
（5）芹菜愈伤组织的准备：将诱导出的芹菜愈伤组织从培养中的器皿中取出，挑取1 mm的小块放到载玻片上，滴2滴卡诺氏固定液进行固定，固定时间10分钟；
（6）芹菜愈伤组织的染色：用滤纸将放在载玻片上的愈伤组织周围的固定液吸干，滴1滴事先配制好的卡宝品红或醋酸洋红染色液进行染色。染色时间为15分钟，染色温度为26℃；
（7）染色后的愈伤组织在载玻片上直接盖上盖玻片，用压片机进行压片，使得愈伤组织细胞均匀分散开。将制作好的压片放到显微镜下进行观察，根据镜检结果判断芹菜愈伤组织胚性化程度；
（8）鉴别芹菜愈伤组织完全胚性化的标准：在显微观察的视野下，以能够看清细胞的细胞核和细胞基本轮廓为前提，一般在放大200-400倍的条件下进行观察计数。分别选取不同视野下统计细胞的总数量在1000个，被统计的细胞中处于分裂期的细胞占被观察的全部细胞的百分数为1.64%，就可以判定此时的芹菜愈伤组织细胞达到完全胚性化。另外，为了使得鉴别结果的可靠性，在计算细胞的分裂频度的同时，再引入一个参数-核占比作为判定依据，具体计算方法是统计100个细胞，用测微尺分别测量被观测细胞核与细胞的直径，再计算它们的比值。这一比值为51.2%，就可以基本判断这些细胞处于完全胚性化状态。将上述两个指标相结合，二者同时达到相应的标准时，就可以判定芹菜愈伤组织已经达到了完全胚性化。
（9）验证判断芹菜愈伤组织完全胚性化标准可靠性的方法：将判定为完全胚性化的芹菜愈伤组织转接到无激素的培养基上进行培养，培养温度为26℃，1000 Lx连续光照，经过50-60 d后就可以看到通过胚性化再生出的完整植株，而且每块愈伤组织上都能看到数量不等的再生苗长出。再经过移栽培养获得生长正常的芹菜植株，此时就可以判断此鉴别标准是可靠的。
实施例2
对比实验
进行本发明的鉴别和传统的鉴别的对比试验，对40个芹菜愈伤组织进行诱导，在胚性化、再生植株数、质量再生苗的畸形率和试验效率进行比较：
结论：通过本发明的鉴别和传统的鉴别对比试验，在胚性化、再生植株数和试验效率中，本发明鉴别显著高于传统鉴别，并且在质量再生苗的畸形率中，本发明鉴别显著低于传统鉴别。说明本发明在鉴定芹菜愈伤组织完全胚性化是有显著效果的。
在详细说明的较佳实施例之后，熟悉该项技术人士可清楚地了解，在不脱离上述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所作任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。且本发明亦不受说明书中所举实例实施方式的限制。
Claims (2)
1.一种鉴别芹菜愈伤组织完全胚性化的方法，其特征在于按如下的步骤进行：
（1）芹菜愈伤组织的准备：将诱导出的芹菜愈伤组织从培养中的器皿中取出，挑取1-2mm的小块放到载玻片上，滴2-3滴卡诺氏固定液进行固定，固定时间5-10分钟；
（2）芹菜愈伤组织的染色：用滤纸将放在载玻片上的愈伤组织周围的固定液吸干，滴1滴事先配制好的卡宝品红或醋酸洋红染色液进行染色，染色时间为10-15分钟，染色温度为25-28℃；
（3）染色后的愈伤组织在载玻片上直接盖上盖玻片，用压片机进行压片，使得愈伤组织细胞均匀分散开；将制作好的压片放到显微镜下进行观察，根据镜检结果判断芹菜愈伤组织胚性化程度；
（4）鉴别芹菜愈伤组织完全胚性化的标准：在显微观察的视野下，以能够看清细胞的细胞核和细胞基本轮廓为前提，在放大200-400倍的条件下进行观察计数；判断愈伤组织细胞完全胚性化的依据是分别选取不同视野下统计细胞的总数量在500-1000个，当被统计的细胞中处于分裂期的细胞占被观察的全部细胞的百分数达到1-2%时，就判定此时的芹菜愈伤组织细胞达到完全胚性化；在计算细胞的分裂频度的同时，再引入一个参数-核占比作为判定依据，具体计算方法是统计100-200个细胞，用测微尺分别测量被观测细胞核与细胞的直径，计算它们的比值；这一比值达到40-60%时，就判断这些细胞处于完全胚性化状态；上述两个指标相结合，二者同时达到相应的标准时，就判定芹菜愈伤组织已经达到了完全胚性化；
（5）验证判断芹菜愈伤组织完全胚性化标准可靠性的方法：将判定为完全胚性化的芹菜愈伤组织转接到无激素的培养基上进行培养，培养温度为25-28℃，1000 Lx连续光照，经过50-60 d后，到通过胚性化再生出的完整植株，而且每块愈伤组织上都能看到数量不等的再生苗长出，经过移栽培养获得生长正常的芹菜植株，就判断此鉴别标准是可靠的。
2.权利要求1所述鉴别芹菜愈伤组织完全胚性化的方法在提高芹菜愈伤组织胚性化再生效率上的应用。
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