CN115605579A

CN115605579A - 用于产生硫辛酸的代谢工程化

Info

Publication number: CN115605579A
Application number: CN202180018634.8A
Authority: CN
Inventors: 张旭; 陈彬彬; 符儒伦; 凌华
Original assignee: National University of Singapore
Current assignee: National University of Singapore
Priority date: 2020-03-02
Filing date: 2021-03-02
Publication date: 2023-01-13
Also published as: WO2021177896A1; US20230123431A1; TW202146641A

Abstract

本发明提供了一种在分离的基因工程化细菌或酵母细胞中提高游离硫辛酸产生的方法。所述方法涉及在补充半胱氨酸的培养基中培养所述工程化细菌或酵母，所述工程化细菌或酵母被编码多核苷酸分子的重组表达载体转化，从而导致与至少一种启动子连接的以下基因的过表达：(1)底物蛋白(例如Gcv3p)；(2)辛酰基转移酶或硫辛酰合酶；(3)辅因子S‑腺苷甲硫氨酸合酶；和(4)硫辛酰胺酶。本发明还涉及其工程化细菌或酵母细胞。

Description

用于产生硫辛酸的代谢工程化

技术领域

本发明提供了能够提高游离硫辛酸产生的基因工程化细菌或酵母细胞、重组载体和用于产生游离硫辛酸的方法。更具体地，所述游离硫辛酸为R-硫辛酸。

背景技术

硫辛酸是参与大多数生物体中的有氧代谢和甘氨酸裂解系统的几种关键酶所需的必需辅因子(Cronan等人,Advances in Microbial Physiology,RK.Poole编辑,Academic Press.103-146(2005)；Cronan,Microbiology and Molecular BiologyReviews 80:429-450(2016))。由于它能够与自由基直接或间接结合，它可以用作膳食补充的抗氧化剂(Croce等人,Toxicology in Vitro 17:753-759(2003))。此外，来自临床试验的发现已经表明硫辛酸可以提高胰岛素的敏感度，这支持其作为抗糖尿病药物的应用(Lee等人,Biochemical and Biophysical Research Communications 443:885-891(2005))。还已证明硫辛酸可抑制乳腺肿瘤细胞的增殖，表明它具有作为抗癌药物的潜在应用(Li等人,Genetics and Molecular Research 14:17934-17940(2015))。目前，硫辛酸主要通过化学合成工艺获得，这通常产生等量的两种对映异构R形式和S形式的硫辛酸(Balkenhohl和Paust,Zeitschrift for Naturforschung Section B-a Journal of ChemicalSciences 54:649-654(1999)；Ide等人,Journal of Functional Foods 5:71-79(2013))。然而，在生物系统中，硫辛酸仅以R形式存在；S-硫辛酸是化学合成过程中的副产物。因此，R-硫辛酸一般显示出优于S-硫辛酸的生物活性，并且在一些情况下，S-硫辛酸对健康是有害的。例如，已证明R-硫辛酸可保护眼睛中的晶状体免于形成白内障，而S-硫辛酸通过加剧晶状体退化而显示出相反的作用(Kilic等人,Biochem Mol Biol Int 37:361-370(1995))。因此，获得呈对映异构体纯形式的R-硫辛酸有益于使硫辛酸的健康效应最大化并且防止由S-硫辛酸引起的潜在副作用。然而，用于获得纯R-硫辛酸的手性分离和不对称合成方法导致S形式的硫辛酸或具有非所需手性的前体的浪费(US 5,281,722A；US 6,670,484 B2；US 6,864,374 B2；Purude等人,Tetra-hedron-Asymmetry 26:281-287(2015))，因此降低合成化合物时的资源利用效率。

此外，与外消旋硫辛酸的合成相比，这些用于制备纯R-硫辛酸的程序延长了生产过程，并且需要另外的试剂和溶剂，这导致更高的制造成本和对环境更大的影响。鉴于R-硫辛酸的化学合成还涉及毒性试剂和催化剂，并且需要许多步骤，对微生物细胞工厂进行生物工程化以产生游离R-硫辛酸为以可持续且环境友好的方式获得对映异构体纯的R-硫辛酸提供了一种有吸引力的途径。已经在包括大肠杆菌(Escherichia coli)、食爬虫假单胞菌(Pseudomonas reptilivora)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等在内的细菌中证明了通过代谢工程化用细菌产生硫辛酸(Ji等人,Biotechnology Letters 30:1825-1828(2008)；Moon等人,AppliedMicrobiology and Biotechnology 83:329-337(2009)；Christensen等人,Mol Microbiol80:350-363(2011)；Storm,Curr Pharm Des 18:3480-3489(2012)；Sun等人,PLoS one 12:e0169369-e0169369(2017))。在过去的二十年里，对大肠杆菌(E.coli)中的硫辛酸生物合成和蛋白质硫辛酰化途径的研究是最为充分的。在大肠杆菌中，硫辛酸生物合成和蛋白质硫辛酰化有两种互补的途径：(i)从头生物合成途径，其中内源辛酸通过LipB与脱辅基蛋白附接，然后通过LipA插入硫；以及(ii)清除途径，其中外源硫辛酸或辛酸通过Lp1A转移到未硫辛酰化的脱辅基形式的蛋白质上(Sun等人,PLoS one 12:e0169369-e0169369(2017))。

与细菌相比，由于它固有地能够耐受低温、pH变化和噬菌体攻击，作为模式酵母菌株的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为生物化学生产提供了许多优势(Chen等人,Metabolic Engineering 31:53-61(2015)；Jin等人,Biotechnol Bioeng 113:842-851(2016)；Foo等人,Biotechnology and Bioengineering 114:232-237(2017))。重要的是，与大肠杆菌不同，酵母缺乏经由消耗ATP且消耗能量的过程将游离硫辛酸与蛋白质结合的硫辛酸清除途径(Booker,Chemistry&Biology 11:10-12(2004))。因此，酿酒酵母(S.cerevisiae)固有地不消耗游离硫辛酸，这是一种有益的特征，从而允许积累目标化合物，即游离R-硫辛酸。

在酵母中，存在三种众所周知的硫辛酸依赖性酶系统：甘氨酸裂解系统(GCV)、α-酮戊二酸脱氢酶(KGDC)和丙酮酸脱氢酶(PDH)(Schonauer等人,Journal of BiologicalChemistry 284:23234-23242(2009))。GCV参与甘氨酸裂解为氨和C1单元，这对于将甘氨酸用作唯一氮源是至关重要的(Sinclair和Dawes,Genetics 140:1213-1222(1995)；Piper等人,FEMS Yeast Research 2:59-71(2002))。KGDC催化2-氧戊二酸氧化脱羧为琥珀酰辅酶A，它是几种氨基酸的前体和琥珀酸(呼吸链的入口点)的来源(Repetto和Tzagoloff,Molecular and Cellular Biology 11:3931-3939(1991))。PDH催化丙酮酸的氧化脱羧，从而将胞质糖酵解和线粒体呼吸联系起来(Boubekeur等人,Journal of BiologicalChemistry,274(30):21044-21048(1999))。Gcv3p、Kgd2p和Lat1p分别为GCV、KGDC和PDH的硫辛酸结合亚基(Nagarajan和Storms,Journal of Biological Chemistry 272:4444-4450(1997))。不同于大肠杆菌，对酵母中的硫辛酸合成和与目标蛋白的附接的了解不是那么充分。为了形成硫辛酰化的Gcv3p、Kgd2p和Lat1p，已经为酵母线粒体中的硫辛酸合成和蛋白质附接假设了两步转化(Hermes和Cronan,Yeast 30:415-427(2013))。已证明Lip2p和Lip3p可编码利用辛酰基-ACP或辛酰辅酶A将辛酰基与脱辅基形式的硫辛酸依赖性蛋白附接的辛酰基转移酶(Stuart等人,FEBS Letters 408:217-220(1997)；Marvin等人,FEMSMicrobiology Letters 199:131-136(2001)；Hermes和Cronan,Yeast 30:415-427(2013))。硫辛酰合酶Lip5p催化将两个硫插入辛酸碳链中(Sulo和Martin,Journal ofBiological Chemistry 268:17634-17639(1993))。最终，硫辛酸经由其羧基与蛋白质的赖氨酸残基的ε氨基之间的酰胺键结合到Gcv3p、Kgd2p和Lat1p上(Sulo和Martin,Journal ofBiological Chemistry 268:17634-17639(1993))。有趣的是，已经发现Lip2p和Lip5p为所有三种蛋白质的硫辛酰化所需，而Lip3p为Kgd2p和Lat1p的硫辛酰化所需，但不为Gcv3p的硫辛酰化所需(Hermes和Cronan,Yeast 30:415-427(2013))。为了从硫辛酸结合蛋白中释放游离硫辛酸，分离并表征了来自粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的硫辛酰胺酶(EfLPA)，它是酰胺水解酶Ser-Ser-Lys家族的成员(Jiang和Cronan,Journal ofBiological Chemistry 280:2244-2256(2005))。已经证明此酶可从来自大肠杆菌的GCV的硫辛酸结合H蛋白以及KGDC和PDH的E2亚基中释放游离硫辛酸(Spalding和Prigge,PLoSone 4:e7392(2009))。虽然已经在细菌宿主中展示出EfLPA的功能性异源表达，但据诸位发明人所知，EfLPA在酵母中的活性是未知的。

需要改进用于产生游离R-硫辛酸的方法。因此，对酿酒酵母作为游离R-硫辛酸生物合成的潜在生产宿主进行了研究。在下文中，硫辛酸特指R-硫辛酸。

发明内容

已经证明EfLPA可从来自大肠杆菌的GCV的硫辛酸结合H蛋白以及KGDC和PDH的E2亚基中释放游离硫辛酸(Spalding和Prigge,PLoS one 4:e7392(2009))。诸位发明人采用了代谢工程化策略来改进硫辛酸的产生。首先，证实了硫辛酸结合蛋白在酵母中的可用性，然后通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)对它们进行了表征。确定了EfLPA的体外活性以便验证其功能性表达并选择合适的硫辛酰化的蛋白质作为EfLPA的目标底物。为了开发产生游离硫辛酸的菌株，EfLPA被修饰以易位到硫辛酰化的蛋白质所存在的线粒体中。最后，为了提高硫辛酸的产生，过表达了所选择的底物蛋白(即Gcv3p)、催化酶(即Lip2p和Lip5p)和辅因子再生酶(即Sam1p和Sam2p)(图1)。蛋白质组学分析、酶表征和代谢工程化方法共同使前所未有的在酿酒酵母中产生游离硫辛酸得以实现。

在第一方面，本发明提供了一种分离的基因工程化细菌或酵母细胞，其中所述细菌或酵母细胞已经被至少一种多核苷酸分子转化；所述至少一种多核苷酸分子包括可操作地连接到至少一种启动子的硫辛酸途径基因，所述硫辛酸途径基因编码辛酰基转移酶、硫辛酰合酶、硫辛酰化的蛋白质底物、硫辛酰胺酶和/或S-腺苷甲硫氨酸合酶，其中至少一种硫辛酸途径基因是异源的，并且所述基因工程化细菌或酵母细胞与未转化的细胞相比能够提高游离硫辛酸的产生。

所述硫辛酰化的蛋白质底物可以是本领域已知的任何合适的底物，并且可以选自Gcv3p、Lat1p和Kgd2p。

应理解，所述S-腺苷甲硫氨酸合酶可以是本领域已知的任何合适的酶，优选地来自选自以下的细胞：克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、耶氏酵母属(Yarrowia)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、酵母属物种(Saccharomyces spp.)和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。优选地，所述S-腺苷甲硫氨酸合酶为S-腺苷甲硫氨酸合酶1(Sam1)和/或S-腺苷甲硫氨酸合酶2(Sam2)，更优选地，Sam1和Sam2来自酿酒酵母。

在一些实施方案中，所述硫辛酸途径基因包括LIP2(辛酰基转移酶)、LIP5(硫辛酰合酶)、GCV3(甘氨酸裂解系统H蛋白)、LPA(硫辛酰胺酶)、SAM1和/或SAM2。

在一些实施方案中，所述硫辛酸途径基因在线粒体中表达。

在一些实施方案中，所述硫辛酸途径基因借助线粒体靶向肽(MTP)在线粒体中表达。已发现蛋白质诸如Gcv3p、Lat1p和Kgd2p可以通过其天然MTP而被靶向到线粒体，而LPA、Sam1p和Sam2p可以使用非天然MTP(诸如来自酵母细胞色素c氧化酶亚基IV的MTP)而被靶向到线粒体。

在一些实施方案中，所述线粒体靶向肽(MTP)来自酵母细胞色素c氧化酶亚基IV(COX4)。在一些实施方案中，所述COX4 MTP的氨基酸序列为5’-MLSLRQSIRFFKPATRTLCSSRYLLQQKP-3’(SEQ ID NO:45)。

在一些实施方案中，所述酵母选自克鲁维酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、耶氏酵母属、德巴利酵母属、酵母属物种和粟酒裂殖酵母。优选地，所述酵母为酿酒酵母。

在一些实施方案中，所述至少一种启动子为组成型启动子。

在一些实施方案中，所述硫辛酰胺酶(LPA)来自粪肠球菌，称为EfLPA。优选地，对EfLPA基因进行密码子优化以在酿酒酵母中表达。如果使用EfLPA基因，则优选的是，所述被靶向进行硫辛酰化的蛋白质底物为Gcv3p。

在一些实施方案中，所述硫辛酸途径基因由一种或多种质粒表达。可替代地，编码所述异源硫辛酸途径基因中的一种或多种的表达盒可以使用整合型载体(诸如实施例1中描述的pIS385)而被整合到基因组中。应理解，整合到宿主DNA中可以提供永久性表达，而质粒表达倾向于是瞬时的。

在一些实施方案中，所述硫辛酸途径基因中的至少一种被整合到所述细菌或酵母的基因组中。

在一些实施方案中，所述LIP2、LIP5、GCV3、LPA、SAM1和/或SAM2基因分别编码包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:11所示的序列的氨基酸序列。应理解，由于遗传密码的冗余，核酸序列与参考序列可以具有小于100％的同一性，并且仍编码相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述LIP2基因包含与SEQ ID NO:2所示的序列具有至少70％序列同一性、至少80％序列同一性、至少85％序列同一性、至少90％序列同一性、至少95％序列同一性或100％序列同一性的多核苷酸序列；所述LIP5包含与SEQ ID NO:4所示的序列具有至少70％序列同一性、至少80％序列同一性、至少85％序列同一性、至少90％序列同一性、至少95％序列同一性或100％序列同一性的多核苷酸序列；所述GCV3基因包含与SEQ IDNO:6所示的序列具有至少70％序列同一性、至少80％序列同一性、至少85％序列同一性、至少90％序列同一性、至少95％序列同一性或100％序列同一性的多核苷酸序列；所述LPA基因包含与SEQ ID NO:8所示的序列具有至少70％序列同一性、至少80％序列同一性、至少85％序列同一性、至少90％序列同一性、至少95％序列同一性或100％序列同一性的多核苷酸序列；所述SAM1基因包含与SEQ ID NO:10所示的序列具有至少70％序列同一性、至少80％序列同一性、至少85％序列同一性、至少90％序列同一性、至少95％序列同一性或100％序列同一性的多核苷酸序列；和/或所述SAM2基因包含与SEQ ID NO:12所示的序列具有至少70％序列同一性、至少80％序列同一性、至少85％序列同一性、至少90％序列同一性、至少95％序列同一性或100％序列同一性的多核苷酸序列。

在第二方面，本发明提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体包含根据本发明任何方面的可操作地连接到启动子的一种或多种异源硫辛酸途径基因，其中所表达的蛋白质被定位到线粒体。

在一些实施方案中，所述启动子为组成型启动子。

在第三方面，本发明提供了一种在基因工程化细胞中产生游离硫辛酸的方法，所述方法包括以下步骤：

a)在用于硫辛酸生物合成的条件下在培养基中培养多个根据本发明任何方面的基因工程化细胞，以及

b)为所述培养基补充半胱氨酸，

其中所述基因工程化细胞与未转化的细胞相比能够提高游离硫辛酸的产生。

在一些实施方案中，所述培养基补充有浓度为至少0.05mg/ml、至少0.1mg/ml、至少0.2mg/ml、至少0.5mg/ml，或在从0.05mg/ml至0.7mg/ml范围内、优选在0.1mg/ml至0.4mg/ml范围内的半胱氨酸。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括分离所述游离硫辛酸。

在一个优选实施方案中，所述细胞为细菌或酵母细胞。

更优选地，所述细胞为酿酒酵母。

附图说明

图1显示了用于在工程化酿酒酵母中产生硫辛酸的代谢途径的示意图。脱辅基-Gcv3p为底物蛋白，而辛酰基和硫辛酰基-Gcv3p是硫辛酸产生途径中的两种中间体。硫辛酰基-Gcv3p是甘氨酸裂解系统(GCV)的硫辛酸结合H亚基。Lip2p和Lip5p作为催化剂酶起作用。EfLPA是用于释放硫辛酸的裂解酶。Sam2p是使S-腺苷甲硫氨酸辅因子再生所需的辅因子再生酶，如虚线框所示。Lip2p：辛酰基转移酶；Lip5p：硫辛酰合酶；EfLPA：来自粪肠球菌(E.faecalis)的硫辛酰胺酶；Sam2p：S-腺苷甲硫氨酸合酶2。所有反应都在线粒体中进行。

图2A-E显示了在硫辛酰基/辛酰基修饰的肽中产物离子(b和y)的检测情况。(A)-(C)显示了在具有硫辛酸修饰的肽的MS/MS谱中离子的计算m/z。(D)-(E)显示了在具有辛酸修饰的肽的MS/MS谱中离子的计算m/z。所获得的序列显示在表格的顶部。检测到的b离子以*显示，而检测到的y离子以^显示。“#”指示氨基酸在序列中的位置。188.03和126.10分别代表硫辛酰基和辛酰基的质量。

图3A-E显示了硫辛酰基/辛酰基修饰的肽的检测情况。(A)-(C)显示了具有硫辛酸修饰的肽的MS/MS谱。分别在位置K102、K114和K75处检测到单电荷的Gcv3p的肽(m/z＝895.3918)(A)和Kgd2p的肽(m/z＝1021.4584)(B)以及双电荷的Lat1p的肽(m/z＝636.7529)(C)具有硫辛酸修饰。(D)-(E)显示了具有辛酸修饰的肽的MS/MS谱。检测到单电荷的在位置S100处具有辛酸修饰的肽(m/z＝833.4583)(D)以及在位置S103处具有辛酸修饰的肽(m/z＝833.4628)(E)。S：丝氨酸；V：缬氨酸；K：赖氨酸；A：丙氨酸；E：谷氨酸；T：苏氨酸；D：天冬氨酸；I：异亮氨酸；Q：谷氨酰胺；M：甲硫氨酸；F：苯丙氨酸；硫辛酰基：硫辛酰基修饰；辛酰基：辛酰基修饰。

图4B-D显示了所提出的Gcv3p的硫插入机制(A)，以及(B)Gcv3p、(C)KGD2的硫辛酰基结构域和(D)LAT1的硫辛酰基结构域的3D蛋白质结构。螺旋显示为浅蓝色，片层显示为红色，并且环显示为紫色。蛋白质表面显示为灰色。K代表赖氨酸残基，而S代表丝氨酸残基。

图5A-F显示了GCV3、KGD2、LAT1和EfLPA蛋白的表达，以及EfLPA对GCV3的体外硫辛酰胺酶活性。(A)GCV3、KGD2、LAT1和EfLPA的表达。通过蛋白质印迹分析证实GCV3、KGD2、LAT1和EfLPA的表达。(B)从EfLPA和Gcv3p混合物提取的产物的LC-MS/MS色谱图。硫辛酸的峰在保留时间4.362min处由箭头指示。(C)硫辛酸的单电荷离子的LC-MS/MS谱。将在(B)中检测到的硫辛酸通过MS/MS进一步碎片化。(D)硫辛酸标准参考的单电荷离子的LC-MS/MS谱。前体离子(对于(C)为205.0360且对于(D)为205.0365)两者都用菱形标记。标记产物离子的m/z值。(E)来自EfLPA和Gcv3p混合物的提取物的GCMS色谱图。在保留时间为23.675min处检测到三甲基硅烷化的硫辛酸(硫辛酰基-TMS)。(F)在(E)中的硫辛酰基-TMS峰的GCMS谱示于顶部的光谱中。它与使用三甲基硅烷化的硫辛酸可靠参考标准获得的底部的GCMS谱相同。

图6A-C显示了EfLPA的亚细胞定位以及硫辛酸的体内产生。(A)线粒体靶向肽的表征。收获携带与和不与线粒体信号肽融合的EGFP(mEGFP和EGFP)的细胞。显示了荧光图。(B)EfLPA的亚细胞定位。提取BY4741-对照、BY4741-EfLPA和BY4741-mEfLPA细胞线粒体中的蛋白质。通过蛋白质印迹分析证实携带6xHis标签的EfLPA在线粒体中的表达。(C)硫辛酸的体内产生。从BY4741-对照、BY4741-EfLPA和BY4741-mEfLPA细胞中提取硫辛酸并且通过LC-MS/MS分析定量。

图7A-B显示了使用不同工程化菌株的硫辛酸产生。(A)用于硫辛酸产生的整体途径工程化。虚线框代表由Sam2p催化的辅因子再生反应。(B)通过不同酶的表达产生的总硫辛酸的比较。“+”和“-”指示存在和不存在相应的修饰。所显示的数据是三个生物学重复的平均值±SD。

具体实施方式

为了方便起见，将在本说明书中提到的书目参考文献以参考文献列表的形式列出并且添加在实施例的末尾。将此类书目参考文献的全部内容通过引用并入本文。任何关于现有技术的讨论都不承认现有技术是本发明领域公知常识的一部分。

定义

为了方便起见，这里收集了说明书、实施例和所附权利要求中采用的某些术语。

必须注意，除非上下文另外明确规定，否则如本文和所附权利要求中所用，单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述”包括复数指示物。

如本文所用，术语“包含”或“包括”应解释为具体说明所提及的所陈述特征、整数、步骤或组分的存在，但是不排除一个或多个特征、整数、步骤或组分或其组的存在或添加。然而，在本公开文本的上下文中，术语“包含”或“包括”还包括“由……组成”。单词“包含(comprising)”的变体(诸如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)以及“包括(including)”的变体(诸如“包括(include)”和“包括(includes)”)具有相应变化的含义。

如本文所用，术语“核苷酸”、“核酸”或“核酸序列”是指寡核苷酸、多核苷酸或其任何片段；基因组或合成来源的DNA或RNA，其可以是单链或双链的并且可以代表正义链或反义链；肽核酸(PNA)；或任何DNA样或RNA样材料。

如本文所用，术语“可操作地连接”意指所述术语所应用的组分处于允许它们在合适的条件下执行其固有功能的关系。例如，“可操作地连接”到蛋白质编码序列的控制序列与其连接，使得在与控制序列的转录活性相容的条件下实现蛋白质编码序列的表达。通过举例的方式，当第一核酸序列被放置地与第二核酸序列有功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子与编码序列可操作地连接。通常，可操作地连接的DNA序列是连续的，并且在需要连接两个蛋白质编码区时，在同一阅读框内。

如本文所用，术语“氨基酸”或“氨基酸序列”是指寡肽、肽、多肽或蛋白质序列，或任何这些的片段；以及天然存在的或合成的分子。在“氨基酸序列”在本文中叙述为是指天然存在的蛋白质分子的氨基酸序列的情况下，“氨基酸序列”和类似术语并不意在将氨基酸序列限制为与所叙述的蛋白质分子相关的完整天然氨基酸序列。

如本文所用，术语“多肽”、“肽”或“蛋白质”是指一条或多条氨基酸链，其中每条链包含通过肽键共价连接的氨基酸，并且其中所述多肽或肽可以包含通过肽键非共价和/或共价连接在一起的多条链(所述多条链具有天然蛋白质(即由天然存在的并且特别是非重组的细胞或者由基因工程化细胞或重组细胞产生的蛋白质)的序列)，并且包括具有天然蛋白质的氨基酸序列的分子或者具有天然序列的一个或多个氨基酸的缺失、增加和/或取代的分子。“多肽”、“肽”或“蛋白质”可以包含一条(称为“单体”)或多条(称为“多聚体”)氨基酸链。

适用于硫辛酸生物合成的培养基包括LB肉汤、YPD、2YT和任何其他合适的培养基。培养基可以包括抗生素(诸如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素)、异丙基β-D-1-吡喃半乳糖苷(IPTG)和L-阿拉伯糖。本领域技术人员应知道每种组分的适当浓度。

载体可以包括一种或多种呈适用于在宿主细胞中表达一种或多种核酸的形式的催化酶核酸。优选地，重组表达载体包括一种或多种可操作地连接到待表达的一种或多种核酸序列的调控序列。术语“调控序列”包括启动子、增强子、核糖体结合位点和/或IRES元件以及其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。表达载体的设计可以取决于诸如待转化的宿主细胞的选择、所需蛋白质的表达水平等因素。可以将本发明的表达载体引入宿主细胞中，从而产生由如本文所述的核酸编码的蛋白质或多肽，包括融合白或多肽(例如，催化酶蛋白)。

本发明的重组表达载体可以设计用于在原核或真核细胞、更特别是原核细胞中表达催化酶蛋白。例如，本发明的多肽可以在细菌(例如，蓝细菌)或酵母细胞中表达。合适的宿主细胞进一步论述于Goeddel,(1990)Gene Expression Technology:Methods inEnzymology 185,Academic Press,San Diego,Calif中。现在已经大体上描述了本发明，通过参考以下实施例将更容易地理解本发明，所述实施例是通过说明的方式来提供的，并不旨在限制本发明。

本领域技术人员应理解，可以根据本文给出的方法在不进行过度实验的情况下实践本发明。方法、技术和化学品如在给出的参考文献中或在标准生物技术和分子生物学教科书中的方案中所描述。

实施例

实施例1

材料和方法

菌株和培养基

除非另外说明，否则使用大肠杆菌TOP10(Invitrogen)和Luria-Bertani(Becton,Dickinson and Company)进行克隆实验。在适用的情况下，使用100mg/L氨苄青霉素选择阳性菌落。使用酵母菌株酿酒酵母BY4741(ATCC)进行基因工程化以用于硫辛酸产生。

在加富培养基YPD/YPGR(1％酵母提取物、2％蛋白胨和2％D-葡萄糖或含1％棉子糖的2％半乳糖)、缺乏尿嘧啶的合成基本培养基SC-U(0.67％酵母氮源基础(yeastnitrogen base)、0.192％尿嘧啶省却(dropout)和2％D-葡萄糖)、缺乏赖氨酸的培养基SC-L(0.67％酵母氮源基础、0.18％赖氨酸省却和2％D-葡萄糖)、缺乏亮氨酸的培养基SC-LE(0.67％酵母氮源基础、0.16％亮氨酸省却和2％D-葡萄糖)或缺乏亮氨酸和尿嘧啶两者的培养基SC-LU(0.67％酵母氮源基础、0.154％亮氨酸和尿嘧啶省却以及2％D-葡萄糖)中培养酿酒酵母BY4741野生型和突变型菌株。补充2％琼脂用于制备固体培养基。酵母生长培养基组分购自Sigma-Aldrich、MP Biomedicals和BD(Becton,Dickinson and Company)。使用5-氟乳清酸(5-FOA，Fermentas)或遗传霉素(G418，PAA Laboratories)进行选择。必要时将半胱氨酸(0.2mg/mL)和硫酸亚铁(0.2mg/mL)(Sigma-Aldrich)补充到生长培养物中。将酵母细胞在烧瓶中在30℃下培养并以225rpm振荡。

质粒构建和基因整合

针对酿酒酵母对EfLPA基因(GenBank登录号AY735444)进行密码子优化，并且由Integrated DNA Technologies合成。将具有和不具有线粒体靶向肽(MTP)序列的EfLPA基因连接在从酿酒酵母基因组DNA中扩增的P_GAL1启动子与T_CYC1终止子之间。将具有和不具有MTP的EfLPA表达盒插入载体pRS41K(Euroscarf)中，分别产生质粒pRS41K-P_GAL1-mEfLPA-T_CYC1和pRS41K-P_GAL1-EfLPA-T_CYC1。分别针对具有和不具有MTP的EGFP，类似地构建质粒pRS41K-P_GAL1-mEGFP-T_CYC1和pRS41K-P_GAL1-EGFP-T_CYC1。所构建的重组质粒列于表1中。所使用的引物列表示于表2中。

表1.在本研究中使用的菌株和质粒

1.Invitrogen；2.ATCC；3.本研究；4.Euroscarf

表2.在本研究中使用的引物。限制位点以粗体显示。

基于Sadowski等人(Sadowski等人,Yeast 24:447-455(2007))先前描述的方法，其中使用含有URA3选择性标记的整合型载体pIS385(Euroscarf)进行整合，将表达盒P_TEF1-GCV3-T_CYC1、P_TEF1-KGD2-T_KGD2和P_TEF1-LAT1-T_ADH1染色体整合到LYS2位点中。此外，基于先前建立的成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关(Cas)系统(Di Carlo等人,Nucleic Acids Research 41:4336-4343(2013))，将表达盒P_TEF1-LIP2-T_LIP2和P_PGI1-LIP5-T_LIP5整合到基因间位点CS6中，而将P_ADH1-mSAM1-T_SAM1和P_ADH1-mSAM2-T_SA _M2整合到基因间位点CS8中(Xia等人,ACS Synthetic Biology 6:276-283(2017))。为了克隆GCV3、LAT1、KGD2、LIP2、LIP5、SAM1和SAM2，使用酿酒酵母的基因组DNA作为PCR模板。将上文提到的所有蛋白质通过其天然MTP(对于Gcv3p、Lat1p和Kgd2p)或来自酵母细胞色素c氧化酶亚基IV(COX4)的MTP(对于mEfLPA、mSam1p和mSam2p)被定位到线粒体(Maarse等人,The EMBO Journal 3:2831-2837(1984))。将六组氨酸标签添加到这些蛋白质的C末端或N末端以进行表达分析。所使用的寡核苷酸引物列于表2中。

硫辛酰化的蛋白质和辛酰化的蛋白质的检测

将细胞在5ml酵母提取物蛋白胨葡萄糖(YPD)培养基中预培养过夜，然后使用500ml烧瓶在100ml YPD培养基中稀释，以达到0.4的初始OD₆₀₀。在生长18h后，通过离心收获细胞。将细胞沉淀物重新悬浮在25ml裂解缓冲液(0.3M NaCl、50mM磷酸钠，pH 6.5)中。用高压均质机(EmulsiFlex-C3，AVESTIN,Inc.)在25000psi下裂解细胞。通过离心收集可溶性细胞裂解物，并且将其与等体积的8M盐酸胍混合。将300μl最终产物注入Agilent1260Infinity二元HPLC(Agilent)中。用mRP-C18高回收率蛋白色谱柱(Agilent)在1.5ml/min的溶剂流速和80℃的柱温下拆分蛋白质。流动相A和B分别为0.1％三氟乙酸/水和0.1％三氟乙酸/乙腈。用以下梯度洗脱蛋白质：0-1min(10％-30％B)，1-12min(30％-50％B)，12-13min(50％-80％B)，13-14min(80％B)，14-15min(80％-10％B)和15-17min(10％B)。从1min开始收集蛋白质，并且收集12个连续的1min级分。将蛋白质在Speedvac浓缩器(ThermoFisher Scientific)中干燥过夜。将蛋白质的各级分用50μl 0.5M三乙基碳酸氢铵(含1μgGlu-C)(Promega)重新悬浮。将混合物孵育过夜。

将7μl消化肽加载到配备有PortID-Chip-43(II)色谱柱(Agilent)的Agilent1260infinity HPLC-Chip/MS系统(Agilent)中。使用乙腈的线性梯度以0.35μl/min的恒定流速从HPLC-Chip系统中洗脱肽。对于LC分离，使用0.2％甲酸/水(流动相A)和0.2％甲酸/乙腈(流动相B)。通过纳米泵用以下梯度洗脱样品：0-1min(7％-10％B)，1-35min(10％-30％B)，35-37min(30％-80％B)，37-38min(80％B)，38-40min(80％-7％B)和40-43min(7％B)。将洗脱的样品直接输注到质谱仪中进行检测。在100-1600m/z的范围内以3个光谱/秒的扫描速率扫描质谱。MS/MS扫描范围为80-2000m/z，扫描速率为4个光谱/秒。在175V的碎裂电压和65V的锥孔(skimmer)电压下以阳离子模式收集质量数据。

肽翻译后修饰(PTM)分析

使用PEAKS 8软件(Bioinformatics Solutions Inc.，加拿大滑铁卢)的SPIDER功能(Zhang等人,Molecular&Cellular Proteomics:MCP 11:M111.010587(2012))基于质量差异鉴定具有PTM的肽。用以下搜索参数搜索酵母肽。前体质量误差容限为100ppm(百万分率)，而碎片质量误差容限为0.1Da。固定的PTM为脲基甲基化(C)(+57.02)，并且可变的PTM为硫辛酰基(K)(+188.03)、辛酰基(TS)(+126.10)、氧化(M)(+15.99)和氧化(HW)(+15.99)。将肽和蛋白质识别可靠性得分(-10lgP，其中P为识别概率)分别设置阈值为15和20，对应于可靠的识别。所使用的数据库为UniProtKB/Swiss-Prot。

用于结构可视化的蛋白质建模

将SWISS-MODEL(Waterhouse等人,Nucleic Acids Research 46:W296-W303(2018))用于使用同源建模技术从Gcv3p、Kgd2p和Lat1p蛋白的氨基酸序列构建其3D结构模型。基于SWISS-MODEL模板库(SMTL)中可用的模板预测结构，所述模板库汇总了来自蛋白质数据库(PDB)的实验结构信息。使用PyMOL Molecular Graphics系统(

Inc.，美国纽约)(Schrodinger,"The PyMOL Molecular Graphics System,Version 1.8"(2015))观察结构。

使用具有41％、37％和48％序列同一性的模板同源蛋白分别对Gcv3p、Kgd2p和Lat1p进行建模。Gcv3p的模板蛋白为来自结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的甘氨酸裂解系统蛋白H(PDB链id：3hgb.1.A)，而对于Kgd2p和Lat1p，由于缺乏具有全长晶体结构的模板，因此仅对N末端(硫辛酰基结构域)进行了建模。Kgd2p的N末端(硫辛酰基结构域)的模板为棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)中2-氧戊二酸脱氢酶复合物的E2组分(PDB链id：1ghj.1.A)的硫辛酰基结构域。使用智人(Homo sapiens)中丙酮酸脱氢酶复合物的二氢硫辛酰赖氨酸残基乙酰基转移酶组分(PDB链id：1y8n.1.B)对Lat1p的N末端(硫辛酰基结构域)进行建模。

蛋白质过表达和纯化

将细胞在5ml培养基中预培养过夜，然后使用200ml烧瓶在50ml诱导培养基中稀释，以达到0.4的初始OD₆₀₀。在细胞生长过夜后，通过离心收获酵母细胞。将细胞沉淀物重新悬浮在裂解缓冲液(0.5M NaCl、20mM磷酸钠、20mM咪唑，pH 6.8)中，并且用高压均质机(EmulsiFlex-C3，AVESTIN,Inc.)在25000psi下裂解。在离心后，将不溶性蛋白质和细胞碎片与可溶性蛋白质分离。为了检查蛋白质表达，将可溶性蛋白质与Laemmli样品缓冲液(Bio-Rad)一起煮沸并在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离。如先前所述(Chen等人,Biotechnology for Biofuels 6:21(2013))，将凝胶中的蛋白质转移到蛋白质印迹膜上并使用HRP缀合的抗6x His标签抗体(ThermoFisher Scientific)。为了检测线粒体中表达的蛋白质，使用酵母线粒体分离试剂盒(Biovision)提取线粒体蛋白质。如所述的，所提取的蛋白质将与Laemmli样品缓冲液一起煮沸，并且通过蛋白质印迹法检测。

为了纯化蛋白质，将可溶性蛋白质与镍-IMAC树脂(GE Healthcare)一起孵育过夜以进行蛋白质结合。在蛋白质结合和洗涤后，用洗脱缓冲液(0.5M NaCl、20mM磷酸钠、300mM咪唑，pH 6.8)洗脱带有His标签的蛋白质。使用蛋白质浓缩器(Thermo Scientific)将洗脱缓冲液与PBS缓冲液交换以进行下游蛋白质活性测试。

游离硫辛酸检测

使用经修改的Chng等人(Chng等人,Journal of Pharmaceutical andBiomedical Analysis51:754-757(2010))开发的LC-MS/MS方法提取和检测游离硫辛酸。将等体积的乙腈添加到细胞培养物或裂解物的上清液中。将混合物涡旋混合2min。在-30℃下冷却30min后，将含有硫辛酸的上层相转移到干净的管中蒸发至干。用200μl的50％乙腈水溶液重构残余物。将所提取的硫辛酸样品以负模式注入LC-MS/MS系统(Agilent 1290液相色谱仪和Agilent 6550iFunnel Q-TOF)中。用Agilent Eclipse Plus C18色谱柱(2.1x100mm，1.8μm，Agilent)以0.7ml/min的流速通过0-5.8min(80％-68％A)、5.8-6.5min(68％-15％A)和6.5-7min(15％-95％A)的梯度溶液实现色谱分离。流动相A为0.1％乙酸(用氢氧化氨溶液调节pH为4)，并且流动相B为乙腈。将雾化器设置为40psig，而鞘气流速为11l/min。硫辛酸的优化碰撞能为8eV。使用2-丙基戊酸(Tokyo Chemical Industry Co.,Ltd.)作为内标实现定量。

还使用气相色谱-质谱(GC-MS)确认硫辛酸的身份。简而言之，将HPLC级乙酸乙酯(Sigma)添加到细胞培养物或裂解物的上清液中以提取硫辛酸。通过离心将混合物分成两相。将含有硫辛酸的上层相与含有1％三甲基氯硅烷的N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)以4:1的比率混合。在以下条件下使用GC-MS分析衍生化的硫辛酸。使用HP-5ms色谱柱(30m x 0.25mm；0.25μm膜；Agilent)，氦气流速设置为1ml/min。在入口设置为250℃的不分流进样条件下注入1μl。GC温度曲线如下：初始温度45℃维持2min，然后以10℃/min的速率升温至280℃，在此时温度保持3.5min。质谱仪检测器以电子电离(EI)模式从30amu扫描到800amu。为了帮助识别峰，使用可靠的硫辛酸(Sigma)标准作为参考。

荧光显微术

使携带质粒pRS41K-P_GAL1-EGFP-T_CYC1和pRS41K-P_GAL1-mEGFP-T_CYC1的酿酒酵母BY4741细胞在诱导培养基(含200mg/L G418的YPGR)中生长至早期对数期。收获细胞，并且将其安装在有聚-L-赖氨酸涂层的载玻片上。用荧光显微镜(Leica DMi8)可视化EGFP荧光。

实施例2

作为游离硫辛酸生物合成底物的硫辛酰化的蛋白质的蛋白质组学分析和表征

为了工程化酵母以用于游离硫辛酸的生物合成，首先打算评价各种形式的硫辛酸结合蛋白的可用性并了解它们的形成过程。假设这将有助于选择合适的硫辛酰化的蛋白质作为底物，以便随后在酰胺键处通过EfLPA酶促裂解以释放游离硫辛酸。硫辛酸经由酰胺键与蛋白质共价结合而存在于酿酒酵母中。假设其生物合成开始于辛酰基部分从辛酰基-ACP转移到脱辅基形式的硫辛酸依赖性蛋白，然后通过插入两个硫原子修饰辛酰基部分(Schonauer等人,Journal of Biological Chemistry 284:23234-23242(2009))。由于硫辛酸主要结合到三种蛋白质，即Gcv3p、Lat1p和Kgd2p，试图将重点放在通过LC-MS/MS分析这些蛋白质上，以更好地了解蛋白质硫辛酰化机制。

为了研究Gcv3p、Lat1p和Kgd2p的硫辛酰化，从酿酒酵母中提取总蛋白，并且通过HPLC用反相色谱柱将蛋白质分成12份，以降低蛋白质样品的复杂性。在本研究中，并非使用先前报道的产成长肽片段的胰蛋白酶和糜蛋白酶(Gey等人,PLoS one 9:e103956(2014))，而是用Glu-C消化每个蛋白质样品，从而产生更短的肽，这提供了更好的精度。通过LC-MS/MS分析消化的肽混合物。基于其m/z值和MS/MS谱，总共鉴定出2,713种肽。如图3A所示，检测到m/z 895.3918的单电荷肽。此片段对应于来自Gcv3p的¹⁰⁰SVKSASE¹⁰⁶(SEQ ID NO:40)序列，在K¹⁰²(赖氨酸¹⁰²)处带有硫辛酸修饰。类似地，m/z 1021.4584的单电荷肽揭示了来自Kgd2p的序列¹¹²TDKIDIE¹¹⁸(SEQ ID NO:41)的存在，其中K¹¹⁴被硫辛酸修饰(图3B)。检测到作为前体离子的m/z 636.7529的双电荷硫辛酰化的肽表明来自Lat1p的序列⁷³TDKAQMDFE⁸¹(SEQ ID NO:42)也在K⁷⁵处被硫辛酸修饰(图3C)。因此，从数据中得出结论，在野生型细胞BY4741中，Gcv3p、Kgd2p和Lat1p分别在位置K^102、K¹¹⁴和K⁷⁵处被硫辛酰化。详细计算结果示于图2中。

除了硫辛酰化的肽外，还在Gcv3p中观察到辛酰化的肽，这些肽可能来源于硫辛酸-蛋白的前体。检测到m/z 833.4583和833.4628的两种单电荷肽分别表明Gcv3p片段在S¹⁰⁰(丝氨酸¹⁰⁰)(¹⁰⁰ SVKSASE¹⁰⁶；SEQ ID NO:43)或S¹⁰³位置(¹⁰⁰SVKSASE¹⁰⁶；SEQ ID NO:44)处具有单个辛酰基修饰(图3D和3E)。这表明，意外地，硫辛酸和辛酸的结合不发生在相同的残基上，而是分别发生在赖氨酸和近端丝氨酸残基上。这些数据提供了Gcv3p蛋白在硫辛酸修饰的赖氨酸残基附近的丝氨酸残基处辛酰化的首个基于MS的证据，推断Gcv3p在S¹⁰⁰或S¹⁰³处加载辛酸以在形成具有硫辛酸修饰的K¹⁰²的硫辛酸-Gcv3p之前充当前体。因此，并非直接将赖氨酸辛酰化，然后将硫原子添加到辛基碳链上，提出通过以下三个步骤形成硫辛酰基-Gcv3p：(i)用辛酰基官能团酯化丝氨酸(S¹⁰⁰或S¹⁰³)侧链，(ii)通过将辛酰基部分从S¹⁰⁰或S¹⁰³进行酰基转移来酰胺化赖氨酸(K¹⁰²)侧链，以及(iii)通过硫辛酰合酶Lip5p将硫原子插入辛酰基部分中(图4A)。有趣的是，没有检测到衍生自Kgd2p和Lat1p的辛酰化的肽。一种可能性是辛酰化的Kgd2p和Lat1p蛋白在产生后可以中间转化为硫辛酸修饰的蛋白质。可替代地，Kgd2p和Lat1p的硫辛酰化可能经由酰胺基从硫辛酸-Gcv3p的转移发生，因为Gcv3p和Lip3p对于形成硫辛酸修饰的Kgd2p和Lat1p是必不可少的，并且已经表明Lip3p是可能的酰胺基转移酶(Schonauer等人,Journal of Biological Chemistry 284:23234-23242(2009)；Hiltunen等人,Biochmica et Biophysica Acta(BBA)-Bioenergetics 1797:1195-1202(2010))。

为了阐明蛋白质结构特征并可视化辛酰化和硫辛酰化位点的位置，通过同源建模预测Gcv3p、Kgd2p和Lat1p的结构(图4B、4C和4D)。所有用于修饰的残基(即Gcv3p中的K¹⁰²、S¹⁰⁰和S¹⁰³，Kgd2p中的K¹¹⁴和Lat1p中的K⁷⁵)都位于通常表面暴露的β-转角上(Marcelino和Gierasch,Biopolymers 89:380-391(2008))。因此，其相应的辛酰基-PTM和硫辛酰基-PTM存在于蛋白质表面上并且可用于对这些残基进行酶促催化，即通过Lip2p/Lip3p将辛酸与丝氨酸残基附接，通过Lip5p将硫原子插入辛酰化的赖氨酸残基中和通过EfLPA水解硫辛酸与赖氨酸残基之间的酰胺键。总体而言，鉴定出在野生型BY4741菌株中Gcv3p、Kgd2p和Lat1p被硫辛酰化的赖氨酸残基，即分别为K¹⁰²、K¹¹⁴和K⁷⁵。在Gcv3p中发现辛酰化的丝氨酸残基表明这样的硫辛酰化机制，其中赖氨酸残基的辛酰化涉及将辛酰基部分预加载到丝氨酸残基上，然后将酰基转移到赖氨酸侧链上。还已经根据Gcv3p、Kgd2p和Lat1p的预测蛋白质结构确定，它们的硫辛酰化的赖氨酸残基可为EfLPA所及以进行水解。因此，随后表征了EfLPA对硫辛酰化的Gcv3p、Kgd2p和Lat1p的活性，以确定这些硫辛酰化的酶作为EfLPA产生游离硫辛酸的底物的适用性。

实施例3

用于游离硫辛酸生物合成的EfLPA的体外表征

游离硫辛酸是通过用硫辛酰胺酶酶促裂解连接硫辛酸依赖性蛋白的硫辛酰基部分与赖氨酸的酰胺键而产生的。先前已证明来自粪肠球菌的EfLPA可从大肠杆菌中的硫辛酸修饰的蛋白质中释放硫辛酸(Spalding和Prigge,PLoS one 4:e7392(2009))。在酵母中，硫辛酸主要结合到三种蛋白质，即Gcv3p、Lat1p和Kgd2p，如图3所展示，但是尚未报道EfLPA是否对这些硫辛酰化的酵母蛋白具有功能性。因此，为了工程化酿酒酵母以用于游离硫辛酸的生物合成，表征了EfLPA对这些硫辛酰化的蛋白质的体外酶活性。假设通过这项体外研究，可以鉴定出EfLPA对其具有催化活性的合适的底物蛋白候选物，用于后续过表达，以增加可以合成硫辛酸的位点的可用性。

为了测试EfLPA对来自酵母的硫辛酰化的蛋白质的催化活性，在来自低拷贝数质粒的强半乳糖诱导型P_GAL1启动子下表达具有六组氨酸标签的EfLPA。在来自基因组的强组成型启动子P_TEF1下单独表达与六组氨酸标签融合的硫辛酸结合蛋白(即Gcv3p、Kgd2p和Lat1p)。如图5A所示，通过蛋白质印迹证实了酿酒酵母中Gcv3p、Kgd2p、Lat1p和EfLPA的表达。Gcv3p显示出比其他蛋白质高得多的蛋白质表达，而Kgd2p显示出最低的蛋白质表达。Kgd2p和Lat1p表达水平低的原因尚不清楚，但是已经表明必需蛋白的蛋白质半衰期相对较短，这可能是由于严格的保真度要求和对必需蛋白的损伤阈值较低(Martin-Perez和Villén,Cell Systems 5:283-294.e285(2017))。因此，Kgd2p和Lat1p的低蛋白质表达可能是由于蛋白质转换快，因为Kgd2p和Lat1p两者都参与有氧呼吸，它是细胞代谢中的中心过程(Schonauer等人,Journal of Biological Chemistry 284:23234-23242(2009))。EfLPA蛋白的蛋白质印迹分析显示出多个条带，这与先前的报道相一致(Spalding和Prigge,PLoSone 4:e7392(2009))。

为了确定EfLPA是否对来自酵母的硫辛酰化的蛋白质具有广泛的硫辛酰胺酶活性，将纯化的Gcv3p、Kgd2p和Lat1p蛋白单独与纯化的EfLPA在37℃下一起孵育2h。通过LC-MS/MS分析从酶促反应混合物中提取的产物。在仅含有EfLPA、Gcv3p、Kgd2p或Lat1p的对照反应混合物中没有检测到硫辛酸。有趣的是，在单独含有EfLPA和Kgd2p或Lat1p的反应混合物中没有观察到硫辛酸。只有EfLPA与Gcv3p的反应产生指示硫辛酸的m/z205.0360的峰(图5B)。上文提到的前体离子m/z 205.0360的产物离子扫描在m/z 64.9521、93.0706、127.0576和171.0485处展现出清晰且丰富的产物离子(图5C)，这与硫辛酸参考标准的质谱相同(图5D)。另外通过GC-MS分析所提取的产物以进一步确认硫辛酸的存在。三甲基硅烷基衍生化的产物的分析显示出这样的峰，其相应的质谱与参考标准的质谱相同(图5E和4F)。这些结果证明，EfLPA在体外对来自酵母的Gcv3p具有硫辛酰胺酶活性，并且可以潜在地用作酰胺水解酶，以从酵母中的硫辛酸修饰的蛋白质中释放游离硫辛酸。尚不清楚为什么EfLPA没有从Kgd2p或Lat1p产生硫辛酸。Gcv3p、Kgd2p和Lat1p的结构模型表明，所有修饰的残基(即Gcv3p中的K¹⁰²、S¹⁰⁰和S¹⁰³，Kgd2p中的K¹¹⁴和Lat1p中的K⁷⁵)都存在于暴露于蛋白质表面上的溶剂的β-转角上，因此难以接近硫辛酰化位点不太可能是EfLPA对Kgd2p和Lat1p缺乏硫辛酰胺酶活性的原因。其他可能性可能是(i)Lat1p和Kgd2p的蛋白质表达水平太低(图5A)，(ii)与Gcv3p相比，与Lat1p和Kgd2p蛋白附接的硫辛酸部分较少(Hermes和Cronan,Yeast 30:415-427(2013))，或(iii)EfLPA的底物特异性不包括Lat1p和Kgd2p两者。

总之，体外结果表明，作为与Lat1p和Kgd2p相比是更好的EfLPA底物的Gcv3p是用于后续途径工程化以优化游离硫辛酸生物合成的三种候选物中最合适的蛋白质底物。此外，Gcv3p是比Kgd2p和Lat1p更小的蛋白质(分别为19kDa、50kDa和52kDa)，因此其过表达所利用的资源比后者蛋白质少。此外，与硫辛酸-Gcv3p的形成不同，Kgd2p和Lat1p的硫辛酰化需要另外的酶，即Lip3p，如果另外需要LIP3过表达，这可能降低硫辛酰化的效率并增加代谢负担。总的来说，确定EfLPA在酿酒酵母中功能性表达并且对Gcv3p具有活性，因此选择它作为首选的硫辛酰化的蛋白质底物。采用这些酶随后对酿酒酵母进行工程化，以在体内过量产生游离硫辛酸。

实施例4

线粒体中EfLPA的过表达导致硫辛酸的体内生物合成

如所提到的，硫辛酸合成发生在酵母的线粒体中。为了使得能够在体内进行硫辛酸生物合成，EfLPA必须要易位到线粒体中，在这里它从硫辛酰化的蛋白质底物中水解出硫辛酸。为此，探索了来自酵母细胞色素c氧化酶亚基IV(COX4)的29个氨基酸的线粒体靶向肽(MTP)(Maarse等人,The EMBO Journal 3:2831-2837(1984))，用于将蛋白质易位到线粒体中。如图6A所示，与MTP融合的EGFP位于线粒体中，而无MTP的EGFP则在胞质溶胶中扩散。为了将EfLPA定位到线粒体，将EfLPA与所表征的MTP融合。提取线粒体蛋白，并且通过蛋白质印迹法进行分析以确定EfLPA的线粒体易位。只有来自表达MTP-EfLPA融合蛋白(mEfLPA)的细胞的提取物显示出与所述蛋白质相对应的条带，而在来自具有空质粒的野生型BY4741和表达无MTP的EfLPA的细胞的提取物中没有观察到条带，因此证实当与MTP融合时EfLPA易位到线粒体中(图6B)。

通过对生长3d的细胞培养物中的硫辛酸浓度定量对线粒体中EfLPA的体内活性进行了评价。发现具有空质粒的野生型BY4741和表达无MTP的EfLPA的BY4741没有产生可检测到的硫辛酸，而在线粒体中表达EfLPA的BY4741-mEfLPA菌株以10.1μg/L产生游离硫辛酸(图6C)。因此，这里构建的BY4741-mEfLPA是首个报道的能够在体内产生游离硫辛酸的酵母菌株，并且充当进一步工程化以提高效价的基础菌株。

实施例5

途径酶的表达和辅因子的再生改进硫辛酸的产生

用于体内硫辛酸产生的整体基因工程化示于图7A中。作为改进硫辛酸产生的第一步，试图通过过表达合适的蛋白质候选物，使得可以形成更多的硫辛酰化的蛋白质充当EfLPA水解的底物来增加硫辛酰化位点的可用性。具体地，如第3.2部分所确定的，选择GCV3p作为过表达的蛋白质候选物。为此，在来自基因组的P_TEF1下共表达GCV3与mEfLPA，从而产生菌株BY4741-GCV3-mEfLPA。然而，如图7B所示，GCV3p的过表达并没有改进游离硫辛酸的产生。这表明从菌株BY4741-mEfLPA产生游离硫辛酸的瓶颈不是可以在游离硫辛酸产生过程中再循环使用的底物蛋白不足，而是可能是合成硫辛酰基部分所需的催化酶和/或辅因子的活性不足(图1)。

已经证明作为辛酰基转移酶的催化酶Lip2p可将脱辅基-Gcv3p转化为辛酰基-Gcv3p，而作为硫辛酰合酶的另一种催化酶Lip5p催化辛酰基-Gcv3p转化为硫辛酰基-Gcv3p(Hermes和Cronan,Yeast 30:415-427(2013))(图1)。因此，为了提高硫辛酰基-Gcv3p的水平，在强P_TEF1启动子下表达LIP2，而在弱P_PGI1启动子下表达LIP5(因为LIP5在强P_TEF1启动子下的表达导致细胞不能存活)。然而，与仅表达mEfLPA的细胞相比，过表达GCV3、LIP2、LIP5和mEfLPA的所得菌株显示出类似的硫辛酸产生(图7B)，这表明Lip2p和Lip5p的活性不是硫辛酸产生的限速因素。

另一个在酵母中产生硫辛酸的可能的限速因素是辅因子、特别是S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的可用性，所述辅因子为辛酰基部分的硫化所需。来自大肠杆菌的同源硫辛酰合酶使用自由基SAM化学将两个硫插入辛酰基部分中，这个过程需要辅因子SAM和硫辛酰合酶中的铁硫簇两者(Cicchillo等人,Biochemistry 43:6378-6386(2004))。从SAM产生自由基中间体，以从辛酰基部分的C-6和C-8中提取氢原子，从而允许随后通过涉及以碳为中心的自由基的机制插入硫。硫辛酰合酶中的铁硫簇在SAM裂解过程中提供电子以产生自由基，并且还可以在硫辛酰化过程中作为硫原子的来源(Cicchillo和Booker,Journal of theAmerican Chemical Society 127:2860-2861(2005))。因此，增加SAM和功能性铁硫簇的可用性可能驱动硫辛酰基部分的形成。在酿酒酵母中，SAM可以通过硫辛酰合酶Sam1p和Sam2p从甲硫氨酸和ATP产生(Marobbio等人,The EMBO Journal 22:5975-5982(2003)；Dato等人,Microbial Cell Factories 13:147(2014))。为了通过从甲硫氨酸和ATP再生而增加SAM的可用性，将SAM1和SAM2与MTP融合以用于线粒体易位，并且在弱P_ADH1启动子下过表达。线粒体mSAM1或mSAM2的过表达将硫辛酸产量分别提高到14.8μg/L和17.0μg/L(图7B)，这表明SAM的可用性是硫辛酸产生中的关键瓶颈。为了在硫辛酰合酶中形成铁硫簇，亚铁离子需要从培养基中引入，并且硫必须通过铁硫簇组装机器从半胱氨酸中释放(Lill等人,Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Molecular Cell Research 1763:652-667(2006))。因此，为了进一步驱动硫辛酰基部分的合成，为最高硫辛酸生产者(即过表达GCV3、LIP2、LIP5、mSAM2和mEfLPA的菌株)的细胞培养物补充硫酸亚铁和半胱氨酸，它们可以被转运到线粒体中(Philpott和Protchenko,Eukaryotic Cell 7:20-27(2008)；Lee等人,Plant and Cell Physiology 55:64-73(2014))。添加硫酸亚铁无益于硫辛酸的产生(11.3μg/L)。相比之下，补充半胱氨酸将硫辛酸产量提高到29.2μg/L，相当于相对于基础菌株BY4741-mEfLPA效价提高了近乎2.9倍。此结果表明，半胱氨酸为铁硫簇的生物发生提供硫，并且被硫辛酰合酶Lip5p用于将硫原子插入辛酰基的碳链中。

虽然已经鉴定出一些硫辛酸产生途径中的限速步骤，但在提高硫辛酸产生方面仍有很大的改进空间。为了进一步提高硫辛酸的效价，将来可以进一步工程化硫离子簇的生物发生和SAM可用性，它们是硫辛酸生物产生的限制因素。此外，为了产生一分子的硫辛酸，需要1摩尔当量的前体辛酰基-ACP(图7A)。因此，可以探索增加辛酰基-ACP供应的方法以提高硫辛酸的产生。此外，由于所有反应都发生在线粒体中，因此增加细胞器数量的菌株工程化(Visser W.等人,Antonie van leeuwenhoek 67:243-253(1995))可能是另一种潜在的提高硫辛酸效价的方法(Zhou等人,Journal of the American Chemical Society138:15368-15377(2016))。需要更多的研究来解决硫辛酸生物合成途径中的瓶颈，以显著提高产生水平。酵母中硫辛酸生物合成的进一步改进未来可能随着酿酒酵母的合成生物学和合成基因组学的快速发展而加速，这将为工程化酵母以获得有益的特征和充当优质微生物细胞工厂提供新的工具(Chen等人,Biotechnology Advances 36:1870-1881(2018)；Jee和Chang,Nature 557:647-648(2018)；Xia等人,Biotechnol Adv 37:107393(2019))。

总结

在本研究中，目标在于开发通过对酿酒酵母进行代谢工程化来环境友好地产生硫辛酸的基于生物的方法。为了实现此目标，试图(i)了解酿酒酵母中的硫辛酰化过程，(ii)表征EfLPA对来自酵母的硫辛酰化的蛋白质的功能，(iii)采用EfLPA使得酿酒酵母能够在体内产生游离硫辛酸，以及(iv)使用代谢工程化策略提高硫辛酸的产生。首先通过LC-MS/MS证实了蛋白质结合硫辛酸的存在。使用同源建模技术，预测了Gcv3p、Kgd2p和Lat1p的蛋白质结构，并且发现用于修饰的残基是暴露于溶剂的，因此可为在这些残基上起作用的酶所及。通过体外活性分析，验证了EfLPA可从酵母的硫辛酰基-Gcv3p中释放硫辛酸，因此展示出EfLPA在酵母中的首次报道的功能性表达，用于从硫辛酸结合酵母蛋白中释放硫辛酸。随后，线粒体中EfLPA的过表达导致体内硫辛酸产生，因此在酵母酿酒酵母中实现前所未有的游离硫辛酸的生物合成。为了提高硫辛酸的产生，采用了代谢工程化方法，包括途径酶的过表达和辅因子的再生，并且酿酒酵母中硫辛酸产生的效价提高了近2.9倍达到29.2μg/L。总体来说，本研究中的蛋白质分析、酶表征、结构建模和组合代谢工程化方法提供了对硫辛酸产生途径的更好的理解，并且揭示了改进它的策略。设想从本研究中获得的知识将为酿酒酵母中的硫辛酸生物合成提供见解，并且引领将来的酵母中硫辛酸产生的努力方向。

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序列表

<110> 新加坡国立大学

<120> 用于产生硫辛酸的代谢工程化

<130> SP102221WO

<150> SG10202001884X

<151> 2020-03-02

<160> 45

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 334

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Lip2

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (328)..(344)

<223> 6x组氨酸标签

<400> 1

Met Ser Arg Cys Ile Arg Gln Ser Val Cys Thr Asn Phe Asn Val Cys

1 5 10 15

Arg Arg Gln Cys Phe Ser Thr Tyr Ala Ser Ala Leu Lys Glu Met Thr

20 25 30

His Pro Ile Lys Pro Ser Ala Gln Thr Leu Arg His Leu Gln Phe Thr

35 40 45

Gln Arg Ile Pro Phe Gln Lys Gly Leu Glu Ile Gln Glu Thr Leu Val

50 55 60

Arg Ala Asn Leu Asp Ile Lys Asp Ile Gln Ser Lys Ile Glu Arg Lys

65 70 75 80

Leu Ile Gln Leu Asp Glu Glu Tyr Lys Gly Thr Ala Thr Ile Asn Asp

85 90 95

Asn Glu Lys Arg Ile Leu Asp Lys Val Met Ala Met Lys Pro Asn Pro

100 105 110

Ile Ile Leu Thr Phe Glu Phe Glu Pro Thr Tyr Thr Gly Gly Lys Arg

115 120 125

Ile Lys Lys Thr Met Thr Pro Asp Gln Ile Ala Ala Tyr Glu Ser Phe

130 135 140

Ile Pro Glu Thr Gln Lys Asp Asn Pro Arg Pro Lys Phe Val Gln Val

145 150 155 160

Glu Arg Gly Gly Gln Val Thr Phe His Gly Pro Gly Gln Ile Val Ile

165 170 175

Tyr Ile Ile Leu Asp Leu Lys Thr Phe Gln Ser Phe Pro Ala Lys Cys

180 185 190

Leu Val Ser Cys Ile Glu Gln Ala Thr Ile Arg Thr Leu Lys Asn Thr

195 200 205

Lys Met Cys Asp Asp Thr Asp Lys Pro Leu Asn Leu Asp Ala Met Thr

210 215 220

Thr Lys Asp Thr Gly Val Trp Val Glu Asn Gly Lys Lys Lys Val Ala

225 230 235 240

Ser Val Gly Ile His Val Arg Arg Ser Ile Thr Ser His Gly Val Ala

245 250 255

Ile Asn Val Asn Thr Asp Leu Ser Tyr Met Asn Ser Phe Glu Met Cys

260 265 270

Gly Leu Lys Asn Thr Leu Thr Thr Ser Ile Met Glu Gln Arg Pro Asp

275 280 285

Ala Val Val Asn Val Gln Ser Val Ala Ile Ser Phe Val Lys Glu Met

290 295 300

Thr Lys Leu Leu Gly Ile Lys Thr Leu Glu Arg Met Gln Ile Asp Asp

305 310 315 320

Val Asn Ile Leu Lys Lys Asn Pro His His His His His His

325 330

<210> 2

<211> 1005

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LIP2

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (985)..(1005)

<223> 6x组氨酸标签

<400> 2

atgtcgaggt gtattcgcca gtccgtatgc acaaacttca atgtctgtag gcgacaatgc 60

tttagcactt atgcctccgc tctcaaggaa atgacacatc ctataaaacc ctcagcgcaa 120

acgctcagac atctacaatt cactcaaaga ataccttttc aaaaaggatt ggaaatacag 180

gagacattag ttagggcaaa tttggacatc aaagacattc aatcgaagat tgagagaaaa 240

ttaatacaat tggatgaaga atataagggc actgcaacaa taaatgataa cgaaaaaaga 300

atattagaca aggttatggc aatgaaacct aatccgataa tattaacgtt tgagtttgag 360

ccaacttata caggtgggaa gaggattaag aaaactatga cgccagatca gatagcggct 420

tatgaaagtt tcattccaga aacgcaaaag gacaacccac gaccaaagtt tgttcaagtg 480

gaaaggggtg gacaagtaac atttcatggt ccaggccaaa ttgttattta cattatttta 540

gatttgaaaa catttcaaag tttccctgct aaatgcttgg tttcatgcat tgagcaggcc 600

actatcagaa cgttgaagaa taccaagatg tgcgacgaca ctgacaagcc tttgaactta 660

gatgctatga ctacaaagga cactggagtt tgggttgaaa atggcaagaa gaaagttgct 720

agtgttggaa tacacgtcag acgttccata acatcgcacg gggtagcaat taatgttaat 780

acagatctat cgtatatgaa tagttttgaa atgtgcggtt tgaaaaatac actgactact 840

tcaattatgg aacaacgacc cgatgctgtt gtaaatgtgc aaagtgtagc aattagtttt 900

gtcaaagaaa tgacaaagct gctaggaata aaaactttgg aaagaatgca aattgacgac 960

gtcaatattt tgaaaaagaa tccgcatcat caccatcacc attaa 1005

<210> 3

<211> 420

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Lip5

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (415)..(420)

<223> 6x组氨酸标签

<400> 3

Met Tyr Arg Arg Ser Val Gly Val Leu Phe Val Gly Arg Asn Thr Arg

1 5 10 15

Trp Ile Ser Ser Thr Ile Arg Cys Gly Thr Ser Ala Thr Arg Pro Ile

20 25 30

Arg Ser Asn Ala Leu Asn Thr Asp Ser Asp Asn Ala Ser Val Arg Val

35 40 45

Pro Val Gly Asn Ser Thr Glu Val Glu Asn Ala Thr Ser Gln Leu Thr

50 55 60

Gly Thr Ser Gly Lys Arg Arg Lys Gly Asn Arg Lys Arg Ile Thr Glu

65 70 75 80

Phe Lys Asp Ala Leu Asn Leu Gly Pro Ser Phe Ala Asp Phe Val Ser

85 90 95

Gly Lys Ala Ser Lys Met Ile Leu Asp Pro Leu Glu Lys Ala Arg Gln

100 105 110

Asn Thr Glu Glu Ala Lys Lys Leu Pro Arg Trp Leu Lys Val Pro Ile

115 120 125

Pro Lys Gly Thr Asn Tyr His Lys Leu Lys Gly Asp Val Lys Glu Leu

130 135 140

Gly Leu Ser Thr Val Cys Glu Glu Ala Arg Cys Pro Asn Ile Gly Glu

145 150 155 160

Cys Trp Gly Gly Lys Asp Lys Ser Lys Ala Thr Ala Thr Ile Met Leu

165 170 175

Leu Gly Asp Thr Cys Thr Arg Gly Cys Arg Phe Cys Ser Val Lys Thr

180 185 190

Asn Arg Thr Pro Ser Lys Pro Asp Pro Met Glu Pro Glu Asn Thr Ala

195 200 205

Glu Ala Ile Lys Arg Trp Gly Leu Gly Tyr Val Val Leu Thr Thr Val

210 215 220

Asp Arg Asp Asp Leu Val Asp Gly Gly Ala Asn His Leu Ala Glu Thr

225 230 235 240

Val Arg Lys Ile Lys Gln Lys Ala Pro Asn Thr Leu Val Glu Thr Leu

245 250 255

Ser Gly Asp Phe Arg Gly Asp Leu Lys Met Val Asp Ile Met Ala Gln

260 265 270

Cys Gly Leu Asp Val Tyr Ala His Asn Leu Glu Thr Val Glu Ser Leu

275 280 285

Thr Pro His Val Arg Asp Arg Arg Ala Thr Tyr Arg Gln Ser Leu Ser

290 295 300

Val Leu Glu Arg Ala Lys Ala Thr Val Pro Ser Leu Ile Thr Lys Thr

305 310 315 320

Ser Ile Met Leu Gly Leu Gly Glu Thr Asp Glu Gln Ile Thr Gln Thr

325 330 335

Leu Lys Asp Leu Arg Asn Ile Gln Cys Asp Val Val Thr Phe Gly Gln

340 345 350

Tyr Met Arg Pro Thr Lys Arg His Met Lys Val Val Glu Tyr Val Lys

355 360 365

Pro Glu Lys Phe Asp Tyr Trp Lys Glu Arg Ala Leu Glu Met Gly Phe

370 375 380

Leu Tyr Cys Ala Ser Gly Pro Leu Val Arg Ser Ser Tyr Lys Ala Gly

385 390 395 400

Glu Ala Phe Ile Glu Asn Val Leu Lys Lys Arg Asn Met Lys His His

405 410 415

His His His His

420

<210> 4

<211> 1263

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LIP5

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1243)..(1263)

<223> 6x组氨酸标签

<400> 4

atgtatagac gatctgttgg agtactattt gttgggagaa atacaagatg gatttcgtcc 60

actattaggt gtggaacgag cgcaactcgg ccaataagat ccaatgcatt gaatactgat 120

tcagataacg ctagcgttag ggtaccagtt ggaaattcaa ctgaggttga aaatgcaacc 180

agtcagttaa cagggacttc gggaaaaaga cgcaagggga acagaaaaag aattacagag 240

ttcaaagatg ctcttaattt gggtccatct tttgcagatt ttgtttcagg taaagcttcg 300

aaaatgatct tggaccctct ggagaaggca aggcaaaata cagaggaagc taaaaaacta 360

cctcgttggc ttaaggttcc tattcctaag ggtaccaatt accataaatt gaaaggcgac 420

gtaaaagaat taggcctgag tactgtttgt gaggaggcaa gatgtcccaa tattggtgaa 480

tgttggggag gcaaagataa atctaaggca acggcaacaa ttatgctgct tggtgatact 540

tgcactcgtg gatgtaggtt ttgttctgtg aagaccaata gaacgcctag taagccggac 600

ccaatggagc ccgaaaatac tgccgaagct atcaaaagat gggggttggg ttatgttgtt 660

ttaactaccg ttgataggga cgatttagtc gatggtggtg ctaatcacct ggccgaaacg 720

gttcgcaaaa tcaaacagaa ggcaccaaat actcttgtag agactctttc tggtgatttc 780

agaggtgatt tgaagatggt ggacattatg gcacaatgtg ggcttgatgt ttacgcacat 840

aatttggaaa cagttgaatc actaacacca catgtcagag acagaagagc tacttataga 900

cagtctttga gtgttttaga aagggcaaaa gctacggttc cgtcactgat tactaaaaca 960

tcaataatgc tgggtctagg agaaactgat gagcaaatta ctcaaacttt gaaggatttg 1020

cgcaatattc aatgtgatgt tgttacattt ggtcaatata tgaggccaac caagagacat 1080

atgaaagtcg tagaatatgt gaaacccgaa aagtttgact actggaaaga gagagcttta 1140

gagatgggat tcttgtattg tgcatctgga cccctagtaa gatcgtcata taaggctggt 1200

gaagcattta ttgagaacgt tttgaagaaa agaaacatga aacatcatca ccatcaccat 1260

taa 1263

<210> 5

<211> 176

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Gcv3

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (171)..(176)

<223> 6x组氨酸标签

<400> 5

Met Leu Arg Thr Thr Arg Leu Trp Thr Thr Arg Met Pro Thr Val Ser

1 5 10 15

Lys Leu Phe Leu Arg Asn Ser Ser Gly Asn Ala Leu Asn Lys Asn Lys

20 25 30

Leu Pro Phe Leu Tyr Ser Ser Gln Gly Pro Gln Ala Val Arg Tyr Thr

35 40 45

Ser Gln His Glu Trp Ile Ala Val His Gln Asp Lys Thr Ala Phe Val

50 55 60

Gly Ile Thr Lys Tyr Ala Thr Asp Ala Leu Gly Asp Ala Thr Tyr Val

65 70 75 80

Glu Leu Pro Glu Val Gly Thr Glu Ile Ala Gln Gly Glu Ser Leu Gly

85 90 95

Ser Ile Glu Ser Val Lys Ser Ala Ser Glu Ile Tyr Gln Pro Ala Asp

100 105 110

Gly Thr Val Glu Glu Ile Asn Thr Asn Leu Glu Glu Asn Pro Gly Val

115 120 125

Val Asn Glu Asp Pro Met Gly Asp Gly Trp Leu Val Lys Met Lys Leu

130 135 140

Gly Glu Gly Val Asn Val Glu Gln Val Glu Gly Leu Met Ser Leu Glu

145 150 155 160

Gln Tyr Glu Lys Thr Leu Val His Asp Asp His His His His His His

165 170 175

<210> 6

<211> 531

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GCV3

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (511)..(531)

<223> 6x组氨酸标签

<400> 6

atgttacgca ctactagact atggaccacc cgcatgccca ctgtgagcaa attgtttttg 60

agaaacagct ccggcaatgc cctaaacaag aataaactac catttttgta ctcatcccaa 120

ggacctcaag ccgtgaggta cacttcccaa catgagtgga tagctgtgca tcaggacaag 180

actgcctttg tcggaattac aaaatacgcc actgatgcct taggggacgc tacctatgtt 240

gagttgccag aagtgggcac tgagattgcc caaggtgagt cgctagggtc cattgagtcc 300

gtcaagtcag cctccgagat ctaccagcct gccgatggta ccgtagagga aattaacact 360

aatcttgagg aaaatccagg tgtggtgaac gaagatccta tgggtgacgg ctggctagtc 420

aaaatgaagc ttggtgaggg cgttaatgtg gaacaggtcg agggtctaat gtccttagaa 480

cagtacgaaa agacactggt tcatgatgac catcatcacc atcaccattg a 531

<210> 7

<211> 760

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Lpa

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (755)..(760)

<223> 6x组氨酸标签

<400> 7

Met Leu Ser Leu Arg Gln Ser Ile Arg Phe Phe Lys Pro Ala Thr Arg

1 5 10 15

Thr Leu Cys Ser Ser Arg Tyr Leu Leu Gln Gln Lys Pro Met Leu Ala

20 25 30

Gln Glu Ser Ile Leu Glu Thr Thr Val Gln Thr Glu Thr Glu Ser Val

35 40 45

Thr Thr Glu Thr Ser Gln Thr Val Ala Asn Leu Glu Ser Glu Thr Thr

50 55 60

Ser Gln Thr Val Met Gln Glu Lys Glu Ser Ser Ser Ala Ile Ala Glu

65 70 75 80

Ser Ser Ser Arg Asn Val Val Ala Val Thr Thr Glu Thr Thr Asn Glu

85 90 95

Ile Gln Asn Ser Gly Thr Asp Gly Lys Ala Val Ser Ala Glu Ser Val

100 105 110

Phe Ser Glu Ala Asp Tyr Lys Gln Ala Thr Ala Leu Glu Leu Ala Thr

115 120 125

Leu Val Arg Glu Lys Lys Val Thr Ser Glu Glu Leu Val Lys Ile Ala

130 135 140

Leu Ala Ile Thr Lys Arg Glu Asn Pro Thr Leu Asn Ala Val Ile Thr

145 150 155 160

Leu Arg Glu Glu Ala Ala Leu Thr Glu Ala Lys Ala Leu Gln Asp Thr

165 170 175

Gly Gln Pro Phe Leu Gly Val Pro Leu Leu Leu Lys Gly Leu Gly Gln

180 185 190

Ser Leu Lys Gly Glu Ser Asn Thr Asn Gly Phe Gly Phe Leu Arg Asp

195 200 205

Gln Val Ala Gly Gly Thr Ser Thr Phe Val Lys Ala Leu Gln Asn Ala

210 215 220

Gly Phe Ile Ile Ile Gly Gln Thr Asn Tyr Pro Glu Leu Gly Trp Lys

225 230 235 240

Asn Ile Ser Asp Ser Lys Leu Tyr Gly Val Ser Val Asn Pro Trp Asn

245 250 255

Pro Asn His Tyr Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ala Gly Ala Ser Val

260 265 270

Ala Ala Ala Phe Val Pro Ile Ala Ser Gly Ser Asp Ala Gly Gly Ser

275 280 285

Ile Arg Ile Pro Ala Ser Trp Thr Gly Thr Val Gly Leu Lys Pro Ser

290 295 300

Arg Gly Val Ile Ile Gly Asn Ser Asn Ser Ala Lys Gly Gln Thr Val

305 310 315 320

His Phe Gly Leu Ser Arg Thr Val Ala Asp Thr Asn Ala Leu Phe Glu

325 330 335

Thr Leu Leu Thr Lys Lys Asp Leu Pro Ala Gly His Leu Ser Gln Ala

340 345 350

Gln Pro Ile Ala Tyr Thr Thr Glu Ser Pro Ala Gly Thr Pro Val Ser

355 360 365

Ala Glu Ala Lys Glu Ala Val Ala Glu Ala Val Ala Phe Leu Lys Asp

370 375 380

Gln Gly Tyr Thr Leu Val Glu Val Lys His Pro Val Asp Gly Glu Arg

385 390 395 400

Leu Met Lys Asn Tyr Tyr Thr Val Ala Ala Gly Ser Ala Gly Ile Ala

405 410 415

Asp Phe Met Ala Arg Gln Lys Leu Lys Arg Pro Leu Glu Arg Asn Asp

420 425 430

Val Glu Leu Leu Thr Trp Ala Leu Phe Gln Thr Gly Lys Asn Ile Thr

435 440 445

Ser Glu Glu Thr Thr Ala Ala Trp Thr Asp Ile Ala Leu Gln Ala Gln

450 455 460

Ala Met Asp Glu Phe Tyr Gln Gln Tyr Pro Ile Leu Leu Thr Pro Thr

465 470 475 480

Thr Ala Ala Thr Ala Pro Ser Ile Asp Asn Pro Leu Leu Lys Pro Glu

485 490 495

His Ala Ala Gln Met Glu Lys Ile Asp Gln Leu Ser Pro Ala Glu Gln

500 505 510

Lys Gln Leu Ile Tyr Asp Gln Trp Leu Thr Ala Phe Thr Tyr Thr Pro

515 520 525

Phe Thr Gln Gln Ala Asn Leu Phe Gly His Pro Ala Leu Ser Val Pro

530 535 540

Thr Tyr Val Ser Lys Glu Gly Leu Pro Leu Gly Ile Gln Phe Asn Ser

545 550 555 560

Ala Leu Asn Glu Asp Arg Thr Leu Leu Gln Leu Gly Ala Leu Phe Glu

565 570 575

Asn Asn His Lys Ile Asn Gln Pro His Val Glu Glu Pro Asp Lys Asp

580 585 590

Lys Glu Pro Asp Ala Ser Gly Glu Pro Glu Lys Asp Lys Asp Pro Asn

595 600 605

Ala Ser Gly Glu Pro Asp Lys Asp Lys Glu Pro Asp Ala Ser Gly Glu

610 615 620

Pro Asp Lys Asp Lys Glu Pro Asp Ala Ser Gly Glu Pro Asp Lys Asp

625 630 635 640

Lys Glu Pro Asp Ala Ser Gly Lys Pro Asp Lys Asp Lys Glu Thr Lys

645 650 655

Thr Ser Glu Gly Pro Ile Glu Gly Lys Asp Gln Asn Gln Asn Pro Asp

660 665 670

Lys Ala Gly Lys Thr Thr Ser Gly Ser Ser Leu Asp Asn Ser Leu Asn

675 680 685

Ser Ser Ala Asn Gln Gly Thr Lys Ser Thr Glu Ser Thr His Ala Phe

690 695 700

Ser Asn Lys Ser Met Ile Gly Lys Gln Glu Gln Leu Pro Lys Lys Val

705 710 715 720

Leu Pro Lys Ala Gly Ala Glu Val Pro Ser Thr Phe Trp Ile Val Leu

725 730 735

Gly Gly Ala Phe Leu Val Thr Ser Gly Thr Ile Tyr Ile Arg Lys Thr

740 745 750

Arg Lys His His His His His His

755 760

<210> 8

<211> 2283

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LPA

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(87)

<223> MTP

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (2263)..(2283)

<223> 6x组氨酸标签

<400> 8

atgctttcac tacgtcaatc tataagattt ttcaagccag ccacaagaac tttgtgtagc 60

tctagatatc tgcttcagca aaaacccatg ctagcccaag aaagcatttt ggaaacaaca 120

gtacagactg aaacagagag tgtgactacg gagacaagcc agacagtcgc caacttggag 180

tctgagacta ccagccagac tgtaatgcaa gaaaaagaga gttcttcagc tatcgcagaa 240

agctcatcaa gaaatgtggt tgcggtaaca actgaaacca cgaatgagat tcaaaatagt 300

ggtactgacg ggaaggctgt gtcagctgaa tctgtatttt ctgaagcaga ttacaaacaa 360

gctactgcat tagaacttgc tactcttgtt agagagaaaa aggtcacttc cgaggaatta 420

gttaagatcg ctctagccat cactaaacgt gagaatccaa cccttaatgc cgtcattact 480

ttaagagaag aggcagcttt aacggaggcc aaggccttgc aagacactgg acaaccgttt 540

ttaggagttc ctttgttgtt gaagggtttg ggtcagtcat taaagggaga atctaacacg 600

aatggcttcg gttttctaag ggaccaagtg gctggtggaa cttcaacttt cgttaaagca 660

ttgcagaacg cgggattcat cataattggc caaactaatt atccggaact aggctggaaa 720

aatatatcag actcaaagtt atatggggtg tccgtcaatc catggaatcc caaccattat 780

tccggaggta gtagtggggg agcgggtgct agtgtggccg cagcattcgt ccccattgct 840

agtggttccg atgctggtgg ctcaattaga atacctgcga gttggactgg cactgtggga 900

ctgaaaccat ctcgtggggt tattattggc aattctaact cagccaaggg tcaaacggtc 960

catttcggtt taagcagaac agttgccgac actaatgcgc ttttcgaaac tcttcttacc 1020

aagaaggatt tgccagctgg ccatttatcc caagcacaac ccatagcgta cactaccgaa 1080

agtccagcag gtacacccgt aagcgctgag gccaaagagg ctgtggccga agcagtagct 1140

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cttatgaaaa actattacac ggtcgccgct ggtagtgccg gcatcgccga ctttatggcc 1260

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ttccaaacag ggaaaaatat aacaagtgaa gaaactacag ccgcatggac cgatatcgct 1380

ctacaagccc aagccatgga tgaattttat caacaatatc caattttgtt aacaccgacg 1440

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ttaactgctt tcacatatac cccgttcaca caacaagcga acctattcgg tcacccggct 1620

ttatctgtac ccacttatgt ctccaaagag ggtttgccac tgggaattca atttaactcc 1680

gccttgaatg aagatagaac tttattgcag ctaggtgcat tgttcgaaaa caatcacaaa 1740

atcaaccagc ctcatgttga agagcctgat aaagacaagg aacctgatgc cagcggagag 1800

cctgaaaaag ataaggaccc aaatgcgtcc ggtgagccag acaaggacaa agagcccgat 1860

gcttcaggtg aacccgataa agataaagaa ccagatgcca gtggggaacc agataaagat 1920

aaggaaccag acgcaagtgg taagccagat aaagataaag agaccaagac ttccgaaggg 1980

ccgatcgagg gtaaagatca aaaccaaaat cccgataagg ctggtaagac aacctcaggg 2040

tctagcctag ataatagttt aaatagcagt gcaaaccagg gcacaaaatc cactgaatca 2100

actcatgcgt tttctaataa atccatgatc ggtaaacaag aacaattgcc gaaaaaagta 2160

ttgccaaagg cgggagcaga agtgccatct actttctgga ttgttcttgg tggtgctttc 2220

ttagtgacga gtggtactat ctacattaga aagacccgta agcatcatca ccatcaccat 2280

taa 2283

<210> 9

<211> 423

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Sam1

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (418)..(423)

<223> 6x组氨酸标签

<400> 9

Met Leu Ser Leu Arg Gln Ser Ile Arg Phe Phe Lys Pro Ala Thr Arg

1 5 10 15

Thr Leu Cys Ser Ser Arg Tyr Leu Leu Gln Gln Lys Pro His His His

20 25 30

His His His Met Ala Gly Thr Phe Leu Phe Thr Ser Glu Ser Val Gly

35 40 45

Glu Gly His Pro Asp Lys Ile Cys Asp Gln Val Ser Asp Ala Ile Leu

50 55 60

Asp Ala Cys Leu Ala Glu Asp Pro His Ser Lys Val Ala Cys Glu Thr

65 70 75 80

Ala Ala Lys Thr Gly Met Ile Met Val Phe Gly Glu Ile Thr Thr Lys

85 90 95

Ala Gln Leu Asp Tyr Gln Lys Ile Val Arg Asp Thr Ile Lys Lys Ile

100 105 110

Gly Tyr Asp Asp Ser Ala Lys Gly Phe Asp Tyr Lys Thr Cys Asn Val

115 120 125

Leu Val Ala Ile Glu Gln Gln Ser Pro Asp Ile Ala Gln Gly Val His

130 135 140

Glu Glu Lys Asp Leu Glu Asp Ile Gly Ala Gly Asp Gln Gly Ile Met

145 150 155 160

Phe Gly Tyr Ala Thr Asp Glu Thr Pro Glu Gly Leu Pro Leu Thr Ile

165 170 175

Leu Leu Ala His Lys Leu Asn Met Ala Met Ala Asp Ala Arg Arg Asp

180 185 190

Gly Ser Leu Ala Trp Leu Arg Pro Asp Thr Lys Thr Gln Val Thr Val

195 200 205

Glu Tyr Lys Asp Asp His Gly Arg Trp Val Pro Gln Arg Ile Asp Thr

210 215 220

Val Val Val Ser Ala Gln His Ala Asp Glu Ile Thr Thr Glu Asp Leu

225 230 235 240

Arg Ala Gln Leu Lys Ser Glu Ile Ile Glu Lys Val Ile Pro Arg Asp

245 250 255

Met Leu Asp Glu Asn Thr Lys Tyr Phe Ile Gln Pro Ser Gly Arg Phe

260 265 270

Val Ile Gly Gly Pro Gln Gly Asp Ala Gly Leu Thr Gly Arg Lys Ile

275 280 285

Ile Val Asp Ala Tyr Gly Gly Ala Ser Ser Val Gly Gly Gly Ala Phe

290 295 300

Ser Gly Lys Asp Tyr Ser Lys Val Asp Arg Ser Ala Ala Tyr Ala Ala

305 310 315 320

Arg Trp Val Ala Lys Ser Leu Val Ala Ala Gly Leu Cys Lys Arg Val

325 330 335

Gln Val Gln Phe Ser Tyr Ala Ile Gly Ile Ala Glu Pro Leu Ser Leu

340 345 350

His Val Asp Thr Tyr Gly Thr Ala Thr Lys Ser Asp Glu Glu Ile Ile

355 360 365

Asp Ile Ile Ser Lys Asn Phe Asp Leu Arg Pro Gly Val Leu Val Lys

370 375 380

Glu Leu Asp Leu Ala Arg Pro Ile Tyr Leu Pro Thr Ala Ser Tyr Gly

385 390 395 400

His Phe Thr Asn Gln Glu Tyr Pro Trp Glu Lys Pro Lys Thr Leu Lys

405 410 415

Phe His His His His His His

420

<210> 10

<211> 1272

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SAM1

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(87)

<223> MTP

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1252)..(1272)

<223> 6x组氨酸标签

<400> 10

atgctttcac tacgtcaatc tataagattt ttcaagccag ccacaagaac tttgtgtagc 60

tctagatatc tgcttcagca aaaaccccat catcaccatc accatatggc cggtacattt 120

ttattcactt ctgaatccgt tggtgaaggt cacccagata agatctgtga ccaagtttcc 180

gacgccatct tggacgcttg tttagccgag gaccctcact ccaaagttgc gtgtgaaacc 240

gcggcaaaga ctggtatgat tatggtcttt ggtgaaatta ctaccaaggc acagttggat 300

taccaaaaaa tcgtcagaga caccatcaag aagattggtt acgatgattc cgccaagggt 360

ttcgactata agacctgtaa cgtccttgtc gccattgagc aacaatctcc agatatcgcc 420

caaggtgtcc acgaggagaa ggatttggaa gacatcggtg ccggtgacca aggtatcatg 480

tttggttacg ccacagatga aactccagag ggtttgcctt tgactattct tttggctcat 540

aaactaaaca tggccatggc tgacgcgaga agagatggct ctttagcgtg gttgagacca 600

gacaccaaga ctcaagtcac cgtcgaatac aaggatgacc acggtagatg ggttccacaa 660

agaatcgaca ccgtcgtcgt ctccgctcaa catgctgacg aaatcacgac cgaggactta 720

agagcgcaac taaagtccga gatcattgaa aaagtcatcc caagagacat gttggacgaa 780

aacaccaaat actttatcca accttccggt agattcgtca tcggtggtcc tcaaggtgac 840

gctggtttga ccggtagaaa gatcatcgtc gacgcttacg gtggtgcctc atccgtcggt 900

ggtggtgcct tctccggtaa ggactactct aaggttgatc gttctgccgc ttatgccgct 960

agatgggttg ccaagtccct agttgccgct ggtttatgta agagagttca agttcaattt 1020

tcttatgcca tcggtattgc ggaaccattg tccttgcacg ttgacaccta tggtactgcg 1080

accaagtctg acgaagaaat tatcgacatt atcagcaaga actttgactt gagacctggt 1140

gtattggtca aggagttgga cttagctaga ccaatctact tgccaaccgc ttcttatggc 1200

catttcacaa accaagaata cccatgggaa aagcctaaga ctttgaagtt ccatcatcac 1260

catcaccatt aa 1272

<210> 11

<211> 425

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Sam2

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (419)..(425)

<223> 6x组氨酸标签

<400> 11

Met Leu Ser Leu Arg Gln Ser Ile Arg Phe Phe Lys Pro Ala Thr Arg

1 5 10 15

Thr Leu Cys Ser Ser Arg Tyr Leu Leu Gln Gln Lys Pro His His His

20 25 30

His His His Met Ser Lys Ser Lys Thr Phe Leu Phe Thr Ser Glu Ser

35 40 45

Val Gly Glu Gly His Pro Asp Lys Ile Cys Asp Gln Val Ser Asp Ala

50 55 60

Ile Leu Asp Ala Cys Leu Glu Gln Asp Pro Phe Ser Lys Val Ala Cys

65 70 75 80

Glu Thr Ala Ala Lys Thr Gly Met Ile Met Val Phe Gly Glu Ile Thr

85 90 95

Thr Lys Ala Arg Leu Asp Tyr Gln Gln Ile Val Arg Asp Thr Ile Lys

100 105 110

Lys Ile Gly Tyr Asp Asp Ser Ala Lys Gly Phe Asp Tyr Lys Thr Cys

115 120 125

Asn Val Leu Val Ala Ile Glu Gln Gln Ser Pro Asp Ile Ala Gln Gly

130 135 140

Leu His Tyr Glu Lys Ser Leu Glu Asp Leu Gly Ala Gly Asp Gln Gly

145 150 155 160

Ile Met Phe Gly Tyr Ala Thr Asp Glu Thr Pro Glu Gly Leu Pro Leu

165 170 175

Thr Ile Leu Leu Ala His Lys Leu Asn Met Ala Met Ala Asp Ala Arg

180 185 190

Arg Asp Gly Ser Leu Pro Trp Leu Arg Pro Asp Thr Lys Thr Gln Val

195 200 205

Thr Val Glu Tyr Glu Asp Asp Asn Gly Arg Trp Val Pro Lys Arg Ile

210 215 220

Asp Thr Val Val Ile Ser Ala Gln His Ala Asp Glu Ile Ser Thr Ala

225 230 235 240

Asp Leu Arg Thr Gln Leu Gln Lys Asp Ile Val Glu Lys Val Ile Pro

245 250 255

Lys Asp Met Leu Asp Glu Asn Thr Lys Tyr Phe Ile Gln Pro Ser Gly

260 265 270

Arg Phe Val Ile Gly Gly Pro Gln Gly Asp Ala Gly Leu Thr Gly Arg

275 280 285

Lys Ile Ile Val Asp Ala Tyr Gly Gly Ala Ser Ser Val Gly Gly Gly

290 295 300

Ala Phe Ser Gly Lys Asp Tyr Ser Lys Val Asp Arg Ser Ala Ala Tyr

305 310 315 320

Ala Ala Arg Trp Val Ala Lys Ser Leu Val Ala Ala Gly Leu Cys Lys

325 330 335

Arg Val Gln Val Gln Phe Ser Tyr Ala Ile Gly Ile Ala Glu Pro Leu

340 345 350

Ser Leu His Val Asp Thr Tyr Gly Thr Ala Thr Lys Ser Asp Asp Glu

355 360 365

Ile Ile Glu Ile Ile Lys Lys Asn Phe Asp Leu Arg Pro Gly Val Leu

370 375 380

Val Lys Glu Leu Asp Leu Ala Arg Pro Ile Tyr Leu Pro Thr Ala Ser

385 390 395 400

Tyr Gly His Phe Thr Asn Gln Glu Tyr Ser Trp Glu Lys Pro Lys Lys

405 410 415

Leu Glu Phe His His His His His His

420 425

<210> 12

<211> 1278

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SAM2

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(87)

<223> MTP

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1258)..(1278)

<223> 6x组氨酸标签

<400> 12

atgctttcac tacgtcaatc tataagattt ttcaagccag ccacaagaac tttgtgtagc 60

tctagatatc tgcttcagca aaaaccccat catcaccatc accatatgtc caagagcaaa 120

actttcttat ttacctctga atccgtcggt gaaggtcacc cagacaagat ttgtgaccaa 180

gtttctgatg ctattttgga cgcttgttta gaacaagatc cattctccaa ggttgcctgt 240

gaaacagctg ccaaaactgg tatgattatg gttttcggtg aaattaccac caaagctaga 300

cttgactacc aacaaatagt aagagatacc atcaagaaga ttggttatga cgattctgcc 360

aagggtttcg actacaagac atgtaatgtt ttagtagcta tcgaacaaca atctccagat 420

atcgctcaag gtctgcacta tgaaaagagc ttagaagact taggtgctgg tgaccaaggt 480

ataatgtttg gttacgctac agacgaaact ccagaagggt taccattgac cattcttttg 540

gctcacaaat tgaacatggc tatggcagat gctagaagag atggttctct cccatggttg 600

agaccagaca caaagactca agtcactgtc gaatacgaag acgacaatgg tagatgggtt 660

ccaaagagga tagataccgt tgttatttct gctcaacatg ctgatgaaat ttccaccgct 720

gacttgagaa ctcaacttca aaaagatatt gttgaaaagg tcataccaaa ggatatgtta 780

gacgaaaata ccaaatattt catccaacca tccggtagat tcgtcatcgg tggtcctcaa 840

ggtgacgctg gtttgaccgg tagaaagatt attgtcgacg cttacggtgg tgcctcatcc 900

gtcggtggtg gtgccttctc cggtaaggac tattccaagg tcgatcgttc cgctgcttac 960

gctgctagat gggttgccaa gtctctagtt gccgctggtt tgtgtaagag agtccaagtc 1020

caattttcat atgctattgg tattgctgaa ccattgtctt tacatgtgga cacctatggt 1080

acagctacaa aatcagatga cgaaatcatt gaaattatta agaagaactt cgacttgaga 1140

ccaggtgtgt tagtaaagga attagatttg gctagaccaa tttacttacc aaccgcttct 1200

tatggtcact tcactaatca agagtactca tgggaaaaac caaagaaatt ggaatttcat 1260

catcaccatc accattaa 1278

<210> 13

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PGAL1-F

<400> 13

aaacgagctc agtacggatt agaagcc 27

<210> 14

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PGAL1-R

<400> 14

tttttagggt tttttctcct tgacgtt 27

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TCYC1-F

<400> 15

atccgctcta accgaaaagg 20

<210> 16

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TCYC1-R

<400> 16

aaacgagctc cttcgagcgt cccaaaacc 29

<210> 17

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> EfLPA-F

<400> 17

cgtcaaggag aaaaaaccct aaaaaatgct agcccaagaa 40

<210> 18

<211> 127

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mEfLPA-F

<400> 18

cgtcaaggag aaaaaaccct aaaaaatgct ttcactacgt caatctataa gatttttcaa 60

gccagccaca agaactttgt gtagctctag atatctgctt cagcaaaaac ccatgctagc 120

ccaagaa 127

<210> 19

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> EfLPA-R

<400> 19

ctaactcctt ccttttcggt tagagcggat tcattaatgg tgatggtgat gatgcttacg 60

ggtctttcta atgtaga 77

<210> 20

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> EGFP-F

<400> 20

cgtcaaggag aaaaaaccct aaaaaatgtc taaaggtgaa 40

<210> 21

<211> 127

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mEGFP-F

<400> 21

cgtcaaggag aaaaaaccct aaaaaatgct ttcactacgt caatctataa gatttttcaa 60

gccagccaca agaactttgt gtagctctag atatctgctt cagcaaaaac ccatgtctaa 120

aggtgaa 127

<210> 22

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> EGFP-R

<400> 22

ctaactcctt ccttttcggt tagagcggat tcattaatgg tgatggtgat gatgtttgta 60

caattcatc 69

<210> 23

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PTEF1-F

<400> 23

accgctcgag catagcttca aaatgtttct actccttt 38

<210> 24

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PTEF1-R

<400> 24

ttgtaattaa aacttagatt agattgc 27

<210> 25

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GCV3-F

<400> 25

gcaatctaat ctaagtttta attacaaatg ttacgcacta ctagactatg g 51

<210> 26

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GCV3-R

<400> 26

ctaactcctt ccttttcggt tagagcggat tcattaatgg tgatggtgat gatggtcatc 60

atgaaccagt gt 72

<210> 27

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> KGD2-F

<400> 27

gcaatctaat ctaagtttta attacaaatg ctttccagag cgacg 45

<210> 28

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> KGD2-R

<400> 28

atcagattgg tatgggctgc aaatttcaaa tcattaatgg tgatggtgat gatgccataa 60

caacattttt ctag 74

<210> 29

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TKGD2-F

<400> 29

tttgaaattt gcagcccata c 21

<210> 30

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TKGD2-R

<400> 30

attcgagctc atgtggaaat caaaagaata ttagttgat 39

<210> 31

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LAT1-F

<400> 31

gcaatctaat ctaagtttta attacaaatg tctgcctttg tcagggtg 48

<210> 32

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LAT1-R

<400> 32

taataaaaat cataaatcat aagaaattcg tcattaatgg tgatggtgat gatgcaatag 60

catttccaaa ggat 74

<210> 33

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TADH1-F

<400> 33

cgaatttctt atgatttatg attttta 27

<210> 34

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TADH1-R

<400> 34

acgcggatcc gagcgacctc atgctatacc t 31

<210> 35

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LIP2-LIP5-CS6-F

<400> 35

aacctcgagg agaagttttt ttacccctct ccacagatcc tcgagcatag cttcaaaatg 60

tttctac 67

<210> 36

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LIP2-LIP5-CS6-R

<400> 36

taattaggta gaccgggtag atttttccgt aaccttggtg tcgagctcac gcattttttt 60

cttttgc 67

<210> 37

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SAM1/2-CS8-F

<400> 37

caaaattacc tacggtaatt agtgaaaggc caaaatctaa tgttacaata gtatactaga 60

agaatgagcc aag 73

<210> 38

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SAM1-CS8-R

<400> 38

gaccgttccc ttgtgttgta ccagtggtag ggttcttctc ggtagcttct ataagataaa 60

gtttggtttg ttgatc 76

<210> 39

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SAM2-CS8-R

<400> 39

gaccgttccc ttgtgttgta ccagtggtag ggttcttctc ggtagcttct cctcaaagac 60

attctatatt tcaacc 76

<210> 40

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来自Gcv3p的片段

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (3)..(3)

<223> 硫辛酸修饰

<400> 40

Ser Val Lys Ser Ala Ser Glu

1 5

<210> 41

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来自Kgd2p的片段

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (3)..(3)

<223> 硫辛酸修饰

<400> 41

Thr Asp Lys Ile Asp Ile Glu

1 5

<210> 42

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来自Lat1p的片段

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (3)..(3)

<223> 硫辛酸修饰

<400> 42

Thr Asp Lys Ala Gln Met Asp Phe Glu

1 5

<210> 43

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来自Gcv3p的片段

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(1)

<223> 硫辛酸修饰

<400> 43

Ser Val Lys Ser Ala Ser Glu

1 5

<210> 44

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来自Gcv3p的片段

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (4)..(4)

<223> 硫辛酸修饰

<400> 44

Ser Val Lys Ser Ala Ser Glu

1 5

<210> 45

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MTP

<400> 45

Met Leu Ser Leu Arg Gln Ser Ile Arg Phe Phe Lys Pro Ala Thr Arg

1 5 10 15

Thr Leu Cys Ser Ser Arg Tyr Leu Leu Gln Gln Lys Pro

20 25

Claims

1.一种分离的基因工程化细菌或酵母细胞，其中所述细胞已经被至少一种多核苷酸分子转化；

所述至少一种多核苷酸分子包括可操作地连接到至少一种启动子的硫辛酸途径基因，所述硫辛酸途径基因编码辛酰基转移酶、硫辛酰合酶、硫辛酰化的蛋白质底物、硫辛酰胺酶和/或S-腺苷甲硫氨酸合酶，

其中至少一种硫辛酸途径基因是异源的，并且所述基因工程化细菌或酵母细胞与未转化的细胞相比能够提高游离硫辛酸的产生。

2.根据权利要求1所述的分离的基因工程化细菌或酵母细胞，其中所述硫辛酰化的蛋白质底物选自Gcv3p(甘氨酸裂解系统H蛋白)、Lat1p和Kgd2p。

3.根据权利要求1或2所述的分离的基因工程化细菌或酵母细胞，其中所述S-腺苷甲硫氨酸合酶来自选自以下的细胞：克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、耶氏酵母属(Yarrowia)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、酵母属物种(Saccharomyces spp.)和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的分离的基因工程化细菌或酵母细胞，其中所述硫辛酸途径基因包括至少一种选自以下的基因：LIP2(辛酰基转移酶)、LIP5(硫辛酰合酶)、GCV3(甘氨酸裂解系统H蛋白)、LPA(硫辛酰胺酶)、SAM1和/或SAM2。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的分离的基因工程化细菌或酵母细胞，其中所述硫辛酸途径基因在线粒体中表达。

6.根据权利要求5所述的分离的基因工程化细菌或酵母，其中所述硫辛酸途径基因借助线粒体靶向肽(MTP)在线粒体中表达。

7.根据权利要求6所述的分离的基因工程化细菌或酵母，其中对于LPA、Sam1和/或Sam2，所述线粒体靶向肽(MTP)来自酵母细胞色素c氧化酶亚基IV(COX4)。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的分离的基因工程化酵母，其中所述酵母选自克鲁维酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、耶氏酵母属、德巴利酵母属、酵母属物种和粟酒裂殖酵母。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的分离的基因工程化细菌或酵母，其中所述至少一种启动子为组成型启动子。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的分离的基因工程化细菌或酵母，其中所述硫辛酸途径基因由一种或多种质粒表达。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的分离的基因工程化细菌或酵母，其中所述硫辛酸途径基因中的至少一种被整合到所述细菌或酵母的基因组中。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的分离的基因工程化细菌或酵母，其中所述硫辛酰胺酶来自粪肠球菌(Enterococcus faecalis)(EfLPA)。

13.根据权利要求4至12中任一项所述的分离的基因工程化细菌或酵母，其中所述LIP2、LIP5、GCV3、LPA、SAM1和/或SAM2基因分别编码包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:11的氨基酸序列。

14.根据权利要求4至13中任一项所述的分离的基因工程化细菌或酵母，其中所述LIP2、LIP5、GCV3、LPA、SAM1和/或SAM2基因分别包含与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10和/或SEQ ID NO:12具有至少70％序列同一性、至少80％序列同一性、至少90％序列同一性或100％序列同一性的多核苷酸序列。

15.一种重组表达载体，所述重组表达载体包含可操作地连接到启动子的在权利要求1至14中任一项所定义的一种或多种异源硫辛酸途径基因，其中从所述途径基因表达的蛋白质被定位到线粒体。

16.根据权利要求15所述的重组载体，其中所述启动子是组成型启动子。

17.一种在基因工程化细胞中产生游离硫辛酸的方法，所述方法包括以下步骤：

a)在用于硫辛酸生物合成的条件下在培养基中培养多个根据权利要求1至14中任一项所述的基因工程化细胞，以及

b)为所述培养基补充半胱氨酸，

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述培养基补充有浓度为至少0.05mg/ml、至少0.1mg/ml、至少0.2mg/ml、至少0.5mg/ml，或在从0.05mg/ml至0.7mg/ml范围内、优选在0.1mg/ml至0.4mg/ml范围内的半胱氨酸。

19.根据权利要求17或18所述的方法，所述方法进一步包括分离所述游离硫辛酸。

20.根据权利要求17至19中任一项所述的方法，其中所述工程化细胞为酵母细胞。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述工程化细胞为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。