CN115536532A - 巴豆烷型二萜类化合物及其制备方法、药物组合物和应用 - Google Patents

巴豆烷型二萜类化合物及其制备方法、药物组合物和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及从狼毒大戟中提取分离的三个具有相同的巴豆烷型二萜母核的巴豆烷型二萜类化合物ecpfisnatiglia A、ecpfisnatiglia B和ecpfisnatiglia C，还公开了该类新化合物及其药用组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明化合物制备方法简单易行，重现性比较好，纯度较高，具有良好的抗肿瘤活性。

Description

巴豆烷型二萜类化合物及其制备方法、药物组合物和应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及巴豆烷型二萜类化合物及其制备方法、药物组合物和应用，具体公开了从狼毒大戟中提取分离的三个具有相同的巴豆烷型二萜母核的巴豆烷型二萜类化合物ecpfisnatiglia A、ecpfisnatiglia B和ecpfisnatiglia C。
背景技术
目前，临床上对于癌症主要的治疗手段有手术切除、放射治疗和化学药物治疗。手术切除主要用于局部肿瘤的治疗，而后期己发生扩散的肿瘤则无法切除，而放射治疗靶向性高，适应症广，并发症少，但是复发率高，且局限性大；化学药物治疗经常作为手术或放射的搭配治疗，效果明显，应用较广，是目前临床上能够有效控制癌症病情的有效手段，但是目前的化学药物治疗也存在很多的弊端，大多数的化学药物不仅杀死肿瘤细胞，同时也对人体的健康细胞造成危险，常见的毒副作用包括白细胞和血小板下降、恶心、头晕、静脉炎等症状。
由于现代治疗癌症方法的种种弊端，使得人们将视野转向了天然来源的药物。比如，近二十年来市场上的抗癌植物药紫杉醇、喜树碱等因其疗效好、副作用少的特点被社会广泛认同，这就使得人们将肿瘤药物的开发寄希望于天然药物上。
狼毒大戟为中药狼毒的来源之一，始载于《神农本草经》，以后历代本草都有记载，其以根入药，味苦、辛，性平有大毒，入肺经，具有逐水祛痰，破击杀虫的功效，临床用于治疗乳腺癌、肺癌、肝癌等恶性肿瘤。现代研究表明，狼毒大戟中的二萜化合物大都具有良好的抗肿瘤作用，巴豆烷型二萜类化合物属于其中的一类，它们对于肿瘤细胞都有一定的杀伤作用。因此，从狼毒大戟中寻找抗肿瘤活性的巴豆烷型二萜类化合物具有一定的价值。
发明内容
针对现有技术所存在的不足，本发明提供了一种巴豆烷型二萜类化合物及其制备方法、药物组合物和应用。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种巴豆烷型二萜类化合物，其是具有如下式I、II、III所示的结构：
Figure 598908DEST_PATH_IMAGE001
I
Figure 653452DEST_PATH_IMAGE002
II
Figure DEST_PATH_IMAGE003
III。
本发明另一方面还提供了上述巴豆烷型二萜类化合物的制备方法，所述巴豆烷型二萜类化合物是从狼毒大戟中提取分离获得。
在上述技术方案中，所述巴豆烷型二萜类化合物的制备方法，包括以下步骤：
S1、取干燥的狼毒大戟，加入溶剂回流提取，合并提取液后浓缩，得浸膏；
S2、将浸膏加入到8-12倍质量的水中混悬后，分别用石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯萃取，石油醚层和乙酸乙酯层舍弃，将二氯甲烷层经硅胶柱色谱，使用石油醚-乙酸乙酯洗脱，收集馏分后利用硅胶薄层层析检识，合并依次得到馏分A、B、C、D、E和F；
S3、将馏分E经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，使用二氯甲烷-甲醇等度洗脱，收集到58个馏分后，利用硅胶薄层层析检识，将馏分E12至馏分E47合并后经ODS柱色谱，使用甲醇-水梯度洗脱，收集得到16个馏分G1~ G16，将馏分G10经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，使用二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，收集到42个馏分H1~ H42；
将馏分F经ODS柱色谱，使用甲醇-水梯度洗脱，收集到42个馏分后，利用硅胶薄层层析检识，将馏分F8至馏分F16合并后经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，使用三氯甲烷-甲醇等度洗脱，收集得到4个馏分I1、I2、I3和I4，将馏分F19至馏分F24合并后经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，使用三氯甲烷-甲醇等度洗脱，收集得到9个馏分J1~ J9；
S4、以乙腈-水为流动相，利用HPLC法分别在馏分J3、馏分H32和馏分I3中制备得到结构式如式I、II和III所示的巴豆烷型二萜类化合物。
在本发明的具体实施方式中，步骤S4中，所述流动相中乙腈-水的体积比为（79∶21）-（87∶13）。
在本发明的具体实施方式中，步骤S3中，
将馏分E12至馏分E47合并后经ODS柱色谱，使用体积比为（30∶70）-（100∶0）的甲醇-水梯度洗脱，并收集16个馏分；
将馏分G10经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，使用体积比为（100∶0）-（0∶100）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，并收集42个馏分；
将馏分F经ODS柱色谱，使用体积比为（30∶70）-（100∶0）的甲醇-水梯度洗脱，并收集42个馏分。
在本发明的具体实施方式中，步骤S2中，将二氯甲烷层经硅胶柱色谱，使用体积比为（100∶0）-（0∶100）的石油醚-乙酸乙酯洗脱，并收集40-50个馏分。
在本发明的具体实施方式中，步骤S1中，所述溶剂为88-98 v%的乙醇水溶液，且其加入质量为狼毒大戟的6-8倍，回流提取的次数为2-3次，每次提取1-2h。
本发明又一方面还提供了含有上述巴豆烷型二萜类化合物的药物组合物。
具体地，在上述技术方案中，所述药物组合物的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、糖浆剂、膏剂、冲剂、滴丸或微丸。
具体地，在上述技术方案中，所述药物组合物还包括药效学上可接受的载体或赋形剂。也就是说，含有作为活性成份的本发明的巴豆烷型二萜类化合物和常规药物赋形剂或辅剂或载体的药物组合物亦包含在本发明内。
本发明再一方面还提供了上述巴豆烷型二萜类化合物或上述药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明与现有技术相比，具有以下优点：
（1）本发明提供了一种巴豆烷型二萜类化合物，并进一步提供了一种操作简单、重现性好、提取纯度高的从狼毒大戟中提取获得该巴豆烷型二萜类化合物的方法；
（2）试验结果表明，本发明所提供的巴豆烷型二萜类化合物对肝癌细胞HepG2、乳腺癌细胞MCF-7、人结肠癌细胞HT-29和宫颈癌细胞HeLa均具有一定的杀伤作用，尤其对于后两者杀伤作用更强，可用于开发抗肿瘤、抗癌类药物，尤其针对临床化疗阶段药物。
附图说明
图1为本发明实施例1所制得的化合物1的HR-ESI-MS谱；
图2为本发明实施例1所制得的化合物1的1H-NMR谱（400MHz，CDCl3）；
图3为本发明实施例1所制得的化合物1的13C-NMR谱（100MHz，CDCl3）；
图4为本发明实施例1所制得的化合物1的HMBC谱；
图5为本发明实施例1所制得的化合物1的NOESY谱（400MHz，CDCl3）；
图6为本发明实施例1所制得的化合物2的HR-ESI-MS谱；
图7为本发明实施例1所制得的化合物2的1H-NMR谱（400MHz，CDCl3）；
图8为本发明实施例1所制得的化合物2的13C-NMR谱（100 MHz，CDCl3）；
图9为本发明实施例1所制得的化合物2的HMBC谱；
图10为本发明实施例1所制得的化合物2的NOESY谱（400MHz，CDCl3）；
图11为本发明实施例1所制得的化合物3的HR-ESI-MS谱；
图12为本发明实施例1所制得的化合物3的1H-NMR谱（400MHz，CDCl3）；
图13为本发明实施例1所制得的化合物3的13C-NMR谱（100 MHz，CDCl3）；
图14为本发明实施例1所制得的化合物3的HMBC谱；
图15为本发明实施例1所制得的化合物3的NOESY谱（400MHz，CDCl3）。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例中，如无特别说明，所用手段均为本领域常规的手段。
本文中所用的术语“包含”、“包括”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1
一种巴豆烷型二萜类化合物的制备方法，包括如下步骤：
S1、称取干燥的狼毒大戟40 Kg，加入质量为狼毒大戟的8倍的90 v%的乙醇水溶液作为溶剂，回流提取2次，每次提取2 h，合并提取液后浓缩，得到1.5 Kg浸膏；
S2、将浸膏（1.5 Kg）加入到10倍质量的水（15 Kg）中混悬后，分别用17 L的石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯萃取，分别萃取两次，得到900 g石油醚层干浸膏（舍弃）、90 g乙酸乙酯层干浸膏（舍弃）和510 g二氯甲烷层干浸膏，将二氯甲烷层干浸膏经硅胶柱色谱，使用体积比为100︰0、90︰10、80︰20、70︰30、60︰40、50︰50、40︰60、30︰70、20︰80、10︰90和0︰100的石油醚-乙酸乙酯洗脱，每500 mL体积为1个馏分，共收集到40个馏分，利用硅胶薄层层析检识，合并依次得到馏分A、B、C、D、E和F；
S3、将馏分E经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，使用二氯甲烷-甲醇等度洗脱，收集到58个馏分（E1~ E58）后，利用硅胶薄层层析检识，将馏分E12至馏分E47合并后经ODS柱色谱，使用体积比为30︰70、40︰60、50︰50、60︰40、70︰30、80︰20、90︰10、100︰0的甲醇-水梯度洗脱，收集得到16个馏分（G1~ G16），将馏分G10经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，使用体积比为100︰0、90︰10、80︰20、70︰30、60︰40、50︰50、40︰60、30︰70、20︰80、10︰90、0︰100的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，收集到42个馏分（H1~ H42）；
将馏分F经ODS柱色谱，使用体积比为30︰70、40︰60、50︰50、60︰40、70︰30、80︰20、90︰10、100︰0的甲醇-水梯度洗脱，收集到42个馏分后，利用硅胶薄层层析检识，将馏分F8至馏分F16合并后经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，使用三氯甲烷-甲醇等度洗脱，收集得到4个馏分（I1、I2、I3和I4），将馏分F19至馏分F24合并后经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，使用三氯甲烷-甲醇等度洗脱，收集得到9个馏分（J1~ J9）；
S4、利用HPLC法，以体积比为87︰13的乙腈-水为流动相在馏分J3中制备得到化合物1，以体积比为82︰18的乙腈-水为流动相在馏分H32中制备得到化合物2，以体积比为79︰21的乙腈-水为流动相在馏分I3中制备得到化合物3。
实施例2
一种巴豆烷型二萜类化合物的制备方法，包括如下步骤：
S1、称取干燥的狼毒大戟50 Kg，加入质量为狼毒大戟的6倍的95 v%的乙醇水溶液作为溶剂，回流提取3次，每次提取1h，合并提取液后浓缩，得到2.0 Kg浸膏；
S2、将浸膏（2.0 Kg）加入到10倍质量的水（20 Kg）中混悬后，分别用22 L的石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯萃取，分别萃取三次，得到1000 g石油醚层干浸膏（舍弃）、100 g乙酸乙酯层干浸膏（舍弃）和560 g二氯甲烷层干浸膏，将二氯甲烷层干浸膏经硅胶柱色谱，使用体积比为100︰0、85︰15、70︰30、55︰45、40︰60、25︰75、10︰90和0︰100的石油醚-乙酸乙酯洗脱，每500 mL体积为1个馏分，共收集到50个馏分，利用硅胶薄层层析检识，合并依次得到馏分A、B、C、D、E和F；
S3、将馏分E经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，使用二氯甲烷-甲醇等度洗脱，收集到58个馏分（E1~ E58）后，利用硅胶薄层层析检识，将馏分E12至馏分E47合并后经ODS柱色谱，使用体积比为35︰65、45︰55、55︰45、65︰35、75︰25、85︰15、95︰5的甲醇-水梯度洗脱，收集得到16个馏分（G1~G16），将馏分G10经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，使用体积比为100︰0、85︰15、70︰30、55︰45、40︰60、25︰75、10︰90、0︰100的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，收集到42个馏分（H1~ H42）；
将馏分F经ODS柱色谱，使用体积比为35︰65、45︰55、55︰45、65︰35、75︰25、85︰15、95︰5的甲醇-水梯度洗脱，收集到42个馏分（F1~F42）后，利用硅胶薄层层析检识，将馏分F8至馏分F16合并后经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，使用三氯甲烷-甲醇等度洗脱，收集得到4个馏分（I1、I2、I3和I4），将馏分F19至馏分F24合并后经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，使用三氯甲烷-甲醇等度洗脱，收集得到9个馏分（J1~ J9）；
S4、利用HPLC法，以体积比为87︰13的乙腈-水为流动相在馏分J3中制备得到化合物1，以体积比为82︰18的乙腈-水为流动相在馏分H32中制备得到化合物2，以体积比为79︰21的乙腈-水为流动相在馏分I3中制备得到化合物3。
实施例3
本发明实施例提供了实施例1所制得的化合物1的物理性质和检测数据，具体如下：
淡黄色油状物，易溶于三氯甲烷、甲醇；
Figure 519514DEST_PATH_IMAGE005
+70.77(c0.10，MeOH)。
根据高分辨质谱（HR-ESI-MS，图1）m/z671.4532[M+H]+（计算值671.4563），推测其分子量为670.9720，结合1H-NMR（图2）、13C-NMR谱（图3），确定其分子式为 C41H66O7，计算其不饱和度为9。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) 谱（图2）显示，在低场区含有 2 个连在烯碳上的氢信号 [δ H 7.60 (1H, m); 5.71 (1H, d, J = 3.6 Hz)]；较低场区有 1 个与氧相连的亚甲基信号[δ H 4.44 (2H, m)]；高场区存在 3 个单峰甲基信号[δ H 2.04, 1.06, 1.18 (each3H, s)]，3 个多重峰甲基信号[δ H 1.77, 0.89, 0.86 (each 3H, m)]，一组亚甲基信号[δ H 1.25-1.31 (m)]，推测可能为一组脂肪链上化学环境相似的亚甲基氢信号。
13C-NMR (100 MHz, CDCl3) 谱（图3）显示共有 41 个碳信号，包括 6 个甲基碳信号(δ C 23.4, 21.1, 18.7, 15.5, 14.3, 10.3)， 21 个亚甲基碳信号(δ C 69.9, 39.2,34.7, 34.7, 32.1, 32.0, 29.8, 29.8, 29.8, 29.8, 29.8, 29.8, 29.7, 29.7, 29.6,29.5, 29.5, 29.4, 29.3, 24.9, 22.9)，3 个次甲基碳信号(δ C 55.9, 39.6, 32.6)，2组烯氢碳信号(δ C 161.6, 135.0, 134.1, 133.0)，3 个羰基碳信号(δ C 209.2, 176.1,170.9)以及 4 个余下的季碳信号(δ C 76.1, 73.8, 63.6, 36.4)。
1H-NMR、13C-NMR的信号归属如下表所示。
Figure 433244DEST_PATH_IMAGE006
结合1H-NMR谱图，推测该化合物可能含有3个羰基，2对双键，推测余下的4个不饱和度为4个环所占有；此外，还可能含有1个长脂肪链，1个与氧相连的碳信号和6个甲基。结合以上信息，推测该化合物可能为一个巴豆烷型二萜化合物。
在HMBC谱（图4）中，可观察到H-7 (δ H 6.43)和C-14 (δ C 32.6)，C-5 (δ C 39.1)，C-20 (δ C 27.5)；H-20 (δ H 4.44)和 C-5 (δ C 39.1)，C-1'' (δ C 170.9)，以及H-8 (δ H 6.43)和C-15 (δ C 32.6)，C-14 (δ C 39.1)，C-9 (δ C 27.5)，C-6 (δ C 27.5)之间的远程相关，由此可以再次推测该化合物具有巴豆烷型二萜骨架。此外，还能在 HMBC谱中观察到H-2' (δ H2.29)和 C-3' (δ C 24.9)，C-4' (δ C 29.2)，C-1' (δ C 176.1)；H3-2'' (δ H 2.07)和 C-1''(δ C 170.9)的远程相关，综上，可推测该结构中酯基的位置分别在C-13 位和C-20位。
在NOESY谱（图5）中，H3-17 (δ H 1.06)和 H3-18 (δ H 0.89)，H-10 (δ H 3.28)具有NOE相关，H3-18 (δ H 0.89)和 H-14 (δ H 0.80)具有NOE相关，因此确定了化合物的相对构型，即16 位甲基朝向一个平面为α构型，17位甲基、18位甲基、14位氢和10位氢在另一个平面，为β构型。
综上所述，确定了该化合物1的结构如下，命名为eupfisnatiglia A：
Figure 239526DEST_PATH_IMAGE007
。
实施例4
本发明实施例提供了实施例1所制得的化合物2的物理性质和检测数据，具体如下：
淡黄色油状物，易溶于三氯甲烷、甲醇；
Figure 289521DEST_PATH_IMAGE005
+31.98(c0.10,MeOH)。
根据高分辨质谱（HR-ESI-MS，图6）m/z 555.4031[M-H]-,（计算值555.4022），推测其分子量为556.3764，结合1H-NMR（图7）、13C-NMR谱（图8），确定其分子式为 C34H52O6，计算其不饱和度为9。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) 谱（图7）显示，在低场区存在1个醛基上的氢信号[δ H9.43 (1H, s)]，2个与烯碳相连的氢信号[δ H 7.56 (1H, m)；6.72 (1H, dd, 5.7, 2.2)]；高场区含有2个单峰甲基氢信号[δ H 1.23, 1.08 (each 3H, s)]，3个多重峰甲基氢信号[δ H1.78 (3H, dd, 2.9, 1.4); 0.91, 0.91 (each 3H, s)]。
13C-NMR (100MHz, CDCl3)谱（图8）显示共有34个碳信号，包括5个甲基碳信号(δ C23.3, 18.7, 15.4, 14.3, 10.3)，13 个亚甲基碳信号(δ C 34.7, 32.1, 31.9, 29.8,29.8, 29.8, 29.8, 29.6, 29.5, 29.4, 29.3, 24.9, 22.9)，4 个次甲基碳信号(δ C55.9, 41.6, 36.7, 32.1)，2组烯氢碳信号(δ C 160.6, 158.4, 142.9, 133.5)，3个羰基碳信号(δ C 209.5, 193.9, 176.3)以及5个季碳信号(δ C 73.8, 72.9, 63.1, 36.7,23.1)。
1H-NMR、13C-NMR的信号归属如下表所示。
Figure 359109DEST_PATH_IMAGE008
结合1H-NMR 谱图，推测该化合物可能含有3个羰基，2对双键，推测余下的4个不饱和度为4个环所占有；此外，结合高分辨质谱和碳谱中亚甲基个数推测还可能含有1个十四烷基酯链和5个甲基。结合上述谱图数据，推测该化合物可能为一个巴豆烷型二萜化合物。
在HMBC谱（图9）中，可观察到H-20 (δ H 9.43，1H, s)和C-5 (δ C 34.7)，C-4 (δ C72.9)，C-6 (δ C 142.9)，C-7 (δ C 158.4)的远程相关，证明了该羰基直接与 C-6 位相连，即为 C-20 位羰基。结合高分辨质谱分析发现，该化合物的分子式比已知化合物CrotignoidQ多出 2个C及4个H原子的分子质量，推测该化合物为 C-13位连接的侧链多出两个亚甲基信号，在13C-NMR (100MHz, CDCl3)中，观察到化学位移在29.3-29.8 ppm处多出2个亚甲基碳信号，证明了该化合物侧链的亚甲基数量。
在NOESY谱（图10）中，H-8 (δ H 3.37)和H3-17 (δ H 1.08)，H-11 (δ H 2.05)具有NOE相关，H3-18 (δ H 0.91)和 H-10 (δ H 3.08)具有NOE相关。因此确定了该化合物的相对构型，即18位甲基、16位甲基和10位氢朝向同一个平面，为α构型；17 位甲基、11位氢和8位氢朝向另一个平面，为β构型。
综上所述，确定了该化合物2的结构如下，命名为eupfisnatiglia B：
Figure 619189DEST_PATH_IMAGE009
。
实施例5
本发明实施例提供了实施例1所制得的化合物3的物理性质和检测数据，具体如下：
淡黄色油状物，易溶于三氯甲烷、甲醇；
Figure 104528DEST_PATH_IMAGE005
+41.98(c0.10,MeOH)。
根据高分辨质谱（HR-ESI-MS，图11）m/z 597.2546 [M-H]-,（计算值597.2542），推测其分子量为598.4233，结合1H-NMR（图12）、13C-NMR谱（图13），确定其分子式为 C37H58O6，计算其不饱和度为9。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) 谱（图12）显示，在低场区存在1个羰基上的氢信号[δ H9.41 (1H, s)]，2个与烯碳相连的氢信号[δ H 7.54 (1H, t, 2.0); 6.72 (1H, dd, 5.7,2.2)]；高场区含有2个单峰甲基氢信号[δ H 1.22, 1.08 (each 3H, s)]，3 个多重峰甲基氢信号[δ H 1.76 (3H, dd, 2.9, 1.4) 0.88, 0.88 (each 3H, s)]。
13C-NMR (100MHz, CDCl3)谱（图13）显示共有37个碳信号，包括5个甲基碳信号(δ C23.3, 18.7, 15.4, 14.3, 10.2)，16个亚甲基碳信号(δ C 34.7, 32.1, 31.9, 29.8,29.8, 29.8, 29.8, 29.8, 29.8, 29.7, 29.6, 29.5, 29.3, 29.2, 24.9, 22.9)，4个次甲基碳信号(δ C 55.8, 41.6, 36.6, 32.2)，2组烯氢碳信号(δ C 160.7, 158.4, 143.0,135.5)，3个羰基碳信号(δ C 208.6, 193.9, 176.3)以及5个季碳信号(δ C 74.8, 72.9,63.1, 36.6, 23.1)。
1H-NMR、13C-NMR的信号归属如下表所示。
Figure 399243DEST_PATH_IMAGE010
在HMBC谱（图14）中，可观察到H-20 (δ H 9.41, 1H, s)和C-5 (δ C 34.7)，C-4 (δ C72.9)，C-6 (δ C 143.0)，C-7 (δ C 158.4)的远程相关，证明了C-2位的羰基直接与C-6位相连；H-2 (δ H 2.31, 2H, t, 7.5)与H-3' (δ H 1.60, 2H, m)分别与C-1' (δ C 176.3)有远程相关，证明在C-13位有长脂肪侧链。
在NOESY谱（图15）中，H-8 (δ H 3.38)与H3-17 (δ H 1.08)、H-11 (δ H 2.06)具有NOE相关；H3-19 (δ H 1.14)与 H-14 (δ H 0.99)具有NOE相关，由此可以确定，18位甲基、16位氢在同一平面上，为α位取代，17 位甲基、11位氢以及8位氢在另一平面，为β取代。
综上所述，确定了该化合物3的结构如下，命名为eupfisnatiglia C：
Figure 810370DEST_PATH_IMAGE011
。
试验例
本试验例公开了上述化合物1-3（eupfisnatiglia A、eupfisnatiglia B 和eupfisnatiglia C）的抗肿瘤活性试验。
1、实验材料和仪器
受试品：实施例1所制得的化合物1（eupfisnatiglia A）、化合物2（eupfisnatiglia B）和化合物3（eupfisnatiglia C）；
实验细胞株及来源：肝癌细胞HepG2、乳腺癌细胞MCF-7、人结肠癌细胞HT-29和宫颈癌细胞HeLa，均购自中国科学院细胞典藏库（上海）。
2、实验方法
2.1药物处理
化合物ecpfisnatiglia A、ecpfisnatiglia B和ecpfisnatiglia C均为淡黄色油状物，使用DMSO溶解，配成浓度为0.01M的母液，储存于-20℃；临用时将其稀释为200、100、50、25、12.5、6.25、3.125 μM进行实验。
选取顺铂（Cisplatin）作为阳性对照药，按上述方法参照给药组配制成相应浓度的溶液；同时，设置DMSO对照组和不含细胞的空白组。
2.2 CCK-8法的测定方法
取对数生长期的细胞，调整适当的细胞密度，接种于96孔板内，100 μL/well，培养于37℃、5% CO2的培养箱内；培养24 h后，将药物稀释为200、100、50、25、12.5、6.25、3.125μM五个浓度，100 μL/well，作用24 h。分设空白组、给药组，每组设6个复孔；再避光加入CCK-8试剂10 μL，1.5h后利用酶标仪检测450 nm处吸光度值（A）；最后以空白组A值为100%，计算各组细胞抑制率。
细胞增殖抑制率（%）= [(A对照-A样品)/ (A对照-A空白)]×100%。
2.3统计方法
全部资料采用SPSS（13.0）统计软件进行检验分析；各组数据用均值±标准误（Mean±S.E.）表示，采用One-Way ANOVA评价整体性差异，并进行Dunnett 或Dunnett’s T3检验进行组间比较。
3、实验结果
表1 化合物对肿瘤细胞的IC50(μM/L)
Figure 292167DEST_PATH_IMAGE012
从表1的结果可以看出，化合物1-3（eupfisnatiglia A、eupfisnatiglia B 和eupfisnatiglia C）作用24h之后对四种细胞株均具有一定杀伤作用；其中，在HT-29和HeLa细胞中，三个化合物的IC50值均明显小于阳性药的IC50值，结果表明，三个化合物对人结肠癌细胞和宫颈癌细胞毒活性强于阳性药。
综上，本发明所述的巴豆烷型二萜类化合物对肝癌细胞HepG2、乳腺癌细胞MCF-7、人结肠癌细胞HT-29及宫颈癌细胞HeLa均具有一定的杀伤作用，尤其对于后两者杀伤作用更强；因此，所述化合物可用于开发抗肿瘤、抗癌类药物，尤其针对临床化疗阶段药物。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。
应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种巴豆烷型二萜类化合物，其特征在于，
具有如式I、II、III所示的结构：
Figure 344260DEST_PATH_IMAGE001
I
Figure 868782DEST_PATH_IMAGE002
II
Figure 29636DEST_PATH_IMAGE003
III。
2.权利要求1所述的巴豆烷型二萜类化合物的制备方法，其特征在于，
所述巴豆烷型二萜类化合物是从狼毒大戟中提取分离获得。
3.根据权利要求2所述的巴豆烷型二萜类化合物的制备方法，其特征在于，
包括以下步骤：
S1、取干燥的狼毒大戟，加入溶剂回流提取，合并提取液后浓缩，得浸膏；
S2、将浸膏加入到8-12倍质量的水中混悬后，分别用石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯萃取，石油醚层和乙酸乙酯层舍弃，将二氯甲烷层经硅胶柱色谱，使用石油醚-乙酸乙酯洗脱，收集馏分后利用硅胶薄层层析检识，合并依次得到馏分A、B、C、D、E和F；
S3、将馏分E经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，使用二氯甲烷-甲醇等度洗脱，收集到58个馏分后，利用硅胶薄层层析检识，将馏分E12至馏分E47合并后经ODS柱色谱，使用甲醇-水梯度洗脱，收集得到16个馏分G1~ G16，将馏分G10经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，使用二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，收集到42个馏分H1~ H42；
将馏分F经ODS柱色谱，使用甲醇-水梯度洗脱，收集到42个馏分后，利用硅胶薄层层析检识，将馏分F8至馏分F16合并后经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，使用三氯甲烷-甲醇等度洗脱，收集得到4个馏分I1、I2、I3和I4，将馏分F19至馏分F24合并后经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，使用三氯甲烷-甲醇等度洗脱，收集得到9个馏分J1~ J9；
S4、以乙腈-水为流动相，利用HPLC法分别在馏分J3、馏分H32和馏分I3中制备得到结构式如式I、II和III所示的巴豆烷型二萜类化合物。
4.根据权利要求3所述的巴豆烷型二萜类化合物的制备方法，其特征在于，
步骤S4中，所述流动相中乙腈-水的体积比为（79∶21）-（87∶13）。
5.根据权利要求3所述的巴豆烷型二萜类化合物的制备方法，其特征在于，
步骤S3中，
将馏分E12至馏分E47合并后经ODS柱色谱，使用体积比为（30∶70）-（100∶0）的甲醇-水梯度洗脱，并收集16个馏分；
将馏分G10经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，使用体积比为（100∶0）-（0∶100）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，并收集42个馏分；
将馏分F经ODS柱色谱，使用体积比为（30∶70）-（100∶0）的甲醇-水梯度洗脱，并收集42个馏分。
6.根据权利要求3所述的巴豆烷型二萜类化合物的制备方法，其特征在于，
步骤S2中，将二氯甲烷层经硅胶柱色谱，使用体积比为（100∶0）-（0∶100）的石油醚-乙酸乙酯洗脱，并收集40-50个馏分；
步骤S1中，所述溶剂为88-98 v%的乙醇水溶液，且其加入质量为狼毒大戟的6-8倍，回流提取的次数为2-3次，每次提取1-2h。
7.一种药物组合物，其特征在于，
含有权利要求1所述的巴豆烷型二萜类化合物。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，
还包含药学上可接受的载体或赋形剂。
9.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，
所述药物组合物的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、糖浆剂、膏剂、冲剂、滴丸或微丸中的任一种。
10.权利要求1所述的巴豆烷型二萜类化合物或权利要求7-9任一项所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
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