CN115541879A - 一种酶联免疫试剂盒及其制备方法以及检测方法 - Google Patents

一种酶联免疫试剂盒及其制备方法以及检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN115541879A
CN115541879A CN202211196186.3A CN202211196186A CN115541879A CN 115541879 A CN115541879 A CN 115541879A CN 202211196186 A CN202211196186 A CN 202211196186A CN 115541879 A CN115541879 A CN 115541879A
Authority
CN
China
Prior art keywords
solution
prv
antibody
content
gas
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211196186.3A
Other languages
English (en)
Inventor
周敏
张飞雁
秦红刚
李健
徐芳
韩兴
秦伟
熊亮
石宝兰
邓永欢
谢红玲
郑良益
漆世华
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
National Pharmaceutical Group Animal Health Co ltd
Original Assignee
National Pharmaceutical Group Animal Health Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Pharmaceutical Group Animal Health Co ltd filed Critical National Pharmaceutical Group Animal Health Co ltd
Priority to CN202211196186.3A priority Critical patent/CN115541879A/zh
Publication of CN115541879A publication Critical patent/CN115541879A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
    • C07K16/085—Herpetoviridae, e.g. pseudorabies virus, Epstein-Barr virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/01—DNA viruses
    • G01N2333/03—Herpetoviridae, e.g. pseudorabies virus
    • G01N2333/032—Pseudorabies virus, i.e. Aujetzky virus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明的目的是提供一种检测猪伪狂犬病病毒(PRV)含量的酶联免疫试剂盒及其制备方法以及检测方法，该试剂盒在PRV抗原的双抗体夹心ELISA检测方法的基础上，对已知含量的PRV标准品进行定量检测，然后通过待检样品的OD450nm值计算出待检样品的相对效力(RP值)，由此计算待检样品的病毒含量，待检样品的含量lgTCID50/ml＝lg(RP值×标准品的含量)。该试剂盒操作简单快捷，相对传统的TCID50测定方法，可对PRV含量的准确、快捷定量检测，尤其可检测灭活后的病毒含量，用于伪狂犬病疫苗生产的质量控制。

Description

一种酶联免疫试剂盒及其制备方法以及检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术和动物传染病诊断研究领域，具体涉及一种酶联免疫试剂盒及其制备方法以及检测方法。
背景技术
伪狂犬病，又称aujeszky氏病，是由疱疹病毒科(herpesviridae)α亚科中的猪疱疹病毒i型(suid herpesvirus 1strain，亦称伪狂犬病病毒pseudorabies virus，PRV)所引起的猪、牛、羊、犬、猫、兔、鼠、野猪、貂、熊和狐等多种家畜、野生动物的一种以发热、奇痒(除猪外)及脑脊髓炎为主症的急性传染病。猪的伪狂犬病在我国广泛存在，危害严重，是制约规模化猪场生产的主要疾病之一，可引起妊娠母猪流产、死胎或木乃伊胎，仔猪出现神经症状、麻痹等。
疫苗免疫是防控猪伪狂犬病的重要手段，在猪伪狂犬病疫苗的生产过程中，病毒含量是疫苗质控的重要指标，目前测定病毒含量的方法主要是采用组织细胞半数感染量TCID50，该方式耗时长，至少需要72h；而且只能检测有活性的病毒，在灭活疫苗的生产中，病毒灭活之后不能采用该方法测定病毒含量，给疫苗质控造成一定的短板。
1971年瑞典学者Engvail和Perlmann，荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent，assay，ELISA)。它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。迄今为止，还没有利用ELISA检测PRV含量的试剂盒。
综上所述，现有技术测量的PRV含量的方法一般为TCID50，该方法耗时长，而且只能测定有活性的病毒，对于灭活病毒却不能采用该方法，给疫苗质控造成一定的短板。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种酶联免疫试剂盒及其制备方法以及检测方法，旨在提供一种耗时更短，能够检测灭活前后PRV含量的酶联免疫试剂盒。
为实现上述目的，本发明提出一种酶联免疫试剂盒，所述酶联免疫试剂盒用于检测PRV含量，所述酶联免疫试剂盒包括：PRV标准品、阴性对照液、阳性对照液、酶标板、抗体溶液和辅助试剂；其中，所述抗体溶液是经过辣根过氧化物酶标记的抗PRV单克隆抗体溶液；所述酶标板为抗PRV多克隆抗体包被的酶标板。
可选地，所述辅助试剂包括稀释液，所述稀释液为磷酸盐缓冲液；和/或，
所述辅助试剂包括PBST，所述PBST为含有吐温20的磷酸盐缓冲液；和/或，
所述辅助试剂包括封闭液，所述封闭液为含有BSA的稀释液；和/或，
所述辅助试剂包括终止液，所述的终止液为硫酸溶液。
可选地，所述辅助试剂包括底物液，所述底物液包括底物液A和底物液B，所述底物液A为乙酸钠溶液，所述底物液B为3,3’,5,5’-四甲基联苯胺、乙酸钠以及二甲亚砜的混合水溶液。
本发明还提供上述酶联免疫试剂盒的制备方法，所述酶联免疫试剂盒的制备方法包括：
S1、将猪的血清纯化并提取抗PRV多克隆抗体后，稀释为1～3μg/mL，在3～5℃下包被12～16h、再用封闭液封闭，用PBST洗涤2～4次后，获得抗PRV多克隆抗体包被的酶标板；
S2、分别配置阴性对照液、阳性对照液、抗体溶液、PRV标准品和辅助试剂；
S3、将抗PRV多克隆抗体包被的酶标板与S2制备的阴性对照液、阳性对照液、抗体溶液、PRV标准品和辅助试剂组装成所述的酶联免疫试剂盒。
可选地，所述S1的步骤中，所述封闭步骤包括：用所述封闭液在36～33℃下封闭50～70min，再用PBST洗涤2～4次。
可选地，所述抗体溶液是通过以下方法制备：由杂交瘤细胞株5B5E10分泌抗体、纯化后，将单克隆抗体5B5E10经过辣根过氧化物酶标记后，获得的辣根过氧化物酶标记的抗PRV单克隆抗体即抗体溶液。
可选地，所述S2中配制所述PRV标准品的步骤，包括：
S10、在DMEM基础培养基中加入牛血清配制成培养液；
S20、使用培养液对ST细胞进行培养，获得ST细胞培养液；
S30、将C1201株病毒液倒入ST细胞培养液中进行培养获得C1201株病毒液；
S40、将S30中获得的C1201株病毒液测定合格后，进行灭活，检验合格后，得PRV标准品。
此外，本发明还提供一种PRV含量的检测方法，所述PRV含量的检测方法包括：
S100、分别将PRV标准品、待测样品、阴性对照液、阳性对照液稀释，并进行第一次孵育，洗涤液清洗、干燥后，分别加入稀释后的抗体溶液，经第二次孵育、洗涤液清洗、干燥后，分别加入底物液避光反应，然后分别加入终止液，得待测酶标板；
S101、将待测酶标板的进行吸光度值测定，根据测定的吸光度值计算出待检样品的PRV的含量。
可选地，所述S100步骤中，
所述PRV标准品的稀释倍数为1:(2～256)；和/或，
所述待测样品的稀释倍数为1:(2～256)；和/或，
所述阴性对照液的稀释倍数为1:(9～11)；和/或，
所述阳性对照液的稀释倍数为1:(9～11)。
可选地，所述S100的步骤中：
所述PBST溶液稀释倍数为1:(4500～5500)；和/或，
所述孵育的温度为35～40℃；和/或，
所述孵育的时间为55～65min。
本发明提供的技术方案中，为了快速检测PRV含量，同时还能检测出灭活前后的PRV的含量，提出了一种酶联免疫试剂盒，所述酶联免疫试剂盒包括PRV标准品、阴性对照液、阳性对照液、抗PRV多克隆抗体包被的酶标板、辣根过氧化物酶标记的抗PRV单克隆抗体和辅助试剂，利用双抗体夹心ELISA检测方法，将所述PRV标准品当作计算病毒含量时的参照品，所述抗PRV多克隆抗体包被的酶标板为捕获抗体，将捕获抗体封闭，孵育后能够与所述辣根过氧化物酶标记的抗PRV单克隆抗体溶液发生反应，整个过程中会用到辅助试剂用以稀释、孵育、洗涤、显色等，它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，读取相应的OD值由此用于定量测定待检样品的病毒含量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例1中的辣根过氧化物酶标记的抗PRV单克隆抗体配制过程中的SDS-PASE分析纯化后腹水纯化的效果图；
图2为本发明实施例1中的辣根过氧化物酶标记的抗PRV单克隆抗体配制过程中的单克隆抗体5B5E10的特异性鉴定图；
图3为本发明实施例1制备的酶联免疫试剂盒内PRV的标准品的定量标准曲线；
图4为利用本发明实施例1制备的酶联免疫试剂盒针对不同病毒的检测结果示意图；
图5为实施例1制备的试剂盒检测PRV含量的敏感性曲线。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案、或B方案、或A和B同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
疫苗免疫是防控猪伪狂犬病的重要手段，在猪伪狂犬病疫苗的生产过程中，病毒含量是疫苗质控的重要指标，目前测定病毒含量的方法主要是采用组织细胞半数感染量(TCID50)，该方法也存在不足，首先，检测周期长，至少需要72小时；其次，病毒含量的检测受细胞基质的影响较大，当细胞状态不好时，影响检测结果；另外该方法只能检测有活性的病毒，灭活后的病毒含量无法检测。
鉴于此，本发明提出一种酶联免疫试剂盒，旨在解决现有的经典TCID50法测定的不足，能够极大缩短PRV含量的测定所用时间，利用本发明制备的酶联免疫试剂盒的测定时间可仅需2.5-3小时，同时也可以检测灭活前和灭活后的病毒含量，所测定的病毒含量与经典TCID50法测定结果一致，且本发明制备的酶联免疫试剂盒还具有重复性好、特异性高的优点。
所述酶联免疫试剂盒是用于检测PRV含量，所述酶联免疫试剂盒包括：PRV标准品、阴性对照液、阳性对照液、酶标板、抗体溶液和辅助试剂；其中，所述抗体溶液是经过辣根过氧化物酶标记的抗PRV单克隆抗体溶液；所述酶标板为抗PRV多克隆抗体包被的酶标板，利用双抗体夹心ELISA检测原理，将所述PRV标准品当作计算病毒含量时的参照品，所述抗PRV多克隆抗体包被的酶标板为捕获抗体，捕获抗体封闭，孵育后能够与所述辣根过氧化物酶标记的抗PRV单克隆抗体发生反应，整个过程中会用到辅助试剂用以稀释、孵育、洗涤、显色等，它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，读取相应的OD值由此用于定量测定待检样品的病毒含量。
在一些实施例中，所述辅助试剂包括稀释液，所述稀释液为磷酸盐缓冲液，在一些实施例中，所述稀释液为0.01mol/L磷酸盐缓冲液，具体制备步骤是：所述磷酸盐缓冲液是每升含有3g NaCl，0.2g KCl，0.24g KH2PO4，3.6gNa2HPO4的水溶液，稀盐酸调节pH值为7.4，加超纯水定容至1L即可获得。
进一步地，所述辅助试剂包括PBST，所述PBST为含有吐温20的磷酸盐缓冲液所述PBST为含有吐温20的磷酸盐缓冲液，该磷酸盐缓冲液的pH值为7.4，具体制备步骤是：在0.1mol/L，pH值7.4的PBS中加入体积比为0.05％的吐温20，使用前以去离子水稀释10倍备用；
进一步地，所述辅助试剂包括封闭液，所述封闭液为含有BSA的稀释液，所述封闭液为含体积比为1％BSA的稀释液；具体制备步骤是：在0.01mol/L、pH值7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中加入1％(m/v)BSA配制而成。
进一步地，所述辅助试剂包括底物液，所述底物液包括底物液A和底物液B，所述底物液A为乙酸钠溶液，所述底物液B为3,3’,5,5’-四甲基联苯胺、乙酸钠以及二甲亚砜的混合水溶液。
需要注意的是，底物A液的制备步骤：准确称量乙酸钠10g溶于900ml超纯水中，用乙酸调pH值至5.0，加入过氧化氢1ml，再加超纯水定容至1L。在2～3℃温度下保存，保存期为12～15个月。
底物B液的制备步骤：准确称量3,3’,5,5'-四甲基联苯胺(TMB)0.2g溶解于10ml二甲基亚砜(DMSO)中制成母液1；准确称量乙酸钠的10g溶于1000ml超纯水中，用乙酸溶液调pH值至5.0制成母液2；将母液1溶于990ml母液2中制成底物B溶液。在2～3℃温度下保存，保存期为12～15个月。
进一步地、所述辅助试剂还包括终止液为2mol/L硫酸溶液。具体制备方法：取103.6mL浓度为95％的浓硫酸，加超纯水至1L，制成浓度为2mol/L的H2SO4溶液。
所述阴性对照液是灭活的PRV溶液，所述阳性对照液是健康ST细胞培养液，用以当作对照物。
本发明所述的酶联免疫试剂盒的制备方法包括：
S1、将猪的血清纯化并提取抗PRV多克隆抗体后，稀释为1～3μg/mL，在3～5℃下包被12～16h、再用封闭液封闭，用PBST洗涤2～4次后，获得抗PRV多克隆抗体包被的酶标板；
在本实施例中，S1中的抗PRV多克隆抗体由猪的血清通过辛酸硫酸铵沉淀法纯化获得，再将纯化后的抗PRV多克隆抗体用包被稀释液稀释后加入到酶联免疫试剂盒的酶标板各孔，稀释至2μg/mL，然后以100μL/孔含量放入酶标板上，置4℃条件下，包被过夜(12～16h)，移去孔内液体，PBST洗后拍干，再用封闭液在37℃下封闭60min，用PBST洗涤液洗3次，每次5分钟，洗后拍干，晾干，即获得抗PRV多克隆抗体包被的酶标板，抗PRV多克隆抗体包被酶标板中的抗体可以捕捉待测样品中病毒(抗原)，具有富集作用，提高了该酶联免疫试剂盒的检出率。
需要注意的是，S1中的稀释为利用包被稀释液稀释，该包被稀释液是0.05mol/LpH值为9.6碳酸盐缓冲液配制而成，配制步骤是：准确称取1.59g碳酸钠，2.93g碳酸氢钠，调节pH值至9.6，加超纯水定容至1L即可。
需要注意的是，本实施例中此处封闭是影响系统非特异性的关键步骤之一，它是用封闭剂最大限度地封闭酶标板上未被包被的位点，从而屏蔽待检物与酶标板之间的非特异性的结合，封闭剂的种类很多，有明胶、脱脂奶粉、牛血清白蛋白(BSA)等，单就BSA来讲，浓度不一样，效果也不一样，本实验发现BSA作为封闭液时P/N值最大，因此其封闭的效果较好。
进一步地，此处封闭的操作步骤是：用体积比1％的BSA(以0.01mol/L，pH为7.4的PBS配制)封闭，每个酶标板孔200μL，在37℃孵育60min，洗涤3次，拍干即可。
S2、分别制备阴性对照液、阳性对照液、抗体溶液、PRV标准品和辅助试剂；
在步骤S2实施之前，我们需要先制备并筛选出符合酶联免疫试剂盒标准的辣根过氧化物酶标记的抗PRV单克隆抗体，即S2中的抗体溶液，具体操作步骤如下：由杂交瘤细胞株5B5E10分泌获得，将杂交瘤细胞株注入小鼠腹腔制备5B5E10的单克隆抗体腹水，再利用Protein S进行单克隆抗体IgS纯化。纯化后利用SDS-PASE鉴定，选择正确的且纯度高的单克隆抗体5B5E10，再使用高碘酸钠氧化法对杂交瘤细胞5B5E10分泌的符合要求的单克隆抗体进行HRP标记，5B5E10这株单克隆抗体经过酶标记后，记为5B5E10-HRP，即为酶联免疫试剂盒标准的辣根过氧化物酶标记的抗PRV单克隆抗体。
需要注意的是：选择正确的且纯度高的单克隆抗体5B5E10的标准是：将纯化后5B5E10单抗的SDS-PASE鉴定如图1所示，其中，泳道M：蛋白Marker；泳道1：纯化前的PRV腹水5B5E10；泳道2：PRV腹水5B5E10流穿液；泳道3：纯化后的PRV单克隆抗体5B5E10。由图1可知，才是获得了正确的且纯度高的单克隆抗体5B5E10。
进一步地，检测所述的正确的且纯度高的单克隆抗体5B5E10的特异性，是否是针对PRV的抗体的步骤是：
将灭活后的PRV经SDS-PASE分离后，按常规方法在Bio-Rad电转移系统中将凝胶蛋白带转移至硝酸纤维膜上，依次用5％脱脂奶粉-TBS封闭，纯化的单克隆抗体为一抗，辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgS为二抗，以ECL系统显色。Western Blot结果显示纯化的单抗与PRV出现特异性反应，与培养基对照不反应。泳道M为蛋白Marker；泳道1为含10％新生牛血清DMEM细胞培养液；泳道2为灭活后PRV溶液。由图2可知，单克隆抗体5B5E10是针对PRV的抗体。
在实施S2步骤过程中，配制所述PRV标准品的步骤，包括：
S10、在DMEM基础培养基中加入牛血清配制成培养液；
S20、使用培养液对ST细胞进行培养，获得ST细胞培养液；
S30、将C1201株病毒液倒入ST细胞培养液中进行培养获得C1201株病毒液；
S40、将S30中获得的C1201株病毒液测定合格后，进行灭活，检验合格后，得PRV标准品。
具体实际操作如下：在DMEM基础培养基中加入10％新生牛血清(以培养基体积计)配制成培养液，再使用该培养液对健康的ST细胞进行培养，获得ST细胞培养液，再将C1201株病毒液倒入ST细胞培养液中培养72h，获得病毒液，随后将病毒液进行澄清，分离，采用TCID50方法对其毒价进行测定，测定结果符合标准后，再使用β-丙内酯对其进行灭活，灭活检验合格后分装保存。
S3、将抗PRV多克隆抗体包被的酶标板与S2制备的阴性对照液、阳性对照液、抗体溶液、PRV标准品和辅助试剂组装成所述的酶联免疫试剂盒。本发明还提供一种所述PRV含量的检测方法，所述PRV含量的检测方法包括：
在进行检测之前，需要注意的是，本发明试剂盒判定标准为：检测中阳性对照(PC)样品的OD450nm值应在1.5～2.3范围之内，阴性对照(NC)样品的OD450nm值应小于0.3，检测结果才被认为有效；在有效的前提下，再以待检样品的OD450nm值计算出待检样品的RP值，由此计算除待检样品的含量。待检样品的含量lgTCID50/ml＝lg(RP值×标准品的含量)。
S100、分别将PRV标准品、待测样品、阴性对照液、阳性对照液稀释，并进行第一次孵育，洗涤液清洗、干燥后，分别加入稀释后的抗体溶液，经第二次孵育、洗涤液清洗、干燥后，分别加入底物液避光反应，然后分别加入终止液，得待测酶标板；
需要注意的是，所述孵育是为了使待测样品中的抗原与酶标板中的固相抗体充分反应，形成固相抗原-抗体复合物。
其中，所述PRV标准品的稀释倍数为1:(2～256)，所述待测样品的稀释倍数为1:(2～256)；所述阴性对照液的稀释倍数为1:(9～11)；所述阳性对照液的稀释倍数为1:(9～11)；所述PBST溶液稀释倍数为1:(4500～5500)；所述孵育的温度为35～40℃；所述孵育的时间为55～65min。
具体地，在一些实施例中，具体操作如下：使用时，先将PRV标准品和待测样品分别用稀释液1:2、1:4、1:3、1:16、1:32、1:64、1:123、1:256倍稀释待用，阳性对照液用稀释液10倍稀释待用，阴性对照液用稀释液10倍稀释待用，作为对照，随后在37℃孵育60min，用PBST洗涤5次，接着，再将抗体溶液按1:5000稀释后，100μL/孔，分别加入酶标板，在37℃下进行第二次孵育，孵育60min，PBST洗涤5次，干燥后再分别加入底物液A和底物液B各50μL/孔，避光室温下反应10min后，再加入终止液，最后将酶标板放置在酶标仪下测定。
此处洗涤是为了使得经过辣根过氧化物酶标记的抗PRV单克隆抗体溶液与包被了抗PRV多克隆抗体的酶标板以及PRV溶液充分反应后，洗去未结合的物质，此处加入标记抗PRV单克隆抗体并进行第二次孵育，目的是为了形成固相抗体-抗原-标记抗体复合物(双抗体夹心法)。
S101、将待测酶标板的进行吸光度值测定，根据测定的吸光度值计算出待检样品的PRV含量。
具体地，将待测酶标板置于酶标仪测定450nm吸光度值(OD450nm),，读取OD450nm，按判定标准进行结果判定。
其中，本发明试剂盒判定标准为：检测中阳性对照(PC)样品的OD450nm值应在1.5～2.3范围之内，阴性对照(NC)样品的OD450nm值应小于0.3，检测被认为有效；以待检样品的OD450nm值计算出待检样品的RP值，由此计算除待检样品的含量。待检样品的含量lgTCID50/ml＝lg(RP值×标准品的含量)。
以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
酶联免疫试剂盒的制备
(1)分别配置酶联免疫试剂盒内的溶液
阴性对照液：健康ST细胞培养液；
阳性对照液：灭活的PRV溶液；
辣根过氧化物酶标记的抗PRV单克隆抗体：
将杂交瘤细胞株注入小鼠腹腔制备5B5E10的单克隆抗体腹水，再利用Protein S进行单克隆抗体IgS纯化。纯化后利用SDS-PASE鉴定，选择正确的且纯度高的单克隆抗体5B5E10，再使用高碘酸钠氧化法对杂交瘤细胞5B5E10分泌的符合要求的单克隆抗体进行HRP标记，5B5E10这株单克隆抗体经过酶标记后，记为5B5E10-HRP，即获得辣根过氧化物酶标记的抗PRV单克隆抗体；
PRV标准品：
在DMEM基础培养基中加入牛血清配制成培养液，使用培养液对ST细胞进行培养，将C1201株病毒液倒入到阴性对照液中培养72h后，并用C1201株病毒液测定合格后，进行灭活，检验合格后，即获得PRV标准品；
稀释液：3g NaCl，0.2g KCl，0.24g KH2PO4，3.6g Na2HPO4的水溶液，稀盐酸调节pH7.4，加超纯水定容至1L即可获得；
PBST：0.1mol/L，pH值7.4的PBS中加入体积比为0.05％的吐温20，使用前以去离子水稀释10倍备用；
封闭液：在0.01mol/L、pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中加入1％(m/v)BSA配制而成；
底物A液的制备：准确称量乙酸钠10g溶于900ml超纯水中，用乙酸调pH值至5.0，加入过氧化氢1ml，再加超纯水定容至1L。在2～3℃温度下保存，保存期为12～15个月。
底物B液的制备：准确称量3,3’,5,5'-四甲基联苯胺(TMB)0.2g溶解于10ml二甲基亚砜(DMSO)中制成母液1；准确称量乙酸钠的10g溶于1000ml超纯水中，用乙酸溶液调pH值至5.0制成母液2；将母液1溶于990ml母液2中制成底物B溶液。在2～3℃温度下保存，保存期为12～15个月。
终止液：取103.6mL浓度为95％的浓硫酸，加超纯水至1L，制成浓度为2mol/L的H2SO4溶液；
(2)将猪的血清纯化并提取抗PRV多克隆抗体后，用稀释液稀释为2μg/mL，每孔100μL，在4℃下包被12h、移去孔内液体，用PBST洗后拍干，再用封闭液在37℃下封闭60min，PBST洗涤3次，每次5分钟，洗后拍干，晾干，即可获得抗PRV多克隆抗体包被的酶标板；
(3)将(2)中获得的抗PRV多克隆抗体包被的酶标板与(1)中分别制备的阴性对照液、阳性对照液、辣根过氧化物酶标记的抗PRV单克隆抗体、PRV标准品和辅助试剂组装成所述的酶联免疫试剂盒。
酶联免疫试剂盒的应用
(4)从所述的酶联免疫试剂盒中取出酶标板，将标准品和待测样品分别用样品稀释液进行1:2、1:4、1:3、1:16、1:32、1:64、1:123、1:256倍稀释，阴、阳性对照液做1:10倍稀释，100μL/孔，加入酶标板中，阳性对照及阴性对照各1列作为对照；
(5)轻振酶标板混匀孔中样品，37℃孵育60min；
(6)弃去孔中溶液，洗涤液清洗5次，最后一次在吸水纸上拍干；
(7)每孔加入酶标抗体(1:5000倍稀释)100μL/孔，37℃孵育60min。
(3)重复步骤(6)，将底物液A和B各50μL/孔加入ELISA反应板，避光室温作用10min；
(9)在每个酶标孔中加入50μL终止液，将酶标板置于酶标仪测定450nm吸光度值(OD450nm)。
实施例2
酶联免疫试剂盒的制备
(1)分别配置酶联免疫试剂盒内的溶液
阴性对照液：健康ST细胞培养液；
阳性对照液：灭活的PRV溶液；
辣根过氧化物酶标记的抗PRV单克隆抗体：
将杂交瘤细胞株注入小鼠腹腔制备5B5E10的单克隆抗体腹水，再利用Protein S进行单克隆抗体IgS纯化。纯化后利用SDS-PASE鉴定，选择正确的且纯度高的单克隆抗体5B5E10，再使用高碘酸钠氧化法对杂交瘤细胞5B5E10分泌的符合要求的单克隆抗体进行HRP标记，5B5E10这株单克隆抗体经过酶标记后，记为5B5E10-HRP，即获得辣根过氧化物酶标记的抗PRV单克隆抗体；
PRV标准品：
在DMEM基础培养基中加入10％牛血清(以培养基的体积计)配制成培养液，使用培养液对ST细胞进行培养，将C1201株病毒液倒入到培养液中培养72h后，并用C1201株病毒液测定合格后，进行灭活，检验合格后，即获得猪伪狂犬病毒标准品；
稀释液：3g NaCl，0.2g KCl，0.24g KH2PO4，3.6g Na2HPO4的水溶液，稀盐酸调节pH至7.4，加超纯水定容至1L即可获得；
PBST：0.1mol/L，pH7.4的PBS中加入体积比为0.05％的吐温20，使用前以去离子水稀释10倍备用；
封闭液：在0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中加入1％(m/v)BSA配制而成；
底物A液的制备：准确称量乙酸钠10g溶于900ml超纯水中，用乙酸调pH值至5.0，加入过氧化氢1ml，再加超纯水定容至1L。保存2～3℃保存，保存期为12～15个月。
底物B液的制备：准确称量3,3’,5,5'-四甲基联苯胺(TMB)0.2g溶解于10ml二甲基亚砜(DMSO)中制成母液1；准确称量乙酸钠的10g溶于1000ml超纯水中，用乙酸溶液调pH值至5.0制成母液2；将母液1溶于990ml母液2中制成底物B溶液。保存2～3℃保存，保存期为12～15个月。
终止液：取103.6mL浓度为95％的浓硫酸，加超纯水至1L，制成浓度为2mol/L的H2SO4溶液；
(2)将猪的血清纯化并提取抗PRV多克隆抗体后，用稀释液稀释为1μg/mL，每孔100μL，在5℃下包被15h、移去孔内液体，用PBST洗后拍干，再用封闭液在36℃下封闭70min，PBST洗涤2次，每次5分钟，洗后拍干，晾干，即可获得抗猪伪狂犬病毒多克隆抗体包被的酶标板；
(3)将(2)中获得的抗PRV多克隆抗体包被的酶标板与(1)中分别制备的阴性对照液、阳性对照液、辣根过氧化物酶标记的抗猪伪狂犬病毒单克隆抗体、PRV标准品和辅助试剂组装成所述的酶联免疫试剂盒。
酶联免疫试剂盒的应用
(4)从所述的酶联免疫试剂盒中取出酶标板，将标准品和待测样品分别用样品稀释液进行1:2、1:4、1:3、1:16、1:32、1:64、1:123、1:256倍稀释，阴、阳性对照液做1:9倍稀释，100μL/孔，加入酶标板中，阳性对照及阴性对照各1列作为对照；
(5)轻振酶标板混匀孔中样品，40℃孵育55min；
(6)弃去孔中溶液，洗涤液清洗4次，最后一次在吸水纸上拍干；
(7)每孔加入酶标抗体(1:4500倍稀释)100μL/孔，35℃孵育65min。
(3)重复步骤(6)，将底物液A和B各50μL/孔加入ELISA反应板，避光室温作用10min；
(3)在每个酶标孔中加入50μL终止液，将酶标板置于酶标仪测定450nm吸光度值(OD450nm)。
实施例3
酶联免疫试剂盒的制备
(1)分别配置酶联免疫试剂盒内的溶液
阴性对照液：健康ST细胞培养液；
阳性对照液：灭活的PRV溶液；
辣根过氧化物酶标记的抗PRV单克隆抗体：
将杂交瘤细胞株注入小鼠腹腔制备5B5E10的单克隆抗体腹水，再利用Protein S进行单克隆抗体IgS纯化。纯化后利用SDS-PASE鉴定，选择正确的且纯度高的单克隆抗体5B5E10，再使用高碘酸钠氧化法对杂交瘤细胞5B5E10分泌的符合要求的单克隆抗体进行HRP标记，5B5E10这株单克隆抗体经过酶标记后，记为5B5E10-HRP，即获得辣根过氧化物酶标记的抗PRV单克隆抗体；
PRV标准品：
在DMEM基础培养基中加入牛血清配制成培养液，使用培养液对阴性对照液进行培养，将C1201株病毒液倒入到阴性对照液中培养70h后，并用C1201株病毒液测定合格后，进行灭活，检验合格后，即获得PRV标准品；
稀释液：3g NaCl，0.2g KCl，0.24g KH2PO4，3.6g Na2HPO4的水溶液，稀盐酸调节pH至7.4，加超纯水定容至1L即可获得；
PBST：0.1mol/L，pH 7.4的PBS中加入体积比为0.05％的吐温20，使用前以去离子水稀释10倍备用；
封闭液：在0.01mol/L、pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中加入1％(m/v)BSA配制而成；
底物A液的制备：准确称量乙酸钠10g溶于900ml超纯水中，用乙酸调pH值至5.0，加入过氧化氢1ml，再加超纯水定容至1L。保存2～3℃保存，保存期为12～15个月。
底物B液的制备：准确称量3,3’,5,5'-四甲基联苯胺(TMB)0.2g溶解于10ml二甲基亚砜(DMSO)中制成母液1；准确称量乙酸钠的10g溶于1000ml超纯水中，用乙酸溶液调pH值至5.0制成母液2；将母液1溶于990ml母液2中制成底物B溶液。保存2～3℃保存，保存期为12～15个月。
终止液：取103.6mL浓度为95％的浓硫酸，加超纯水至1L，制成浓度为2mol/L的H2SO4溶液；
(2)将猪的血清纯化并提取抗PRV多克隆抗体后，用稀释液稀释为3μg/mL，每孔100μL，在3℃下包被16h、移去孔内液体，用PBST洗后拍干，再用封闭液在33℃下封闭50min，PBST洗涤4次，每次5分钟，洗后拍干，晾干，即可获得抗PRV多克隆抗体包被的酶标板；
(3)将(2)中获得的抗PRV多克隆抗体包被的酶标板与(1)中分别制备的阴性对照液、阳性对照液、辣根过氧化物酶标记的抗PRV单克隆抗体、PRV标准品和辅助试剂组装成所述的酶联免疫试剂盒。
酶联免疫试剂盒的应用
(4)从所述的酶联免疫试剂盒中取出酶标板，将标准品和待测样品分别用样品稀释液进行1:2、1:4、1:3、1:16、1:32、1:64、1:123、1:256倍稀释，阴、阳性对照液做1:11倍稀释，100μL/孔，加入酶标板中，阳性对照及阴性对照各1列作为对照；
(5)轻振酶标板混匀孔中样品，35℃孵育65min；
(6)弃去孔中溶液，洗涤液清洗6次，最后一次在吸水纸上拍干；
(7)每孔加入酶标抗体(1:5500倍稀释)100μL/孔，40℃孵育55min。
(3)重复步骤(6)，将底物液A和B各50μL/孔加入ELISA反应板，避光室温作用10min；
(9)在每个酶标孔中加入50μL终止液，将酶标板置于酶标仪测定450nm吸光度值(OD450nm)。
对比例1
在灭活前，除了检测方法用传统的TCID50方法测量，其余所用样品都与实施例1的对相同的待测样品的病毒含量检测进行测定。
双人重复检验3次取平均值，按照现行《中国兽药典》进行无菌检，标准品灭活后进行灭活检验，实验结果如表一所示：
表一：PRV标准品的检验结果
Figure BDA0003869947590000151
性能测试：
本发明制备的酶联免疫试剂盒的测定时间可仅需2.5-3小时，同时也可以检测灭活前和灭活后的病毒含量，所测定的疫苗含量与经典TCID50法测定结果一致。
利用上述实施例1制备出的酶联免疫试剂盒，与对比例1用传统的TCID50测定相同的待测样品的含量，比较两种方法的测定时间，待测样品的测定结果，以及针对PRV的特异性检测，以及灵敏度的测试，实验结果如下所示：有效性实验(测定的病毒含量与经典TCID50法测定结果一致)
表二为实施例1根据PRV标准品的检测结果绘制标准曲线，检测OD450nm结果如表二所示：
表二：实施例1检测OD450nm结果
Figure BDA0003869947590000161
根据表二的检测结果，以病毒含量作为横坐标，以OD450nm检测值作为纵坐标绘制PRV定量标准曲线，如图3所示，由图3可知：标准曲线方程为：y＝1.4729x-9.0043，相关系数R2＝0.9916，证明PRV含量与OD450nm检测结果具有良好的相关性。
利用稀释的已知含量的标准品的OD450nm值，根据实施例1所制备的标准曲线可求出待检样品的病毒含量，待检样品含量测定结果如表三所示：
表三：实施例1待检样品含量的测定结果
Figure BDA0003869947590000162
Figure BDA0003869947590000171
由表三可知：检测中阳性对照(PC)样品的OD450nm值应在1.5～2.3范围之内，阴性对照(NC)样品的OD450nm值应小于0.3，检测被认为有效，以上结果满足条件，因此结果有效。以待检样品的OD450nm值计算出待检样品的相对效力，由此计算除待检样品的含量：待检样品的含量lgTCID50/ml＝lg(RP值×标准品的含量)，标准品RP值为103.0/ml，待检样品的RP值为1.26×103/ml，因此待检样品的含量为103.1/ml。
利用实施例1制备的酶联免疫试剂盒测定三批样品的病毒含量，三批样品的编号分别为：20220414p、20220523p、20220602p，同时，对于上述三个样品，依据经典TCID50测定方法对其病毒进行TCID50测定。比较待检样品的病毒含量及TCID50的检测结果，结果见表四：
表四：实施例1制备的酶联免疫试剂盒与对比例1的测定结果
Figure BDA0003869947590000172
由表四可知：本发明的酶联免疫试剂盒与经典TCID50测定方法的检测结果差值在±0.3之内，其误差范围符合疫苗生产质控标准要求。
特异性实验
利用实施例1制得的酶联免疫试剂盒分别检测PRV、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪圆环2型病毒、塞内卡病毒、支原体、Cap2蛋白、E2蛋白和PRV阴性对照。
本发明试剂盒判定标准为：检测中阳性对照(PC)样品的OD450nm值应在1.5～2.3范围之内，阴性对照(NC)样品的OD450nm值应小于0.3，检测被认为有效，绘制PRV含量快速检测试剂盒的特异性曲线。
由图4可知：使用本发明的酶联免疫试剂盒检测不同病毒，结果显示无交叉反应，阴阳性对照均成立，表明本试剂盒具有良好的特异性。
灵敏度测试
将待测的PRV样品分别以1:2、1:4、1:3、1:16、1:32、1:64、1:123、1:256、1:512、1:1024、1:2043的比例稀释后，再用实施例1制备的酶联免疫试剂盒去检测，每个梯度平行加样3个孔，测定OD450nm值，计算其OD450nm平均值。以病毒稀释度的对数为横坐标，吸光度为纵坐标绘制PRV含量快速检测试剂盒的敏感性曲线。直线回归法确定该方法的最佳线性范围，线性范围最低检出限即灵敏度。结果如表五所示：
表五：测定不同稀释度的待测的PRV值
Figure BDA0003869947590000181
由表五可知：将PRV含量为3.0(TCID50为103.0/mL)从1:2开始做倍比稀释，由图5所示：以病毒稀释度的对数为横坐标，以吸光度为纵坐标，得出线性回归方程y＝-0.4637x+3.0266，R2＝0.9933。曲线显示，当病毒稀释至1:16时为病毒最低稀释度，因此该试剂盒的最低检出量为6.25(TCID50为106.25/mL)。
重复性测试
选择3批不同的PRV，每个重复3次，用实施例1制备的酶联免疫试剂盒进行检测，分别计算变异系数，如表六所示：
表六：测量在酶联免疫试剂盒板内的变异系数
Figure BDA0003869947590000191
表六可知：板内重复结果显示，对于不同PRV含量的测定，该试剂盒的板内重复变异系数小于5％，在1.31％～2.6％范围波动。
用3种不同批次包被的ELISA反应板检测3批PRV，按权利要求7所述的检测方法进行检测，分别计算变异系数，如表七所示
表七：测量在酶联免疫试剂盒板间的变异系数
Figure BDA0003869947590000192
由表七可知：板间的变异系数在0.96％～3.77％范围内波动，都在规定范围内(板内变异系数一般在10％以下是允许的，板间变异系数一般不超过15％之内)，从而可以证实用本实施例制备的酶联免疫试剂盒检测PRV含量时，变异系数小、重复性良好，可用于PRV含量的定量检测。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种酶联免疫试剂盒，其特征在于，用于检测PRV含量，所述酶联免疫试剂盒包括：PRV标准品、阴性对照液、阳性对照液、酶标板、抗体溶液和辅助试剂；其中，所述抗体溶液是经过辣根过氧化物酶标记的抗PRV单克隆抗体溶液；所述酶标板为抗PRV多克隆抗体包被的酶标板。
2.如权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述辅助试剂包括稀释液，所述稀释液为磷酸盐缓冲液；和/或，
所述辅助试剂包括PBST，所述PBST为含有吐温20的磷酸盐缓冲液；和/或，
所述辅助试剂包括封闭液，所述封闭液为含有BSA的稀释液；和/或，
所述辅助试剂包括终止液，所述的终止液为硫酸溶液。
3.如权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述辅助试剂包括底物液，所述底物液包括底物液A和底物液B，所述底物液A为乙酸钠溶液，所述底物液B为3,3’,5,5’-四甲基联苯胺、乙酸钠以及二甲亚砜的混合水溶液。
4.一种制备权利要求1至3中任意一项所述的酶联免疫试剂盒的制备方法，其特征在于，所述酶联免疫试剂盒的制备方法包括：
S1、将猪的血清纯化并提取抗PRV多克隆抗体后，稀释为1～3μg/mL，在3～5℃下包被12～16h、再用封闭液封闭，用PBST洗涤2～4次后，获得抗PRV多克隆抗体包被的酶标板；
S2、分别配置阴性对照液、阳性对照液、抗体溶液、PRV标准品和辅助试剂；
S3、将抗PRV多克隆抗体包被的酶标板与S2制备的阴性对照液、阳性对照液、抗体溶液、PRV标准品和辅助试剂组装成所述的酶联免疫试剂盒。
5.如权利要求4所述的酶联免疫试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤S1的步骤中，所述封闭步骤包括：
用所述封闭液在36～33℃下封闭50～70min，再用PBST洗涤2～4次。
6.如权利要求4所述的酶联免疫试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述抗体溶液是通过以下方法制备：由杂交瘤细胞株5B5E10分泌抗体、纯化后，将单克隆抗体5B5E10经过辣根过氧化物酶标记后，获得的辣根过氧化物酶标记的抗PRV单克隆抗体即抗体溶液。
7.如权利要求4所述的酶联免疫试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤S2中配制所述PRV标准品的步骤，包括：
S10、在DMEM基础培养基中加入牛血清配制成培养液；
S20、使用培养液对ST细胞进行培养，获得ST细胞培养液；
S30、将C1201株病毒液倒入ST细胞培养液中进行培养获得C1201株病毒液；
S40、将S30中获得的C1201株病毒液测定合格后，进行灭活，检验合格后，得PRV标准品。
8.一种PRV含量的检测方法，其特征在于，采用如权利要求1至3中任意一项所述的酶联免疫试剂盒，所述PRV含量的检测方法包括：
S100、分别将PRV标准品、待测样品、阴性对照液、阳性对照液进行稀释，并进行第一次孵育，洗涤液清洗、干燥后，分别加入稀释后的抗体溶液，经第二次孵育、洗涤液清洗、干燥后，分别加入底物液避光反应，然后分别加入终止液，得待测酶标板；
S101、将待测酶标板的进行吸光度值测定，根据测定的吸光度值计算出待检样品的PRV的含量。
9.如权利要求3所述PRV含量的检测方法，其特征在于，所述S100步骤中，
所述PRV标准品的稀释倍数为1:(2～256)；和/或，
所述待测样品的稀释倍数为1:(2～256)；和/或，
所述阴性对照液的稀释倍数为1:(9～11)；和/或，
所述阳性对照液的稀释倍数为1:(9～11)。
10.如权利要求3所述PRV含量的检测方法，其特征在于，所述S100的步骤中：
所述PBST溶液稀释倍数为1:(4500～5500)；和/或，
所述孵育的温度为35～40℃；和/或，
所述孵育的时间为55～65min。
CN202211196186.3A 2022-09-28 2022-09-28 一种酶联免疫试剂盒及其制备方法以及检测方法 Pending CN115541879A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211196186.3A CN115541879A (zh) 2022-09-28 2022-09-28 一种酶联免疫试剂盒及其制备方法以及检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211196186.3A CN115541879A (zh) 2022-09-28 2022-09-28 一种酶联免疫试剂盒及其制备方法以及检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115541879A true CN115541879A (zh) 2022-12-30

Family

ID=84731293

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211196186.3A Pending CN115541879A (zh) 2022-09-28 2022-09-28 一种酶联免疫试剂盒及其制备方法以及检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115541879A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111337682B (zh) 一种新型冠状病毒IgM/IgG磁微粒化学发光免疫检测试剂盒
O'Beirne et al. Heterogeneous enzyme immunoassay.
CN111337673B (zh) 一种用于新型冠状病毒免疫检测的合成多肽组合物及应用
JPH02503029A (ja) ペルオキシダーゼ接合体を用いるイムノアツセイの性能を改良するためのポリオキシエチレンエーテル類の使用
CN111337672B (zh) 一种新型冠状病毒IgG抗体的酶联免疫法检测试剂盒
CN111551715B (zh) 一种新型冠状病毒IgM抗体的酶联免疫法检测试剂盒
CN111474346B (zh) 猪流行性腹泻病毒IgA和IgG抗体检测试剂盒及其制备方法和应用
CN110261623A (zh) 一种检测羊细粒棘球蚴病抗体间接elisa检测试剂盒及其应用
CN105606802A (zh) 同时检测八种猪病相关抗体试剂盒及其使用方法
CN105758846A (zh) 检测克伦特罗的化学发光酶联免疫检测试剂盒
CN112213483A (zh) 一种检测单纯疱疹病毒1+2型IgM抗体的化学发光免疫分析试剂盒及其制备方法
CN115541879A (zh) 一种酶联免疫试剂盒及其制备方法以及检测方法
CN112114151B (zh) 一种2019-nCoV的IgG、IgM和IgA抗体联合检测试剂盒及其检测方法
Xinglin et al. Quantitative and qualitative study of enzyme-linked immunosorbent assay to detect IgG against Japanese encephalitis virus in swine sera
CN107475076A (zh) 自动核酸提取仪用猪蓝耳病抗体免疫磁珠法检测试剂盒
CN115541884A (zh) 一种试剂盒及其制备方法以及应用
CN112285342A (zh) 用于辣根过氧化物酶标记抗体的稀释稳定保护剂，其制备方法及试剂盒
CN117777259B (zh) 检测结核感染的抗原组合物、试剂盒及其应用
CN112904018B (zh) 一种检测病毒中和抗体的试剂盒、方法和用途
CN113493514B (zh) 抗三碘甲状腺原氨酸单抗的酶结合物、总三碘甲状腺原氨酸定量检测试剂盒及其使用方法
CN115656516A (zh) 基于ELISA检测的重组PCVⅡ型Cap蛋白含量检测方法
CN113495157A (zh) 一种酶结合物稀释液、一种总甲状腺素定量检测试剂盒及其使用方法
CN112881716A (zh) 一种阳性组合质控品，其制备方法及应用
CN118624897A (zh) EB病毒NA1重组抗原包被板及EB病毒NA1-IgA抗体酶联免疫检测试剂盒
CN117630376A (zh) 非洲猪瘟病毒p30蛋白阻断蛋白芯片抗体检测试剂盒及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination