CN1155828C - 样本的组群或子组群的选定方法 - Google Patents

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Abstract

一种应用较重的密实粒子和重力沉积从生物样本中分离出选定的所需或不需组群的分离程序。粒子具有一个或多个反应剂连结在其上，该反应剂专门针对所选定的组群并容易与它连结。粒子与样本的混合最好是使粒子反复通过样本的相当大的部分进行沉积以便与选定的组群连结。然后最好使粒子和连结在其上的选定的组群在样本内沉积，包括非选定组群的上层清液可从粒子和连结着的选定组群上分开。粒子可以加热以便杀菌并清除内毒素。

Description

样本的组群或子组群的选定方法
本发明一般地涉及从样本中分离出所需或不需组群或子组群以便单独得到所需组群或子组群，或在一个或多个不需子组群从其中除去后得到一个强化组群或子组群的方法。更具体点说，本发明的目标是要分离出所需或不需组群或子组群，例如从骨髓或血液中分离出细胞，办法是将组群或子组群结合到较密实的粒子中，然后利用重力沉积将组群或子组群从其余的样本上层清液中分离出来。
样本组群或子组群的强化可应用于多种用途。例如在有B细胞淋巴瘤的情况下，可能需要在骨髓中除去所有的非何杰金氏的B淋巴瘤细胞。如果骨髓要清除B细胞并重新输送给病人，那么要紧的是，骨髓必须完全净化，否则骨髓会受到损害。
目前流行的一种方法是利用许多磁性的微球体，这些微球体通常是由具有较低密度的以聚合物为基的磁性材料制成。它们需要具有较低的密度，因为它们将与骨髓或血液混合在一起并且专门被设计为不会被重力沉积法沉积出来。这些微球体典型地具有较小的尺寸，一般直径约为或小于一微米。但美国纽约州Grest Neck的Dynal公司所销售的一种采用磁性聚合物微球体的产品，其公称直径为28或4.5微米，其较低的微球体密度约为1.5g/cm3。现有技术的微球体要求在样本中维持悬浮状态，因此被设计成为在样本悬浮液中进行极其缓慢的或基本上消失的重力沉积。
磁性微球体具有至少一个连结在其上的抗体专门针对所需除去的组群或子组群。通常，如在Dynal方法中，有一第一单克隆抗体连结到所关心的细胞并有一个专门针对第一单克隆抗体的第二抗体连结在微球体上。这些细胞在连结到单克隆抗体之前通常先从整个血液或骨髓中被分离出来然后被清洗，该清洗步骤不会对细胞造成可辨别的损失。微球体和细胞随后混合在一起并通过第一和第二抗体将微球体连结到细胞上。为了净化血液或骨髓，一个样本将和许多连结着微球体的抗体混合，然后被放置在一个磁场内。当微球体被保持在磁场内时，剩下的样本或上层清液即可除去。这道程序通常必须重复多次，因为单一的净化步骤往往不能把不需的组群或子组群排除到足够的百分比。净化的目标是要把所有的(100％)作为目标的组群或子组群都排除掉。这一点通常不能完全做到，此时只能尽可能地将样本净化到接近100％。
磁性排除程序存在着若干问题。该程序在每一次进行排除步骤时也从其他组群中非特定地排除掉一些细胞。这将减少产出，即其余的所需组群所占的百分比。这时单一的排除步骤将产生一个百分比较低的可变的产出，每一个接续步骤也将减少产出。另外，磁性微球体是比较费钱的。
磁性微球体程序也被用来强化子组群以便研究该子组群。在这种情况下，磁性微球体被连结到所需子组群上，而连结着细胞的微球体则从样本中被排除。这样子组群便可直接被研究或者可从微球体中除出来供研究。这个程序非常耗费时间，大约需要耗费一至六个小时或更长，并且可议论的是未能产生一个原来的子组群，这是因为子组群已有至少一个单克隆抗体连结到至少一种细胞抗原上。
净化的另一用途是研究或强化一个特定的子组群，例如淋巴细胞(L)的CD4组群。在这种情况下，微球体具有专门针对一个或多个非CD4组群的单克隆抗体连结在其上。排除其他组群可提高样本的总共留下的细胞组群内的CD4细胞数。但当采用磁性微球体时，一部分CD4子组群的非特定的排除能够严重地影响到CD4子组群留下来的数目。当采用一个大体积的样本如为5ml或更大时，由于需要大量的磁性微球体，细胞的非特定的排除会带来更多的问题。当将磁性微球体放置在一个磁场内时，其他非目标的细胞的非特定的捕捉和排除带会发生。
包括用抗体标记的表面在内的其它各种正面的或负面的选定方法都曾被应用以便从一个不同型式的细胞混合物中产生细胞的子组群。这些方法通常都有抗体共价地连结到一个柱管内的塑料表面或聚合物粒子上。一般地说，要使这个混合的细胞组群与连结的抗体结合起来，或是将它们加入到一个柱管中任它们培育或是使它们沉积在一个表面上。要使这些程序顺利进行，须先将红血球(RBC)和血浆从混合的细胞组群中除去，办法是通过密度梯度制备一个血沉棕黄色层或一个单细胞核的制剂，然后清洗细胞并使它们与用抗体标记的表面结合。这两种方法在使用前都还需要准备分离系统并用一缓冲剂冲洗，这样在采用柱管和烧瓶的方法时，连同与抗体培育的时间30至60分钟，整个程序需要至少三个小时。这些方法能够用来对所关心的细胞组群进行负面的或正面的选定。在这两种方法中，直接分离造成高浓缩的组群，同时非特定地造成非目标的细胞的损失。释出的细胞在其表面上可具有抗体，这些细胞常被分离技术激活，而这通常是不希望有的。
实施本发明的方法和设备能够应用到各种免疫反应上，如含有反应剂和细胞的免疫反应。本文在使用时，细胞被定义为动物的或植物的细胞，包括细胞状的细菌和真菌，这些细胞可分开来或成为集合物予以辨认。细胞是有生命物质的最小的结构集合体，它能作为独立的单元而发挥其功能。例如，细胞可以是人体的组织、骨髓及/或血液的样本中的红血球(RBC)和白血球(WBC)组群、癌或其他不正常的细胞。适当加标志或标记的细胞当然可望像人体的血球或骨髓那样以相同的方式用本发明的方法和设备来进行操作。
本文在使用时，术语“反应剂”被定义为各种分子，如单克隆或多克隆抗体，它们能够检测并与一个或多个在细胞表面上的特定的互补分子如抗原反应。下面给出一些实例：
反应剂：                  特定分子
抗体                      抗原
药剂                      药剂受体
激素                      激素受体
生长素                    生长素受体
外源凝集素                碳水化合物分子
核酸序列                  互补的核酸序列
酶                        余因子或抑制剂
反应剂偶合或连结到细胞上的特定分子上。
因此需要有一个有效的方法来清除或选出一个或多个子组群而不影响样本如全部血液和骨髓中的其余组群。这个方法应该是花费不多的、快速的、高收获率的并且对所要作用的样本的体积是没有限制的。
本发明提供一种方法和设备可以用来从一个生物液体样本如全部血液中分离出一个所需或不需的组群或子组群，不仅快速而且具有高收获率。连结着一个或多个反应剂如单克隆或多克隆抗体的多个密实的、比较重的粒子与样本混合在一起。连结在粒子上的抗体可瞄准不感兴趣的细胞。通过重力使连结着细胞的粒子分化沉积，然后除去其余的样本。这样便可提高在样本中留下的关心细胞的数目，这种细胞是没有被粒子作为目标的。连结在粒子上的抗体也可瞄准关心的细胞。然后可将样本液体中的其余部分和非目标的细胞从连结着目标细胞的粒子中除去并分析确定除去了多少非目标细胞。然后再将目标细胞从粒子上取出以便进一步分析。一种较好的有价值的粒子材料可能是镍。镍粒子在需要时能够加热来使粒子成为无菌。如果样本已被净化并要移植到人体内，那么可用磁场和清洗程序来除去RBC并进一步确保所有的密实粒子都从样本中取出。
按照本发明的第一方面，提供一种从生物液体样本中除去至少一种预先选定的细胞组群或子组群的方法，包括：提供多个粒子，所述粒子具有连结于其上的反应剂，所述反应剂专门地连结于至少一种预先选定的组群或子组群的细胞，并且所述粒子具有的密度足以形成所述预先选定的组群或子组群从其余样本的差重沉淀，所述粒子的密度为所述细胞密度的至少两倍；使一部分所述样本与所述粒子混合，以便使所述粒子连结于所述预先选定的组群或子组群而不显著有形地损伤所述预先选定的组群或子组群，所述混合是通过使所述粒子反复通过所述一部分样本的主要部分沉淀而进行的；使带有所述被连结的组群或子组群的所述粒子沉淀，产生基本没有所述被连结的组群或子组群的上清液，所述沉淀主要是借助重力完成的；以及使包括非选定的组群或子组群的所述样本部分的至少一部分所得到的上清液与所述粒子和所述被连结的组群或子组群分离。
按照本发明的第二方面，提供一种增强生物液体样本中所关心的选定组群或子组群的方法，包括：提供多个所具有的密度足以形成差重沉淀的粒子，所述粒子具有连结于其上的多克隆抗体，所述多克隆抗体上连结着反应剂，所述反应剂专门地连结于细胞或生物粒子的至少一个预先选定的组群或子组群，所述形成差重沉淀的粒子的密度为所述细胞密度的至少两倍；使体积至少一毫升的一部分所述样本与所述粒子混合，以便使所述粒子连结所述预先选定的组群或子组群而不显著有形地损伤待增强的所述组群或子组群；差重沉淀在所述样本部分中的带有所述被连结的组群或子组群的所述粒子；以及使包括所述被增强的组群或子组群的所述样本部分的至少一部分得到的上清液与所述粒子和所述被连结的组群或子组群分离。
按照本发明的第三方面，提供一种增强在生物液体样本中所关心的选定组群或子组群的方法，包括：提供多个所具有的密度足以形成差重沉淀的粒子，所述粒子具有连结或固定其上的反应剂，所述反应剂专门地连结于细胞或生物粒子的至少一个预先选定的组群或子组群，所述形成差重沉淀的粒子的密度为所述细胞密度的至少两倍；使体积至少一毫升的一部分所述样本与所述粒子混合，以便所述颗粒连结于所述预先选定的组群或子组群而不显著有形地损伤所述待增强组群或子组群；差重沉淀在所述样本部分中的带有所述被连结的组群或子组群的所述粒子；以及使包括所述被增强的组群或子组群的所述样本部分的至少一部分所得到的上清液与所述粒子和所述被连结的组群或子组群分离。
按照本发明的第四方面，提供一种增强在具有多个细胞组群的生物液体样本中所关心的选定细胞组群或子组群的方法，包括：提供多个所具有的密度足以形成差重沉淀的粒子，所述粒子具有连结其上的反应剂，所述反应剂专门地连结于不关心的至少一个预先选定的组群或子组群的细胞或生物粒子，所述形成差重沉淀的粒子的密度为所述细胞密度的至少两倍；使一部分所述样本与所述粒子混合，以便使所述粒子连结所述预先选定的组群或子组群的所述细胞或生物粒子而不显著有形地损伤所关心的所述选定的组群或子组群的所述细胞；差重沉淀在所述样本部分中的带有所述被连结的细胞或生物粒子组群或子组群的所述粒子；从所述粒子和所述被连结的细胞或生物粒子的组群或子组群除去包括所述所关心的细胞的所述选定的组群或子组群的所述样本部分的至少一部分所得到的上清液；提供第二种多个所具有的密度足以形成差重沉淀的粒子，所述粒子具有连结其上的反应剂，所述反应剂专门地连接于所关心的至少一种预先选定的组群或子组群的细胞或生物粒子；使包括所关心的所述选定的细胞组群或子组群的所述样本部分的所述被除去的上清液与所述第二种多个粒子混合，以便使所述第二种多个粒子连结于所述第二种预先选定的细胞或生物粒子组群或子组群而不显著有形地损伤所关心的所述选定的细胞组群或子组群；差重沉淀在所述样本部分的所述上清液中的带有所述被连结的细胞组群或子组群的第二种粒子；以及从所述第二种粒子和所述被连结的细胞或生物粒子的组群或子组群除去包括所关心的所述选定的细胞组群或子组群的至少一部分所得到的第二上清液，并且回收原来在所述上清液样本部分中的所述选定的细胞组群或子组群的至少50％。
按照本发明的第五方面，提供一种用于从生物液体样本除去至少一种预先选定的细胞组群或子组群的设备，包括：多个具有连结其上的反应剂的粒子，所述反应剂专门地连接于至少一个预先选定的组群或子组群，所述粒子所具有的密度足以形成所述组群或子组群从其余样本的差重沉淀，所述粒子密度至少为细胞密度的两倍；用于使所述样本的一部分与所述粒子混合的装置，所述混合装置用于使所述粒子连结于所述预先选定的组群或子组群而不显著有形地损伤所述预先选定的组群或子组群，所述混合装置包括用于使所述粒子通过所述样本的重要部分反复沉淀的装置；以及用于分离所述样本的至少一部分上清液的装置，所述至少一部分上清液包括非选定的组群或子组群，是从所述粒子和所述被连结的组群或子组群的沉淀而得到的。
按照本发明的第六方面，提供一种用于从生物液体样本除去至少一个预先选定的组群或子组群细胞的设备，所述样本是一部分全血或骨髓，所述设备包括：多个粒子，所述粒子具有至少三微米的直径，并且具有连结其上的抗体，所述抗体专门地连结于至少一个预先选定的组群或子组群细胞上的抗原，其中所述粒子所具有的密度足以形成所述预先选定的组群或子组群与其余样本的差重沉淀，所述粒子密度至少为细胞密度的两倍；用于使所述样本的体积至少为半毫升的一部分与所述粒子混合以便使所述粒子连结于所述预先选定的组群或子组群而不显著有形地损伤所述预先选定的组群或子组群的装置，所述混合装置包括使所述粒子通过所述样本部分的主要部分反复沉淀的装置；以及用于分离所述样本部分的至少一部分包括非选定的组群或子组群、从所述粒子和所述被连结的组群或子组群的沉淀而得到的上清液的装置。
下面对附图简要说明：
图1为按照本发明的选定方法的第一实施例的示意方块图；
图2为按照本发明的连结着目标细胞的粒子的概念上的实施方案；
图3A-3E为本发明的血袋混合器的前视、侧视和端视图；
图4A和4B分别为按照本发明得到的全部血液控制和粒细胞富集的方形图；
图5A和5B分别为按本发明得到的全部血液控制和淋巴细胞富集的方形图；
图6A-6C为Rhon-Poulenc磁性粒子的重力沉积与本发明的密实粒子比较的方形图；
图7A-7B分别为按本发明得到的全部血液控制和血小板或粒细胞已被排除的方形图；
图8A-8C分别为按照本发明得到的全部血液控制和血小板及粒细胞已被排除的方形图；
图9A-9F为示出本发明的重力沉积与本发明的加速沉积的比较结果的方形图；
图10A-10F为示出本发明的重力沉积时间变化后的结果的方形图；
图11A-11C为本发明的加热粒子与不加热粒子比较的方形图。
下面详细说明本发明的实施方式：
现在参阅图1，按照本发明的选定方法和设备在总体上用标号10指出。选定设备10包括一个液体样本，该样本包含一个视需要准备加强或除去的预先选定的组群或子组群，该组群或子组群可以是细胞的组群或子组群，包括：在骨髓或血液中查到的细胞，如血小板、嗜中性细胞(N)、嗜曙红细胞(E)、单核细胞(M)、淋巴细胞(L)、淋巴细胞子集、从干细胞开始的发育不全的细胞到成熟的白细胞，及患病的细胞和人体或动物的癌细胞。
液体样本可以是一种生物液，包括全部血液或其一部分、骨髓、脊髓液或尿、或其他液体，其中含有的组群或子组群有如上述。
分离设备10还包括一个粒子源14。粒子14包括一个连结在其上的单克隆或多克隆抗体，该抗体将特定地连结到选定的细胞上。该抗体能够共价地或被吸附地直接连结到粒子14上，或者通过第二抗体以任一种传统方式间接地连结到粒子14上。多个粒子14和至少一部分样本12通过各自的路线16和18在一混合站20中结合。结合的样本部分和粒子14混合在一起，然后用重力沉积法进行分化沉积如图中方块22所示。样本12和粒子14的混合使粒子迅速地与样本内所选定的细胞接触，从而促使粒子迅速地与所关心而选定的细胞连结。采用密实粒子14的一个优点是，它们将会由于重量的不同而分别沉降通过进行混合的样本12，基本上不会捕捉非选定的或非目标的细胞。在混合时，粒子14的另一个优点是，混合是在使粒子14反复通过样本而沉积时完成的，能使细胞与粒子连结而不会在实际上损害细胞和粒子14。就大约为数微升的小体积而言，混合可以迅速进行，如用美国专利5,238,812号所公开的涡旋方法，该专利在这里提到供参阅。对于大约为0.5毫升至几公升的大体积而言，一种有效的混合方法是将粒子14和样本12以上下颠倒的方式翻滚。
一旦粒子14与样本12混合，便可使粒子沉积在容器(未示出)的底面上，然后便可将其余的样本液和细胞分离出去，如图中的方块24所示。粒子1 4具有比样本12中的组群，不管是目标的还是非目标的，都大到足够程度的密度，以致粒子和连结在其上的目标组群在通过样本12时会分化沉积，留下未被结合的或非目标的组群悬浮在液体中。例如，如果样本12为一血液样本，血细胞的密度约为1.05g/cm3，那么粒子14应该显著地比细胞更为密实，其密度至少约为细胞密度的两至三倍。其余的样本液体和细胞可移走供研究之用，而所关心的选定细胞则留在液体中并得到加强，且没有与粒子14连结。如果需要，也可使连结的粒子1 4和细胞从其余的样本液体中取出以便从粒子14上取出细胞，研究这个所关心而被连结的细胞。其余的液体和细胞也可重新植入到活的器官中，这时在该液体中已不再含有需要从样本或液体中除去的连结着细胞的粒子。
设备10可以是一自动的装置，它将样本12和粒子14结合起来并使它们在各站间移动；或者也可是一手动程序，如同由一操作者利用试管或容器作为各个中间站20、22和24来实施；或者也可将在两种情况结合起来。
而且，当沉积和分离步骤22和24能单独用重力分离法来较好地完成时，如果需要，还可增加另外的步骤，样本12和粒子14可简单地旋转，如方块26所示，以便使沉积的步骤加速。粒子14也可为一磁性材料，这时，一个如方块28所示的磁铁或磁场可施加在容器(未示出)的底部以便使沉积步骤加速。另外，磁场28可保持着或者可施加在容器的底部以便确保在分离步骤中该粒子14不会被取走。其余的样本可移走并可使它通过一个磁场30的旁边或穿过以资确保在液体样本中不再留有粒子碎片或粒子14，当该样本要重新值入到活的器官如人体内时，这道步骤是必需的。
现在参阅图2的概念图，其中示出一个粒子14，有两个不同的抗体A和B连结在其上。
作为例子，假定所示出的一对A正细胞32包括至少一个抗原A’，该抗原A’特定地将与粒子14上连结着的一个抗体A连结。同时示出的一对B正细胞34包括至少一个抗原B’，该抗原B’特定地将与粒子14上连结着的一个抗体B连结。实际上，细胞的连结并没有特殊的次序，并且通常有一A或B的正细胞会堵住粒子在其两个自由侧(未示出)上的视域，而且，在一个粒子14上的A和B会连结到一个代表A’和B’两种抗原的单一细胞上。例如，如果A细胞为CD4正细胞，  B细胞为CD8细胞，那么可以有四或五个A细胞而只有一或两个B细胞连结到粒子14上。虽然在该例子中说有两个不同的抗体A和B都连结到粒子14上，但如果需要，每一种抗体都可连结到分开的粒子14上。
再一次如前所述，目标细胞或选定细胞可从样本12中取出，连结到粒子14上，然后再从粒子14上取出该细胞以便对该细胞进行分开的研究。该细胞可从粒子14上用传统的技术如生物化学的分离法或机械的分裂法来取出。
虽然没有一个特定的粒子能起决定性的作用，但一个磁性的高密度粒子14通常是较好的。一种较好的粒子14是羰基镍如INCO所制造称为型号123的镍粉制成的。粒子14最好制成公称直径约为5微米，较好的范围为3-35微米，但并不以此为限。细小的部分(较小的碎片)在应用前便已去除。粒子14较重，密度最好约为9g/cm3。粒子的密度这样选择使它在通过样本悬浮液时将比细胞分化沉积得更快。这样连结在粒子上的目标细胞便可在未连结(非目标)的细胞的沉积作出任何显著分离之前被重力分离出来。显然，在样本组群与粒子14之间的密度差异越大，分化沉积将会发生得越快。
样本液体的体积视所要完成的程序而变。对于血液、骨髓或脊髓液的分析，小到10微米便可够用，而对于临床的移值如骨髓，体积可从约100毫升到3公升。骨髓程序为典型的净化程序，要从骨髓液中清除不需要的细胞。在全部血液或骨髓内有许多程序可以应用，例如干细胞分离是由消除其他血细胞来达到的，这些其它血细胞被连结到一个或多个粒子集14所连结着的一个或多个单克隆抗体上。
混合粒子14和样本12的一种较好的方法是温和地上下翻滚粒子14和样本的混合物使粒子14反复地从上面掉下通过样本12而连结到所关心的组群上。这种方法是比较好的，但如果能防止重而密实的粒子对所关心的细胞产生有形的损害时，常见的滚动摇摆器或较强的混合程序也是有效的。一种这样的装置可以是一种试管夹持器，该器可缓慢地旋转使试管或类似的容器上下颠倒地旋转。这样便可使粒子14和样本12“温和地混合”，其时每一次旋转，粒子14都通过相当大的一部分样本，与它们混合并沉积，这样便可使目标细胞连结到粒子上而不会对细胞产生明显的有形损害。将试管来回旋转或摆动，使试管的每一端一忽儿在上、一忽儿在下，就象上下颠倒的旋转那样，也可得到相同的混合运动。滚动摇摆器的速率也可设定使它执行基本上相同的混合程序。
血袋型上下颠倒混合器的一个实施例在图3A-3E中示出并在总体上用标号40指出。松开夹持器的顶部42和底部44便可将血袋(未示出)插入到混合器40内。顶部42和底部44有一按压搭扣46可将两个部分夹持在一起。顶部和底部42、44并且最好用一铰链48铰接在一起。
虽然在图3A和3B中示出的是在水平位置上，但混合器40的取向基本上是垂直的，以便对样本液体12和粒子14提供上下颠倒的翻滚。混合器40可用支架50(图3E)装在一个基本上为水平的电动机轴(未示出)的轴线上。支架50连结到混合器40的一个部分44上。
支架50可以通过在部分44上制出的多个小孔52(图3D)连结到部分44上。支架50设有多个配合孔54(图3E)可与小孔52对准，然后将支架50装上并用多个螺栓或其他紧固件固紧。支架50用一个中心孔56装到一根电动机轴(未示出)上并通过一个或多个螺纹孔58以便与电动机一起旋转。有螺栓(未示出)用螺纹旋入到螺纹孔58内以便抵压在电动机轴上使混合器40旋转。
如同血液试管那样，在混合器40中的血袋缓慢旋转，使粒子在每一次旋转时通过相当大的一部分样本混合并沉积，以便与样本中的目标细胞连结。
标记粒子的一种较好的方法是用抗体，该抗体可有效地从样本混合物即全部血液、骨髓、混合的细胞组群或体液中排除特定的细胞子组群，并且由于粒子的密度可立即被重力分化沉积，从而可将特定连结的细胞与粒子一起移走。关于粒子的标记，下文还要列出。
材料：
镍粒子-从Novamet特种产品公司(Wyckoff，NJ 07481)得到的一批INCO(Suffern，NY10901)的型号为123的镍粉。这批镍粉曾通过400号筛(每平方时为400孔)，去除了大颗粒和空气，定级为粗粒。最后形成的粒子按Fisher，大小为5.7微米，表面积为0.34m2/g。
缓冲剂A-三胺/Nacl，pH7.2
9.55g/L的三胺
4.0g/L的Nacl
在dH2O中化合；用Conc.Hcl使达到pH7.2
缓冲剂B-三胺/Nacl/BSA
将牛血清白蛋白(BSA)0.2g/100ml加入到缓冲剂A中。
抗体溶液-从粒子标记用的表I，确定需要添加到粒子上去的抗体的数量。计算能得出所需纯抗体必需量的现有抗体溶液的体积。从现有抗体溶液中量出所需体积并正好在添加到粒子上去之前添加到缓冲剂A内。
方法：
1.量出镍粒子的重量(按1g粒子/0.34m2表面积计算)。
2.用dH2O清洗粒子两次。
2a.将dH2O添加到粒子上并用涡旋和颠倒试管的方法来混合。
2b.使粒子沉积约两分钟以便从液体中分离出来并除去液体。
3.用1％的漂白剂溶液像步骤2那样清洗粒子。
4.用缓冲剂A像步骤2那样清洗粒子。
5.用BSA最佳地将镍粒子掩蔽起来。
5a.在缓冲剂A中使粒子重新悬浮在体积为2ml/g粒子的体积内。
5b.将数量为50mg/ml的BSA溶液(缓冲剂B的1∶4的稀释)添加进去使最后得出的浓度为3mg的BSA/m2的粒子表面。
5c.在室温下将试管放在滚动器上3-6小时。
5d.用缓冲剂A像步骤2那样清洗粒子两次，在两次清洗之间放在滚动器上30-60分钟。
6.将抗体添加到粒子上。
6a.使步骤5中“掩蔽”起来的粒子(珠子)重新悬浮在体积为1ml/g珠子的体积内。
6b.在加入以前制备好的抗体溶液时用超声波处理珠子。
6c.洗净试管，在试管内用缓冲剂A制成抗体溶液并使这个溶液与粒子结合。
6d.用缓冲剂A使体积增加到1ml/g。
7.将试管放在滚动器上并在室温下将粒子/抗体溶液滚动过夜。
8.用BSA将标记粒子堵塞。
8a.像步骤5d那样用缓冲剂A清洗粒子两次。
8b.按2ml/g的体积将缓冲剂B添加到粒子上。
8c.用超声处理和涡旋使粒子重新悬浮。
8d.滚动粒子一个小时。
8e.更换缓冲剂B两次，在两次更换之间滚动30分钟。
9.标记珠子的存储。
9a.除去最后堵塞的缓冲剂B。
9b.加入新鲜的缓冲剂B使体积达到2ml/g。
9c.在室温下在带盖的试管内存储覆盖着抗体的珠子。
10.抗体/粒子制备液的试验。
10a.将抗体/粒子计量过的数量加入到试管内，通常的范围是10-200μl的抗体/粒子每ml的全部血液。
10b.用三倍Isoton II(Coulter氏诊断法)和葡萄糖的混合物的体积(4.5g/L)清洗抗体/粒子三次。
10c.缓慢注入IG溶液并加入1ml的全部血液(用EDTA(乙二胺四乙酸)或肝素的抗凝血剂收集而得)。
10d.用上下颠倒翻滚4-5分钟来混合。
10e.将试管垂直地放置在试管夹持器内4-5分钟。
10f.用一吸管将粒子之上的血液转移到另一试管内(在转移时吸管可夹持在一个磁铁上以便除去在步骤10e中没有沉淀的镍粒子)。
10g.用对被排除的组群为最好的方法进行分析，并将剩余的细胞与原始样本中存在原始组群进行比较。
10h.选择一个每ml的全部血液所需的粒子数量以便有效地除去所考虑的细胞组群。
本发明特别适用于将微球体连结到血小板上和白血球的组群或白血球的子组群上。这里所说的白血球的子组群是特定的单克隆抗体能连结上的白血球组群的子集。世界卫生组织和国际免疫学学会曾对单克隆抗体定出一个命名法则，称为集束标志(CD)命名法，该命名法限定细胞或细胞群的特殊品种和专门对那个CD群适用的单克隆抗体。只是为了举例的目的，在下表中列出与Coulter的抗体标志符相应的CD群。
                  表I
          排除用镍粒子制备时所需抗体数量
粒子标记                    抗体/标志符(数量/m 2 )
血小板              CD41 PLT-1               (3mg)
B细胞               CD20 B1                  (9mg)
                    CD19 B4                  (3mg)
MY                  CD14 MY4A              (10.5mg)
                    CD33 MY9                (4.5mg)
MT8                 CD2 T11                (6.75mg)
                    CD5 T1                  (4.6mg)
                    CD7 3A1                (2.25mg)
                    CD26 TA1                (1.5mg)
T4                  CD4 T4                    (5mg)
T8                  CD8 T8                    (5mg)
KC-48               CD15 KC-48                (5mg)
HLA-DR              I3                        (5mg)
                    例1
从全部血液中制备粒细胞组群
在EDTA内收集到的全部血液样本中的一部分被转到Coulter的STKS仪器(该器用溶解法除去红血球)上运行作为下一步排除的控制，结果如图4A所示。控制图示出用DC(Coulter)和光散射(LS)为参数的标准的组群模式，包括L 60.M62的组群、粒细胞(N 64和E66)和废弃部68。预先计量好的覆盖着抗体的适量的镍粒子被放入到一12×75mm的玻璃试管内并用含有4.5g/L葡萄糖的Isoton II溶液(IG缓冲剂)(Coulter公司)重力沉积清洗三次。将3毫升的全部血液样本加入到洗过的粒子上，并将试管盖严。然后将试管放在一可上下颠倒的滚动器上以大约30转/分的速率旋转。这样就可将粒子保持在悬浮状态，使粒子反复通过血液降落。血液和粒子放在这个辊子上混合4分钟。在混合后取出试管，将它垂直地放在试管架上4分钟以便进行分化重力沉积。为了分析其余组群，可用吸管将粒子之上的血液转移到另一试管内。在某些情况下，吸管筒可夹持在一个磁铁上以资确保未被沉积出来的Ni微粒都被排除。样本然后在Coulter的STKS仪器上运行，结果可与全部血液的控制图比较。这种操作的说明已在美国专利5,125,737号中公开，这里提到供参考。显然粒子和全部血液混合在一起并且粒子与白血球的组群或分组群连结，在每种情况下红血球都是在得到图示结果之前便已被溶解除去。这里提到的血小板和红血球的结果是在与白血球通道分开的仪器通道内只用一个Coulter体积(DC)的参数得到的。
全部血液样本部分用下列标记镍粒子来排除：MY4 200μl/ml、T4 100μl/ml、B1 100μl/ml、PLT-180μl/ml、T8 50μl/ml和3A1 50μl/ml。这个连结着抗体的标记粒子的混合物可排除大部分的M62’、L60’和血小板，从而得出富含粒细胞(N64’和E’66)的组群如图4B所示。排除的结果是，与全部血液比较，血小板减少86％，在排除过的样本内M62’和L60’被清除。这样就造成一个含有98％粒细胞64’和66’的细胞制剂，而原先的粒细胞数为91％。红血球保持在控制全部血液样本的91％，指示出细胞排除物的品种。
                         例2
用镍粒子分配和保持淋巴细胞制备淋巴细胞制剂
淋巴细胞制剂是用抗体覆盖的镍粒子制成的如图5A和5B所示。全部血液控制在Coulter的STKS血液学分析仪上运行后结果在图5A中示出。得出的标准模式为27％的L70，9％的M72，61％的N74，和2％的E76。将以前用PLT-1(70μl的粒子/ml的血液)：KC-48(50μl的粒子/ml的血液)和MY-4(100μl的粒子/ml的血液)标记过的镍粒子的适量的复合物(按10ml的全部血液配制)放入到-15ml的聚苯乙烯试管内，并用IG缓冲剂清洗三次。移走最后一次清洗的上层清液并将在EDTA内收集的全部血液10ml加入到粒子上，使粒子重新在血液中悬浮，然后放到一个可上下颠倒的滚动器上翻滚4分钟。在混合后，将试管垂直放置在试管架上停留4分钟使粒子分化沉积。在粒子沉积后用塑料转揿吸管移走用过的血液并将它放到新的试管内。在转移时将试管筒夹持在一个磁铁上以便除去任何镍微粒。分析在CoulterSTKS血液分析仪中上的淋巴细胞制剂(图5B)指出淋巴细胞组群提高到92％。与全部血液(图5A)比较，其他细胞组群的减少为，血小板减少94％，N74减少98％，M72减少80％，E76减少95％和红血球减少1％。这就指出最终排除的样本是由L70组成的，只有极小一部分非特定地被除去(淋巴细胞保留量大于99％)。
                          例3
在排除全部血液后从抗体标记的镍粒子中回收T8细胞
用T8抗体标记的镍粒子在初始时被用来排除全部血液的T8淋巴细胞。采用次优排除用量(采用15μl而不用50μl/ml的全部血液)的T8标记的镍粒子在IG缓冲剂内清洗三次，将全部血液加入到粒子上并放在上下颠倒滚动器上10分钟，再直立放置5分钟。移走用过的血液，粒子和结合的细胞用IG缓冲剂清洗两次，使它重新悬浮在一个等于样本原来数量一半的体积内，轻轻倒转使粒子和结合的细胞沉积出来。在清洗后，粒子/细胞粒重新悬浮在IG缓冲剂中，然后放在一个磁性搅动器内进行机械分裂大约30秒。结果细胞就从粒子上分开。使粒子沉积出来，上层清液便与粒子分开，可用吸管移走并用流动的血细胞计数器来分析。分析三个样本：一个全部血液控制样本，另一个是用T8标记的粒子排除后的血液，还有一个是在粒子/细胞被搅动后使粒子沉积出来后的带有释出细胞的上层清液。在Profile II(一种血细胞计数器的型号)上的结果指出排除后的血液的标准形态，淋巴细胞的组群有少量的16％的减少。但回收的细胞却显示有高度富集并纯化的淋巴细胞组群。在用荧光的T4和T8的表面标记器分析后发现排除后的血液T8组群从26％减少到6.3％，而T4组群则从52.5％增加到56.1％，这是由于T8细胞的减少。在回收的组群中超过96％的细胞都是T8正细胞。
                      例4
                标记各种密实粒子
探讨A：在表II中列出的各种密实粒子按本方法用T8抗体标记。采用标记型号123镍粒子的标准程序来用5mg/m2的T8抗体标记包括用3-30mg/m2的BSA堵塞的各种粒子。在标记并清洗全部血液的T8排除物后，按标准的方法测定所加入的标记粒子的数量。在与血液进行4分钟后，使粒子沉积4分钟。然后在一流动血细胞计数器(CoulterProfile II)上分析最终排除后的样本内的T8细胞的百分比。排空量将被计算为留下的T8细胞的百分比与全部血液内T8该值的比。型号123的镍粒子不仅用于其他试验上并且是其他型式粒子的比较对象。从滴定情况看，每ml全部血液使用25μl的型号123的镍粒子，T8细胞排除的程度可超过96％。而不锈钢粒子即使采用100μl/ml的全部血液也不能起排除作用。用T8抗体标记的锌粒会使全部血液凝集，这可能是由于锌和EDTA抗凝剂之间的化学作用将样本内的钙释放出来引起纤维蛋白原的激活所致。其他型号的镍粒子也可起排除作用，但不如型号123那样有效。
探讨B：几种用T4抗体标记但没有用BSA预先覆盖的粒子用来进行标记试验以便确定它们连结细胞的能力。所有连结着抗体的粒子都是用同一方法来确定的，Pd和VM63-Ni在连结细胞方面是等价的或稍优于型号123的Ni，只是沉积缓慢。TiO2、Pb和VM63-Ni在标记细胞以便进行显微镜辨认方面都是有效的。只有Ta在用抗体标记后被指称为在连结细胞方面是无效的。
探讨C：按照对型号123镍粒子的标准程序用对嗜中性细胞特定的KC-48抗体标记粒子，然后将粒子与全部血液混合，制成一个血斑在显微镜下检查，所有这些粒子显示都能特定地连结在嗜中性细胞上。
总起来讲，差不多所有试验的金属粒子都至少有几分吸收抗体的能力。但就排除能力而言，型号123的镍是最为有利的，这是由于它的表面性能和沉积率。作为一个例子，钯和二氧化锰粒子也能很好排除，但不能足够快地沉积以致不能有效地在本发明中应用。吸附在二氧钛粒子上的抗体能有效地标志出细胞便于用显微镜辨认，但由于粒子的尺寸很小，不能在全部血液中形成显著不同的沉积率。
表II
材料      标志    制造者/样本/批号   物理和磁的特性  排除能力
探讨A：
镍        型号123   Novamet/3451313        不规则           +++
镍        VM163     Novamet/VM63           特细粉           +++
镍        10/585A   Novamet/1 0/585A       球粒             ++
镍        HDNP      Novamet/347355         粉               ++
不锈钢    P316L     Ametek/0813290         形状不规则       -
锌粒                Aldrich/HY13401CY      无磁性           *
探讨B：
镍        型号123   Novamet/3451313                         +++
镍        VM63      Novamet/VM63           特细粉           +++
镍        8/209A    Novamet/8/209A         球粒             ++
镍        08841R    Spex Ind.08841R        粉               ++
镍        01509BW   Aldrich/01509BW        粉               ++
镍        347355    Novamet/347355         粉               ++
Pd        D13A17    John Mattheney                          ++++
                    Elec./D13A17
TiO2     ANATASE                          无磁性           -
Ta        SGQ       Norton Metals                           +
                    Div./SGQ-2-3764
SiO2                                      无磁性           +
NiO2     N04990    Pflatz&                无磁性           ++
                    Bauer/040291
探讨C：
Pd        D13A17    John Mattheney       直径约0.5μ                   ++++
                     Elec./D13A17
TiO       ANATASE                        直径约1.0μ                   -
MnO2               Aldrich/23，094-4        粉             ++
Ta           SGQ           Norton Metals       粉       +
                          Div./SGQ-2-3764
*锌加入到全部血液内会造成凝集。
                          例5
                   用抗体标记的镍粒子
排除全部血液的T4和T8子组群
按上面提到的抗体标记的程序用T4或T8抗体标记镍粒子。为了排除，将粒子(50μl/ml的全部血液)转移到一试管内并用IG缓冲剂清洗三次。在移走第三次的洗液后，将全部血液加入到粒子上并以上下颠倒的方式混合两者4分钟。在混合后，将试管放置在直立状态使它沉积4分钟。排除过的血液然后用T4-RDI/T8-FITC荧光抗体(Coulter公司，Coulter Cytostat部件号6603802)标记并在一流动血细胞计数器(Coulter ProfileII)上检测。所有样本均计数一分钟，然后比较不同象限内的T4和T8的淋巴细胞。与全部血液控制图相比，当采用T4粒子时，94％的T4组群都被排除，只有18％的T8被移走。当采用T8粒子时，96％的T8组群被排除，只有4％的T4组群被移走。
                         例6
                      分化沉积
图6A-C示出本发明的密实粒子与现有技术的Rhone-Poulenc磁性粒子所得出的不同沉积率的对比。图6A并示出STKS上的一个控制的方形图，包括一个由L80、M82、N84和E86组成的标准组群模式。图6B示出用KC-48单克隆抗体标记的镍粒子排除后得出的模式。在图6A中示出的N84为白血球控制组群的59.6％，而在图6B中示出的N84已减少到为白血球组群的2.3％。
Rhone-Poulenc粒子与镍粒子按类似方式使用，但如图6C所示出的方形图，实际上没有重力沉积。特别是，连结的N和Rhone-Poulenc粒子示出的模式为88，而不连结的Rhone-Poulenc粒子显示的模式90如同一个噪声或废弃物那样。正像Rhone-Poulenc的刊物所声称的那样“在没有任何磁场时在好几小时内不会有显著的沉积发生”，可见这些粒子的设计本来就是防止重力沉积的。
                         例7
                      混合时间
混合时间和方法可随样本体积和所需的培育时间而变化。对于约为0.5ml或更小的体积，两种快速混合方法如密实粒子的涡旋或盘旋和上下颠倒地翻滚沉积都可有效地使用，不会有形地损伤细胞组群。涡旋是用分开的连结着抗体的粒子KC48-Ni(50μl/ml WB)和PLT-Ni(100μl/ml WB)在Coulter的STKS上完成的，结果如表III。在表III中以及在每一个类似的表如表V、VIII、IX和XII中，血小板和白血球的单位都是103/μl，而红血球的单位是106/μl。
                         表III
      WBC   N     L     M     PLT  RBC
A)    5.6    2.8    2.1    0.5    230   4.09
B)    4.1    1.4    2.1    0.4    91    4.19
C)    3.4    0.7    2.0    0.5    58    4.15
例A作为控制，没有任何粒子，涡旋30秒，例B包括粒子，涡旋15秒，例C包括粒子，涡旋30秒，这三个例子都沉积4分钟。
总结起来，在15秒的涡旋下，嗜中性细胞被排除50％，血小板被排除60％，而在增加的15秒的涡旋下，嗜中性细胞的排除增加到75％，血小板的排除也增至75％。还可注意到其他细胞组群保持没有非特定的流失。
同一血液样本用颠上下颠倒的方式混合，变化其混合时间如表IV所示。
表IV
A)作为控制，无粒子参加，10分钟
B)KC48/PLT，30-45秒
C)KC48/PLT，1分钟
D)KC48/PLT，1.5分钟
E)KC48/PLT，2.0分钟
F)KC48/PLT，4.0分钟
G)KC48/PLT，10分钟
用表IV的混合程序得出的排除结果在表V中示出。当STKS仪器报告为0.0时(如N在表V的F或G中)，实际的结果是在0.05之下，即排除率一般大于99％。
                   表V(％排除)
结果：       WBC      N           L    M     PCT       RBC
作为控制     A)5.6     2.8          2.1   0.5    240        4.20
30-45秒      B)3.7     1.0(64％)    2.0   0.5    69(71％)   4.08
1分          C)3.2     0.6(79％)    1.9   0.5    39(84％)   4.02
1.5分        D)2.8     0.4(86％)    1.8   0.4    37(85％)   4.00
2.0分        E)2.9     0.3(89％)    1.9   0.5    14(94％)   4.10
4.0分        F)2.6     0.0(＞99％)  2.0   0.5    1(99.6％)  4.19
10分         G)2.7     0.0(＞99％)  2.0   0.6    0(＞99％)  4.22
对于这些粒子和抗体，看来最少的混合时间为4分钟，对于其他的粒子和抗体，混合时间可在本发明所定的范围内变化。显然，在最少时间之外进行小量的混合在某些情况下可以是合乎需要而不会有害于本发明的。
                           例8
                      最小样本体积
20μl的小体积的全部血液可与5μl的KC48的镍粒子一起涡旋4分钟。结果显示可有95％的N被消除，这个结果是从传统的全部血液的血斑检测中得出的如表VI所示。
                           表VI
                 N    L    M      E
作为控制，无粒子 58    27    12      2
排除后           3     82    11      3
第二个10μl的小体积的全部血液在用1μl的KC48和2μl的PLT-1一起涡旋4分钟后，结果是粒细胞的82％可被排除，这个结果是在ProfileII型流动血细胞计数器上得到的。
                           例9
             从样本制剂中移走粒细胞及/或血小板
血小板是全部血液和骨髓的一个组成部分，它在制备细胞悬浮液要用各种方法移走。血小板的属性使它在治疗创伤方面起到有效的作用，但对细胞的准备工作却是不利的，因为血小板会凝集并且非特定地粘结在其他细胞上。由于在全部血液内的每一个淋巴细胞约有20-50个血小板，在任何分离工作之前移走血小板可增加淋巴细胞的回收能力，形成一个与全部血液非常相似的淋巴细胞分布并减少制备时间，因最普通的移走血小板的方法是在细胞悬浮液隔离后用三个分开的低速的离心分离来完成。在一要给病人服用的制剂中，如果在冷冻之前能先移走血小板，可以减少要注射的细胞的非特定的流失并消除血小板的凝集。另外，成熟的粒细胞含有的微粒在注射时会释放出来给病人以冲击。如将成熟的粒细胞和血小板两者都移走，那么用来注射的细胞制剂，不管是立即使用的还是冷冻后使用的，都将对病人比较安全而较少会产生问题。
图7A示出一个控制用的全部血液组群，该组群含有L100、M102、N104、E106和血小板(未示出)。血小板在控制图上为276×103血小板/μl，而粒细胞(N和E)为3.2×103/μl。两组密实粒子被结合起来并与血液一起混合4分钟然后沉积4分钟。一组粒子包括用PLT-1标记的粒子，用量为80μl/ml，另一组粒子包括用KC-48标记的粒子，用量为50μl/ml。如图7B所示，L100’和M102’受到的影响很小，而N104’和E106’都被减少约99.9％。血小板被减少到约为2×103/μl。
血小板和粒细胞也可在分开的血液样本部分中分别移走。图8A示出一个控制用的全部血液组群，该组群含有L110、M112、N114、E116和血小板(未示出)。图8B示出一个仍然用PLT-1标记的密实粒子在排除血小板后用的样本部分。血小板从在控制用的全部血液组群中的231×103血小板/μl减少到在排除过的样本部分中的3×103血小板/μl。其余的组群L110’、M112’、N114’和E116’相对地没有受到影响。
图8C示出应用KC-48标记的密实粒子在排除N114和E116以后的样本部分。N114”和E116”从N114和E116的总数为2.8×103/μl减少到基本为零。血小板相对地没有受到影响。
                     例10
                 强化重力沉积
图9A-9F示出采用本发明的粒子的重力沉积与筒单的加速沉积比较的方形图。图9A-9D示出采用表VII中所列各种抗体标记的粒子制备的N制剂。
表VII
T4                       50μl/ml
T8                       50μl/ml
MY4                      50μl/ml
B1                       50μl/ml
PLT                      50μl/ml
I3                       50μl/ml
图9A还示出一个控制用的全部血液组群，衾中L120、M122、N124、E126、血小板(未示出)和红血球(未示出)。
                         表VIII
图   样本         WBC  N   L    M    E   PLT  RBC
9A    控制用        6.9  4.1   2.2   0.4   0.2  288  4.87
9B    排除、沉积    4.3  3.9   0.2   0.0   0.1  35   4.59
9C    旋转、控制用  6.9  4.1   2.2   0.4   0.1  297  4.74
9D    排除、旋转    4.3  3.9   0.2   0.0   0.1  15   4.60
9E    旋转、控制用  7.4  4.5   2.2   0.4   0.2  293  4.96
9F    排除、旋转    2.7  0.0   2.1   0.4   0.1  280  4.94
采用表VII中的标记粒子的N制剂可以得出一个富含N的组群124’，使N在WBC中的百分比从59.7％增加到89.6％。L从32.1％减少到4.9％，M从5.5％减少到0.8％，如图9B所示。
图9C示出一个控制用的全部血液组群，含有L130、M132、N134和E136。在本例中，没有使样本部分和粒子重力沉积，而是用一小的离心机，如Fisher 59A型科学的微型离心机使它们在第二档离心旋转15秒。这个简单的离心分离或加强的重力沉积如果需要，可在较短时间内得到与重力沉积相似的结果。N的百分比从59.5％增加到89.1％，L从31.5％减少到5.7％，而M则从5.8％减少到0.5％如图9D所示。
任何单一的组群或子组群都可用相同的程序，例如，如图9E和9F所示。图9E示出一个控制用全部血液由L140、M142、N144和E146组成的组群。在本例中，N144是用样本和粒子加强的重力旋转移走的。N从控制图中的61.4％减少到0.7％如图9F中的144’所示，其余的组群相对地没有受到影响。
本发明的第一方案趋向于采用密实粒子重力沉积。但加强的重力沉积对密度梯度系统内的细胞如ficoll也是可以用的，在那种情况下粒子只要求比细胞和梯度系统略为更密实一些就可以了。采用加强的重力沉积(旋转)，略为更密实一些的粒子和连结在其上的细胞能够在ficoll梯度系统中分离出来。
                         例11
                      沉积时间
图10A-10F示出本发明的具有各种重力沉积时间的结果的方形图，这些结果被汇总列在表IX中。
                        表IX
图     样本       WBC  N    L     M     RBC  PLT
10A    控制4分      8.2  3.5    3.3    1.0    5.45  315
10B    排除后4分    5.0  0.1    3.4    1.1    5.44  315
10C    控制2小时    8.4  3.7    3.2    1.0    5.08  350
10D    排除后2小时  4.6  0.1    3.3    1.0    5.33  319
10E    控制3小时    8.3  3.6    3.2    1.0    5.48  321
10F    排除后3小时  4.6  0.0    3.4    1.0    5.31  321
表IX的结果是这样得到的，将同一全部血液的组群样本的四个3ml的部分分别加入到四个分离的试管或容器内。第一个试管为控制管，另外三个试管的每一个试管中都各加入120μl的用KC48标记的粒子。然后将四个试管都上下颠倒地混合4分钟，再使它们分别重力沉积4分钟、2小时和3小时。然后将在粒子之上的样本部分移走、混合并分析。将控制部分(图10A、10C和10E)与各该排除过的样本(图10B、10D和10F)比较。如同图和表所示，控制部分的全部血液样本在4分钟到3小时的范围内实际上并无变化。同时，如所示出，排除过的部分对每一种沉积时间基本上也都是相同的。
就4分钟的沉积例子言，N150(图10A)从42.9％减少到N150’(图10B)的2.5％。同样在2小时的沉积例子中，N152(图10C)从43.5％减少到N152’(图1 0D)的1.1％。在3小时沉积的例子中，N154(图10E)从42.7％减少到N154’(图10F)的0.8％。
                     例12
                   粒子加热
图11A-11C示出来加热的型号123的镍粒子与加热的型号123的镍粒子的比较，结果在表X中列出：
                     表X
图     样本  WBC  N    L    M    RBC  PLT
11A    控制用  6.4  3.9    1.8   0.5   4.28  337
11B    未加热  2.4  0.0    1.9   0.4   4.14  311
11C    加热    2.4  0.0    1.9   0.4   4.19  307
再一次，结果是用KC48标记的粒子得到的，除了N以外，其他的组群相对地没有受到影响，同时未加热的粒子(图11B)与加热的粒子(图11C)的结果基本上是一样的。在吸附抗体之前将粒子加热到250℃维持3小时以便消毒(除去细菌)并从粒子去除内毒素，这种方法特别用于当一处理过的样本要重新注入到病人体内时。加热粒子由于在粒子表面形成一个氧化层，同时减少粒子中的Ni离子的溶解。如同以前一样，粒子在混合4分钟后再沉积4分钟。N156(图11A)在使用未加热粒子时从61.8％减少到N156’(图11B)的1.4％，而在使用加热粒子时则减少到N156”(图11C)的1.7％。通常，型号123的镍粒子可加热到250℃至280℃的范围维持3至5小时。由于加热粒子与未加热粒子的结果基本相同，其他例子将不再重复举出而只反映未加热粒子的应用。
                        例13
              移植用的改进的细胞制剂
本发明的粒子也可用来排除骨髓制剂(prep)内的血小板。传统的骨髓加工方法与本发明的粒子去除技术的比较在表XI中示出。
                    表XI
                传统法   粒子/PLT排除法
解冻后的回收率    29％        46％
成活率            95％        99％
CFU回收率         56％        71％
骨髓制剂的传统方法是用ficoll离心机上分离物使它重新悬浮并清洗进行三次的低速离心分离来去除血小板的。传统技术的实例在骨髓解冻后只能回收29％，其中95％是有活力的，并能回收56％的群体形成单位(CFU)或原始粒子细胞。与此不同，本发明的粒子排除比传统法要快捷得多，复杂程度也小得多，在解冻后可回收46％，其中99％具有活力，并且CFU的回收率可达71％。血小板是在进行ficoll分离之前用粒子从骨髓上分离出来的。这样可取消传统的缓慢的离心分离和清洗，减少血小板/细胞的凝集，从而提高CFU的回收率。在表XI示出的例子中，30ml的骨髓是用600μl的PLT-1标记的镍粒子来排除的，上下颠倒地混合并进行沉积各4分钟。然后将样本放在ficoll机的上层，以600G进行30分钟的离心分离。然后收获界面上附着物并在三胺/Nacl+0.05％BSA中用离心作用进行浓缩。回收的细胞被重新悬浮在培养基RPMI1640+10％FCS(小牛胎血清)。再将加工过的样本冻结并解冻以便与传统法进行比较。
要使CFU进一步富集，可将一小部分(1.3ml)的第一次排除过血小板的骨髓样本进一步用标记粒子，包括15μl的KC48粒子、50μl的T11粒子、50μl的标有B1和B4的粒子及50μl的标有MY4和MY9的粒子来排除。这将在基本上将所有的血统正(成熟的)细胞从骨髓上排除。排除成熟的细胞后，一个高度富集的原始粒子/干细胞(CFU)的组群便可回收供分析。用传统的制备法在冷冻前的样本中得到的每105个细胞中的CFU-GM(粒细胞、单核细胞)为143CFU-GM，用本发明的粒子的血小板排除法可得到147CFU-GM，而用本发明的进一步用粒子排除血统正细胞可得到620CFU-GM。
                     例14
                    冻干的粒子
如表XII所示，本发明的冻干的粒子在排除N和PLT上也可起到有效的作用。两组粒子，其一用KC48标记，另一用PLT-1标记，结合起来排除N和PLT。
                     表XII
样本         WBC   N    L      M     PLT  RBC
白血球控制用  7.2   4.2    2.4     0.5    207   4.33
白血球带有冻  3.1   0.1    2.5     0.4    6     4.45
干粒子
总结地说，冻干粒子显得与非冻干粒子同样有效。冻干粒子可用于随身仪器上或其他用途上，因为冻干料子可不需将粒子保持在溶液中。
在上述说明的启示下，本发明有可能作出许多种修改和变化。因此应该知道，在本发明的权利要求限定的范围内，本发明在实施时不一定要像上面具体说明的那样。

Claims (96)

1.一种从生物液体样本中除去至少一种预先选定的细胞组群或子组群的方法，包括：
提供多个粒子，所述粒子具有连结于其上的反应剂，所述反应剂专门地连结于至少一种预先选定的组群或子组群的细胞，并且所述粒子具有的密度足以形成所述预先选定的组群或子组群从其余样本的差重沉淀，所述粒子的密度为所述细胞密度的至少两倍；
使一部分所述样本与所述粒子混合，以便使所述粒子连结于所述预先选定的组群或子组群而不显著有形地损伤所述预先选定的组群或子组群，所述混合是通过使所述粒子反复通过所述一部分样本的主要部分沉淀而进行的；
使带有所述被连结的组群或子组群的所述粒子沉淀，产生基本没有所述被连结的组群或子组群的上清液，所述沉淀主要是借助重力完成的；以及
使包括非选定的组群或子组群的所述样本部分的至少一部分所得到的上清液与所述粒子和所述被连结的组群或子组群分离。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述细胞是血细胞。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述细胞是癌细胞、白血球、血小板、免疫细胞或血统待定细胞中的至少一种。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述混合是通过颠倒翻滚所述样本和所述粒子而实现的。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述粒子是镍构成。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述粒子具有大约3至35微米的直径。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述粒子具有约为5微米的直径。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述粒子具有约为9g/cm3的密度。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述粒子的密度大约为所述组群或子组群细胞密度的三倍。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述反应剂是抗体、药物、激素、生长素、外源凝集素或核酸序列中的至少一种。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述反应剂是抗体。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于：所述抗体专门地连结于血小板或白血球。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述混合进行大约15秒至30分钟。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于：所述混合进行大约4分钟。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于：借助重力的所述沉淀进行大约15秒至180分钟。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于：借助重力的所述沉淀进行大约4分钟。
17.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述分离步骤包括分离所述粒子，然后从所述粒子除去所述被连结的组群或子组群。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于：所述反应剂专门地连结于CD8正细胞。
19.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述样本是全血，所述粒子至少具有与其连结的抗单核细胞、抗淋巴细胞和抗血小板的单克隆抗体，所述样本部分的至少一部分的所得到的上清液被除去，没有所述带有被连结的单核细胞、淋巴细胞和血小板，从而提供一种浓缩的粒性细胞制剂。
20.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述样本是全血，所述粒子至少具有连结其上的抗单核细胞、抗嗜中性粒细胞、抗嗜曙红细胞和抗血小板的单克隆抗体，所述样本部分的至少一部分所得到的上清液被除去，没有带有被连结的单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞和血小板，从而提供一种浓缩的淋巴细胞制剂。
21.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述样本是一部分全血或骨髓，至少一部分的所述粒子具有连结于其上的抗血小板的单克隆抗体，所述样本部分的至少一部分所得到的上清液被除去，没有所述具有被连结的血小板的粒子。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于：第二部分的所述粒子具有连结其上的抗嗜中性粒细胞的单克隆抗体，所述样本的至少一部分所得到的上清液被除去，没有具有被连结的嗜中性粒细胞。
23.如权利要求21所述的方法，其特征在于：第二部分的所述粒子具有专门地连结于基本上全部的指定血统的细胞的单克隆抗体，所述样本部分的至少一部分所得到的上清液被除去，没有具有所述被连结的指定血统的细胞的粒子。
24.如权利要求1所述的方法，其特征在于：包括在连结所述反应剂以前加热所述粒子。
25.如权利要求1所述的方法，其特征在于：包括冻干所述粒子。
26.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述样本是一部分全血或骨髓，所述粒子具有专门地连结于基本全部指定血统的细胞的单克隆抗体，所述样本部分的至少一部分所得到的上清液被除去，没有具有被连结的指定血统的细胞。
27.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述样本是一部分全血或骨髓。
28.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述生物液体样本是一部分全血或骨髓，所述粒子的直径至少为三微米，所述反应剂是专门地连结于所述细胞的抗原的抗体，所述样本具有至少半毫升的体积。
29.如权利要求28所述的方法，其特征在于：所述混合是通过使所述样本和所述粒子颠倒翻滚而实现的。
30.如权利要求28所述的方法，其特征在于：所述粒子是由镍构成的。
31.如权利要求28所述的方法，其特征在于：所述粒子的直径约为3至35微米。
32.如权利要求28所述的方法，其特征在于：所述粒子的密度约为9g/cm3。
33.如权利要求28所述的方法，其特征在于：所述粒子的密度约为所述组群或子组群细胞的密度的三倍。
34.如权利要求28所述的方法，其特征在于：所述抗体专门地连结于血小板或白血球。
35.如权利要求28所述的方法，其特征在于：所述混合进行大约15秒至30分钟。
36.如权利要求35所述的方法，其特征在于：所述混合进行大约4分钟。
37.如权利要求28所述的方法，其特征在于：所述借助重力的沉淀进行大约15秒至180分钟。
38.如权利要求37所述的方法，其特征在于：所述借助重力的沉淀进行大约4分钟。
39.如权利要求28所述的方法，其特征在于：所述分离步骤包括分离所述粒子，然后从所述粒子除去所述被连结的组群。
40.如权利要求28所述的方法，其特征在于：所述样本是全血，所述粒子至少具有连结其上的抗单核细胞、抗淋巴细胞和抗血小板的单克隆抗体，所述样本部分的至少一部分所得到的上清液被除去，没有所述粒子和被连接的单核细胞、淋巴细胞和血小板，以便提供浓缩的粒性白细胞制剂。
41.如权利要求28所述的方法，其特征在于：所述样本是全血，所述粒子至少具有连结其上的抗单核细胞、抗嗜中性粒细胞、抗嗜曙红细胞和抗血小板的单克隆抗体，所述样本部分的至少一部分所得到的上清液被除去，没有具有所连结的单核细胞、嗜曙中性粒细胞、嗜红细胞和血小板，以便提供浓缩的淋巴细胞制剂。
42.如权利要求28所述的方法，其特征在于：至少一部分的所述粒子具有连结其上的抗血小板单克隆抗体，所述样本部分的至少一部分所得到的上清液被除去，没有具有被连结的血小板的所述粒子。
43.如权利要求42所述的方法，其特征在于：第二部分的所述粒子具有连结其上的嗜中性粒细胞单纯系统体，所述样本部分的至少一部分所得到的上清液被除去，没有具有被连结的嗜中性细胞的所述粒子。
44.如权利要求42所述的方法，其特征在于：第二部分的所述粒子具有专门地连结于基本全部指定血统的细胞的单克隆抗体，所述样本部分的至少一部分所得到的上清液被除去，没有具有被连结的指定血统的细胞的所述粒子。
45.如权利要求28所述的方法，其特征在于：包括在连结所述抗体以前加热所述粒子。
46.如权利要求28所述的方法，其特征在于：包括冻干所述粒子。
47.如权利要求28所述的方法，其特征在于：所述粒子的至少一部分具有连结其上的专门地连结于基本全部指定血统的细胞的单克隆抗体，所述样本部分的至少一部分所得到的上清液被除去，没有具有被连结的指定血统的细胞的所述粒子。
48.一种增强生物液体样本中所关心的选定组群或子组群的方法，包括：
提供多个所具有的密度足以形成差重沉淀的粒子，所述粒子具有连结于其上的多克隆抗体，所述多克隆抗体上连结着反应剂，所述反应剂专门地连结于细胞或生物粒子的至少一个预先选定的组群或子组群，所述形成差重沉淀的粒子的密度为所述细胞密度的至少两倍；
使体积至少一毫升的一部分所述样本与所述粒子混合，以便使所述粒子连结所述预先选定的组群或子组群而不显著有形地损伤待增强的所述组群或子组群；
差重沉淀在所述样本部分中的带有所述被连结的组群或子组群的所述粒子；以及
使包括所述被增强的组群或子组群的所述样本部分的至少一部分得到的上清液与所述粒子和所述被连结的组群或子组群分离。
49.一种增强在生物液体样本中所关心的选定组群或子组群的方法，包括：
提供多个所具有的密度足以形成差重沉淀的粒子，所述粒子具有连结或固定其上的反应剂，所述反应剂专门地连结于细胞或生物粒子的至少一个预先选定的组群或子组群，所述形成差重沉淀的粒子的密度为所述细胞密度的至少两倍；
使体积至少一毫升的一部分所述样本与所述粒子混合，以便所述颗粒连结于所述预先选定的组群或子组群而不显著有形地损伤所述待增强组群或子组群；
差重沉淀在所述样本部分中的带有所述被连结的组群或子组群的所述粒子；以及
使包括所述被增强的组群或子组群的所述样本部分的至少一部分所得到的上清液与所述粒子和所述被连结的组群或子组群分离。
50.一种增强在具有多个细胞组群的生物液体样本中所关心的选定细胞组群或子组群的方法，包括：
提供多个所具有的密度足以形成差重沉淀的粒子，所述粒子具有连结其上的反应剂，所述反应剂专门地连结于不关心的至少一个预先选定的组群或子组群的细胞或生物粒子，所述形成差重沉淀的粒子的密度为所述细胞密度的至少两倍；
使一部分所述样本与所述粒子混合，以便使所述粒子连结所述预先选定的组群或子组群的所述细胞或生物粒子而不显著有形地损伤所关心的所述选定的组群或子组群的所述细胞；
差重沉淀在所述样本部分中的带有所述被连结的细胞或生物粒子组群或子组群的所述粒子；
从所述粒子和所述被连结的细胞或生物粒子的组群或子组群除去包括所述所关心的细胞的所述选定的组群或子组群的所述样本部分的至少一部分所得到的上清液；
提供第二种多个所具有的密度足以形成差重沉淀的粒子，所述粒子具有连结其上的反应剂，所述反应剂专门地连接于所关心的至少一种预先选定的组群或子组群的细胞或生物粒子；
使包括所关心的所述选定的细胞组群或子组群的所述样本部分的所述被除去的上清液与所述第二种多个粒子混合，以便使所述第二种多个粒子连结于所述第二种预先选定的细胞或生物粒子组群或子组群而不显著有形地损伤所关心的所述选定的细胞组群或子组群；
差重沉淀在所述样本部分的所述上清液中的带有所述被连结的细胞组群或子组群的第二种粒子；以及
从所述第二种粒子和所述被连结的细胞或生物粒子的组群或子组群除去包括所关心的所述选定的细胞组群或子组群的至少一部分所得到的第二上清液，并且回收原来在所述上清液样本部分中的所述选定的细胞组群或子组群的至少50％。
51.一种用于从生物液体样本除去至少一种预先选定的细胞组群或子组群的设备，包括：
多个具有连结其上的反应剂的粒子，所述反应剂专门地连接于至少一个预先选定的组群或子组群，所述粒子所具有的密度足以形成所述组群或子组群从其余样本的差重沉淀，所述粒子密度至少为细胞密度的两倍；
用于使所述样本的一部分与所述粒子混合的装置，所述混合装置用于使所述粒子连结于所述预先选定的组群或子组群而不显著有形地损伤所述预先选定的组群或子组群，所述混合装置包括用于使所述粒子通过所述样本的重要部分反复沉淀的装置；以及
用于分离所述样本的至少一部分上清液的装置，所述至少一部分上清液包括非选定的组群或子组群，是从所述粒子和所述被连结的组群或子组群的沉淀而得到的。
52.如权利要求51所述的设备，其特征在于：所述细胞是血细胞。
53.如权利要求51所述的设备，其特征在于：所述细胞是癌细胞、白血球、血小板、免疫细胞或指定血统细胞中的至少一种。
54.如权利要求51所述的设备，其特征在于：所述混合装置包括用于颠倒翻滚所述样本和所述粒子的装置。
55.如权利要求51所述的设备，其特征在于：所述粒子是镍构成的。
56.如权利要求51所述的设备，其特征在于：所述粒子的直径约为3至35微米。
57.如权利要求56所述的设备，其特征在于：所述粒子具有5微米的直径。
58.如权利要求51所述的设备，其特征在于：所述粒子具有约为9g/cm3的密度。
59.如权利要求51所述的设备，其特征在于：所述粒子的密度约为所述组群或子组群细胞密度的三倍。
60.如权利要求51所述的设备，其特征在于：所述反应剂是抗体、药品、激素、生长素、外源凝集素、酶或核酸序列中的至少一种。
61.如权利要求51所述的设备，其特征在于：所述反应剂是抗体。
62.如权利要求61所述的设备，其特征在于：所述抗体专门地连结于血小板或白血球。
63.如权利要求51所述的设备，其特征在于：所述混合进行大约15秒至30分钟。
64.如权利要求63所述的设备，其特征在于：所述混合进行大约4分钟。
65.如权利要求51所述的设备，其特征在于：所述借助重力的沉淀进行大约15秒至180分钟。
66.如权利要求65所述的设备，其特征在于：所述借助重力的沉淀进行大约4分钟。
67.如权利要求51所述的设备，其特征在于：所述分离装置包括用于分离所述粒子，然后从所述粒子除去所述被连结的组群或子组群的装置。
68.如权利要求67所述的设备，其特征在于：所述反应剂专门地连结于CD8正细胞。
69.如权利要求51所述的设备，其特征在于：所述粒子至少具有连结其上的抗单核细胞、抗淋巴细胞和抗血小板的单克隆抗体，所述分离装置包括用于除去所述样本部分的至少一部分所得到的上清液，没有具有被连结的单核细胞、淋巴细胞和血小板的所述粒子，从而提供浓缩的粒性白细胞制剂的装置。
70.如权利要求51所述的设备，其特征在于：所述粒子至少具有连结其上的抗单核细胞、抗嗜中性白细胞、抗嗜曙红细胞和抗血小板的单克隆抗体，所述分离装置包括用于除去所述样本部分的至少一部分所得到的上清液，没有具有被连结的单核细胞、嗜中性白细胞、嗜曙红细胞和血小板的所述粒子，从而提供浓缩的淋巴细胞制剂的装置。
71.如权利要求51所述的设备，其特征在于：所述样本是一部分全血或骨髓，所述粒子的至少一部分具有连结其上的抗血小板单克隆抗体，所述分离装置包括用于除去所述样本部分的至少一部分所得到的上清液，从而没有具有被连结的血小板的所述粒子的装置。
72.如权利要求71所述的设备，其特征在于：第二部分的所述粒子具有连结其上的抗嗜中性白细胞的单克隆抗体，所述分离装置包括用于除去所述样本部分的至少一部分所得到的上清液，从而没有具有被连结的嗜中性白细胞的所述粒子的装置。
73.如权利要求71所述的设备，其特征在于：第二部分的所述粒子具有连结其上的专门地连结于基本全部指定血统的单克隆抗体，所述分离装置包括用于除去所述样本部分的至少一部分所得到的上清液，从而没有具有被连结的指定血统细胞的所述粒子的装置。
74.如权利要求51所述的设备，其特征在于：包括在连结所述反应剂以前加热所述粒子的装置。
75.如权利要求51所述的设备，其特征在于：包括用于冻干所述粒子的装置。
76.如权利要求51所述的设备，其特征在于：所述样本是一部分全血或骨髓，所述粒子具有连结其上的专门地连结于基本全部指定血统的细胞的单克隆抗体，所述分离装置包括用于除去所述样本部分的至少一部分所得到的上清液，从而没有具有被连接的指定血统细胞的粒子的装置。
77.一种用于从生物液体样本除去至少一个预先选定的组群或子组群细胞的设备，所述样本是一部分全血或骨髓，所述设备包括：
多个粒子，所述粒子具有至少三微米的直径，并且具有连结其上的抗体，所述抗体专门地连结于至少一个预先选定的组群或子组群细胞上的抗原，其中所述粒子所具有的密度足以形成所述预先选定的组群或子组群与其余样本的差重沉淀，所述粒子密度至少为细胞密度的两倍；
用于使所述样本的体积至少为半毫升的一部分与所述粒子混合以便使所述粒子连结于所述预先选定的组群或子组群而不显著有形地损伤所述预先选定的组群或子组群的装置，所述混合装置包括使所述粒子通过所述样本部分的主要部分反复沉淀的装置；以及
用于分离所述样本部分的至少一部分包括非选定的组群或子组群、从所述粒子和所述被连结的组群或子组群的沉淀而得到的上清液的装置。
78.如权利要求77所述的设备，其特征在于：所述混合装置包括用于使所述样本和所述粒子颠倒翻滚的装置。
79.如权利要求77所述的设备，其特征在于：所述粒子是镍构成的。
80.如权利要求77所述的设备，其特征在于：所述粒子的直径约为3至35微米。
81.如权利要求77所述的设备，其特征在于：所述粒子具有约为9g/cm3的密度。
82.如权利要求77所述的设备，其特征在于：所述粒子的密度约为所述组群或子组群细胞密度的三倍。
83.如权利要求77所述的设备，其特征在于：所述抗体专门地连结于血小板或白血球。
84.如权利要求77所述的设备，其特征在于：所述混合进行大约15秒至30分钟。
85.如权利要求84所述的设备，其特征在于：所述混合进行大约4分钟。
86.如权利要求77所述的设备，其特征在于：所述借助重力的沉淀进行大约15秒至180分钟。
87.如权利要求86所述的设备，其特征在于：所述借助重力的沉淀进行大约4分钟。
88.如权利要求77所述的设备，其特征在于：所述分离装置包括用于分离所述粒子，然后从所述粒子除去所述被连结的组群或子组群的装置。
89.如权利要求77所述的设备，其特征在于：所述粒子至少具有连结其上的抗单核细胞、抗淋巴细胞和抗血小板的单克隆抗体，所述分离装置包括用于除去所述样本部分的至少一部分所得到的上清液，没有具有被连结的单核细胞、淋巴细胞和血小板的所述粒子，从而提供浓缩的粒性白细胞制剂的装置。
90.如权利要求77所述的设备，其特征在于：所述粒子至少具有连结其上的抗单核细胞、抗嗜中性白细胞、抗嗜曙红细胞和抗血小板的单克隆抗体，所述分离装置包括用于除去所述样本部分的至少一部分所得到的上清液，没有具有被连结的单核细胞、嗜中性白细胞、嗜曙红细胞和血小板的所述粒子，从而提供浓缩的淋巴细胞制剂的装置。
91.如权利要求77所述的设备，其特征在于：第一部分的所述粒子具有连结其上的抗血小板的单克隆抗体，所述分离装置包括用于除去所述样本部分的至少一部分所得到的上清液，从而没有具有被连结的血小板的装置。
92.如权利要求91所述的设备，其特征在于：第二部分的所述粒子具有连结其上的抗嗜中性白细胞的单克隆抗体，所述分离装置包括用于除去所述样本部分的至少一部分所得到的上清液，从而没有具有被连结的嗜中性白细胞的所述粒子的装置。
93.如权利要求91所述的设备，其特征在于：第二部分的所述粒子具有连结其上的专门地连结于基本全部指定血统的单克隆抗体，所述分离装置包括用于除去所述样本部分的至少一部分所得到的上清液，从而没有具有被连结的指定血统细胞的所述粒子的装置。
94.如权利要求77所述的设备，其特征在于：包括在连结所述反应剂以前加热所述粒子的装置。
95.如权利要求77所述的设备，其特征在于：包括用于冻干所述粒子的装置。
96.如权利要求77所述的设备，其特征在于：所述粒子的至少一部分具有专门地连结于基本全部指定血统的细胞的单克隆抗体，所述分离装置包括用于除去所述样本部分的至少一部分所得到的上清液，从而没有具有被连结的指定血统细胞的所述粒子的装置。
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