CN115541749A - 一种分离测定丙氨酸酯类盐含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了一种分离测定丙氨酸酯类盐含量的方法，采用氨基酸分析仪，以阳离子交换树脂柱为分离柱，以流动相进行梯度洗脱，利用柱后衍生化反应测定丙氨酸酯类盐的含量。本申请使用氨基酸自动分析仪，茚三酮为柱后衍生化试剂，并使用醋酸钠作为流动相进行分离，可以很好的将丙氨酸酯类盐与其他组分分离，测得丙氨酸酯类盐含量，方法准确度高，重复性好，检测限低。
Description
技术领域
本申请涉及分析分离领域，具体涉及丙氨酸酯类盐含量的分离和测定的方法。
背景技术
β-丙氨酸甲酯盐酸盐又叫3-氨基丙酸甲酯盐酸盐，是一种细粉末晶体，易溶于水，不溶于或微溶于丙酮。其生产工艺主要采用酶转化法。可用作食品添加剂，饲料、医药中间体。
β-丙氨酸甲酯盐酸盐在医药及农药中间体的制备方面有着重要的应用，同时β-丙氨酸甲酯盐酸盐是合成肌肽等的重要原料。
专利CN201310298964.4公开了采用N-BOC-β-丙氨酸甲酯盐酸盐与L-组氨酸在强碱催化下胺解反应，酸脱氨基保护，制备得到L-肌肽。
专利CN201810357806.4公开了采用L-组氨酸、去离子水、β-丙氨酸甲酯盐酸盐，用碱性溶液调节pH值至7.0-9.0，加入酶，进行酶反应制备L-肌肽，离心、超滤、纳滤、上柱、浓缩、搅拌、析晶等工艺得到肌肽粗品，析晶、搅拌析晶、放料离心、减压真空干燥等工艺得肌肽精品。
在使用β-丙氨酸甲酯盐酸盐进行医药及农药或肌肽的制备过程中，因工艺多繁琐冗长，制备过程中的中间产物或粗品或精品中往往不同程度的残留β-丙氨酸甲酯盐酸盐，对β-丙氨酸甲酯盐酸盐含量进行分析和检测有助于对肌肽等转化和纯化方法的评估，及时有效控制转化或反应条件，提高产率。
发明内容
为了解决上述问题，本申请提供一种丙氨酸酯类盐的检测方法，利用氨基酸分析仪，茚三酮做为衍生化试剂，采用柱后衍生技术，回收率高、重现性好，精密度高，检测限低，能够实现对丙氨酸酯类盐高效、准确及快速检测。
具体的，本申请采用的技术方案是：
1、一种分离测定丙氨酸酯类盐含量的方法，包括如下步骤：
采用氨基酸分析仪，以阳离子交换树脂柱为分离柱，以流动相进行梯度洗脱，利用衍生化试剂和反应柱进行衍生化反应后，采用光度法测定丙氨酸酯类盐的含量。
2、根据项1所述的方法，其所述流动相为无机溶剂，优选，所述无机溶剂为无机酸或其盐、无机碱、乙醇中任意一种或任意两种的混合物，所述无机酸或其盐优选为磷酸和醋酸钠；所述无机碱优选为氢氧化钠。
3、根据项1-2中任一项所述的方法，所述衍生化试剂包括衍生化反应试剂和衍生化缓冲液，优选，所述衍生化反应试剂为邻苯二甲醛或茚三酮试剂。
4、根据项1-3中任一项所述的方法，所述流动相包括：
流动相A，为磷酸和乙醇的水溶液，优选，磷酸10-20wt％、乙醇5-15wt％；
流动相B，为磷酸和醋酸钠的水溶液，优选，磷酸2-10wt％、醋酸钠5-10wt％；
流动相C，为醋酸钠的水溶液，优选，醋酸钠溶液2-10wt％；
流动相D，为醋酸钠和乙醇的水溶液，优选，醋酸钠5-10wt％、乙醇0.5-5wt％，
流动相E，为乙醇和氢氧化钠的水溶液，优选乙醇溶液60-85wt％、氢氧化钠0.5-5wt％。
5.根据项1-4中任一项所述的方法，所述衍生化试剂包括，
衍生化反应试剂R1，30-50mg/mL茚三酮丙二醇溶液；
衍生化缓冲液R2，15-25mg/mL乙酸钠+20-60mg/mL乙二醇；
衍生化缓冲液R3，4-6％乙醇溶液。
6、根据项5所述的方法，所述梯度洗脱和衍生化反应条件为：
首先，采用流动相A；
随后，采用流动相B；
随后，采用流动相C；
随后，采用流动相A；
随后，采用流动相D，衍生化反应试剂R1，衍生化缓冲液R2；
随后，采用流动相D，衍生化反应试剂R1，衍生化缓冲液R2；
随后，采用流动相E，衍生化缓冲液R3；
随后，采用流动相A。
7、根据项1-6中任一项所述的方法，所述分离柱为强酸型阳离子交换树脂柱，优选为含有磺酸基的阳离子交换树脂柱，所述反应柱的填充物为石英砂或者是金刚砂，优选为金刚砂。
8、根据项1-7中任一项所述的方法，所述分离柱柱温为50-60℃；所述反应柱柱温为125-140℃。
9、根据项1-8中任一项所述的方法，所述光度法的检测波长为550nm-575nm。
10、根据项1-9中任一项所述的方法，进样到所述分离柱的进样量为10-30μL。
11、根据项1-10中任一项所述的方法，所述方法中的丙氨酸酯类盐的检测限≥0.7×10-4ppm。
发明效果
本申请使用氨基酸自动分析仪，茚三酮为柱后衍生化反应试剂，并使用醋酸钠作为流动相进行分离，可以很好的将丙氨酸酯类盐与其他组分分离，测得丙氨酸酯类盐含量，方法准确度高，重复性好，检测限低。
附图说明
图1是实施例1中对照品色谱图。
图2是实施例1中供试品的色谱图。
图3是实施例1中空白的色谱图。
发明的具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本申请，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本申请，并非用于限制本申请。
除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。以下结合具体实施例对本申请作进一步的说明，但不用来限制本申请的范围。
本申请提供了一种分离测定丙氨酸酯类盐含量的方法，具体为，采用氨基酸分析仪，以阳离子交换树脂柱为分离柱，以流动相进行梯度洗脱，利用衍生化试剂和反应柱进行衍生化反应后，所述反应在反应柱中进行，然后采用光度法测定丙氨酸酯类盐的含量。
进一步的，所述丙氨酸酯类盐包括丙氨酸甲酯盐和丙氨酸乙酯盐，
优选，所述丙氨酸甲酯盐为β-丙氨酸甲酯盐酸盐、L-丙氨酸甲酯盐酸盐、DL-丙氨酸甲酯盐酸盐或D-丙氨酸甲酯盐酸盐；
优选，所述丙氨酸乙酯盐为β-丙氨酸乙酯盐酸盐、L-丙氨酸乙酯盐酸盐、DL-丙氨酸乙酯盐酸盐或D-丙氨酸乙酯盐酸盐。
在一个优选的实施方式中，所述丙氨酸酯类盐包括β-丙氨酸甲酯盐酸盐，β-丙氨酸甲酯盐酸盐是指化学领域的所熟知的化学物质，也称为3-氨基丙酸甲酯盐酸盐，分子式是C4H9NO2·HCl。β-丙氨酸甲酯盐酸盐在医药及农药中间体的制备方面有着重要的应用，对β-丙氨酸甲酯盐酸盐的含量检测能够及时有效控制转化或反应条件，提高产率。
氨基酸分析仪，是指用于测定蛋白质、肽及其他药物制剂的氨基酸组成或含量的方法。它是基于阳离子交换柱分离、柱后茚三酮衍生、光度法测定的离子交换色谱仪。氨基酸分析仪由色谱柱、自动进样器、检测器、数据记录和处理系统组成。氨基酸分析仪的基本原理为流动相(缓冲溶液)推动氨基酸混合物流经装有阳离子交换树脂的色谱柱，各氨基酸与树脂中的交换基团进行离子交换，当用不同的pH缓冲溶液进行洗脱时因交换能力的不同而将氨基酸混合物分离，分离出的单个氨基酸组分与茚三酮试剂反应，生成紫色化合物或黄色化合物，用可见光检测器检测其在570nm、440nm的吸光度。这些有色产物对应的吸收强度与洗脱出来的各氨基酸浓度之间的关系符合朗伯-比尔定律。据此，可对氨基酸各组分进行定性、定量分析。氨基酸分析仪也可利用阴离子交换分离后经积分脉冲安培法检测，该检测方法无需将待测氨基酸进行柱前或柱后衍生。本申请中使用到的是利用阳离子交换柱分离、柱后衍生、光度法测定的方法。
本申请中使用到的阳离子交换树脂柱，是指在高纯度的惰性硅胶表面键合一种阳离子交换配位体的分离柱。
所述梯度洗脱(gradient elution)又称为梯度淋洗或程序洗脱。是指在同一个分析周期中，按一定程度不断改变流动相的浓度配比的洗脱方式。从而可以使一个复杂样品中的性质差异较大的组分能按各自适宜的容量因子k达到良好的分离目的。进行梯度洗脱可以缩短分析周期、提高分离能力、改善峰型、减少拖尾、增加灵敏度。
所述柱后衍生化指的是利用化学变换把化合物转化成类似化学结构的物质的技术，作用在于把难于分析的物质转化为与其化学结构相似但易于分析的物质，便于量化和分离。氨基酸分析仪的化学衍生法是指在一定条件下利用某种试剂(通称化学衍生试剂或标记试剂)与样品组分进行化学反应，反应的产物有利于色谱检测。
本申请中使用无机溶剂作为流动相进行丙氨酸酯类盐的分离，流动相根据梯度洗脱的要求有多种，所述流动相为无机溶剂，无机溶剂可以是无机酸或其盐、无机碱或乙醇，以及他们的混合溶液，在一个优选的实施方式中，流动相为磷酸、醋酸钠或氢氧化钠以及其中任意两种的混合物。
进一步优选的实施方式中，所述流动相具有五种：
流动相A，为磷酸和乙醇的水溶液，在一个优选的实施方式中，流动相A中磷酸占比10-20wt％，例如可以为10wt％、11wt％、12wt％、13wt％、14wt％、15wt％、16wt％、17wt％、18wt％、19wt％、20wt％，乙醇占比5-15wt％，例如可以为5wt％、6wt％、7wt％、8wt％、9wt％、10wt％、11wt％、12wt％、13wt％、14wt％、15wt％；
流动相B，为磷酸和醋酸钠的水溶液，在一个优选的实施方式中，流动相B中磷酸占比2-10wt％，例如可以为2wt％、3wt％、4wt％、5wt％、6wt％、7wt％、8wt％、9wt％、10wt％，醋酸钠占比5-10wt％，例如可以为5wt％、6wt％、7wt％、8wt％、9wt％、10wt％；
流动相C，为醋酸钠的水溶液，在一个优选的实施方式中，流动相C中醋酸钠占比2-10wt％，例如可以为2wt％、3wt％、4wt％、5wt％、6wt％、7wt％、8wt％、9wt％、10wt％；
流动相D，为醋酸钠和乙醇的水溶液，在一个优选的实施方式中，流动相D中醋酸钠占比5-10wt％，例如可以为5wt％、6wt％、7wt％、8wt％、9wt％、10wt％，乙醇占比0.5-5wt％，例如可以为0.5wt％、1wt％、2wt％、3wt％、4wt％、5wt％；
流动相E，为乙醇和氢氧化钠的水溶液，在一个优选的实施方式中，流动相E中乙醇溶液占比60-85wt％，例如可以为60wt％、61wt％、62wt％、63wt％、64wt％、65wt％、66wt％、67wt％、68wt％、69wt％、70wt％、71wt％、72wt％、73wt％、74wt％、75wt％、76wt％、77wt％、78wt％、79wt％、80wt％、81wt％、82wt％、83wt％、84wt％、85wt％，氢氧化钠占比0.5-5wt％，例如可以为0.5wt％、1wt％、2wt％、3wt％、4wt％、5wt％。
一个优选的实施方式，包括衍生化反应试剂和衍生化缓冲液，优选，所述衍生化反应试剂为邻苯二甲醛或茚三酮试剂，优选为茚三酮试剂。所用的衍生化反应试剂为茚三酮，茚三酮能与丙氨酸酯类盐反应，生成深色的复合物，检测波长为550nm-575nm，在570nm处有最大吸收。
在进一步的优选实施方式中，所述衍生化试剂包括，
衍生化反应试剂R1，30-50mg/mL茚三酮丙二醇溶液，例如可以为31mg/mL、32mg/mL、33mg/mL、34mg/mL、35mg/mL、36mg/mL、37mg/mL、38mg/mL、39mg/mL、40mg/mL、41mg/mL、42mg/mL、43mg/mL、44mg/mL、45mg/mL、50mg/mL、55mg/mL、56mg/mL、57mg/mL、58mg/mL、59mg/mL茚三酮丙二醇溶液；
衍生化缓冲液R2，15-25mg/mL乙酸钠+20-60mg/mL乙二醇，例如可以为15mg/mL乙酸钠+20g/L乙二醇；
20mg/mL乙酸钠+20g/L乙二醇；
25mg/mL乙酸钠+20g/L乙二醇；
15mg/mL乙酸钠+30g/L乙二醇；
20mg/mL乙酸钠+30g/L乙二醇；
25mg/mL乙酸钠+30g/L乙二醇；
15mg/mL乙酸钠+40g/L乙二醇；
20mg/mL乙酸钠+40g/L乙二醇；
25mg/mL乙酸钠+40g/L乙二醇；
15mg/mL乙酸钠+50g/L乙二醇；
20mg/mL乙酸钠+50g/L乙二醇；
25mg/mL乙酸钠+50g/L乙二醇；
15mg/mL乙酸钠+60g/L乙二醇；
20mg/mL乙酸钠+60g/L乙二醇；
25mg/mL乙酸钠+60g/L乙二醇；
衍生化缓冲液R3，4-6％乙醇溶液，例如可以为4.5％、5％、5.5％的乙醇溶液。
在进一步优选的实施方式中，所述流动相和衍生化试剂以下述方式进行梯度洗脱，以达到分离测定的目的：
首先，采用流动相A；
随后，采用流动相B；
随后，采用流动相C；
随后，采用流动相A；
随后，采用流动相D，衍生化反应试剂R1，衍生化缓冲液反应试剂R2；
随后，采用流动相D，衍生化反应试剂R1，衍生化缓冲液反应试剂R2；
随后，采用流动相E，衍生化缓冲液反应试剂R3；
随后，采用流动相A。
在进一步优选的实施方式中，所述流动相和衍生化试剂以下述方式进行梯度洗脱，以达到分离测定的目的：
首先，采用流动相A，衍生化反应试剂R1，衍生化缓冲液反应试剂R2；
随后，采用流动相B，衍生化反应试剂R1，衍生化缓冲液反应试剂R2；
随后，采用流动相C，衍生化反应试剂R1，衍生化缓冲液反应试剂R2；
随后，采用流动相A，衍生化反应试剂R1，衍生化缓冲液反应试剂R2；
随后，采用流动相D，衍生化反应试剂R1，衍生化缓冲液反应试剂R2；
随后，采用流动相D，衍生化反应试剂R1，衍生化缓冲液反应试剂R2；
随后，采用流动相E，衍生化缓冲液反应试剂R3；
随后，采用流动相A，衍生化缓冲液反应试剂R3；
随后，采用流动相A，衍生化反应缓冲液试剂R1，衍生化缓冲液反应试剂R2；
最后，采用流动相A，衍生化缓冲液反应试剂R3。
在进一步优选的实施方式中，所述流动相和衍生化试剂以下述方式进行梯度洗脱，以达到分离测定的目的：
一个优选的实施方式，在分离步骤中，所述流动相的流速为0.4-0.5ml/min，优选为0.4-0.45ml/min，最优选为0.4ml/min。
在本申请中，一个优选的实施方式，所述阳离子交换树脂柱为强酸型阳离子交换树脂柱，进一步优选为含有苯磺酸基团的阳离子交换树脂，所选用的离子交换树脂柱能够快速高效分离丙氨酸酯类盐，避免样品峰的拖尾，提高对丙氨酸酯类盐的检测准确度。
一个优选的实施方式，所述反应柱为不锈钢柱，填充物为石英砂或者是金刚砂，优选为金刚砂，反应柱是为丙氨酸酯类盐与茚三酮提供反应场所，需反应柱填料为惰性物质，不影响衍生化反应进行。进一步优选的，树脂柱的填料粒径为3μm。
一个优选的实施方式，所述分离柱柱温为50-60℃，例如可以为50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃，优选为50℃；
所述反应柱柱温为125-140℃，例如可以为125℃、126℃、127℃、128℃、129℃、130℃、131℃、132℃、133℃、134℃、135℃、136℃、137℃、138℃、139℃、140℃，优选为135℃。
一个优选的实施方式，在衍生反应步骤中，茚三酮与茚三酮缓冲液的流速为0.3-0.5ml/min，优选为0.3-0.4ml/min，最优选为0.3ml/min，流速太慢，会导致整个分析时间延长，降低检测效率，加大流动相的用量。流速太快，会影响丙氨酸酯类盐与茚三酮的衍生化反应，影响检测准确度。
一个优选的实施方式，在进样步骤中，分离柱的进样量为10μL-30μL进样量太少，峰面积很小，进样量太多，峰面积太大，超过仪器量程，都会影响结果准确度，进样量10μL-30μL之间对结果准确度影响差异不显著，优选为20μL，。
一个优选的实施方式，采用外标法测定丙氨酸酯类盐的含量，丙氨酸酯类盐的检测限低至10-4ppm。
所述“外标法”是指添加一定量的标准品于空白检材中制成对照样品，与未知检材平行地进行样品处理并检测，根据对照样品响应值与其中所添加标准品浓度的函数关系推算未知检材中被测组分浓度的定量方法。本申请中采用的外标法没有限定，可以采用标准曲线法。
实施例
以下利用实施例对本申请做以详细说明。然而应当理解，可以以各种形式实现本申请而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本申请，并且能够将本申请的范围完整的传达给本领域的技术人员。在本申请中列举的数值范围均包括该数值范围的两个端点的数据，也包括该数值范围中具体的每一个数值，并且该数值可以与端点任意组合组成新的小范围。
实施例1
1.仪器和试剂
氨基酸分析仪(日立LA8080)、分析天平(梅特勒托利多AL104)；
β-丙氨酸甲酯盐酸盐对照品(99.9％)(阿拉丁，批号：I2017128)、超纯水、盐酸(分析纯)、磷酸、醋酸钠、乙醇、乙二醇、乙醇、茚三酮
2.色谱条件
分离柱：填充阳离子交换树脂柱(4.4mm×60mm，3μm，型号：852-8534)；
反应柱：填充金刚砂(4.6mm×40mm，型号：8L03600)；
分离流速：0.4ml/min；
反应流速：0.3ml/min；
分离柱温度：50℃；
反应柱温度：135℃；
进样量：20μL；
检测波长：570nm。
梯度洗脱程序，其中，流动相A、B、C、D、E的配比如下：
A：磷酸20wt％、乙醇溶液11wt％，
B：磷酸2wt％、醋酸钠10wt％，
C：醋酸钠溶液2.5wt％，
D：醋酸钠6wt％、0.5wt％乙醇，
E：乙醇溶液79wt％、氢氧化钠0.8wt％。
衍生化试剂R1、R2、R3的配比如下：
衍生化反应试剂R1：40mg/mL茚三酮丙二醇溶液；
衍生化缓冲液R2：20mg/mL乙酸钠+40g/L乙二醇；
衍生化缓冲液R3：5％乙醇溶液。
洗脱条件如表1所示。
表1梯度洗脱程序
| 时间/min | A％ | B％ | C％ | D％ | E％ | R1％ | R2％ | R3％ |
| 0.0 | 100 | -- | -- | -- | -- | 50 | 50 | -- |
| 3.5 | 100 | -- | -- | -- | 50 | 50 | -- | |
| 3.6 | -- | 100 | -- | -- | 50 | 50 | -- | |
| 6.5 | -- | -- | 100 | -- | -- | 50 | 50 | -- |
| 6.6 | 100 | -- | -- | 50 | 50 | -- | ||
| 12.8 | -- | -- | 100 | -- | 50 | 50 | -- | |
| 12.9 | -- | -- | -- | 100 | -- | 50 | 50 | -- |
| 21.0 | -- | -- | -- | -- | 100 | -- | -- | 100 |
| 32.1 | 100 | -- | -- | -- | -- | -- | 100 | |
| 37.1 | 100 | 50 | 50 | |||||
| 40.0 | 100 | -- | -- | -- | -- | 100 |
3.样品制备：
对照品溶液：精密称取β-丙氨酸甲酯盐酸盐对照品20mg至10mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀，稀释100倍，过滤得到对照品溶液。
供试品溶液：称取中间产物(华熙生物，批号为：211025)供试品20mg至10mL容量瓶中，超纯水溶解定容，超纯水稀释100倍，过滤，得到供试品溶液，测其β-丙氨酸甲酯盐酸盐的含量。
空白溶液：超纯水过滤后作为空白溶液。
4.测定
分别取空白溶液、对照品溶液、供试品溶液进样，按照上述色谱条件进行检测，以外标法峰面积计算供试品溶液中β-丙氨酸甲酯盐酸盐的含量。
含量的测定采用下式进行计算：
供试品中β-丙氨酸甲酯盐酸盐含量计算公式：
Pi＝(Ai×Cr×Vi)/(Ar×Mi)
注：Pi---供试品中β-丙氨酸甲酯盐酸盐含量，mg/g，
Cr---对照品溶液中β-丙氨酸甲酯盐酸盐含量，mg/ml，
Ai---供试品溶液的峰面积，
Ar---对照品溶液的峰面积，
Vi---供试品溶液的体积，ml，
Mi---供试品的重量，g。
5.结果
检测结果如表2所示，色谱图分别如图1-3所示，检测限为0.7×10-4ppm。
表2实施例1中检测结果
实施例2
按照实施例1中的供试品处理方式，取与实施例1不同批号样品中间产物(华熙生物，批号为：211029)，其他条件与实施例1相同，测定其中β-丙氨酸甲酯盐酸盐的含量，结果如表3所示，检测限为0.7×10-4ppm。
表3实施例2的β-丙氨酸甲酯盐酸盐的含量结果
实施例3
将实施例1中的检测波长换为550nm，其他条件与实施例1相同，测定的β-丙氨酸甲酯盐酸盐的含量如下，检测限为4×10-3ppm。
表4实施例3的β-丙氨酸甲酯盐酸盐的含量结果
实施例4
将实施例1中的分离柱柱温改为60℃，他条件与实施例1相同，测定的β-丙氨酸甲酯盐酸盐的含量如下，检测限为3.8×10-4ppm。
表5实施例4的β-丙氨酸甲酯盐酸盐的含量结果
实施例5
将实施例1中的反应柱柱温改为125℃，其他条件与实施例1相同，测定的β-丙氨酸甲酯盐酸盐的含量如下，检测限为3×10-3ppm。
表6实施例5的β-丙氨酸甲酯盐酸盐的含量结果
实施例6
将实施例1中的进样量改为10μL，其他条件与实施例1相同，测定的β-丙氨酸甲酯盐酸盐的含量如下，检测限为2.5×10-4ppm。
表7实施例6的β-丙氨酸甲酯盐酸盐的含量结果
实施例7
将实施例1中的进样量改为30μL，其他条件与实施例1相同，测定的β-丙氨酸甲酯盐酸盐的含量如下，检测限为3×10-4ppm。
表8实施例7的β-丙氨酸甲酯盐酸盐的含量结果
实施例8
将实施例1中分离流速改为0.5ml/min，其他条件与实施例1相同，测定的β-丙氨酸甲酯盐酸盐的含量如下，检测限为1×10-4ppm。
表9实施例8的β-丙氨酸甲酯盐酸盐的含量结果
实施例9
将实施例1中衍生流速改为0.5ml/min，其他条件与实施例1相同，测定的β-丙氨酸甲酯盐酸盐的含量如下，检测限为2.5×10-4ppm。
表10实施例9的β-丙氨酸甲酯盐酸盐的含量结果
实施例10
将实施例1中流动相A中磷酸的浓度改为10wt％，其他条件与实施例1相同，测定的β-丙氨酸甲酯盐酸盐的含量如下，检测限为3.4×10-4ppm。
表11实施例10的β-丙氨酸甲酯盐酸盐的含量结果
实施例11
将实施例1中流动相C中醋酸钠的浓度改为10wt％，其他条件与实施例1相同，测定的β-丙氨酸甲酯盐酸盐的含量如下，检测限为3.6×10-4ppm。
表12实施例11的β-丙氨酸甲酯盐酸盐的含量结果
实施例12
将实施例1中流动相C中醋酸钠的浓度改为2wt％，其他条件与实施例1相同，测定的β-丙氨酸甲酯盐酸盐的含量如下，检测限为2.6×10-4ppm。
表13实施例12的β-丙氨酸甲酯盐酸盐的含量结果
实施例13
将实施例1中R1改为30mg/mL茚三酮丙二醇溶液，R2改为25mg/mL乙酸钠+20mg/mL乙二醇，R3改为6％乙醇溶液，其他条件与实施例1相同，测定的β-丙氨酸甲酯盐酸盐的含量如下，检测限为1×10-3ppm表14实施例13的β-丙氨酸甲酯盐酸盐的含量结果
实施例14重复性测定
按照实施例1中的供试品处理方式，取与实施例1同一批号样品，平行制备6份，对照品溶液以及检测条件同实施例1相同，测定结果如表16所示。结果表明该方法测定β-丙氨酸甲酯盐酸盐，重复性比较好。
表16实施例14的β-丙氨酸甲酯盐酸盐的含量结果
实施例15日间精密度的测定
按照实施例1中的供试品处理方式，取与实施例1同一批号样品，在不同的时间平行制备6份，对照品溶液以及检测条件同实施例1相同，测定结果如表17所示。重复性和日间精密度结果，说明用来测定β-丙氨酸甲酯盐酸盐的该方法比较稳定，重复性好。
表17实施例15的β-丙氨酸甲酯盐酸盐的含量结果
实施例16准确度的测定
取不含β-丙氨酸甲酯盐酸盐的空白溶液，按照实施例1中的供试品处理方式处理空白溶液，精密称取实施例1中对照品，模拟处方配成处方量的80％、100％、120％浓度供试品溶液，分别平行制备3份，共9份。对照品溶液以及检测条件同实施例1-1相同，测定结果如表18所示。说明该方法准确度高。
表18β-丙氨酸甲酯盐酸盐准确度验证结果
对比例1
将实施例1中衍生化试剂茚三酮改为2，4-二硝基氟苯，其他条件与实施例1相同，发现检测结果偏低，平行性差，其检测限为3×10-2ppm。
表19对比例1的β-丙氨酸甲酯盐酸盐的含量结果
对比例2
将实施例1中流动相A和B中的磷酸换成柠檬酸钠，即
流动相A更改为柠檬酸钠20wt％、乙醇溶液11wt％，
流动相B更改为柠檬酸钠2wt％、醋酸钠10wt％，
其他条件与实施例1相同，检测供试品中β-丙氨酸甲酯盐酸盐。结果未发现β-丙氨酸甲酯盐酸盐的峰，无法检测到β-丙氨酸甲酯盐酸盐。说明采用氨基酸分析仪中常用的柠檬酸钠参与配置的流动相无法分离供试品中的β-丙氨酸甲酯盐酸盐。
对比例3
配置β-丙氨酸样品溶液：称取β-丙氨酸(国药集团，批号：20200302)20mg至10mL容量瓶中，超纯水溶解定容，超纯水稀释100倍，过滤，得到β-丙氨酸样品溶液。
空白溶液：超纯水过滤后作为空白溶液。
采用实施例1的检测条件检测上述β-丙氨酸样品溶液，未发现β-丙氨酸的峰，无法检测到β-丙氨酸。说明本申请中的检测β-丙氨酸甲酯盐酸盐含量的方法对于β-丙氨酸的检测没有通用性，为针对β-丙氨酸甲酯盐酸盐含量的特定方法。
对比例4
将实施例1中流动相A中磷酸的浓度改为5wt％，其他条件与实施例1相同，测定的β-丙氨酸甲酯盐酸盐的含量如下，结果偏低，平行性差。无法进行β-丙氨酸甲酯盐酸盐的检测。
表20对比例4的β-丙氨酸甲酯盐酸盐的含量结果
对比例5
将实施例1中流动相C中醋酸钠的浓度改为15wt％，结果没有发现β-丙氨酸甲酯盐酸盐的峰。无法进行β-丙氨酸甲酯盐酸盐的检测。
对比例6
将实施例1中的梯度洗脱程序改为
未发现β-丙氨酸甲酯盐酸盐的峰，无法检测到β-丙氨酸甲酯盐酸盐。说明对比例6中的梯度洗脱程序不适用于β-丙氨酸甲酯盐酸盐的检测。
尽管以上结合对本申请的实施方案进行了描述，但本申请并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和在不脱离本申请权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本申请保护之列。
Claims (10)
1.一种分离测定丙氨酸酯类盐含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
采用氨基酸分析仪，以阳离子交换树脂柱为分离柱，以流动相进行梯度洗脱，利用衍生化试剂和反应柱进行衍生化反应后，采用光度法测定丙氨酸酯类盐的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相为无机溶剂，优选，所述无机溶剂为无机酸或其盐、无机碱、乙醇中任意一种或任意两种的混合物。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其特征在于，所述衍生化试剂包括衍生化反应试剂和衍生化缓冲液。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述流动相包括：
流动相A，为磷酸和乙醇的水溶液，优选，磷酸10-20wt％、乙醇5-15wt％；
流动相B，为磷酸和醋酸钠的水溶液，优选，磷酸2-10wt％、醋酸钠5-10wt％；
流动相C，为醋酸钠的水溶液，优选，醋酸钠溶液2-10wt％；
流动相D，为醋酸钠和乙醇的水溶液，优选，醋酸钠5-10wt％、乙醇0.5-5wt％，
流动相E，为乙醇和氢氧化钠的水溶液，优选乙醇溶液60-85wt％、氢氧化钠0.5-5wt％。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述衍生化试剂包括，
衍生化反应试剂R1，30-50mg/mL茚三酮丙二醇溶液；
衍生化缓冲液R2，15-25mg/mL乙酸钠+20-60mg/mL乙二醇；
衍生化缓冲液R3，4-6％乙醇溶液。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱和衍生化反应条件包括：
采用流动相A；
随后，采用流动相B；
随后，采用流动相C；
随后，采用流动相A；
随后，采用流动相D，衍生化反应试剂R1，衍生化缓冲液R2；
随后，采用流动相D，衍生化反应试剂R1，衍生化缓冲液R2；
随后，采用流动相E，衍生化缓冲液R3；
随后，采用流动相A。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述分离柱为强酸型阳离子交换树脂柱，优选为含有磺酸基的阳离子交换树脂柱，所述反应柱的填充物为石英砂或者是金刚砂。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述分离柱柱温为50-60℃；所述反应柱柱温为125-140℃。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述光度法的检测波长为550nm-575nm。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，进样到所述分离柱的进样量为10-30μL。
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|---|---|---|---|---|
| CN118010453A (zh) * | 2024-04-08 | 2024-05-10 | 四川旅游学院 | 一种适用于肉类样品游离氨基酸检测处理装置及方法 |
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2022
- 2022-09-27 CN CN202211180197.2A patent/CN115541749A/zh active Pending
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