CN115515618A - 用于治疗肾脏疾病或病症的单臂ActRIIA和ActRIIB异多聚体和方法 - Google Patents

用于治疗肾脏疾病或病症的单臂ActRIIA和ActRIIB异多聚体和方法 Download PDF

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Abstract

在一些方面，本公开文本涉及单臂ActRIIA异多聚体和单臂ActRIIB异多聚体，以及使用此类异多聚体治疗、预防肾脏疾病或病症或降低肾脏疾病或病症的进展速率和/或严重性，特别是治疗、预防一种或多种肾相关并发症或降低一种或多种肾相关并发症的进展速率和/或严重性的方法。本公开文本还提供了使用单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体治疗、预防多种病症或降低多种病症的进展速率和/或严重性的方法，所述多种病症包括但不限于奥尔波特综合征、局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)、多囊肾病和/或慢性肾脏疾病。

Description

用于治疗肾脏疾病或病症的单臂ActRIIA和ActRIIB异多聚体 和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年3月13日提交的美国临时申请号62/989,037的权益和优先权。将前述申请通过引用以其整体并入本文。
背景技术
肾脏疾病包括一系列可能导致肾功能丧失的病症，并且在一些情况下可能是致命的。正常发挥功能的肾过滤来自血液的废物和多余液体，其然后在尿中排出。例如，当慢性肾脏疾病达到晚期时，可能在血流中积累危险的水平的液体、电解质和废物。如果不治疗，肾脏疾病可能进展为终末期肾脏疾病(例如，终末期肾衰竭)，其在不进行人工过滤(透析)或肾移植的情况下是致命的。因此，对治疗肾脏疾病或病症(例如，奥尔波特综合征(Alportsyndrome)、局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)、多囊肾病、慢性肾脏疾病)的有效疗法存在很高的尚未满足的需求。
发明内容
部分地，本公开文本提供了包含单个ActRIIA或单个ActRIIB多肽(包括其片段和变体)的单臂异多聚体复合物。这些构建体在本文中可以被称为单臂异多聚体、单臂ActRIIA异多聚体或异二聚体以及单臂ActRIIB异多聚体或异二聚体。任选地，本文所公开的单臂多肽异多聚体(例如，单臂ActRIIB异多聚体，诸如单臂ActRIIB异二聚体Fc融合物)与相应的异多聚体(例如，ActRIIB同二聚体Fc融合物)相比具有不同的配体结合特异性/谱。如本文实施例所示，包含ActRIIA的单结构域或ActRIIB多肽的单结构域的异多聚体展现出新的特性。
异多聚体结构包括例如异二聚体、异三聚体和更高级复合物。优选地，如本文所述的ActRIIA或ActRIIB多肽包含受体的配体结合结构域，例如ActRIIA或ActRIIB受体的细胞外结构域。因此，在某些方面，本文所述的异多聚体包含ActRIIA或ActRIIB多肽的细胞外结构域以及其截短和变体。优选地，如本文所述的ActRIIA或ActRIIB多肽以及包含其的异多聚体是可溶的。在某些方面，本公开文本的异多聚体结合一种或多种ActRIIA或ActRIIB配体(例如，激活素A、激活素B、GDF11、GDF8、GDF3、BMP5、BMP6和BMP10)。任选地，本公开文本的蛋白质复合物以小于或等于10-8、10-9、10-10、10-11或10-12的KD结合这些配体中的一种或多种。一般而言，本公开文本的单臂异多聚体拮抗(抑制)至少一种ActRIIA或ActRIIB配体的一种或多种活性，并且此类活性改变可以使用本领域中已知的多种测定来测量，所述多种测定包括例如本文所述的基于细胞的测定。优选地，本公开文本的单臂异多聚体在哺乳动物(例如，小鼠或人)中展现出至少4、6、12、24、36、48或72小时的血清半衰期。任选地，本公开文本的单臂异多聚体可以在哺乳动物(例如，小鼠或人)中展现出至少6、8、10、12、14、20、25或30天的血清半衰期。
部分地，本公开文本提供了可以用于治疗肾脏疾病或病症(例如，奥尔波特综合征、局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)、多囊肾病、慢性肾脏疾病)的ActRIIA或ActRIIB单臂异多聚体。在UUO和Col4a3(-/-)奥尔波特综合征模型中观察到单臂ActRIIB异多聚体的积极作用。本公开文本确立了ActRII(例如，ActRIIA和ActRIIB)信号传导途径的拮抗剂可以用于降低肾脏疾病或病症(例如，奥尔波特综合征、局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)、多囊肾病、慢性肾脏疾病)的严重性，并且可以根据ActRII信号传导拮抗剂活性选择所需的治疗剂。因此，在一些实施方案中，本公开文本提供了使用多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体治疗肾脏疾病或病症的方法，所述肾脏疾病或病症包括但不限于奥尔波特综合征、局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)、多囊肾病和慢性肾脏疾病，所述多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体包括例如抑制一种或多种ActRIIA或ActRIIB配体[例如，激活素A、激活素B、GDF11、GDF8、GDF3、BMP6、BMP5和BMP10]的单臂异多聚体。
在一些实施方案中，本公开文本提供了治疗肾脏疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用单臂ActRIIB异多聚体。在一些实施方案中，本公开文本提供了治疗肾脏疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用单臂ActRIIB异多聚体，所述异多聚体包含与第二多肽共价或非共价缔合的第一多肽，其中所述第一多肽包含相互作用对的第一成员的氨基酸序列和ActRIIB的氨基酸序列；并且所述第二多肽包含所述相互作用对的第二成员的氨基酸序列，并且其中所述第二多肽不包含ActRIIB。
在一些实施方案中，ActRIIB多肽包含如下氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1、2、3、4、5和6中任一个的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；或者与开始于SEQID NO:1的氨基酸20、21、22、23、24、25、26、27、28或29中任一个并且结束于SEQ ID NO:1的氨基酸109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134中任一个的多肽至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
在一些实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO:79的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO:79的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，其中所述ActRIIB多肽在关于SEQ ID NO:1的位置79处包含酸性氨基酸。在某些实施方案中，根据本文所述的方法和用途使用的ActRIIB多肽在与SEQ IDNO:1的L79对应的位置处不包含酸性氨基酸。在某些实施方案中，根据本文所述的方法和用途使用的ActRIIB多肽在与SEQ ID NO:1的L79对应的位置处不包含天冬氨酸(D)。
在一些实施方案中，本公开文本提供了治疗肾脏疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用单臂ActRIIA异多聚体。在一些实施方案中，本公开文本提供了治疗肾脏疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用单臂ActRIIA异多聚体，所述异多聚体包含与第二多肽共价或非共价缔合的第一多肽，其中所述第一多肽包含相互作用对的第一成员的氨基酸序列和ActRIIA的氨基酸序列；并且所述第二多肽包含所述相互作用对的第二成员的氨基酸序列，并且其中所述第二多肽不包含ActRIIA。
在一些实施方案中，ActRIIA多肽包含如下氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:9、10和11中任一个的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；或者与开始于SEQ IDNO:9的氨基酸21、22、23、24、25、26、27、28、29或30中任一个并且结束于SEQ ID NO:9的氨基酸110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134或135中任一个的多肽至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
在本公开文本的一些实施方案中，异多聚体是异二聚体。
在本公开文本的一些实施方案中，相互作用对的第一成员包含来自IgG重链的第一恒定区。在一些实施方案中，来自IgG重链的第一恒定区是第一免疫球蛋白Fc结构域。在一些实施方案中，来自IgG重链的第一恒定区包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO:14-28中任一个的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
在本公开文本的一些实施方案中，相互作用对的第二成员包含来自IgG重链的第二恒定区。在一些实施方案中，来自IgG重链的第二恒定区是第一免疫球蛋白Fc结构域。在一些实施方案中，来自IgG重链的第二恒定区包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO:14-28中任一个的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
在本公开文本的一些实施方案中，第一多肽包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO:46、48、55、57、58、59、60、61、84、86、88、89、90和91中任一个的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，第二多肽包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO:49、51、62、63、85和87中任一个的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
在本公开文本的一些实施方案中，单臂ActRIIB异多聚体包含定位于ActRIIB多肽与相互作用对的第一成员之间的接头结构域。在一些实施方案中，接头结构域包含选自SEQID NO:29-44中任一个的氨基酸序列。
在本公开文本的一些实施方案中，单臂ActRIIA异多聚体包含定位于ActRIIA多肽与相互作用对的第一成员之间的接头结构域。在一些实施方案中，接头结构域包含选自SEQID NO:29-44中任一个的氨基酸序列。
在本公开文本的一些实施方案中，所述第一多肽和/或所述第二多肽包含一个或多个经修饰的氨基酸残基，所述一个或多个经修饰的氨基酸残基选自：糖基化氨基酸、PEG化氨基酸、法尼基化氨基酸、乙酰化氨基酸、生物素化氨基酸、与脂质部分缀合的氨基酸和与有机衍生剂缀合的氨基酸。在一些实施方案中，所述第一多肽和/或所述第二多肽是糖基化的，并且具有可从所述第一多肽和/或所述第二多肽在CHO细胞中的表达获得的糖基化模式。
在一些实施方案中，异多聚体(例如，异二聚体Fc融合物)结合选自以下的一种或多种ActRIIA或ActRIIB配体：激活素A、激活素B、GDF11、GDF8、GDF3、BMP5、BMP6和BMP10。在一些实施方案中，单臂ActRIIB异二聚体Fc融合物比ActRIIB同二聚体Fc融合物具有更大的配体选择性。在一些实施方案中，ActRIIB同二聚体Fc融合物与激活素A、激活素B、GDF11、GDF8和BMP10强结合。在一些实施方案中，单臂ActRIIB异二聚体Fc融合物与激活素B和GDF11强结合，并且与GDF8和激活素A中等结合。在一些实施方案中，单臂ActRIIB异二聚体Fc融合物显示与BMP10的弱的、最小的或不可检测的结合。在一些实施方案中，单臂ActRIIB异二聚体Fc融合物拮抗激活素A、激活素B、GDF8和GDF11，并且最低限度地拮抗BMP9、BMP10、BMP6和GDF3中的一种或多种。在一些实施方案中，单臂ActRIIA异二聚体Fc融合物展现出相比于激活素B与激活素A优先结合，并且相比于GDF11对激活素A的选择性大大增强。在一些实施方案中，单臂ActRIIA异二聚体Fc融合物主要保留与GDF8和BMP10的中等结合，如用ActRIIA同二聚体Fc融合物观察到的。在一些实施方案中，将单臂ActRIIA异二聚体Fc融合物用于治疗应用中，其中需要相比于激活素B对激活素A优先拮抗，同时使GDF11的拮抗作用降至最低。在本公开文本的一些实施方案中，单臂ActRIIA异二聚体Fc融合物或单臂ActRIIB异二聚体Fc融合物抑制一种或多种ActRIIA或ActRIIB配体在基于细胞的测定中的活性。
在本公开文本的一些实施方案中，肾脏疾病或病症是奥尔波特综合征。在一些实施方案中，肾脏疾病或病症是局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)。在一些实施方案中，FSGS是原发性FSGS。在一些实施方案中，FSGS是继发性FSGS。在一些实施方案中，FSGS是遗传性FSGS。在一些实施方案中，肾脏疾病或病症是常染色体显性多囊肾病(ADPKD)。在一些实施方案中，肾脏疾病或病症是常染色体隐性多囊肾病(ARPKD)。在一些实施方案中，肾脏疾病或病症是慢性肾脏疾病(CKD)。
在一些实施方案中，本公开文本的方法包括向受试者进一步施用用于治疗肾脏疾病或病症的另外的活性剂和/或支持疗法。在一些实施方案中，用于治疗肾脏疾病或病症的另外活性剂和/或支持疗法选自：血管紧张素受体阻滞剂(ARB)(例如，氯沙坦、厄贝沙坦、奥美沙坦、坎地沙坦、缬沙坦、非马沙坦、阿齐沙坦、沙普立沙坦和替米沙坦)、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂(例如，贝那普利、卡托普利、依那普利、赖诺普利、培哚普利、雷米普利、群多普利和佐芬普利)、糖皮质激素(例如，倍氯米松、倍他米松、布地奈德、可的松、地塞米松、氢化可的松、甲泼尼龙、泼尼松龙、甲基泼尼松、泼尼松和曲安西龙)、钙调磷酸酶抑制剂(例如，环孢菌素、他克莫司)、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、JAK激酶抑制剂(例如，托法替尼(tofacitinib))、mTOR抑制剂(例如，西罗莫司、依维莫司)、IMDH抑制剂(例如，硫唑嘌呤、来氟米特、霉酚酸酯)、生物制剂(例如，阿巴西普、阿达木单抗、阿那白滞素、巴利昔单抗、赛妥珠单抗(certolizumab)、达克利珠单抗(daclizumab)、依那西普、非苏木单抗(fresolimumab)、戈利木单抗、英夫利昔单抗、伊卡组单抗(ixekizumab)、那他珠单抗、利妥昔单抗、司库奴单抗(secukinumab)、托珠单抗、乌司奴单抗、维多珠单抗)、他汀类药物(例如，贝那普利、缬沙坦、氟伐他汀、普伐他汀)、lademirsen(抗miRNA-21)、甲基巴多索隆、Achtar凝胶、托伐普坦、阿巴西普与司帕生坦(sparsentan)的组合、阿利吉仑、别嘌呤醇、ANG-3070、阿托伐他汀、布来鲁单抗(bleselumab)、波舒替尼、CCX140-B、CXA-10、D6-25-羟基维生素D3、达格列净、地塞米松与文鲁司他MMF的组合、大黄素、FG-3019、FK506、FK-506和MMF、FT-011、半乳糖、GC1008、GFB-887、异维甲酸、兰瑞肽、左旋咪唑、利希普坦、洛吡莫德、二甲双胍、咪唑立宾(mizorbine)、N-乙酰甘露糖胺、奥曲肽、帕立骨化醇(paricalcitol)、PF-06730512、吡格列酮、丙帕锗、丙帕锗和厄贝沙坦、雷帕鸣、雷帕霉素、RE-021(例如，司帕生坦)、RG012、罗格列酮(例如，文迪雅(Avandia))、沙奎那韦、SAR339375、生长抑素、螺内酯、特伐替尼(tesevatinib)(KD019)、替可克(tetracosactin)、雷公藤多甙(tripterygiumwilfordii)(TW)、丙戊酸、VAR-200、文鲁司他(venglustat)(GZ402671)、维立诺雷(verinurad)、伏环孢素、VX-147、肾透析、肾移植、间充质干细胞疗法、骨髓干细胞、脂蛋白去除、Liposorber LA-15装置、血浆单采术、血浆置换和饮食改变(例如饮食钠摄入)。在一些实施方案中，用于治疗肾脏疾病或病症的另外活性剂和/或支持疗法是选自以下的血管紧张素受体阻滞剂(ARB)：氯沙坦、厄贝沙坦、奥美沙坦、坎地沙坦、缬沙坦、非马沙坦、阿齐沙坦、沙普立沙坦和替米沙坦。在一些实施方案中，用于治疗肾脏疾病或病症的另外活性剂和/或支持疗法是选自以下的血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂：贝那普利、卡托普利、依那普利、赖诺普利、培哚普利、雷米普利、群多普利和佐芬普利。在一些实施方案中，用于治疗肾脏疾病或病症的另外活性剂和/或支持疗法是ARB和ACE抑制剂的组合。
在一些实施方案中，本公开文本的方法降低了有需要的受试者的白蛋白尿、蛋白尿、微量白蛋白尿和巨白蛋白尿中的一种或多种的严重性、发生率和/或持续时间。在本公开文本的一些实施方案中，受试者患有蛋白尿。在一些实施方案中，受试者患有白蛋白尿。
在一些实施方案中，受试者有中度白蛋白尿。在一些实施方案中，受试者患有重度白蛋白尿。在一些实施方案中，受试者具有在约30与约300mg白蛋白/24小时尿收集之间的白蛋白-肌酐比率(ACR)。在一些实施方案中，受试者具有在约30与约300mg白蛋白/g肌酐之间的ACR。在一些实施方案中，受试者具有高于约300mg白蛋白/24小时的白蛋白-肌酐比率(ACR)。在一些实施方案中，受试者具有高于约300mg白蛋白/g肌酐的ACR。
在一些实施方案中，受试者患有A1期白蛋白尿。在一些实施方案中，受试者患有A2期白蛋白尿。在一些实施方案中，受试者患有A3期白蛋白尿。在一些实施方案中，本公开文本提供了降低A1期白蛋白尿的严重性、发生率和/或持续时间的方法。在一些实施方案中，本公开文本提供了降低A2期白蛋白尿的严重性、发生率和/或持续时间的方法。在一些实施方案中，本公开文本提供了降低A3期白蛋白尿的严重性、发生率和/或持续时间的方法。
在一些实施方案中，本公开文本的方法延迟或防止患有A1期白蛋白尿的受试者进展为A2期白蛋白尿。在一些实施方案中，本公开文本的方法延迟或防止患有A2期白蛋白尿的受试者进展为A3期白蛋白尿。在一些实施方案中，本公开文本的方法延迟或防止有需要的受试者的白蛋白尿分期进展的恶化。在一些实施方案中，本公开文本的方法将受试者的白蛋白尿分类改善了一期或多期。
在一些实施方案中，本公开文本的方法降低受试者的ACR。在一些实施方案中，所述方法将受试者的ACR降低了约0.1与约100.0mg之间的白蛋白/g肌酐(例如，降低了约0.1与约2.5mg之间的白蛋白/g肌酐、约2.5与约3.5mg之间的白蛋白/g肌酐、约3.5与约5.0mg之间的白蛋白/g肌酐、约5.0与约7.5mg之间的白蛋白/g肌酐、约7.5与约10.0mg之间的白蛋白/g肌酐、约10.0与约15.0mg之间的白蛋白/g肌酐、约15.0与约20.0mg之间的白蛋白/g肌酐、约20.0与约25.0mg之间的白蛋白/g肌酐、约30.0与约35.0mg之间的白蛋白/g肌酐、约40.0与约45.0mg之间的白蛋白/g肌酐、约45.0与约50.0mg之间的白蛋白/g肌酐、约50.0与约60.0mg之间的白蛋白/g肌酐、约60.0与约70.0mg之间的白蛋白/g肌酐、约70.0与约80.0mg之间的白蛋白/g肌酐、约80.0与约90.0mg之间的白蛋白/g肌酐、约90.0与约100.0mg之间的白蛋白/g肌酐)。在一些实施方案中，与基线测量相比，所述方法将受试者的ACR降低了至少2.5％(例如，5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％)。
在一些实施方案中，本公开文本的方法降低受试者的尿蛋白-肌酐比率(UPCR)。在一些实施方案中，所述方法将受试者的UPCR降低了约0.1与约100.0mg之间的尿蛋白/mg肌酐(例如，降低了约0.1与约2.5mg之间的尿蛋白/mg肌酐、约2.5与约3.5mg之间的尿蛋白/mg肌酐、约3.5与约5.0mg之间的尿蛋白/mg肌酐、约5.0与约7.5mg之间的尿蛋白/mg肌酐、约7.5与约10.0mg之间的尿蛋白/mg肌酐、约10.0与约15.0mg之间的尿蛋白/mg肌酐、约15.0与约20.0mg之间的尿蛋白/mg肌酐、约20.0与约25.0mg之间的尿蛋白/mg肌酐、约30.0与约35.0mg之间的尿蛋白/mg肌酐、约40.0与约45.0mg之间的尿蛋白/mg肌酐、约45.0与约50.0mg之间的尿蛋白/mg肌酐、约50.0与约60.0mg之间的尿蛋白/mg肌酐、约60.0与约70.0mg之间的尿蛋白/mg肌酐、约70.0与约80.0mg之间的尿蛋白/mg肌酐、约80.0与约90.0mg之间的尿蛋白/mg肌酐、约90.0与约100.0mg之间的尿蛋白/mg肌酐)。
在一些实施方案中，本公开文本的方法降低受试者的尿蛋白-肌酐比率(UPCR)。在一些实施方案中，所述方法将受试者的UPCR降低了约0.1与约100.0g之间的尿蛋白/g肌酐(例如，降低了约0.1与约2.5g之间的尿蛋白/g肌酐、约2.5与约3.5g之间的尿蛋白/g肌酐、约3.5与约5.0g之间的尿蛋白/g肌酐、约5.0与约7.5g之间的尿蛋白/g肌酐、约7.5与约10.0g之间的尿蛋白/g肌酐、约10.0与约15.0g之间的尿蛋白/g肌酐、约15.0与约20.0g之间的尿蛋白/g肌酐、约20.0与约25.0g之间的尿蛋白/g肌酐、约30.0与约35.0g之间的尿蛋白/g肌酐、约40.0与约45.0g之间的尿蛋白/g肌酐、约45.0与约50.0g之间的尿蛋白/g肌酐、约50.0与约60.0g之间的尿蛋白/g肌酐、约60.0与约70.0g之间的尿蛋白/g肌酐、约70.0与约80.0g之间的尿蛋白/g肌酐、约80.0与约90.0g之间的尿蛋白/g肌酐、约90.0与约100.0g之间的尿蛋白/g肌酐)。在一些实施方案中，与基线测量相比，所述方法将受试者的绝对UPCR降低了大于或等于0.5g尿蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，与基线测量相比，所述方法将受试者的UPCR降低至小于0.5g尿蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，与基线测量相比，所述方法将受试者的UPCR降低至小于0.3g尿蛋白/g肌酐。
在一些实施方案中，与基线测量相比，所述方法将受试者的UPCR降低了至少2.5％(例如，5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％)。在一些实施方案中，与基线测量相比，所述方法将受试者的UPCR降低了大于或等于30％。在一些实施方案中，与基线测量相比，所述方法将受试者的UPCR降低了大于或等于40％。在一些实施方案中，与基线测量相比，所述方法将受试者的UPCR降低了大于或等于50％。
在一些实施方案中，本公开文本的方法增加受试者的估计肾小球滤过率(eGFR)和/或肾小球滤过率(GFR)。在一些实施方案中，使用血清肌酐、年龄、种族和性别变量来测量eGFR。在一些实施方案中，使用Cockcroft-Gault公式、肾脏疾病饮食改良(Modificationof Diet in Renal Disease，MDRD)公式、CKD-EPI公式、Mayo二次公式和Schwartz公式中的一种或多种来测量eGFR。在一些实施方案中，与基线测量相比，eGFR和/或GFR增加了至少2.5％(例如，5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％)。在一些实施方案中，与基线测量相比，eGFR和/或GFR增加了大于或等于30％。在一些实施方案中，与基线测量相比，eGFR和/或GFR增加了大于或等于40％。
在一些实施方案中，与基线测量相比，eGFR和/或GFR增加了约1mL/min/1.73m2(例如，3、5、7、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100mL/min/1.73m2)。在一些实施方案中，与基线测量相比，eGFR和/或GFR增加了约1mL/min/年(例如，2、3、5、7、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100mL/min/年)。在一些实施方案中，与基线测量相比，eGFR和/或GFR增加了大于或等于1mL/min/年。在一些实施方案中，与基线测量相比，eGFR和/或GFR增加了大于或等于3mL/min/年。
在本公开文本的一些实施方案中，以慢性肾脏疾病(CKD)分期评估受试者的肾脏疾病或病症。在一些实施方案中，受试者患有一期慢性肾脏疾病(CKD)。在一些实施方案中，受试者患有二期慢性肾脏疾病(CKD)。在一些实施方案中，受试者患有三期慢性肾脏疾病(CKD)。在一些实施方案中，受试者患有四期慢性肾脏疾病(CKD)。在一些实施方案中，受试者患有五期慢性肾脏疾病(CKD)。在一些实施方案中，本公开文本的方法降低1期CKD的严重性、发生率和/或持续时间。在一些实施方案中，本公开文本的方法降低2期CKD的严重性、发生率和/或持续时间。在一些实施方案中，本公开文本的方法降低3期CKD的严重性、发生率和/或持续时间。在一些实施方案中，本公开文本的方法降低3a期CKD的严重性、发生率和/或持续时间。在一些实施方案中，本公开文本的方法降低3b期CKD的严重性、发生率和/或持续时间。在一些实施方案中，本公开文本的方法降低4期CKD的严重性、发生率和/或持续时间。在一些实施方案中，本公开文本的方法降低5期CKD的严重性、发生率和/或持续时间。在一些实施方案中，本公开文本的方法防止或延迟患有1期CKD的受试者进展为2期CKD。在一些实施方案中，本公开文本的方法防止或延迟患有2期CKD的受试者进展为3期CKD。在一些实施方案中，本公开文本的方法防止或延迟患有2期CKD的受试者进展为3a期CKD。在一些实施方案中，本公开文本的方法防止或延迟患有3a期CKD的受试者进展为3b期CKD。在一些实施方案中，本公开文本的方法防止或延迟患有3期CKD的受试者进展为4期CKD。在一些实施方案中，本公开文本的方法防止或延迟患有3b期CKD的受试者进展为4期CKD。在一些实施方案中，本公开文本的方法防止或延迟患有4期CKD的受试者进展为5期CKD。在一些实施方案中，本公开文本的方法防止或延迟有需要的受试者的CKD分期进展的恶化。在一些实施方案中，本公开文本的方法将受试者的肾损伤CKD分类改善了一期或多期。
在一些实施方案中，本公开文本的方法减少受试者的肾总体积。在一些实施方案中，与基线测量相比，肾总体积减少了至少2.5％(例如，5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％)。
在一些实施方案中，本公开文本的方法减少受试者的血尿素氮(BUN)。在一些实施方案中，与基线测量相比，BUN减少了至少2.5％(例如，5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％)。
在一些实施方案中，本公开文本的方法降低受试者的尿中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(uNGAL)浓度。在一些实施方案中，与基线测量相比，uNGAL降低了至少2.5％(例如，5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％)。在一些实施方案中，受试者具有<50ng/mL的uNGAL测量值，指示低急性肾损伤风险。在一些实施方案中，受试者具有在约50与约149ng/mL之间的uNGAL测量值，指示模棱两可的急性肾损伤风险。在一些实施方案中，受试者具有在约150与约300ng/mL之间的uNGAL测量值，指示中度急性肾损伤风险。在一些实施方案中，受试者具有>300ng/mL的uNGAL测量值，指示高急性肾损伤风险。在本公开文本的一些实施方案中，所述方法将受试者的uNGAL降低了约0.1与约300.0ng/mL之间(例如，降低了约0.1与约50ng/mL之间、约0.1与约100.0ng/mL之间、约0.1与约150.0ng/mL之间、约0.1与约200.0ng/mL之间、约0.1与约250.0ng/mL之间、约0.1与约300.0ng/mL之间、约0.1与约25ng/mL之间、约25与约50ng/mL之间、约50与约100ng/mL之间、约100与约150ng/mL之间、约150与约200ng/mL之间、约200与约250ng/mL之间、约250与约300ng/mL之间、超过300ng/mL)。
在一些实施方案中，本公开文本的方法防止或延迟肾脏疾病或病症(例如，奥尔波特综合征、局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)、多囊肾病、慢性肾脏疾病)的临床恶化。在一些实施方案中，本公开文本的方法降低了因与肾脏疾病或病症(例如，奥尔波特综合征、局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)、多囊肾病、慢性肾脏疾病)相关的一种或多种并发症住院的风险。
在一些实施方案中，皮下施用本公开文本的单臂ActRIIB异多聚体或单臂ActRIIA异多聚体。在一些实施方案中，每两周施用一次单臂ActRIIB异多聚体或单臂ActRIIA异多聚体。在一些实施方案中，每三周施用一次单臂ActRIIB异多聚体或单臂ActRIIA异多聚体。在一些实施方案中，每四周施用一次单臂ActRIIB异多聚体或单臂ActRIIA异多聚体。
附图说明
图1示出了人ActRIIA(SEQ ID NO:66)和人ActRIIB(SEQ ID NO:2)的细胞外结构域的比对，其中在本文中基于多个ActRIIB和ActRIIA晶体结构的综合分析被推断为直接接触配体的残基用方框表示。
图2示出了不含其细胞内结构域的多种脊椎动物ActRIIB前体蛋白(分别为SEQ IDNO:67、68、69、70、71、72)、不含其细胞内结构域的人ActRIIA前体蛋白(SEQ ID NO:73)以及共有的ActRII前体蛋白(SEQ ID NO:74)的多序列比对。
图3示出了多种脊椎动物ActRIIA蛋白和人ActRIIA(SEQ ID NO:75-82)的多序列比对。
图4示出了使用Clustal 2.1得到的来自人IgG同种型的Fc结构域的多序列比对。铰链区由虚线下划线指示。双下划线指示在IgG1 Fc(SEQ ID NO:22)中工程化以促进不对称链配对的位置和相对于其他同种型IgG2(SEQ ID NO:23)、IgG3(SEQ ID NO:24)和IgG4(SEQ ID NO:26)的相应位置的例子。
图5示出了与ActRIIB同二聚体Fc融合物相比单臂ActRIIB异二聚体Fc融合物的配体结合数据。对于每种蛋白质异多聚体，配体按解离速率(koff或kd)(其是与配体信号传导抑制良好相关的动力学常数)排序，并且以结合亲和力的降序列出(最紧密结合的配体在顶部列出)。在左侧，黄线、红线、绿线和蓝线指示解离速率常数的数量级。特别感兴趣的配体以粗体突出显示，而其他配体以灰色表示，并且黑色实线指示配体与异二聚体的结合与同二聚体相比增强或不变，然而虚线指示与同二聚体相比结合大大减少。如图所示，ActRIIB同二聚体Fc融合物以类似的高亲和力与五种高亲和力配体中的每一种结合，然而单臂ActRIIB异二聚体Fc融合物更容易区分这些配体。因此，单臂ActRIIB异二聚体Fc融合物与激活素B和GDF11强结合，并且以中等强度与GDF8和激活素A结合。与ActRIIB同二聚体Fc融合物进一步形成对比，单臂ActRIIB异二聚体Fc融合物仅显示与BMP10的弱结合并且不结合BMP9。这些数据表明，单臂ActRIIB异二聚体Fc融合物比同二聚体ActRIIB Fc融合物具有更大的配体选择性。
图6示出了与ActRIIA同二聚体Fc融合物相比单臂ActRIIA异二聚体Fc融合物的配体结合数据。格式与图5相同。如图所示，ActRIIA同二聚体Fc融合物展现出与激活素B的优先结合以及与激活素A和GDF11的强结合，然而单臂ActRIIA异二聚体Fc融合物具有相比于激活素B对激活素A的逆优先选择，并且相比于GDF11(弱结合剂)对激活素A的选择性大大增强。这些数据表明，单臂ActRIIA异二聚体Fc融合物比同二聚体ActRIIA Fc融合物具有明显不同的配体选择性。
图7示出了单臂ActRIIB异二聚体Fc融合物(“sa-IIB-hd”)在UUO模型中的治疗效果。十六只小鼠在肾下极的水平进行了两次左侧单侧输尿管结扎，并且3天后，将它们随机分为两组：i)“UUO/PBS”(八只小鼠在手术后第3天、第7天、第10天和第14天皮下注射媒介物对照磷酸盐缓冲盐水(PBS))和ii)“UUO/sa-IIB-hd”(八只小鼠在手术后第3天、第7天、第10天和第14天皮下注射10mg/kg剂量的单臂ActRIIB异二聚体Fc融合物)。“对照(Control)”是未经历单侧输尿管梗阻手术的对侧肾。图7A-图7F示出了纤维化基因标记(分别为纤连蛋白、PAI-I、CTGF、Col-I、Col-III、a-SMA)的基因表达分析，图7G-图7H示出了炎性基因标记(分别为MCP-1、TNFa)的基因表达分析，图7I示出了凝血酶敏感蛋白1(Thbs1)的基因表达分析，图7J示出了肾损伤标记(NGAL)的基因表达分析，并且图K-图N示出了TGFβ配体(分别为Tgfb1、Tgfb2、Tgfb3、激活素A)的基因表达分析。相对于“UUO/PBS”治疗的小鼠，“UUO/sa-IIB-hd”治疗的小鼠表现出显著降低的纤维化和炎性基因表达，减少的TGFβ1/2/3、激活素A和Thbs1上调，以及降低的肾损伤基因表达。对于“对照”与样品“UUO/PBS”之间的比较，统计学显著性(p值)描绘为*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001和****p<0.0001。对于“对照”与样品“UUO/sa-IIB-hd”之间的比较，统计学显著性(p值)描绘为#p<0.05、##p<0.01、###p<0.001和####p<0.0001。对于样品“UUO/PBS”与样品“UUO/sa-IIB-hd”之间的比较，统计学显著性(p值)描绘为@p<0.05、@@p<0.01、@@@p<0.001和@@@@p<0.0001。“B.D.L.”意指测量值低于检测极限，并且对于与“B.D.L”值相比的值，未计算统计学。
图8示出了单臂ActRIIB异二聚体Fc融合蛋白(“sa-IIB-hd”)在Col4a3(-/-)奥尔波特综合征模型中的治疗效果。将十三只Col4a3-/-小鼠随机分为两组：i)“Col4a3媒介物”(七只小鼠皮下注射媒介物对照磷酸盐缓冲盐水(PBS)，每周两次)和ii)“Col4a3 sa-IIB-hd(30mpk)”(六只小鼠以30mg/kg的剂量皮下注射单臂ActRIIB异二聚体Fc融合物，每周两次)。在7.5周时还分析了六只“WT”小鼠(未经治疗的Col4a3+/+小鼠)。相对于Col4a3媒介物小鼠，用单臂ActRIIB异二聚体Fc融合蛋白治疗小鼠(Col4a3 sa-IIB-hd小鼠)将白蛋白尿(描绘为白蛋白-肌酐比率(ACR))显著减少约49.9％(p<0.01)(图8A)，这与Col4a3 sa-IIB-hd小鼠中降低的血尿素氮(BUN)(图8B)相关。统计学显著性(p值)描绘为*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001和****p<0.0001。
图9示出了单臂ActRIIB异二聚体Fc融合蛋白(“sa-IIB-hd”)在Col4a3(-/-)奥尔波特综合征模型中的治疗效果。将五十八只6周龄的Col4a3-/-小鼠用在饮用水中的雷米普利(ACEi，10mg/kg/天)治疗，并且随机分为三组：i)“Col4a3媒介物”(二十七只小鼠皮下注射媒介物对照磷酸盐缓冲盐水(PBS)，每周两次)；ii)“Col4a3 sa-IIB-hd(10mpk)”(十一只小鼠以10mg/kg的剂量皮下注射单臂ActRIIB异二聚体Fc融合蛋白，每周两次)；和iii)“Col4a3 sa-IIB-hd(30mpk)”(二十只小鼠以30mg/kg的剂量皮下注射单臂ActRIIB异二聚体Fc融合蛋白，每周两次)。“WT”小鼠是未经治疗的Col4a3+/+小鼠。相对于Col4a3媒介物小鼠，在ACEi的存在下用10mg/pk和30mg/kg两个剂量的单臂ActRIIB异二聚体Fc融合蛋白治疗小鼠(Col4a3 sa-IIB-hd小鼠)显著减少白蛋白尿(图9A)。此外，在ACEi的存在下，30mg/kg治疗显著降低尿NGAL(例如，uNAGL)水平(图9B)。在ACEi的存在下，“Col4a3媒介物”小鼠的中值存活期为76天(图9C)。统计学显著性(p值)描绘为*：30mpk相对于媒介物p<0.05；***：30mpk相对于媒介物p<0.001；****：30mpk相对于媒介物p<0.0001；##：10mpk相对于媒介物p<0.01；和###：10mpk相对于媒介物p<0.001。
具体实施方式
1.概述
部分地，本公开文本涉及包含ActRIIA的细胞外结构域或ActRIIB的细胞外结构域的单臂异多聚体、制备此类单臂异多聚体的方法及其用途。如本文所述，单臂异多聚体可以包含ActRIIA或ActRIIB的细胞外结构域。在某些优选的实施方案中，本公开文本的异多聚体具有相对于相应的同多聚体复合物改变的与ActRIIA或ActRIIB配体的结合谱(例如，ActRIIB异二聚体Fc融合物与ActRIIB同二聚体Fc融合物相比)。
TGF-β超家族包括30种以上的分泌因子，包括TGF-β、激活素、nodal、骨形态发生蛋白(BMP)、生长和分化因子(GDF)以及抗苗勒管激素(AMH)[Weiss等人(2013)DevelopmentalBiology,2(1):47-63]。在脊椎动物和无脊椎动物中均发现的所述超家族的成员在不同组织中普遍表达并在动物整个一生的发育的最早阶段期间起作用。实际上，TGF-β超家族蛋白是干细胞自我更新、原肠胚形成、分化、器官形态发生和成体组织稳态的关键介质。与这种普遍存在的活性一致，异常的TGF-β超家族信号传导与广泛范围的人体病理学相关，所述人体病理学包括例如自身免疫性疾病、心血管疾病、纤维化疾病和癌症。
TGF-β超家族的配体(例如，与ActRIIA或ActRIIB结合的配体)共有相同的二聚体结构，其中一个单体的中心3-1/2转螺旋组装在由另一个单体的β链形成的凹面上。大多数TGF-β家族成员通过分子间二硫键进一步稳定。这种二硫键穿过由其他两个二硫键形成的环，从而产生所谓的“半胱氨酸结”基序[Lin等人(2006)Reproduction 132:179-190；以及Hinck等人(2012)FEBS Letters 586:1860-1870]。
TGF-β超家族(例如，ActRIIA或ActRIIB)信号传导由I型和II型丝氨酸/苏氨酸激酶受体的异聚体复合物介导，所述激酶受体在配体刺激后磷酸化并激活下游SMAD蛋白(例如，SMAD蛋白1、2、3、5和8)[Massagué(2000)Nat.Rev.Mol.Cell Biol.1:169-178]。这些I型和II型受体是跨膜蛋白，其由具有富半胱氨酸区的配体结合细胞外结构域、跨膜结构域和具有预测的丝氨酸/苏氨酸激酶特异性的细胞质结构域构成。一般而言，I型受体介导细胞内信号传导，而II型受体是结合TGF-β超家族配体所需的。I型和II型受体在配体结合后形成稳定的复合物，从而导致II型受体对I型受体的磷酸化。
TGF-β家族可以根据它们结合的I型受体和它们激活的Smad蛋白而分为两个系统发生分支。一个分支是最近进化的分支，其包括例如TGF-β、激活素、GDF8、GDF9、GDF11、BMP3和nodal，它们通过激活Smad 2和3的I型受体发送信号[Hinck(2012)FEBS Letters 586:1860-1870]。另一个分支包含所述超家族的更远相关的蛋白质，并且包括例如BMP2、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP8b、BMP9、BMP10、GDF1、GDF5、GDF6和GDF7，它们通过Smad 1、5和8发送信号。
激活素是TGF-β超家族的成员，并且最初被发现作为促卵泡激素分泌的调节剂，但随后已经表征了多种生殖和非生殖作用。有三种主要的激活素形式(A、B和AB)，它们是两个密切相关的β亚基的同二聚体/异二聚体(分别为βAβA、βBβB和βAβB)。人类基因组还编码主要在肝脏中表达的激活素C和激活素E，并且含有βC或βE的异二聚体形式也是已知的。在TGF-β超家族中，激活素是独特的多功能因子，其可以刺激在卵巢和胎盘细胞中的激素产生，支持神经元细胞存活，根据细胞类型积极或消极地影响细胞周期进程，并且至少在两栖动物胚胎中诱导中胚层分化[DePaolo等人(1991)Proc Soc Ep Biol Med.198:500-512；Dyson等人(1997)Curr Biol.7:81-84；和Woodruff(1998)Biochem Pharmacol.55:953-963]。在若干个组织中，激活素信号传导被其相关的异二聚体抑制素拮抗。例如，在促卵泡激素(FSH)从垂体分泌的调节中，激活素促进FSH合成和分泌，而抑制素减少FSH合成和分泌。可以调节激活素生物活性和/或与激活素结合的其他蛋白质包括卵泡抑素(FS)、卵泡抑素相关蛋白(FSRP，也称为FLRG或FSTL3)和α2-巨球蛋白。
如本文所述，与“激活素A”结合的药剂是特异性地结合βA亚基的药剂，无论是在分离的βA亚基的背景下还是作为二聚体复合物(例如，βAβA同二聚体或βAβB异二聚体)。在异二聚体复合物(例如，βAβB异二聚体)的情况下，结合“激活素A”的药剂对存在于βA亚基内的表位具有特异性，但是不结合存在于复合物的非βA亚基(例如，复合物的βB亚基)内的表位。类似地，本文所公开的拮抗(抑制)“激活素A”的药剂是抑制如由βA亚基介导的一种或多种活性的药剂，无论是在分离的βA亚基的背景下还是作为二聚体复合物(例如，βAβA同二聚体或βAβB异二聚体)。在βAβB异二聚体的情况下，抑制“激活素A”的药剂是特异性地抑制βA亚基的一种或多种活性而不抑制复合物的非βA亚基(例如，复合物的βB亚基)的活性的药剂。此原理也适用于结合和/或抑制“激活素B”、“激活素C”和“激活素E”的药剂。本文所公开的拮抗“激活素AB”的药剂是抑制如由βA亚基介导的一种或多种活性和如由βB亚基介导的一种或多种活性的药剂。
BMP和GDF一起形成共有TGF-β超家族的特征性折叠的半胱氨酸结细胞因子的家族[Rider等人(2010)Biochem J.,429(1):1-12]。此家族包括例如BMP2、BMP4、BMP6、BMP7、BMP2a、BMP3、BMP3b(也称为GDF10)、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8、BMP8a、BMP8b、BMP9(也称为GDF2)、BMP10、BMP11(也称为GDF11)、BMP12(也称为GDF7)、BMP13(也称为GDF6)、BMP14(也称为GDF5)、BMP15、GDF1、GDF3(也称为VGR2)、GDF8(也称为肌肉生长抑制素)、GDF9、GDF15和生物皮肤生长因子(decapentaplegic)。除了诱导骨形成的能力(这赋予了BMP的名称)之外，BMP/GDF在广泛范围的组织的发育中显示出形态发生活性。BMP/GDF同二聚体和异二聚体与I型和II型受体二聚体的组合相互作用以产生多种可能的信号传导复合物，从而导致两组竞争的SMAD转录因子之一的激活。BMP/GDF具有高度特异性和局限性的功能。这些功能通过许多方式进行调节，包括BMP/GDF表达的发育限制和通过分泌以高亲和力结合细胞因子的几种特异性BMP拮抗剂蛋白。奇怪的是，许多这些拮抗剂类似于TGF-β超家族配体。
生长和分化因子8(GDF8)也称为肌肉生长抑制素。GDF8是骨骼肌质量的负调节剂，并且在正在发育的骨骼肌和成人骨骼肌中高度表达。转基因小鼠中的GDF8无效突变的特征在于骨骼肌的显著的肥大和增生[McPherron等人Nature(1997)387:83-90]。在牛中和引人注目地在人类中的天然发生的GDF8突变中骨骼肌质量的类似增加是明显的[Ashmore等人(1974)Growth,38:501-507；Swatland和Kieffer,J.Anim.Sci.(1994)38:752-757；McPherron和Lee,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1997)94:12457-12461；Kambadur等人GenomeRes.(1997)7:910-915；以及Schuelke等人(2004)N Engl J Med,350:2682-8]。研究还表明，与人类中的HIV感染相关的肌肉消耗伴随着GDF8蛋白表达的增加[Gonzalez-Cadavid等人,PNAS(1998)95:14938-43]。另外，GDF8可以调节肌肉特异性酶(例如，肌酸激酶)的产生并调节成肌细胞增殖[国际专利申请公开号WO 00/43781]。GDF8前肽可以与成熟的GDF8结构域二聚体非共价结合，使其生物活性失活[Miyazono等人(1988)J.Biol.Chem.,263:6407-6415；Wakefield等人(1988)J.Biol.Chem.,263；7646-7654；以及Brown等人(1990)Growth Factors,3:35-43]。与GDF8或结构相关的蛋白质结合并抑制其生物活性的其他蛋白质包括卵泡抑素并且可能包括卵泡抑素相关蛋白[Gamer等人(1999)Dev.Biol.,208:222-232]。
GDF11(也称为BMP11)是在小鼠发育期间在尾芽、肢芽、上颌弓和下颌弓以及背根神经节中表达的分泌蛋白[McPherron等人(1999)Nat.Genet.,22:260-264；以及Nakashima等人(1999)Mech.Dev.,80:185-189]。GDF11在模式化中胚层和神经组织两者中发挥独特的作用[Gamer等人(1999)Dev Biol.,208:222-32]。GDF11被证明是正在发育的小鸡肢体中软骨形成和肌生成的负调节剂[Gamer等人(2001)Dev Biol.,229:407-20]。GDF11在肌肉中的表达也表明其在调节肌肉生长方面的作用类似于GDF8。另外，GDF11在脑中的表达表明GDF11也可以具有与神经系统功能相关的活性。有趣的是，发现GDF11抑制嗅上皮中的神经发生[Wu等人(2003)Neuron.,37:197-207]。因此，GDF11可以在治疗疾病诸如肌肉疾病和神经退行性疾病(例如，肌萎缩侧索硬化)中具有体外和体内应用。
如本文所用，ActRII是指II型激活素受体家族。此家族包括由ACVR2A基因编码的激活素受体IIA型(ActRIIA)和由ACVR2B基因编码的激活素受体IIB型(ActRIIB)两者。ActRII受体是结合多种TGF-β超家族配体的TGF-β超家族II型受体，所述TGF-β超家族配体包括激活素、GDF8(肌肉生长抑制素)、GDF11、以及BMP的子集(尤其是BMP6和BMP7)。ActRII受体与多种生物障碍有关，所述多种生物障碍包括肌肉和神经肌肉障碍(例如，肌营养不良、肌萎缩侧索硬化(ALS)和肌肉萎缩)、不希望的骨/软骨生长、脂肪组织障碍(例如，肥胖症)、代谢障碍(例如，2型糖尿病)和神经退行性障碍。参见例如，Tsuchida等人,(2008)Endocrine Journal 55(1):11-21；Knopf等人,U.S.8,252,900；以及OMIM条款102581和602730。
在某些方面，本公开文本涉及分别包含ActRIIA或ActRIIB的细胞外结构域的单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体(优选地可溶性异多聚体)拮抗由一种或多种ActRIIA或ActRIIB配体(例如，激活素A、激活素B、GDF11、GDF8、GDF3、BMP5、BMP6和BMP10)启动的细胞内信号转导(例如Smad信号传导)的用途。如本文所述，单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体可以用于治疗肾脏疾病或病症(例如，奥尔波特综合征、局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)、多囊肾病、慢性肾脏疾病)。
如本文所证明，单臂ActRIIB异二聚体Fc融合物可有效抑制纤维化和炎性基因的表达，从而抑制TGFβ1/2/3、激活素A和Thbs1的上调并减少肾损伤。在UUO模型中，单臂ActRIIB异二聚体Fc融合物治疗会抑制肾纤维化和炎症并减少肾损伤。此外，计算尿白蛋白与肌酐比率(ACR)以测量白蛋白尿，其在Col4a3-/-小鼠(“Col4a3媒介物”)小鼠中从4周到7.5周显著增加。用单臂ActRIIB异二聚体Fc融合物治疗小鼠将白蛋白尿显著减少了49.9％(p<0.01)，这与Col4a3-/-小鼠(“Col4a3媒介物”)小鼠中的BUN降低相关。无论ACE抑制剂治疗如何，在Col4a3-/-小鼠(“Col4a3媒介物”)中从6周到10周白蛋白尿显著增加。相对于Col4a3媒介物小鼠，在ACEi的存在下用10mg/pk和30mg/kg两个剂量的单臂ActRIIB异二聚体Fc融合蛋白治疗小鼠(Col4a3 sa-IIB-hd小鼠)显著减少白蛋白尿并增加存活期。这些数据证明，在奥尔波特小鼠模型中，单臂ActRIIB异二聚体Fc融合物治疗会减少白蛋白尿并改善肾功能。此外，这些数据表明，其他单臂ActRII异二聚体Fc融合蛋白可能可用于治疗或预防肾脏疾病或病症，包括例如单臂ActRIIA异二聚体Fc融合蛋白。
本说明书中使用的术语在本公开文本的上下文中以及在使用每个术语的特定上下文中通常具有它们在本领域中的普通含义。某些术语在下文或本说明书的其他地方进行讨论，以向从业者提供关于描述本公开文本的组合物和方法以及如何制备和使用它们的其他指导。术语的任何使用的范围或含义将从使用它的特定上下文中变得清楚。
所有语法形式和拼写变体的“同源的”是指具有“共同的进化起源”的两种蛋白质之间的关系，所述蛋白质包括来自相同生物物种中的超家族的蛋白质以及来自不同生物物种的同源蛋白质。此类蛋白质(及其编码核酸)具有如通过其序列相似性所反映的序列同源性，无论是就同一性百分比而言还是根据特定残基或基序和保守位置的存在。然而，在通常的用法中和在本申请中，术语“同源的”在用副词诸如“高度地”修饰时可以是指序列相似性，并且可以涉及或可以不涉及共同的进化起源。
所有语法形式的术语“序列相似性”是指可以共享或可以不共有共同的进化起源的核酸或氨基酸序列之间的同一性或对应的程度。
关于参考多肽(或核苷酸)序列的“序列同一性百分比(％)”被定义为在为了实现最大序列同一性百分比并且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分而比对序列和引入缺口(如果需要)后，候选序列中与参考多肽(核苷酸)序列中的氨基酸残基(或核酸)相同的氨基酸残基(或核酸)的百分比。为了确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以通过本领域技术范围内的多种方式实现，例如使用公开获得的计算机软件诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件来实现。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，出于本文的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生氨基酸(核酸)序列同一性％值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.编写，并且已将源代码与用户文档一起提交到美国版权局(U.S.Copyright Office)(华盛顿特区(Washington D.C.)20559)，并在美国版权局以美国版权注册号TXU510087进行了注册。ALIGN-2程序可以从加利福尼亚州南旧金山市(SouthSan Francisco,Calif.)的Genentech,Inc.公开获得，或者可以从源代码编译。应编译ALIGN-2程序以在UNIX操作系统上使用，该操作系统包括数字UNIX V4.0D。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设置，并且不改变。
所有语法形式的“基本上不与X结合”旨在意味着药剂对“X”具有大于约10-7、10-6、10-5、10-4或更大的KD(例如，通过用于确定KD的测定未检测到结合)。
所有语法形式的“激动”是指激活蛋白质和/或基因(例如，通过激活或扩增该蛋白质的基因表达或通过诱导无活性蛋白质进入活性状态)或提高蛋白质和/或基因的活性的过程。
所有语法形式的“拮抗”是指抑制蛋白质和/或基因(例如，通过抑制或降低该蛋白质的基因表达或通过诱导活性蛋白质进入无活性状态)或降低蛋白质和/或基因活性的过程。
在整个说明书和权利要求中结合数值使用的术语“约”和“大约”表示本领域技术人员熟悉并且可接受的精确度区间。一般而言，这种精确度区间为±10％。可替代地并且特别地，在生物系统中，术语“约”和“大约”可以意指在给定值的一个数量级内(优选地≤5倍且更优选地≤2倍)的值。
本文所公开的数字范围包含限定所述范围的数字。
术语“一个”和“一种”包括复数指代物，除非使用该术语的上下文另有明确规定。术语“一个”(或“一种”)以及术语“一个/一种或多个/多种”和“至少一个/至少一种”在本文中可以互换使用。此外，本文使用的“和/或”被视为两个或更多个指定特征或组分中的每一个在有或没有另一个特征或组分的情况下的特定公开。因此，如在本文中以短语诸如“A和/或B”使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样地，如以短语诸如“A、B和/或C”使用的术语“和/或”旨在涵盖以下方面中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。
在整个本说明书中，词语“包含(comprise)”及其变体诸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”将被理解为暗示包括所述整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组。
2.包含ActRIIA或ActRIIB多肽的单臂异多聚体
在某些方面，本公开文本涉及分别包含ActRIIA或ActRIIB多肽的单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体。在某些实施方案中，本文所公开的多肽可以形成蛋白质复合物(例如，异多聚体)，其包含与第二多肽共价或非共价缔合的第一多肽，其中所述第一多肽包含ActRIIA或ActRIIB多肽的氨基酸序列和相互作用对的第一成员的氨基酸序列；并且所述第二多肽包含所述相互作用对的第二成员的氨基酸序列，并且其中所述第二多肽不包含ActRIIA或ActRIIB多肽。相互作用对可以是相互作用以形成复合物(特别是异二聚体复合物)的任何两个多肽序列，但是可操作的实施方案也可以使用形成同二聚体序列的相互作用对。如本文所述，相互作用对的一个成员可以融合至ActRIIA或ActRIIB多肽，诸如包含与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、9、10、11、46、48、55、57、58、59、60、61、84、86、88、89、90和91中任一个的序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。优选地，部分地选择相互作用对以赋予改善的血清半衰期，或充当衔接子，在所述衔接子上附接另一部分(诸如聚乙二醇部分)以提供相对于ActRIIA或ActRIIB多肽的单体形式改善的血清半衰期。
如本文所示，ActRIIA或ActRIIB的单体(单臂)形式与其相应的同二聚体形式相比可以展现出实质改变的配体结合选择性，但单体形式往往具有短的血清停留时间(半衰期)，这在治疗设置中是不希望的。改善血清半衰期的常见机制是将多肽作为具有IgG恒定结构域部分(例如Fc部分)的同二聚体融合蛋白表达。然而，作为同二聚体蛋白(例如，在Fc融合构建体中)表达的ActRIIA或ActRIIB多肽可能不展现出与单体形式相同的活性谱。如本文所证明，所述问题可以通过将单体形式融合至半衰期延长部分来解决，并且令人惊讶的是，这可以通过以下方式容易地实现：将此类蛋白质作为不对称异二聚体融合蛋白(其中相互作用对的一个成员与ActRIIA或ActRIIB多肽融合，而相互关系对的另一个成员不与部分融合或与异源部分融合)表达，从而导致新的配体结合谱并且通过相互作用对赋予血清半衰期的改善。
在某些方面，本公开文本涉及包含ActRIIA或ActRIIB多肽(例如，包含SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、9、10、11、46、48、55、57、58、59、60、61、84、86、88、89、90和91中任一个的氨基酸序列的多肽)的单臂异多聚体，其在本文中通常被称为“本公开文本的单臂异多聚体”或“单臂ActRIIA异多聚体”或“单臂ActRIIB异多聚体”。优选地，本公开文本的单臂异多聚体是可溶的，例如，单臂异多聚体包含至少一种ActRIIA或ActRIIB多肽的可溶性部分。通常，ActRIIA或ActRIIB的细胞外结构域对应于ActRIIA或ActRIIB多肽的可溶性部分。因此，在一些实施方案中，本公开文本的单臂异多聚体包含ActRIIA或ActRIIB多肽的细胞外结构域。本文公开了ActRIIA和ActRIIB的示例性细胞外结构域，并且可以根据本公开文本的发明(例如，单臂异多聚体组合物及其用途)使用此类序列以及其片段、功能变体和修饰形式。在一些实施方案中，可以任选地提供除去C末端赖氨酸(K)的ActRIIA或ActRIIB细胞外结构域氨基酸序列(例如，分别为SEQ ID NO:88和89、或者84、86和91)。
被称为三指毒素折叠的定义结构基序对于通过ActRIIA或ActRIIB的配体结合而言是重要的，并且由位于每个单体受体的细胞外结构域内的不同位置处的10个、12个或14个保守的半胱氨酸残基形成。参见例如Greenwald等人(1999)Nat Struct Biol 6:18-22；Hinck(2012)FEBS Lett 586:1860-1870。本文所述的任何异聚体复合物都可以包含ActRIIA或ActRIIB的此类结构域。如由这些保守半胱氨酸的最外侧划分的ActRIIA或ActRIIB的核心配体结合结构域对应于SEQ ID NO:1(ActRIIB前体)的位置29-109和SEQ IDNO:9(ActRIIA前体)的位置30-110。这些半胱氨酸划分的核心序列侧翼的结构上不太有序的氨基酸可以在任一末端被截短1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个或37个残基，而不必改变配体结合。N末端和/或C末端截短的示例性细胞外结构域包括SEQ ID NO:2、3、5、6、10、11和83。
在其他优选的实施方案中，本公开文本的单臂异多聚体结合并抑制(拮抗)一种或多种ActRIIA或ActRIIB配体的活性，所述一种或多种ActRIIA或ActRIIB配体包括但不限于激活素A、激活素B、GDF11、GDF8、GDF3、BMP5、BMP6和BMP10。具体地，本公开文本的单臂异多聚体可以用于拮抗由一种或多种TGFβ超家族配体(例如，ActRIIA或ActRIIB配体)启动的细胞内信号转导(例如，Smad信号传导)。如本文所述，此类拮抗剂异多聚体可以用于治疗或预防多种TGF-β相关的病症，包括但不限于受TGF-β超家族的一种或多种配体(例如，ActRIIA或ActRIIB配体)影响的肾脏疾病或病症(例如，奥尔波特综合征、局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)、多囊肾病、慢性肾脏疾病)。在一些实施方案中，本公开文本的单臂异多聚体与其相应的同多聚体相比(例如，单臂ActRIIB异二聚体Fc融合物与相应的单臂ActRIIB同二聚体Fc融合物相比)具有不同的配体结合谱。如本文所述，本公开文本的单臂异多聚体包括例如异二聚体、异三聚体、异四聚体和基于单臂单一复合物的另外的寡聚体结构。在某些优选的实施方案中，本公开文本的单臂异多聚体是异二聚体。
如本文所用，术语“ActRIIB”是指来自任何物种的激活素受体IIB型(ActRIIB)蛋白质家族以及通过诱变或其他修饰衍生自此类ActRIIB蛋白的变体。本文中对ActRIIB的提及应理解为对任何一种当前鉴定的形式的提及。ActRIIB家族的成员通常是跨膜蛋白，其由包含富半胱氨酸区的配体结合细胞外结构域、跨膜结构域和具有预测的丝氨酸/苏氨酸激酶活性的细胞质结构域构成。
术语“ActRIIB多肽”包括如下多肽，所述多肽包含ActRIIB家族成员的任何天然存在的多肽以及其保留有用活性的任何变体(包括突变体、片段、融合物和肽模拟物形式)。在整个本公开文本中以及国际专利申请公开号WO 2006/012627和WO 2008/097541中提供了此类变体ActRIIB多肽的例子，将所述专利申请通过引用以其整体并入本文。本文所述的所有ActRIIB相关多肽的氨基酸的编号均基于下文提供的人ActRIIB前体蛋白序列(SEQ IDNO:1)的编号，除非另外特别指出。
人ActRIIB前体蛋白序列如下：
Figure BDA0003929492720000141
信号肽用单下划线指示；细胞外结构域用粗体字指示；并且潜在的内源性N-连接糖基化位点用双下划线指示。
加工的细胞外ActRIIB多肽序列如下：
GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT(SEQ ID NO:2).
在一些实施方案中，可以产生在N末端具有“SGR……”序列的蛋白质。细胞外结构域的C末端“尾部”由单下划线指示。缺失“尾部”的序列(Δ15序列)如下：
GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEA(SEQ ID NO:3).
在文献中还报道了在SEQ ID NO:1的位置64处具有丙氨酸(A64)的ActRIIB形式。参见例如Hilden等人(1994)Blood,83(8):2163-2170。申请人已经确定包含具有A64取代的ActRIIB的细胞外结构域的ActRIIB-Fc融合蛋白对激活素和GDF11具有相对较低的亲和力。相比之下，在位置64处具有精氨酸(R64)的相同ActRIIB-Fc融合蛋白对激活素和GDF11具有在低纳摩尔至高皮摩尔范围内的亲和力。因此，具有R64的序列用作本公开文本中人ActRIIB的“野生型”参考序列。
在位置64处具有丙氨酸的ActRIIB形式如下：
Figure BDA0003929492720000142
Figure BDA0003929492720000151
信号肽由单下划线指示，并且细胞外结构域由粗体字指示。
替代A64形式的经加工的细胞外ActRIIB多肽序列如下：
GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWANSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT(SEQ ID NO:5)
在一些实施方案中，可以产生在N末端具有“SGR……”序列的蛋白质。细胞外结构域的C末端“尾部”由单下划线指示。缺失“尾部”的序列(Δ15序列)如下：GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWANSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEA(SEQ ID NO:6)
编码人ActRIIB前体蛋白的核酸序列如下所示(SEQ ID NO:7)，包含Genbank参考序列NM_001106.3的核苷酸25-1560，其编码ActRIIB前体的氨基酸1-513。所示的序列提供了位置64处的精氨酸，并且可以被修饰为替代地提供丙氨酸。信号序列加下划线。
Figure BDA0003929492720000152
编码经加工的细胞外人ActRIIB多肽的核酸序列如下(SEQ ID NO:8)。所示的序列提供了位置64处的精氨酸，并且可以被修饰为替代地提供丙氨酸。
Figure BDA0003929492720000153
Figure BDA0003929492720000161
图1展示了人ActRIIB可溶性细胞外结构域和人ActRIIA可溶性细胞外结构域的氨基酸序列的比对。此比对指示了两种受体内被认为直接接触ActRII配体的氨基酸残基。图2描绘了多种脊椎动物ActRIIB蛋白和人ActRIIA的多序列比对。根据这些比对，可以预测配体结合结构域内对于正常的ActRII配体结合活性重要的关键氨基酸位置，并且预测可能容忍取代而不显著改变正常的ActRII配体结合活性的氨基酸位置。ActRII蛋白在结构和功能特征方面(特别是关于配体结合)已经在本领域进行了表征。参见例如Attisano等人(1992)Cell 68(1):97-108；Greenwald等人(1999)Nature Structural Biology 6(1):18-22；Allendorph等人(2006)PNAS 103(20:7643-7648；Thompson等人(2003)The EMBO Journal22(7):1555-1566；以及美国专利号：7,709,605、7,612,041和7,842,663。
例如，Attisano等人表明ActRIIB的细胞外结构域C末端的脯氨酸结的缺失降低了受体对激活素的亲和力。含有本发明SEQ ID NO:1的氨基酸20-119的ActRIIB-Fc融合蛋白“ActRIIB(20-119)-Fc”相对于ActRIIB(20-134)-Fc具有降低的与GDF11和激活素的结合，所述ActRIIB(20-134)-Fc包括脯氨酸结区域和完整的近膜结构域(参见例如，美国专利号7,842,663)。然而，即使脯氨酸结区域被破坏，ActRIIB(20-129)-Fc蛋白相对于野生型仍保留类似但略微降低的活性。因此，在氨基酸134、133、132、131、130和129(关于SEQ ID NO:1)处终止的ActRIIB细胞外结构域预期全部都具有活性，但在134或133处终止的构建体可能是最具活性的。类似地，预期在残基129-134(关于SEQ ID NO:1)中任一个处的突变不会大幅改变配体结合亲和力。支持这一点的是，本领域中已知P129和P130(关于SEQ ID NO:1)的突变基本上不降低配体结合。因此，本公开文本的ActRIIB多肽可以提早在氨基酸109(最终半胱氨酸)处结束，然而，预期在109和119处或在109与119之间(例如，109、110、111、112、113、114、115、116、117、118或119)结束的形式具有降低的配体结合。氨基酸119(关于本发明SEQ ID NO:1)较不保守，并且因此容易改变或截短。在128(关于SEQ ID NO:1)处或稍后结束的ActRIIB多肽和基于ActRIIB的GDF捕获物(GDF traps)应保留配体结合活性。关于SEQ ID NO:1在119和127处或在119与127之间(例如，119、120、121、122、123、124、125、126或127)结束的ActRIIB多肽和基于ActRIIB的GDF捕获物将具有中等结合活性。根据临床或实验设置，可能需要使用这些形式中的任何一种。
在ActRIIB的N末端，预期开始于氨基酸29或之前(关于SEQ ID NO:1)的蛋白质将保留配体结合活性。氨基酸29代表初始半胱氨酸。在位置24(关于SEQ ID NO:1)处的丙氨酸至天冬酰胺突变引入N-连接糖基化序列，而不会实质上影响配体结合。参见例如美国专利号7,842,663。这证实了信号切割肽与半胱氨酸交联区之间的区域(对应于氨基酸20-29)的突变具有良好的容忍度。具体地，开始于位置20、21、22、23和24(关于SEQ ID NO:1)的ActRIIB多肽和基于ActRIIB的GDF捕获物应保留一般配体结合活性，并且开始于位置25、26、27、28和29(关于SEQ ID NO:1)的ActRIIB多肽和基于ActRIIB的GDF捕获物也预期保留配体结合活性。在例如美国专利号7,842,663中所示的数据证明，令人惊讶地，开始于22、23、24或25的ActRIIB构建体将具有最多的活性。
总之，ActRIIB的活性部分(例如，配体结合部分)包含SEQ ID NO:1的氨基酸29-109。因此，本公开文本的ActRIIB多肽可以例如包含与在与SEQ ID NO:1的氨基酸20-29对应的残基处开始(例如，开始于氨基酸20、21、22、23、24、25、26、27、28或29)并且在与SEQ IDNO:1的氨基酸109-134对应的位置处结束(例如，结束于氨基酸109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134)的ActRIIB部分至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。其他例子包括开始于SEQ ID NO:1的位置20-29(例如，位置20、21、22、23、24、25、26、27、28或29)或21-29(例如，位置21、22、23、24、25、26、27、28或29)并且结束于位置119-134(例如，119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134)、119-133(例如，119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132或133)、129-134(例如，129、130、131、132、133或134)或129-133(例如，129、130、131、132或133)的多肽。其他例子包括开始于SEQ ID NO:1的位置20-24(例如，20、21、22、23或24)、21-24(例如，21、22、23或24)或22-25(例如，22、22、23或25)并且结束于位置109-134(例如，109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134)、119-134(例如，119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134)或129-134(例如，129、130、131、132、133或134)的构建体。还考虑了这些范围内的变体，特别是与SEQ ID NO:1的相应部分具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的那些变体。
本公开文本包括复合ActRIIB结构的分析结果，如图2所示，从而证明配体结合口袋部分地由残基Y31、N33、N35、L38至T41、E47、E50、Q53至K55、L57、H58、Y60、S62、K74、W78至N83、Y85、R87、A92以及E94至F101定义。此外，ActRIIB在几乎所有脊椎动物中都具有良好的保守性，其中大段的细胞外结构域完全保守。因此，来自多种脊椎动物生物体的ActRIIB序列的比较提供了对可以改变的残基的见解。例如，R40在爪蟾(Xenopus)中是K，表明这个位置处的碱性氨基酸将是容忍的。L46在爪蟾ActRIIB中是缬氨酸，因此这个位置可以被改变，并且可以任选地改变为另一种疏水性残基(诸如V、I或F)或者非极性残基(诸如A)。E52在爪蟾中是K，表明这个位点可能容忍各种变化，包括极性残基诸如E、D、K、R、H、S、T、P、G、Y和可能A。Q53在牛ActRIIB中是R并且在爪蟾ActRIIB中是K，因此在这个位置将容忍包括R、K、Q、N和H在内的氨基酸。T93在爪蟾中是K，表明在这个位置可以容忍广泛的结构变化，其中极性残基是有利的，诸如S、K、R、E、D、H、G、P、G和Y。F108在爪蟾中是Y，因此Y或其他疏水性基团(诸如I、V或L)应该被容忍。E111在爪蟾中是K，表明在这个位置将容忍带电荷的残基(包括D、R、K和H)以及Q和N。R112在爪蟾中是K，表明在这个位置容忍碱性残基，包括R和H。在位置119处的A相对较不保守，并且在啮齿类动物中作为P出现且在爪蟾中作为V出现，因此在这个位置应该容忍基本上任何氨基酸。本文所述的变异能以各种方式组合。此外，本领域中所描述的诱变程序的结果还证实ActRIIB中存在通常有利于保存的氨基酸位置。关于SEQ IDNO:1，这些位置包括位置64(碱性氨基酸)、位置80(酸性或疏水性氨基酸)、位置78(疏水性氨基酸，以及特别是色氨酸)、位置37(酸性氨基酸，以及特别是天冬氨酸或谷氨酸)、位置56(碱性氨基酸)、位置60(疏水性氨基酸，特别是苯丙氨酸或酪氨酸)。因此，在本文所公开的ActRIIB多肽中，本公开文本提供了可能保守的氨基酸的框架。可能希望保守的其他位置如下：位置52(酸性氨基酸)、位置55(碱性氨基酸)、位置81(酸性氨基酸)、98(极性或带电荷的氨基酸，特别是E、D、R或K)，所有这些位置都是关于SEQ ID NO:1。
因此，本公开文本的ActRIIB多肽的通式是包含如下氨基酸序列的通式，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸29-109至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，任选地开始于在20-24(例如，20、21、22、23或24)或22-25(例如，22、23、24或25)范围内的位置并且结束于在129-134(例如，129、130、131、132、133或134)范围内的位置，并且包含在配体结合口袋中的不超过1个、2个、5个、10个或15个保守氨基酸变化以及在配体结合口袋中的位置40、53、55、74、79和/或82处的零个、一个或多个非保守改变。可变性可以被特别良好容忍的在结合口袋外部的位点包括细胞外结构域(如上所述)的氨基和羧基末端以及位置42-46和65-73(关于SEQ ID NO:1)。位置65处的天冬酰胺至丙氨酸改变(N65A)实际上改善A64背景下的配体结合，并且因此预期对R64背景下的配体结合没有不利影响。参见例如美国专利号7,842,663。这种变化可能消除A64背景中的N65处的糖基化，因此证明这个区域中的显著变化可能被容忍。虽然R64A变化不太被容忍，但R64K被良好容忍，因此在位置64处可以容忍另一种碱性残基，诸如H。参见例如美国专利号7,842,663。
在某些实施方案中，本公开文本涉及包含至少一种ActRIIB多肽的单臂异多聚体，所述ActRIIB多肽包括其片段、功能变体和修饰形式。优选地，根据本公开文本的发明(例如，包含ActRIIB多肽的单臂异多聚体及其用途)使用的ActRIIB多肽是可溶性的(例如，ActRIIB的细胞外结构域)。在其他优选的实施方案中，根据本公开文本的发明使用的ActRIIB多肽结合和/或抑制(拮抗)一种或多种TGF-β超家族配体的活性(例如，诱导Smad信号传导)。在一些实施方案中，本公开文本的单臂异多聚体包含至少一种ActRIIB多肽，所述至少一种ActRIIB多肽包含如下氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成，所述氨基酸序列与开始于与SEQ ID NO:1的氨基酸20-29对应的残基(例如，开始于氨基酸20、21、22、23、24、25、26、27、28或29)并且结束于与SEQ ID NO:1的氨基酸109-134对应的位置(例如，结束于氨基酸109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134)的ActRIIB部分至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开文本的单臂异多聚体包含至少一种ActRIIB多肽，所述至少一种ActRIIB多肽包含如下氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成，所述氨基酸序列与开始于与SEQ ID NO:1的氨基酸20-29对应的残基(例如，开始于氨基酸20、21、22、23、24、25、26、27、28或29)并且结束于在与SEQ ID NO:1的氨基酸109-134对应的位置(例如，结束于氨基酸109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134)的ActRIIB部分至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，其中与SEQ ID NO:1的L79对应的位置是酸性氨基酸(即，D或E氨基酸残基)。在某些优选的实施方案中，本公开文本的单臂异多聚体包含至少一种ActRIIB多肽，所述至少一种ActRIIB多肽包含如下氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸29-109至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在其他优选的实施方案中，本公开文本的单臂异多聚体包含至少一种ActRIIB多肽，所述至少一种ActRIIB多肽包含如下氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸29-109至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，其中与SEQ ID NO:1的L79对应的位置是酸性氨基酸(即，D或E氨基酸残基)。在其他优选的实施方案中，本公开文本的单臂异多聚体包含至少一种ActRIIB多肽，所述至少一种ActRIIB多肽包含如下氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸29-109至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，其中与SEQ ID NO:1的L79对应的位置不是酸性氨基酸(即，D或E氨基酸残基)。在一些实施方案中，本公开文本的单臂异多聚体包含至少一种ActRIIB多肽，所述至少一种ActRIIB多肽与SEQID NO:1、2、3、4、5、6、46、48、60、61、84、86、90或91中任一个的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一些实施方案中，本公开文本的单臂异多聚体包含至少一种ActRIIB多肽，所述至少一种ActRIIB多肽与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、46、48、60、61、84、86、90或91中任一个的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，其中与SEQ ID NO:1的L79对应的位置是酸性氨基酸(即，D或E氨基酸残基)。在一些实施方案中，本公开文本的单臂异多聚体包含至少一种ActRIIB多肽，所述至少一种ActRIIB多肽与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、46、48、60、61、84、86、90或91中任一个的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，其中与SEQ ID NO:1的L79对应的位置不是酸性氨基酸(即，D或E氨基酸残基)。在一些实施方案中，本公开文本的单臂异多聚体包含至少一种ActRIIB多肽、由其组成或基本上由其组成，所述至少一种ActRIIB多肽与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、46、48、60、61、84、86、90或91中任一个的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开文本的单臂异多聚体包含至少一种ActRIIB多肽、由其组成或基本上由其组成，所述至少一种ActRIIB多肽与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、46、48、60、61、84、86、90或91中任一个的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，其中与SEQID NO:1的L79对应的位置是酸性氨基酸(即，D或E氨基酸残基)。在一些实施方案中，本公开文本的单臂异多聚体包含至少一种ActRIIB多肽、由其组成或基本上由其组成，所述至少一种ActRIIB多肽与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、46、48、60、61、84、86、90或91中任一个的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，其中与SEQ ID NO:1的L79对应的位置不是酸性氨基酸(即，D或E氨基酸残基)。
在一些实施方案中，本公开文本的单臂异多聚体包含至少一种ActRIIB多肽、由其组成或基本上由其组成，所述至少一种ActRIIB多肽与SEQ ID NO:83的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，其中与L79对应的位置是天冬氨酸(D)。下面示出了不含前导序列、hFc结构域和接头的截短的GDF捕获物ActRIIB(L79D 25-131)的氨基酸序列(SEQ ID NO:83)。在天然序列中的位置79处取代的天冬氨酸加下划线并以粗体显示，通过测序揭示是成熟融合蛋白中的N末端残基的谷氨酸也如此。
Figure BDA0003929492720000191
在某些实施方案中，本公开文本涉及包含ActRIIA多肽的蛋白质复合物。如本文所用，术语“ActRIIA”是指来自任何物种的激活素受体IIA型(ActRIIA)蛋白质家族和通过诱变或其他修饰衍生自此类ActRIIA蛋白的变体。本文中对ActRIIA的提及应理解为对任何一种当前鉴定的形式的提及。ActRIIA家族的成员通常是跨膜蛋白，其由包含富半胱氨酸区的配体结合细胞外结构域、跨膜结构域和具有预测的丝氨酸/苏氨酸激酶活性的细胞质结构域构成。
术语“ActRIIA多肽”包括如下多肽，所述多肽包含ActRIIA家族成员的任何天然存在的多肽以及其保留有用活性的任何变体(包括突变体、片段、融合物和肽模拟物形式)。在整个本公开文本以及国际专利申请公开文本号WO 2006/012627中提供了此类变体ActRIIA多肽的例子，将所述专利申请通过引用以其整体并入本文。本文所述的所有ActRIIA相关多肽的氨基酸的编号均基于下文提供的人ActRIIA前体蛋白序列(SEQ ID NO:9)的编号，除非另外特别指出。
人ActRIIA前体蛋白序列如下：
Figure BDA0003929492720000192
Figure BDA0003929492720000201
信号肽由单下划线指示；细胞外结构域以粗体字指示；并且潜在的内源N-连接糖基化位点由
Figure BDA0003929492720000202
指示。
加工的细胞外人ActRIIA多肽序列如下：
ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTSNPVTPKPP(SEQ ID NO:10)
细胞外结构域的C末端“尾部”由单下划线指示。缺失“尾部”的序列(Δ15序列)如下：
ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEM(SEQ ID NO:11)
编码人ActRIIA前体蛋白的核酸序列如下所示(SEQ ID NO:12)，对应于Genbank参考序列NM_001616.4的核苷酸159-1700。信号序列加下划线。
Figure BDA0003929492720000203
编码经加工的细胞外ActRIIA多肽的核酸序列如下：
Figure BDA0003929492720000211
因此，ActRIIA的活性部分(例如，配体结合部分)的通式是包含SEQ ID NO:9的氨基酸30-110、基本上由其组成或由其组成的多肽。因此，ActRIIA多肽可以例如包含如下氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成，所述氨基酸序列与在与SEQ ID NO:9的氨基酸21-30中任一个对应的残基处开始(例如，开始于氨基酸21、22、23、24、25、26、27、28、29或30中的任一个)并且在与SEQ ID NO:9的氨基酸110-135中任一个对应的位置处结束(例如，结束于氨基酸110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134或135中的任一个)的ActRIIA部分至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。其他例子包括如下构建体，所述构建体开始于选自SEQ ID NO:9的21-30的位置(例如，开始于氨基酸21、22、23、24、25、26、27、28、29或30中的任一个)、开始于选自22-30的位置(例如，开始于氨基酸22、23、24、25、26、27、28、29或30中的任一个)、开始于选自23-30的位置(例如，开始于氨基酸23、24、25、26、27、28、29或30中的任一个)、开始于选自24-30的位置(例如，开始于氨基酸24、25、26、27、28、29或30中的任一个)，并且结束于选自SEQ ID NO:9的111-135的位置(例如，结束于氨基酸111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134或135中的任一个)、结束于选自112-135的位置(例如，结束于氨基酸112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134或135中的任一个)、结束于选自113-135的位置(例如，结束于氨基酸113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134或135中的任一个)、结束于选自120-135的位置(例如，结束于氨基酸120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134或135中的任一个)、结束于选自130-135的位置(例如，结束于氨基酸130、131、132、133、134或135中的任一个)、结束于选自111-134的位置(例如，结束于氨基酸110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134中的任一个)、结束于选自111-133的位置(例如，结束于氨基酸110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132或133中的任一个)、结束于选自111-132的位置(例如，结束于氨基酸110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131或132中的任一个)或结束于选自111-131的位置(例如，结束于氨基酸110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130或131中的任一个)。还考虑了这些范围内的变体，特别是包含与SEQ ID NO:9的相应部分具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的那些变体。因此，在一些实施方案中，ActRIIA多肽可以包含与SEQ ID NO:9的氨基酸30-110至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽、基本上由其组成或由其组成。任选地，ActRIIA多肽包含如下多肽，所述多肽与SEQ ID NO:9的氨基酸30-110至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同并且在配体结合口袋中包含不超过1个、2个、5个、10个或15个保守氨基酸变化。
ActRIIA在脊椎动物中具有良好的保守性，其中大段的细胞外结构域完全保守。例如，图3描绘了人ActRIIA细胞外结构域与多种ActRIIA直系同源物相比的多序列比对。许多结合ActRIIA的配体也是高度保守的。因此，根据这些比对，可以预测配体结合结构域内对于正常的ActRIIA-配体结合活性重要的关键氨基酸位置，并且可以预测可能容忍取代而不显著改变正常的ActRIIA-配体结合活性的氨基酸位置。因此，根据本发明公开的方法有用的活性人ActRIIA变体多肽可以包括在来自另一种脊椎动物ActRIIA的序列的相应位置处的一个或多个氨基酸，或者可以包括与人或其他脊椎动物序列中的残基类似的残基。
不意图进行限制，以下例子展示了定义活性ActRIIA变体的这种方法。如图3中所展示，人细胞外结构域中的F13在绵羊(Ovis aries)(SEQ ID NO:76)、原鸡(Gallusgallus)(SEQ ID NO:79)、牛(Bos Taurus)(SEQ ID NO:80)、仓鸮(Tyto alba)(SEQ ID NO:81)和大卫鼠耳蝠(Myotis davidii)(SEQ ID NO:82)ActRIIA中是Y，表明在这个位置容忍芳香族残基，包括F、W和Y。人细胞外结构域中的Q24在牛ActRIIA中是R，表明在这个位置将容忍带电荷的残基，包括D、R、K、H和E。人细胞外结构域中的S95在原鸡和仓鸮ActRIIA中是F，表明这个位点可以容忍各种变化，包括极性残基(诸如E、D、K、R、H、S、T、P、G、Y)和可能疏水性残基(诸如L、I或F)。人细胞外结构域中的E52在绵羊ActRIIA中是D，表明在这个位置容忍酸性残基，包括D和E。人细胞外结构域中的P29相对不太保守，在绵羊ActRIIA中作为S出现且在大卫鼠耳蝠ActRIIA中作为L出现，因此在这个位置应该容忍基本上任何氨基酸。
在某些实施方案中，本公开文本涉及包含至少一种ActRIIA多肽的单臂异多聚体，所述ActRIIB多肽包括其片段、功能变体和修饰形式。优选地，根据本公开文本的发明(例如，包含ActRIIA多肽的单臂异多聚体及其用途)使用的ActRIIA多肽是可溶性的(例如，ActRIIA的细胞外结构域)。在其他优选的实施方案中，根据本公开文本的发明使用的ActRIIA多肽结合和/或抑制(拮抗)一种或多种TGF-β超家族配体的活性(例如，诱导Smad信号传导)。在一些实施方案中，本公开文本的单臂异多聚体包含至少一种ActRIIA多肽，所述至少一种ActRIIA多肽与SEQ ID NO:9、10、11、55、57、58、59、88或89中任一个的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一些实施方案中，本公开文本的单臂异多聚体包含至少一种ActRIIA多肽、由其组成或基本上由其组成，所述至少一种ActRIIA多肽与SEQ ID NO:9、10、11.55、57、58、59、88或89中任一个的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％或99％相同。
在一些实施方案中，本公开文本考虑了出于诸如增强治疗功效或稳定性(例如，保质期和/或对体内蛋白水解降解的抗性)等目的，通过修饰ActRIIA或ActRIIB多肽的结构来制备功能变体。变体可以通过氨基酸取代、缺失、添加或其组合来产生。例如，可以合理地预期用异亮氨酸或缬氨酸单独地置换亮氨酸、用谷氨酸单独地置换天冬氨酸、用丝氨酸单独地置换苏氨酸或用结构上相关的氨基酸类似地置换氨基酸(例如，保守突变)将不会对所得分子的生物活性产生重要影响。保守置换是在它们的侧链中相关的氨基酸的家族内发生的那些。可以通过评估变体多肽在细胞中以类似于野生型多肽的方式产生反应或者结合一种或多种ActRIIA或ActRIIB配体(包括例如激活素A、激活素B、GDF11、GDF8、GDF3、BMP5、BMP6和BMP10)的能力来容易地确定本公开文本的多肽的氨基酸序列变化是否产生功能同系物。
在某些实施方案中，本公开文本考虑了本公开文本的ActRIIA或ActRIIB多肽的特定突变以改变所述多肽的糖基化。可以选择此类突变以引入或消除一个或多个糖基化位点，诸如O-连接或N-连接的糖基化位点。天冬酰胺连接的糖基化识别位点通常包含三肽序列天冬酰胺-X-苏氨酸或天冬酰胺-X-丝氨酸(其中“X”是任何氨基酸)，所述三肽序列由适当的细胞糖基化酶特异性地识别。也可以通过向多肽序列添加一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基或用其取代(对于O-连接糖基化位点)来进行改变。糖基化识别位点的第一或第三氨基酸位置中的一个或两个处的多种氨基酸取代或缺失(和/或第二位置处的氨基酸缺失)导致经修饰的三肽序列处的非糖基化。增加多肽上碳水化合物部分的数目的另一种手段是通过将糖苷与多肽进行化学或酶促偶联。根据所用的偶联模式，可以将一种或多种糖附接至(a)精氨酸和组氨酸；(b)游离羧基基团；(c)游离巯基基团诸如半胱氨酸的那些；(d)游离羟基基团诸如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的那些；(e)芳香族残基诸如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的那些；或(f)谷氨酰胺的酰胺基团。除去多肽上存在的一个或多个碳水化合物部分可以化学地和/或酶促地完成。化学去糖基化可以涉及例如将多肽暴露于化合物三氟甲磺酸或等效化合物。这种处理导致除了连接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)之外的大多数或所有糖的切割，同时保持氨基酸序列完整。如Thotakura等人[Meth.Enzymol.(1987)138:350]所描述，可以通过使用多种内切和外切糖苷酶实现多肽上碳水化合物部分的酶促切割。适当时，根据所用表达系统的类型可以调节多肽的序列，因为哺乳动物、酵母、昆虫和植物细胞全部都可以引入可以受肽的氨基酸序列影响的不同糖基化模式。一般而言，用于人的本公开文本的单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体可以在提供适当糖基化的哺乳动物细胞系(诸如HEK293或CHO细胞系)中表达，但预期其他哺乳动物表达细胞系也是可用的。
在某些实施方案中，本公开文本考虑了本公开文本的ActRIIA或ActRIIB多肽的特定突变。在一些实施方案中，可以修饰本公开文本的多肽的一个或多个氨基酸残基。在一些实施方案中，修饰是糖基化氨基酸。在一些实施方案中，修饰是PEG化氨基酸。在一些实施方案中，修饰是法尼基化氨基酸。在一些实施方案中，修饰是乙酰化氨基酸。在一些实施方案中，修饰是生物素化氨基酸。在一些实施方案中，修饰是与脂质部分缀合的氨基酸。在一些实施方案中，修饰是与有机衍生剂缀合的氨基酸。在一些实施方案中，本公开文本的第一多肽和/或第二多肽包含选自以下的一个或多个氨基酸修饰：糖基化氨基酸、PEG化氨基酸、法尼基化氨基酸、乙酰化氨基酸、生物素化氨基酸、与脂质部分缀合的氨基酸和与有机衍生剂缀合的氨基酸。在一些实施方案中，第一多肽和/或第二多肽是糖基化的，并且具有可从所述第一多肽和/或第二多肽在CHO细胞中的表达获得的糖基化模式。
本公开文本进一步考虑了产生突变体(特别是一组本公开文本的ActRIIA或ActRIIB多肽的组合突变体以及截短突变体)的方法。组合突变体库对于鉴定ActRIIA或ActRIIB多肽序列尤其有用。筛选此类组合文库的目的可以是产生例如具有改变的特性(诸如改变的药代动力学或改变的配体结合)的多肽变体。下文提供了多种筛选测定，并且此类测定可以用于评价变体。例如，可以针对与ActRIIA或ActRIIB配体(例如，激活素A、激活素B、GDF11、GDF8、GDF3、BMP5、BMP6和BMP10)结合、防止ActRIIA或ActRIIB配体与ActRIIA或ActRIIB多肽结合和/或干扰由ActRIIA或ActRIIB配体引起的信号传导的能力筛选ActRIIA或ActRIIB多肽变体。在一些实施方案中，本公开文本的异多聚体在基于细胞的测定中抑制一种或多种ActRIIA或ActRIIB配体的活性。
本公开文本的ActRIIA或ActRIIB单臂异多聚体的活性也可以在基于细胞的测定或体内测定中进行测试。例如，可以评估单臂异多聚体对肾脏疾病或病症(例如奥尔波特综合征、局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)、多囊肾病、慢性肾脏疾病)中所涉及基因的表达的影响。根据需要，这可以在一种或多种重组ActRIIA或ActRIIB配体蛋白(例如，激活素A、激活素B、GDF11、GDF8、GDF3、BMP5、BMP6和BMP10)的存在下进行，并且可以转染细胞以产生单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体以及任选地ActRIIA或ActRIIB配体。同样，可以将本公开文本的单臂异多聚体施用于小鼠或其他动物，并且可以使用本领域公认的方法评估一个或多个测量值，诸如白蛋白肌酐比率(ACR)、肾小球滤过率(GFR)和/或血尿素氮(BUN)。类似地，可以例如通过如本文所述的测定和本领域公知的测定在成骨细胞、脂肪细胞和/或神经元细胞中测试ActRIIA或ActRIIB多肽或其变体的活性对这些细胞的生长的任何影响。SMAD反应性报告基因可以在此类细胞系中用于监测对下游信号传导的影响。
可以产生相对于参考单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体具有增加的选择性或通常增加的效力的组合衍生变体。此类变体在从重组DNA构建体表达时可以用于基因疗法方案中。同样，诱变可以产生细胞外半衰期与相应未经修饰的单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体显著不同的变体。例如，可以使经改变的蛋白质对蛋白水解降解或导致未经修饰的多肽的破坏或以其他方式失活的其他细胞过程更稳定或更不稳定。此类变体和编码它们的基因可以用于通过调节多肽的半衰期来改变多肽复合物水平。例如，短半衰期可以产生更短暂的生物学作用，并且当作为诱导型表达系统的一部分时，可以允许更严格地控制细胞外部的重组多肽复合物水平。在Fc融合蛋白中，可能在接头(如果有的话)和/或Fc部分中进行突变，以改变单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的半衰期。
组合文库可以通过编码多肽文库的基因的简并文库产生，所述多肽各自至少包含潜在的ActRIIA或ActRIIB序列的一部分。例如，可以将合成寡核苷酸的混合物酶促地连接到基因序列中，使得潜在的ActRIIA或ActRIIB编码核苷酸序列的简并组可以作为单独的多肽表达，或者可替代地作为一组较大的融合蛋白(例如，用于噬菌体展示)表达。
有许多方式可以由简并寡核苷酸序列产生潜在同系物的文库。简并基因序列的化学合成可以在自动DNA合成仪中进行，然后可以将合成基因连接至适当的载体中进行表达。简并寡核苷酸的合成是本领域中熟知的。参见例如，Narang,SA(1983)Tetrahedron 39:3；Itakura等人(1981)Recombinant DNA,Proc.3rd Cleveland Sympos.Macromolecules,编辑AG Walton,Amsterdam:Elsevier第273-289页；Itakura等人(1984)Annu.Rev.Biochem.53:323；Itakura等人(1984)Science 198:1056；Ike等人(1983)Nucleic Acid Res.11:477。此类技术已用于其他蛋白质的定向进化。参见例如，Scott等人,(1990)Science 249:386-390；Roberts等人(1992)PNAS USA 89:2429-2433；Devlin等人(1990)Science 249:404-406；Cwirla等人,(1990)PNAS USA 87:6378-6382；以及美国专利号：5,223,409、5,198,346和5,096,815。
可替代地，可以使用其他诱变形式来产生组合文库。例如，本公开文本的单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体可以通过以下方式产生和通过筛选从文库中分离：使用例如丙氨酸扫描诱变[参见例如，Ruf等人(1994)Biochemistry 33:1565-1572；Wang等人(1994)J.Biol.Chem.269:3095-3099；Balint等人(1993)Gene 137:109-118；Grodberg等人(1993)Eur.J.Biochem.218:597-601；Nagashima等人(1993)J.Biol.Chem.268:2888-2892；Lowman等人(1991)Biochemistry 30:10832-10838；以及Cunningham等人(1989)Science 244:1081-1085]；通过接头分区诱变[参见例如,Gustin等人(1993)Virology 193:653-660；以及Brown等人(1992)Mol.Cell Biol.12:2644-2652；McKnight等人(1982)Science232:316]；通过饱和诱变[参见例如，Meyers等人,(1986)Science 232:613]；通过PCR诱变[参见例如，Leung等人(1989)Method Cell Mol Biol 1:11-19]；或通过随机诱变，包括化学诱变[参见例如，Miller等人(1992)A Short Course inBacterial Genetics,CSHL Press,Cold Spring Harbor,NY；以及Greener等人(1994)Strategies in Mol Biol 7:32-34]。接头分区诱变特别是在组合设置中是用于鉴定ActRIIA或ActRIIB多肽的截短(生物活性)形式的有吸引力的方法。
本领域中已知各种用于筛选通过点突变和截短产生的组合文库中的基因产物并且同样用于筛选cDNA文库中的具有某种特性的基因产物的技术。此类技术通常将适用于快速筛选由本公开文本的单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的组合诱变产生的基因文库。用于筛选大基因文库的最广泛使用的技术通常包括将所述基因文库克隆到可复制的表达载体中，用所得载体文库转化适当的细胞，并且在所需活性的检测促进相对容易地分离编码基因(其产物被检测)的载体的条件下表达所述组合基因。优选的测定包括ActRIIA或ActRIIB配体(例如，激活素A、激活素B、GDF11、GDF8、GDF3、BMP5、BMP6和BMP10)的结合测定和/或细胞信号传导测定。
在某些实施方案中，除了在ActRIIA或ActRIIB多肽中天然存在的任何修饰之外，本公开文本的单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体还可以包含翻译后修饰。此类修饰包括但不限于乙酰化、羧基化、糖基化、磷酸化、脂质化和酰化。因此，ActRIIA或ActRIIB单臂异多聚体可以包含非氨基酸要素，诸如聚乙二醇、脂质、多糖或单糖和磷酸盐。此类非氨基酸要素对单臂异多聚体的功能的影响可以如本文针对其他单臂异多聚体变体所描述那样进行测试。当在细胞中通过切割新生形式的多肽产生本公开文本的多肽时，翻译后加工对于蛋白质的正确折叠和/或功能也可能是重要的。不同细胞(例如，CHO、HeLa、MDCK、293、WI38、NIH-3T3或HEK293)具有用于此类翻译后活性的特定细胞机器和特征机制，并且可以进行选择以确保对ActRIIA或ActRIIB多肽的正确修饰和加工。
在某些方面，本文所公开的多肽可以形成蛋白质异多聚体，其包含与含有相互作用对的互补成员的至少一种多肽共价或非共价缔合的至少一种ActRIIA或ActRIIB多肽。优选地，本文所公开的多肽形成单臂异二聚体，但也包括更高级异多聚体，诸如但不限于异三聚体、异四聚体和其他寡聚体结构。在一些实施方案中，本公开文本的ActRIIA或ActRIIB多肽包含至少一个多聚化结构域。如本文所公开的，术语“多聚化结构域”是指促进至少第一多肽与至少第二多肽之间的共价或非共价相互作用的氨基酸或氨基酸序列。本文所公开的多肽可以与多聚化结构域共价或非共价连接。优选地，多聚化结构域促进单臂多肽(例如，包含ActRIIA或ActRIIB多肽的融合多肽)与相互作用对的互补成员之间的相互作用，以促进异多聚体形成(例如，异二聚体形成)，并且任选地阻碍或以其他方式不利于同多聚体形成(例如，同二聚体形成)，从而提高所需异多聚体的产率。
本领域中已知的许多方法可以用于产生本公开文本的单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体。例如，可以通过如下方式来构建非天然存在的二硫键：用含游离硫醇的残基(诸如半胱氨酸)置换第一多肽(例如，包含ActRIIA或ActRIIB多肽的融合多肽)上天然存在的氨基酸，使得游离硫醇与第二多肽(例如，相互作用对的互补成员)上的另一个含游离硫醇残基相互作用，使得在所述第一多肽与所述第二多肽之间形成二硫键。促进异多聚体形成的相互作用的其他例子包括但不限于离子相互作用，诸如Kjaergaard等人,WO2007147901所述；静电转向效应，诸如Kannan等人,U.S.8,592,562所述；卷曲螺旋相互作用，诸如Christensen等人,U.S.20120302737所述；亮氨酸拉链，诸如Pack和Plueckthun,(1992)Biochemistry 31:1579-1584所述；以及螺旋-转角-螺旋基序，诸如Pack等人,(1993)Bio/Technology 11:1271-1277所述。各个区段的连接可以经由例如共价结合(诸如通过化学交联、肽接头、二硫桥等)或亲和相互作用(诸如通过亲和素-生物素或亮氨酸拉链技术)获得。
在某些方面中，多聚化结构域可以包含相互作用对的一个组分。在一些实施方案中，本文所公开的多肽可以形成包含与第二多肽共价或非共价缔合的第一多肽的异多聚体，其中所述第一多肽包含ActRIIA或ActRIIB多肽的氨基酸序列和相互作用对的第一成员的氨基酸序列；并且所述第二多肽包含相互作用对的第二成员的氨基酸序列。相互作用对可以是相互作用以形成异多聚体(特别是异二聚体)的任何两个多肽序列，但是可操作的实施方案也可以使用可以形成同二聚体复合物的相互作用对。相互作用对的一个成员可以与如本文所述的ActRIIA或ActRIIB多肽融合，所述ActRIIA或ActRIIB多肽包括例如包含与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、9、10、11中任一个的序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽序列。可以选择相互作用对以赋予改善的特性/活性(诸如增加的血清半衰期)或充当衔接子，在所述衔接子上附接另一个部分以提供改善的特性/活性。例如，聚乙二醇部分可以附接至相互作用对的一个或两个组分，以提供改善的特性/活性诸如改善的血清半衰期。
相互作用对的第一成员和第二成员可以是不对称对，意味着所述对的成员优先彼此缔合而不是自我缔合。因此，不对称相互作用对的第一成员和第二成员可以缔合形成异二聚体相互作用对。可替代地，相互作用对可以是非引导的，意味着所述对的成员可以彼此缔合或自我缔合而没有实质的优先性，并且因此可以具有相同或不同的氨基酸序列。因此，非引导相互作用对的第一成员和第二成员可以缔合形成同二聚体相互作用对或异二聚体作用对。任选地，相互作用对(例如，不对称对或非引导相互作用对)的第一成员与相互作用对的第二成员共价缔合。任选地，相互作用对(例如，不对称对或非引导相互作用对)的第一成员与相互作用对的第二成员非共价缔合。
作为具体例子，本公开文本提供了异多聚体融合蛋白，其包含与多肽融合的至少一种ActRIIA或ActRIIB多肽。在一些实施方案中，本公开文本提供了异多聚体融合蛋白，其包含与包含免疫球蛋白恒定区的多肽融合的至少一种ActRIIA或ActRIIB多肽，所述免疫球蛋白恒定区诸如免疫球蛋白的CH1、CH2或CH3结构域或Fc结构域。本文提供了衍生自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的Fc结构域。在一些实施方案中，来自IgG重链的第一恒定区是第一免疫球蛋白Fc结构域。在一些实施方案中，来自IgG重链的第二恒定区是第一免疫球蛋白Fc结构域。在一些实施方案中，Fc结构域衍生自来自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链的恒定区。在一些实施方案中，Fc结构域包含来自人IgG1的恒定区。在一些实施方案中，Fc结构域包含来自人IgG2的恒定区。在一些实施方案中，Fc结构域包含来自人IgG3的恒定区。在一些实施方案中，Fc结构域包含来自人IgG4的恒定区。在一些实施方案中，可以任选地提供除去C末端赖氨酸(K)的免疫球蛋白或Fc结构域的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:85和87)。
已知降低CDC或ADCC活性的其他突变，并且共同地，这些变体中的任一种都包括在本公开文本中并且可以用作本公开文本的单臂异多聚体融合蛋白的有利组分。任选地，SEQID NO:22的IgG1 Fc结构域具有在残基诸如Asp-265、Lys-322和Asn-434(根据相应的全长IgG1编号)处的一个或多个突变。在某些情况下，具有这些突变中的一个或多个(例如，Asp-265突变)的突变型Fc结构域相对于野生型Fc结构域具有降低的与Fcγ受体结合的能力。在其他情况下，具有这些突变中的一个或多个(例如，Asn-434突变)的突变型Fc结构域相对于野生型Fc结构域具有增加的与MHC I类相关Fc受体(FcRN)结合的能力。
可以用于人IgG1的Fc部分(G1Fc)的天然氨基酸序列的例子如下所示(SEQ ID NO:22)。虚线下划线指示铰链区，并且实线下划线指示具有天然存在的变体的位置。部分地，本公开文本提供了包含与SEQ ID NO:22具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的多肽。根据SEQ ID NO:22中所用的编号系统，G1Fc中天然存在的变体将包括E134D和M136L(参见UniProt P01857)。
Figure BDA0003929492720000261
可以用于人IgG2的Fc部分(G2Fc)的天然氨基酸序列的例子如下所示(SEQ ID NO:23)。虚线下划线指示铰链区，并且双下划线指示在所述序列中存在数据库冲突的位置(根据UniProt P01859)。部分地，本公开文本提供了包含与SEQ ID NO:23具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的多肽。
Figure BDA0003929492720000262
Figure BDA0003929492720000271
可以用于人IgG3的Fc部分(G3Fc)的氨基酸序列的两个例子如下所示。G3Fc中的铰链区可以是其他Fc链中的最多四倍长，并且含有三个相同的15个残基区段，其前面是相似的17个残基区段。如下所示的第一G3Fc序列(SEQ ID NO:24)含有由单个15个残基区段组成的短铰链区，然而第二G3Fc序列(SEQ ID NO:25)含有全长铰链区。在每种情况下，虚线下划线指示铰链区，并且实线下划线指示具有天然存在的变体的位置(根据UniProt P01859)。部分地，本公开文本提供了包含与SEQ ID NO:24和25具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的多肽。
Figure BDA0003929492720000272
当转化为SEQ ID NO:24中所用的编号系统时，G3Fc中天然存在的变体(例如，参见Uniprot P01860)包括E68Q、P76L、E79Q、Y81F、D97N、N100D、T124A、S169N、S169del、F221Y，并且本公开文本提供了包含含有这些变异中的一个或多个的G3Fc结构域的融合蛋白。另外，人免疫球蛋白IgG3基因(IGHG3)显示出以不同铰链长度为特征的结构多态性[参见Uniprot P01859]。具体地，变体WIS缺少V区的大部分和CH1区的全部。除了通常存在于铰链区中的11之外，它在位置7处具有额外的链间二硫键。变体ZUC缺少V区的大部分、CH1区的全部和铰链的一部分。变体OMM可以代表等位基因形式或另一种γ链亚类。本公开文本提供了另外的融合蛋白，其包含含有这些变体中的一个或多个的G3Fc结构域。
可以用于人IgG4的Fc部分(G4Fc)的天然氨基酸序列的例子如下所示(SEQ ID NO:26)。虚线下划线指示铰链区。部分地，本公开文本提供了包含与SEQ ID NO:26具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的多肽。
Figure BDA0003929492720000273
本文关于G1Fc序列(SEQ ID NO:22)呈现了Fc结构域中的多种工程化突变，并且G2Fc、G3Fc和G4Fc中的类似突变可以源自它们与图4中的G1Fc的比对。由于不等的铰链长度，基于同种型比对的类似Fc位置(图4)在SEQ ID NO:22、23、24和26中具有不同的氨基酸编号。还可以理解，由铰链、CH2和CH3区组成的免疫球蛋白序列(例如，SEQ ID NO:22、23、24和26)中的给定氨基酸位置将通过与当编号涵盖如在Uniprot数据库中的整个IgG1重链恒定结构域(由CH1、铰链、CH2和CH3区组成)时的相同位置不同的编号来鉴定。例如，人G1Fc序列(SEQ ID NO:22)、人IgG1重链恒定结构域(Uniprot P01857)和人IgG1重链中选择的CH3位置之间的对应关系如下。
Figure BDA0003929492720000281
在从单一细胞系大规模生产不对称的基于免疫球蛋白的蛋白质中出现的问题被称为“链缔合问题”。正如在双特异性抗体的产生中突出地面临的那样，链缔合问题涉及从多种组合中有效产生所需多链蛋白的挑战，所述多种组合当在单一细胞系中产生不同的重链和/或轻链时固有地产生[参见，例如，Klein等人(2012)mAbs 4:653-663]。这个问题当在同一细胞中产生两种不同的重链和两种不同的轻链时最为严重，在这种情况下，当通常只需要一种组合时，存在总共16种可能的链组合(但是其中一些组合是相同的)。然而，相同的原理解释了仅并入两条不同(不对称)重链的所需多链融合蛋白的产量降低。
本领域中已知各种方法，所述方法在单一细胞系中增加含Fc融合多肽链的所需配对，从而以可接受产率产生优选的不对称融合蛋白[参见例如，Klein等人(2012)mAbs 4:653-663]。用于获得含Fc链的所需配对的方法包括但不限于基于电荷的配对(静电转向)、“杵臼结构(knobs-into-holes)”空间配对、SEED体配对和基于亮氨酸拉链的配对。参见例如，Ridgway等人(1996)Protein Eng 9:617-621；Merchant等人(1998)Nat Biotech 16:677-681；Davis等人(2010)Protein Eng Des Sel 23:195-202；Gunasekaran等人(2010)；285:19637-19646；Wranik等人(2012)J Biol Chem 287:43331-43339；US 5932448；WO1993/011162；WO 2009/089004以及WO 2011/034605。
例如，可以促进特定多肽之间相互作用的一种手段是通过工程化突起入腔(protuberance-into-cavity)(杵臼结构)互补区域，诸如在Arathoon等人,U.S.7,183,076和Carter等人,U.S.5,731,168中所述。通过用较大侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)从第一多肽(例如，第一相互作用对)的界面置换小氨基酸侧链来构建“突起”。通过用较小的氨基酸侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)置换大氨基酸侧链，任选地在第二多肽(例如，第二相互作用对)的界面上产生与该突起具有相同或相似大小的互补“腔”。当在第一多肽或第二多肽的界面处存在适当定位和尺寸的突起或腔时，仅需要在相邻界面处分别工程化相应的腔或突起。
在中性pH(7.0)下，天冬氨酸和谷氨酸带负电荷，并且赖氨酸、精氨酸和组氨酸带正电荷。这些带电荷的残基可以用于促进异二聚体形成，并且同时阻碍同二聚体形成。相反的电荷之间发生吸引相互作用，并且相似的电荷之间发生排斥相互作用。部分地，本文所公开的蛋白质复合物通过进行带电界面残基的定点诱变利用吸引相互作用来促进异多聚体形成(例如异二聚体形成)，并且任选地利用排斥相互作用来阻碍同二聚体形成(例如同二聚体形成)。
例如，IgG1 CH3结构域界面包含参与结构域-结构域相互作用的四个独特的电荷残基对：Asp356-Lys439’、Glu357-Lys370’、Lys392-Asp399’和Asp399-Lys409’[第二链中的残基编号由(')指示]。应当注意，此处用于指定IgG1 CH3结构域中的残基的编号方案符合Kabat的EU编号方案。由于CH3-CH3结构域相互作用中存在2倍对称性，每种独特的相互作用将在结构中表现两次(例如，Asp-399-Lys409’和Lys409-Asp399’)。在野生型序列中，K409-D399'有利于异二聚体和同二聚体两者的形成。在第一链中转换电荷极性(例如，K409E；正电荷至负电荷)的单个突变导致对于形成第一链同二聚体不利的相互作用。由于在相同电荷之间发生的排斥相互作用(负-负；K409E-D399’和D399-K409E’)而产生了不利的相互作用。在第二链中转换电荷极性(D399K'；负电荷至正电荷)的类似突变导致对于第二链同二聚体形成不利的相互作用(K409’-D399K’和D399K-K409’)。但是，与此同时，这两个突变(K409E和D399K')导致对于异二聚体形成有利的相互作用(K409E-D399K’和D399-K409’)。
通过另外的带电残基的突变可以进一步增强对异二聚体形成和同二聚体阻遏的静电转向效应，所述另外的带电残基可以与第二链中的带相反电荷的残基(包括例如Arg355和Lys360)配对或不配对。下表列出了可以单独或组合使用的可能的电荷变化突变，以增强本文所公开的异多聚体的异多聚体形成。
Figure BDA0003929492720000291
在一些实施方案中，将构成本申请的融合蛋白中的CH3-CH3界面的一个或多个残基用带电荷的氨基酸置换，使得相互作用变得静电不利。例如，将界面中的带正电荷的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸或组氨酸)用带负电荷的氨基酸(例如，天冬氨酸或谷氨酸)置换。可替代地，或与上述取代组合，将界面中的带负电荷的氨基酸用带正电荷的氨基酸置换。在某些实施方案中，将所述氨基酸用具有所需电荷特征的非天然存在的氨基酸置换。应当注意，使带负电荷的残基(Asp或Glu)突变为His将导致侧链体积增加，这可能引起空间问题。此外，His质子供体和受体形式取决于局部环境。这些问题应在设计策略中加以考虑。因为界面残基在人和小鼠IgG亚类中是高度保守的，所以本文所公开的静电转向效应可以应用于人和小鼠IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。这种策略还可以扩展至将不带电荷的残基修饰为CH3结构域界面处的带电荷残基。
部分地，本公开文本使用基于电荷配对(静电转向)工程化为互补的Fc序列提供含Fc不对称多肽链的所需配对。一对具有静电互补的Fc序列中的一个可以任意融合至构建体的ActRIIA或ActRIIB多肽(用或不用任选的接头)，以产生ActRIIA或ActRIIB融合多肽。此单链可以连同与第一Fc互补的Fc序列一起在所选细胞中共同表达，以利于产生所需的多链构建体(例如，单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体)。在这个基于静电转向的例子中，SEQ ID NO:14[人G1Fc(E134K/D177K)]和SEQ ID NO:15[人G1Fc(K170D/K187D)]是互补Fc序列的例子，其中工程化氨基酸取代加双下划线，并且所述构建体的ActRIIA或ActRIIB多肽可以与SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15融合，但不能与两者都融合。鉴于天然hG1Fc、天然hG2Fc、天然hG3Fc和天然hG4Fc之间的高度氨基酸序列同一性，可以理解hG2Fc、hG3Fc或hG4Fc中相应位置处的氨基酸取代(参见图4)将产生互补Fc对，所述互补Fc对可以代替以下互补hG1Fc对(SEQ ID NO:14和15)使用。
Figure BDA0003929492720000301
部分地，本公开文本使用针对空间互补性工程化的Fc序列提供了含Fc不对称多肽链的所需配对。部分地，本公开文本提供了杵臼结构配对作为空间互补性的例子。一对具有空间互补性的Fc序列中的一个可以任意融合至构建体的ActRIIA或ActRIIB多肽(用或不用任选的接头)，以产生单臂ActRIIB异多聚体融合构建体或单臂ActRIIB异多聚体融合构建体。此单链可以连同与第一Fc互补的Fc序列一起在所选细胞中共同表达，以利于产生所需的多链构建体(例如，单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体)。在这个基于杵臼结构配对的例子中，SEQ ID NO:16[人G1Fc(T144Y)]和SEQ ID NO:17[人G1Fc(Y185T)]是互补Fc序列的例子，其中工程化氨基酸取代加双下划线，并且所述构建体的ActRIIA或ActRIIB多肽可以与SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17融合，但不能与两者都融合。鉴于天然hG1Fc、天然hG2Fc、天然hG3Fc和天然hG4Fc之间的高度氨基酸序列同一性，可以理解hG2Fc、hG3Fc或hG4Fc中相应位置处的氨基酸取代(参见图4)将产生互补Fc对，所述互补Fc对可以代替以下互补hG1Fc对(SEQ ID NO:16和17)使用。
Figure BDA0003929492720000302
在SEQ ID NO:18[hG1Fc(S132C/T144W)]和SEQ ID NO:19[hG1Fc(Y127C/T144S/L146A/Y185V)]中公开了基于杵臼结构配对与工程化二硫键组合的Fc互补性的例子。这些序列中的工程化氨基酸取代加双下划线，并且构建体的ActRIIA或ActRIIB多肽可以与SEQID NO:18或SEQ ID NO:19融合，但不能与两者都融合。鉴于天然hG1Fc、天然hG2Fc、天然hG3Fc和天然hG4Fc之间的高度氨基酸序列同一性，可以理解hG2Fc、hG3Fc或hG4Fc中相应位置处的氨基酸取代(参见图4)将产生互补Fc对，所述互补Fc对可以代替以下互补hG1Fc对(SEQ ID NO:18和19)使用。
Figure BDA0003929492720000303
Figure BDA0003929492720000311
部分地，本公开文本提供了使用Fc序列的含Fc不对称多肽链的所需配对，所述Fc序列经工程化以产生人IgG和IgA CH3结构域的指状突β链区段。此类方法包括使用链交换工程化结构域(SEED)CH3异二聚体，从而允许形成SEED体融合蛋白[参见例如，Davis等人(2010)Protein Eng Design Sel 23:195-202]。一对具有SEED体互补性的Fc序列中的一个可以任意融合至构建体的ActRIIA或ActRIIB多肽(用或不用任选的接头)，以产生单臂ActRIIA异多聚体融合构建体或单臂ActRIIB异多聚体构建体。此单链可以连同与第一Fc互补的Fc序列一起在所选细胞中共同表达，以利于产生所需的多链构建体。在这个基于SEED体(Sb)配对的例子中，SEQ ID NO:20[hG1Fc(SbAG)]和SEQ ID NO:21[hG1Fc(SbGA)]是互补IgG Fc序列的例子，其中来自IgA Fc的工程化氨基酸取代加双下划线，并且所述构建体的ActRIIA或ActRIIB多肽可以与SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21融合，但不能与两者都融合。鉴于在天然hG1Fc、天然hG2Fc、天然hG3Fc和天然hG4Fc之间的高度氨基酸序列同一性，可以理解在hG1Fc、hG2Fc、hG3Fc或hG4Fc(参见图4)中相应位置处的氨基酸取代将产生Fc单体，所述Fc单体可以用于以下互补IgG-IgA对(SEQ ID NO:20和21)。
Figure BDA0003929492720000312
部分地，本公开文本提供了含Fc不对称多肽链的所需配对，所述含Fc不对称多肽链具有在Fc CH3结构域C末端附接的可切割亮氨酸拉链结构域。亮氨酸拉链的附接足以引起异二聚体抗体重链的优先组装。参见例如Wranik等人(2012)J Biol Chem 287:43331-43339。如本文所公开的，一对与形成亮氨酸拉链的链附接的Fc序列中的一个可以任意融合至构建体的ActRIIA或ActRIIB多肽(用或不用任选的接头)，以产生单臂ActRIIA异多聚体融合构建体或单臂ActRIIB异多聚体融合构建体。此单链可以连同与形成亮氨酸拉链的互补链附接的Fc序列一起在所选细胞中共同表达，以利于产生所需的多链构建体。用纯化后的细菌胞内蛋白酶Lys-C对构建体进行蛋白水解消化可以释放亮氨酸拉链结构域，从而产生Fc构建体，该Fc构建体的结构与天然Fc的结构相同。在这个基于亮氨酸拉链配对的例子中，SEQ ID NO:27[hG1Fc-Ap1(酸性)]和SEQ ID NO:28[hG1Fc-Bp1(碱性)]是互补IgG Fc序列的例子，其中工程化的互补亮氨酸拉链序列加下划线，并且所述构建体的ActRIIA或ActRIIB多肽可以与SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28融合，但不能与两者都融合。鉴于在天然hG1Fc、天然hG2Fc、天然hG3Fc和天然hG4Fc之间的高度氨基酸序列同一性，可以理解与hG1Fc、hG2Fc、hG3Fc或hG4Fc(参见图4)附接(用或不用任选的接头)的形成亮氨酸拉链的序列将产生Fc单体，所述Fc单体可以用于以下形成亮氨酸拉链的互补对(SEQ ID NO:27和28)中。
Figure BDA0003929492720000313
Figure BDA0003929492720000321
应理解，融合蛋白(例如，免疫球蛋白Fc融合蛋白)的不同元件能以符合所需功能性的任何方式排列。例如，ActRIIA或ActRIIB多肽结构域可以位于异源结构域的C末端，或者可替代地，异源结构域可以位于ActRIIA或ActRIIB多肽结构域的C末端。ActRIIA或ActRIIB多肽结构域和异源结构域不需要在融合蛋白中相邻，并且另外的结构域或氨基酸序列可以包括在任一结构域的C末端或N末端或在所述结构域之间。例如，单臂ActRIIA异多聚体融合构建体或单臂ActRIIB异多聚体融合构建体可以包含如式A-B-C中所示的氨基酸序列。B部分对应于ActRIIA或ActRIIB多肽结构域。A部分和C部分可以独立地是零个、一个或多于一个氨基酸，并且A部分和C部分两者在存在时对于B都是异源的。A部分和/或C部分可以通过接头序列附接至B部分。在某些实施方案中，ActRIIA或ActRIIB融合蛋白包含如式A-B-C中所示的氨基酸序列，其中A是前导(信号)序列，B由ActRIIA或ActRIIB多肽结构域组成，并且C是增强体内稳定性、体内半衰期、吸收/施用、组织定位或分布、蛋白质复合物的形成和/或纯化中的一种或多种的多肽部分。在某些实施方案中，ActRIIA或ActRIIB融合多肽包含如式A-B-C所示的氨基酸序列，其中A是TPA前导序列，B由ActRIIA或ActRIIB多肽结构域组成，并且C是免疫球蛋白Fc结构域。优选的融合多肽包含SEQ ID NO:46、48、55、57、58、59、60、61、84、86、88、89、90或91中任一个中所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开文本的单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体还包含一个或多个异源部分(结构域)，以赋予所需的特性。例如，一些融合结构域对于通过亲和色谱法分离融合蛋白特别有用。此类融合结构域的熟知的例子包括但不限于多组氨酸、Glu-Glu、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、硫氧还蛋白、蛋白A、蛋白G、免疫球蛋白重链恒定区(Fc)、麦芽糖结合蛋白(MBP)或人血清白蛋白。出于亲和纯化的目的，使用亲和色谱法的相关基质，诸如谷胱甘肽、淀粉酶和镍或钴缀合的树脂。此类基质中有许多能以“试剂盒”形式获得，诸如可与(HIS6)融合配偶体一起使用的Pharmacia GST纯化系统和QIAexpressTM系统(Qiagen)。作为另一个例子，可以选择融合结构域以促进配体捕获多肽的检测。此类检测结构域的例子包括多种荧光蛋白(例如，GFP)以及“表位标签”，所述表位标签通常是可获得特异性抗体的短肽序列。可容易获得特异性单克隆抗体的熟知的表位标签包括FLAG、流感病毒血凝素(HA)和c-myc标签。在一些情况下，融合结构域具有诸如用于因子Xa或凝血酶的蛋白酶切割位点，其允许相关蛋白酶部分地消化融合蛋白，从而从中释放重组蛋白。然后可以通过随后的色谱分离从融合结构域分离释放的蛋白质。
在某些实施方案中，本公开文本的ActRIIA或ActRIIB多肽包含能够稳定多肽的一个或多个修饰。例如，此类修饰增强多肽的体外半衰期，增强多肽的循环半衰期，和/或减少多肽的蛋白水解降解。此类稳定化修饰包括但不限于融合多肽(包括例如包含ActRIIA或ActRIIB多肽结构域和稳定剂结构域的融合多肽)、糖基化位点的修饰(包括例如将糖基化位点添加至本公开文本的多肽)以及碳水化合物部分的修饰(包括例如从本公开文本的多肽除去碳水化合物部分)。如本文所用，术语“稳定剂结构域”不仅是指在融合多肽情况下的融合结构域(例如，免疫球蛋白Fc结构域)，而且包括非蛋白质修饰诸如碳水化合物部分或非蛋白质部分诸如聚乙二醇。
在优选的实施方案中，根据本文所述的方法使用的单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体是分离的异多聚体。如本文所用，分离的蛋白质(例如，异多聚体)或多肽(例如，异多聚体)是与其自然环境的组分分离的蛋白质或多肽。在一些实施方案中，将本公开文本的单臂异多聚体纯化至大于95％、96％、97％、98％或99％纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)所确定。用于评估抗体纯度的方法是本领域中熟知的[参见例如Flatman等人,(2007)J.Chromatogr.B848:79-87]。
在某些实施方案中，本公开文本的ActRIIA或ActRIIB多肽及其单臂异多聚体可以通过多种本领域已知的技术产生。例如，本公开文本的多肽可以使用标准蛋白质化学技术来合成，诸如以下文献中所述的那些技术：Bodansky,M.Principles of PeptideSynthesis,Springer Verlag,柏林(1993)以及Grant G.A.(编辑),Synthetic Peptides:AUser's Guide,W.H.Freeman and Company,纽约(1992)。另外，自动化肽合成仪是可商购的(参见例如，Advanced ChemTech Model 396；Milligen/Biosearch 9600)。可替代地，可以使用如本领域中熟知的各种表达系统[例如，大肠杆菌(E.coli)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞、杆状病毒]重组产生本公开文本的多肽和复合物(包括其片段或变体)。在另一实施方案中，可以通过使用例如蛋白酶(例如，胰蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶或成对碱性氨基酸转化酶(PACE))消化重组产生的全长ActRIIA或ActRIIB多肽来产生本公开文本的经修饰或未经修饰的多肽。计算机分析(使用可商购的软件，例如MacVector、Omega、PCGene，Molecular Simulation,Inc.)可以用于鉴定蛋白水解切割位点。
在一些实施方案中，本公开文本的单臂ActRIIB异多聚体包含与第二多肽共价或非共价缔合的第一多肽，其中所述第一多肽包含相互作用对的第一成员的氨基酸序列和ActRIIB的氨基酸序列；并且所述第二多肽包含所述相互作用对的第二成员的氨基酸序列，并且其中所述第二多肽不包含ActRIIB。
在一些实施方案中，单臂ActRIIB异多聚体包含如下氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1、2、3、4、5和6中任一个的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；或者与开始于SEQ ID NO:1的氨基酸20、21、22、23、24、25、26、27、28或29中任一个并且结束于SEQ IDNO:1的氨基酸109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134中任一个的多肽至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
在一些实施方案中，单臂ActRIIB异多聚体包含与SEQ ID NO:1的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，单臂ActRIIB异多聚体包含与SEQID NO:2的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，单臂ActRIIB异多聚体包含与SEQ ID NO:3的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，单臂ActRIIB异多聚体包含与SEQ ID NO:4的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，单臂ActRIIB异多聚体包含与SEQ ID NO:5的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，单臂ActRIIB异多聚体包含与SEQ ID NO:6的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成。
在一些实施方案中，单臂ActRIIB异多聚体包含如下氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成，所述氨基酸序列与开始于SEQ ID NO:1的氨基酸20、21、22、23、24、25、26、27、28或29中任一个并且结束于SEQ ID NO:1的氨基酸109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134中任一个的多肽至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
在一些实施方案中，单臂ActRIIB异多聚体在与SEQ ID NO:1的L79对应的位置处不包含酸性氨基酸。在一些实施方案中，单臂ActRIIB异多聚体在与SEQ ID NO:1的L79对应的位置处不包含天冬氨酸(D)。
在一些实施方案中，单臂ActRIIB异多聚体包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在一些实施方案中，单臂ActRIIB异多聚体由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，单臂ActRIIB异多聚体基本上由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，单臂ActRIIB异多聚体包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在一些实施方案中，单臂ActRIIB异多聚体由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，单臂ActRIIB异多聚体基本上由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，单臂ActRIIB异多聚体包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。在一些实施方案中，单臂ActRIIB异多聚体由SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，单臂ActRIIB异多聚体基本上由SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，单臂ActRIIB异多聚体包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在一些实施方案中，单臂ActRIIB异多聚体由SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，单臂ActRIIB异多聚体基本上由SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，单臂ActRIIB异多聚体包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列。在一些实施方案中，单臂ActRIIB异多聚体由SEQ ID NO:48的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，单臂ActRIIB异多聚体基本上由SEQ ID NO:48的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，单臂ActRIIB异多聚体包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列。在一些实施方案中，单臂ActRIIB异多聚体由SEQ ID NO:84的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，单臂ActRIIB异多聚体基本上由SEQ ID NO:84的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，单臂ActRIIB异多聚体包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。在一些实施方案中，单臂ActRIIB异多聚体由SEQ ID NO:61的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，单臂ActRIIB异多聚体基本上由SEQ ID NO:61的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，单臂ActRIIB异多聚体包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列。在一些实施方案中，单臂ActRIIB异多聚体由SEQ ID NO:86的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，单臂ActRIIB异多聚体基本上由SEQ ID NO:86的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，单臂ActRIIB异多聚体包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列。在一些实施方案中，单臂ActRIIB异多聚体由SEQ ID NO:90的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，单臂ActRIIB异多聚体基本上由SEQ ID NO:90的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，单臂ActRIIB异多聚体包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列。在一些实施方案中，单臂ActRIIB异多聚体由SEQ ID NO:91的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，单臂ActRIIB异多聚体基本上由SEQ ID NO:91的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，本公开文本的单臂ActRIIA异多聚体包含与第二多肽共价或非共价缔合的第一多肽，其中所述第一多肽包含相互作用对的第一成员的氨基酸序列和ActRIIA的氨基酸序列；并且所述第二多肽包含所述相互作用对的第二成员的氨基酸序列，并且其中所述第二多肽不包含ActRIIA。
在一些实施方案中，单臂ActRIIA异多聚体包含如下氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:9、10和11中任一个的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；或者与开始于SEQ ID NO:9的氨基酸21、22、23、24、25、26、27、28、29或30中任一个并且结束于SEQ IDNO:9的氨基酸110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134或135中任一个的多肽至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
在一些实施方案中，单臂ActRIIA异多聚体包含与SEQ ID NO:9的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，单臂ActRIIA异多聚体包含与SEQID NO:10的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，单臂ActRIIA异多聚体包含与SEQ ID NO:11的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成。
在一些实施方案中，单臂ActRIIA异多聚体包含如下氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成，所述氨基酸序列与开始于SEQ ID NO:9的氨基酸21、22、23、24、25、26、27、28、29或30中任一个并且结束于SEQ ID NO:9的氨基酸110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134或135中任一个的多肽至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
在一些实施方案中，单臂ActRIIA异多聚体包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。在一些实施方案中，单臂ActRIIA异多聚体由SEQ ID NO:10的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，单臂ActRIIA异多聚体基本上由SEQ ID NO:10的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，单臂ActRIIA异多聚体包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。在一些实施方案中，单臂ActRIIA异多聚体由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，单臂ActRIIA异多聚体基本上由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，单臂ActRIIA异多聚体包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列。在一些实施方案中，单臂ActRIIA异多聚体由SEQ ID NO:57的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，单臂ActRIIA异多聚体基本上由SEQ ID NO:57的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，单臂ActRIIA异多聚体包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列。在一些实施方案中，单臂ActRIIA异多聚体由SEQ ID NO:88的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，单臂ActRIIA异多聚体基本上由SEQ ID NO:88的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，单臂ActRIIA异多聚体包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列。在一些实施方案中，单臂ActRIIA异多聚体由SEQ ID NO:59的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，单臂ActRIIA异多聚体基本上由SEQ ID NO:59的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，单臂ActRIIA异多聚体包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列。在一些实施方案中，单臂ActRIIA异多聚体由SEQ ID NO:89的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，单臂ActRIIA异多聚体基本上由SEQ ID NO:89的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，单臂异多聚体是异二聚体。在一些实施方案中，相互作用对的第一成员包含来自IgG重链的第一恒定区。在一些实施方案中，来自IgG重链的第一恒定区是第一免疫球蛋白Fc结构域。在一些实施方案中，来自IgG重链的第一恒定区包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO:14-28中任一个的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
在一些实施方案中，来自IgG重链的第一恒定区包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:14的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，来自IgG重链的第一恒定区包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:15的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，来自IgG重链的第一恒定区包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:16的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，来自IgG重链的第一恒定区包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ IDNO:17的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，来自IgG重链的第一恒定区包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:18的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，来自IgG重链的第一恒定区包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:19的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，来自IgG重链的第一恒定区包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:20的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，来自IgG重链的第一恒定区包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:21的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，来自IgG重链的第一恒定区包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:22的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，来自IgG重链的第一恒定区包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:23的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，来自IgG重链的第一恒定区包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:24的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，来自IgG重链的第一恒定区包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:25的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，来自IgG重链的第一恒定区包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:26的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，来自IgG重链的第一恒定区包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:27的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，来自IgG重链的第一恒定区包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:28的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
在一些实施方案中，相互作用对的第二成员包含来自IgG重链的第二恒定区。在一些实施方案中，来自IgG重链的第二恒定区是第一免疫球蛋白Fc结构域。在一些实施方案中，来自IgG重链的第二恒定区包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO:14-28中任一个的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
在一些实施方案中，来自IgG重链的第二恒定区包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:14的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，来自IgG重链的第二恒定区包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:15的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，来自IgG重链的第二恒定区包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:16的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，来自IgG重链的第二恒定区包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ IDNO:17的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，来自IgG重链的第二恒定区包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:18的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，来自IgG重链的第二恒定区包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:19的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，来自IgG重链的第二恒定区包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:20的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，来自IgG重链的第二恒定区包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:21的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，来自IgG重链的第二恒定区包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:22的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，来自IgG重链的第二恒定区包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:23的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，来自IgG重链的第二恒定区包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:24的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，来自IgG重链的第二恒定区包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:25的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，来自IgG重链的第二恒定区包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:26的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，来自IgG重链的第二恒定区包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:27的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，来自IgG重链的第二恒定区包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:28的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
在一些实施方案中，第一多肽包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与选自SEQID NO:46、48、55、57、58、59、60、61、84、86、88、89、90和91中任一个的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
在一些实施方案中，第一多肽包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ IDNO:46的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，第一多肽包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:48的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，第一多肽包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:55的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，第一多肽包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:57的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，第一多肽包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:58的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，第一多肽包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:59的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，第一多肽包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:60的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，第一多肽包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:61的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，第一多肽包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:84的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，第一多肽包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:86的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，第一多肽包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:88的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，第一多肽包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:89的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，第一多肽包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:90的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，第一多肽包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:91的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
在一些实施方案中，第二多肽包含与选自SEQ ID NO:49、51、62、63、85和87中任一个的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第二多肽包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ IDNO:49的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，第二多肽包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:51的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，第二多肽包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:62的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，第二多肽包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:63的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，第二多肽包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:85的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，第二多肽包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:87的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
在一些实施方案中，异多聚体复合物结合选自以下的一种或多种ActRIIA或ActRIIB配体：激活素A、激活素B、GDF11、GDF8、GDF3、BMP5、BMP6和BMP10。在一些实施方案中，单臂ActRIIB异多聚体结合激活素B和GDF11。在一些实施方案中，单臂ActRIIB异多聚体结合GDF8和激活素A。在一些实施方案中，单臂ActRIIA异多聚体结合激活素A多于激活素B和GDF11。在一些实施方案中，单臂ActRIIA异多聚体结合GDF8。
3.接头
本公开文本提供了单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体，并且在这些实施方案中，ActRIIA或ActRIIB多肽和相互作用对的第一成员(例如，来自IgG重链的恒定区)可以通过接头连接。在一些实施方案中，单臂ActRIIA异多聚体包含定位于ActRIIA多肽与相互作用对的第一成员之间的接头结构域。在一些实施方案中，单臂ActRIIB异多聚体包含定位于ActRIIB多肽与相互作用对的第一成员之间的接头结构域。在一些实施方案中，接头是富含甘氨酸和丝氨酸的接头。其他接近中性的氨基酸，诸如但不限于Thr、Asn、Pro和Ala，也可以用于接头序列中。在一些实施方案中，接头包含含有Gly和Ser的氨基酸序列的各种排列。在一些实施方案中，接头的长度大于10个氨基酸。在另外的实施方案中，接头具有至少12个、15个、20个、21个、25个、30个、35个、40个、45个或50个氨基酸的长度。在一些实施方案中，接头为少于40个、35个、30个、25个、22个或20个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为10-50个、10-40个、10-30个、10-25个、10-21个、10-15个、10个、15-25个、17-22个、20个或21个氨基酸。在优选的实施方案中，接头包含氨基酸序列GlyGlyGlyGlySer(GGGGS)(SEQID NO:29)或其重复序列(GGGGS)n，其中n≥2(SEQ ID NO:30)。在特定的实施方案中，n≥3，或n＝3-10。在优选的实施方案中，n≥4，或n＝4-10。在一些实施方案中，在(GGGGS)n接头(SEQ ID NO:29)中，n不大于4。在一些实施方案中，n＝4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、5-8、5-7或5-6。在一些实施方案中，n＝3、4、5、6或7。在特定的实施方案中，n＝4。在一些实施方案中，包含(GGGGS)n序列(SEQ ID NO:29)的接头还包含N末端苏氨酸。在一些实施方案中，接头是以下中的任一个：
GGG(SEQ ID NO:31)
GGGG(SEQ ID NO:32)
GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:33)
SGGG(SEQ ID NO:34)
SGGGG(SEQ ID NO:35)
TGGG(SEQ ID NO:36)
TGGGG(SEQ ID NO:37)
TGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:38)
TGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:39)
TGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:40)
TGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:41)
TGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:42)或
TGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:43)。
在一些实施方案中，接头包含TGGGPKSCDK(SEQ ID NO:44)的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头是缺少N末端苏氨酸的SEQ ID NO:31-44中的任一个。在一些实施方案中，接头不包含SEQ ID NO:42或43的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头包含选自SEQ IDNO:29-44中任一个的氨基酸序列。
4.编码ActRIIA或ActRIIB多肽的核酸
在某些实施方案中，本公开文本提供了编码本文所公开的ActRIIA或ActRIIB多肽(包括其片段、功能变体和融合蛋白)的分离和/或重组的核酸。例如，SEQ ID NO:12编码天然存在的人ActRIIA前体多肽，而SEQ ID NO:13编码ActRIIA的经加工的细胞外结构域。主题核酸可以是单链或双链的。此类核酸可以是DNA或RNA分子。例如，这些核酸可以用于制备本公开文本的ActRIIA或ActRIIB单臂异多聚体的方法中。
如本文所用，一种或多种分离的核酸是指已经与其天然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括细胞中所含的核酸分子，所述细胞通常含有所述核酸分子，但所述核酸分子存在于染色体外或存在于不同于其天然染色体位置的染色体位置。
在某些实施方案中，编码本公开文本的ActRIIA或ActRIIB多肽的核酸被理解为包括作为SEQ ID NO:7、8、12和13中任一个的变体的核酸。在某些实施方案中，编码相互作用对的第一成员和/或第二成员(例如，来自IgG重链的恒定区)的核酸被理解为包括作为SEQID NO:50中任一个的变体的核酸。在一些实施方案中，编码本公开文本的单臂ActRIIA异多聚体融合物或单臂ActRIIB异多聚体Fc融合物的核酸被理解为包括作为SEQ ID NO:47和56中任一个的变体的核酸。在一些实施方案中，单臂ActRIIA异多聚体融合物包含单臂ActRIIA异二聚体Fc融合物，其包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列。在一些实施方案中，单臂ActRIIB异多聚体融合物包含单臂ActRIIB异二聚体Fc融合物，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列。变体核苷酸序列包括因一个或多个核苷酸取代、添加或缺失而不同的序列(包括等位基因变体)，并且因此，将包括与SEQ ID NO:7、8、12、13、47、50和56中任一个指定的核苷酸序列不同的编码序列。在某些实施方案中，本公开文本的ActRIIA或ActRIIB多肽由与SEQID NO:7、8、12、13至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的分离或重组核酸序列编码。在某些实施方案中，本公开文本的相互作用对的第一成员和/或第二成员(例如，来自IgG重链的恒定区)由与SEQ ID NO:50至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的分离或重组核酸序列编码。在一些实施方案中，本公开文本的单臂ActRIIA异多聚体融合物由与SEQ ID NO:56至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的分离或重组核酸序列编码。在一些实施方案中，本公开文本的单臂ActRIIB异多聚体融合物由与SEQ IDNO:47至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的分离或重组核酸序列编码。本领域普通技术人员将理解，与跟SEQ ID NO:7、8、12、13、47、50和56互补的序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列也在本公开文本的范围内。在另外的实施方案中，本公开文本的核酸序列可以与异源核苷酸序列分离、重组和/或融合，或者在DNA文库中。
在其他实施方案中，本公开文本的核酸还包括在高严格条件下与SEQ ID NO:7、8、12、13、47、50和56中指定的核苷酸序列、SEQ ID NO:7、8、12、13、47、50和56的互补序列、或其片段杂交的核苷酸序列。本领域普通技术人员应容易理解，促进DNA杂交的适当严格度条件可以变化。例如，可以在6.0x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)下在约45℃下进行杂交，接着用2.0xSSC在50℃下洗涤。例如，洗涤步骤中的盐浓度可以选自在50℃下的约2.0x SSC的低严格度至在50℃下的约0.2x SSC的高严格度。另外，洗涤步骤中的温度可以从室温(约22℃)下的低严格度条件上升至约65℃下的高严格度条件。温度和盐两者都可以变化，或者温度或盐浓度可以保持恒定，同时改变另一个变量。在一个实施方案中，本公开文本提供了核酸，所述核酸在室温下在6x SSC的低严格条件下杂交，接着在室温下在2x SSC下洗涤。
由于遗传密码的简并性而与SEQ ID NO:7、8、12、13、47、50和56所示的核酸不同的分离的核酸也在本公开文本的范围内。例如，许多氨基酸由多于一个三联体指定。指定同一种氨基酸的密码子或同义密码子(例如，CAU和CAC是组氨酸的同义密码子)可以产生“沉默”突变，其不影响蛋白质的氨基酸序列。然而，预期在哺乳动物细胞中存在确实导致主题蛋白质的氨基酸序列变化的DNA序列多态性。本领域技术人员应理解，由于天然等位基因变异，编码特定蛋白质的核酸的一个或多个核苷酸(多达约3％-5％的核苷酸)的这些变异可以存在于给定物种的个体中。任何和所有此类核苷酸变异和所得氨基酸多态性都在本公开文本的范围内。
在某些实施方案中，本公开文本的重组核酸可以与表达构建体中的一个或多个调节核苷酸序列可操作地连接。调节核苷酸序列通常将适合于用于表达的宿主细胞。对于各种宿主细胞，本领域中已知多种类型的合适的表达载体和合适的调节序列。通常，所述一个或多个调节核苷酸序列可以包括但不限于启动子序列、前导序列或信号序列、核糖体结合位点、转录起始序列和终止序列、翻译起始序列和终止序列、以及增强子或激活子序列。本公开文本考虑了如本领域中已知的组成型或诱导型启动子。启动子可以是天然存在的启动子或组合多于一种启动子的元件的杂合启动子。表达构建体可以存在于细胞中的附加体诸如质粒上，或者表达构建体可以插入染色体中。在一些实施方案中，表达载体含有可选择标记基因以允许选择经转化的宿主细胞。可选择标记基因是本领域中熟知的，并且随着所用宿主细胞而变化。
在本公开文本的某些方面中，主题核酸在包含编码ActRIIA或ActRIIB多肽的核苷酸序列、相互作用对的第一成员和/或第二成员(例如，来自IgG重链的恒定区)和/或单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的表达载体中提供，并且可操作地连接至至少一个调节序列。调节序列是本领域公认的，并且被选择用于指导ActRIIA或ActRIIB多肽、相互作用对的第一成员和/或第二成员(例如，来自IgG重链的恒定区)和/或单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的表达。因此，术语调节序列包括启动子、增强子和其他表达控制元件。示例性调节序列描述于Goeddel；Gene Expression Technology:Methods inEnzymology,Academic Press,San Diego,CA(1990)中。例如，当可操作地连接至DNA序列时，控制所述DNA序列表达的各种表达控制序列中的任何一种都可以用于表达编码ActRIIA或ActRIIB多肽、相互作用对的第一成员和/或第二成员(例如，IgG重链的恒定区)和/或单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的DNA序列的这些载体中。此类有用的表达控制序列包括例如SV40的早期和晚期启动子、tet启动子、腺病毒或巨细胞病毒立即早期启动子、RSV启动子、lac系统、trp系统、TAC或TRC系统、T7启动子(其表达由T7 RNA聚合酶指导)、噬菌体λ的主要操纵子和启动子区域、fd外壳蛋白的控制区域、3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶的启动子、酸性磷酸酶的启动子(例如，Pho5)、酵母α-交配因子的启动子、杆状病毒系统的多面体启动子和已知控制原核或真核细胞或其病毒的基因表达的其他序列及其各种组合。应理解，表达载体的设计可以取决于诸如待转化的宿主细胞和/或期望表达的蛋白质类型的选择等因素。此外，还应考虑载体的拷贝数、控制该拷贝数的能力以及由所述载体编码的任何其他蛋白质诸如抗生素标记的表达。
本公开文本的重组核酸可以通过将所克隆基因或其部分连接至适合于在原核细胞、真核细胞(酵母、禽类、昆虫或哺乳动物)或两者中表达的载体中来产生。用于生产重组ActRIIA或ActRIIB多肽、相互作用对的第一成员和/或第二成员(例如，来自IgG重链的恒定区)和/或单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的表达媒介物包括质粒和其他载体。例如，合适的载体包括以下类型的质粒：用于在原核细胞(诸如大肠杆菌)中表达的pBR322衍生的质粒、pEMBL衍生的质粒、pEX衍生的质粒、pBTac衍生的质粒和pUC衍生的质粒。
一些哺乳动物表达载体既含有原核序列以促进载体在细菌中的增殖，又含有一个或多个在真核细胞中表达的真核转录单位。pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2-dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko-neo和pHyg衍生的载体是适合于转染真核细胞的哺乳动物表达载体的例子。将这些载体中的一些用来自细菌质粒(诸如pBR322)的序列修饰，以促进原核和真核细胞中的复制和药物抗性选择。可替代地，病毒诸如牛乳头瘤病毒(BPV-1)或爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)(pHEBo、pREP衍生的和p205)的衍生物可以用于在真核细胞中蛋白质的短暂表达。其他病毒(包括逆转录病毒)表达系统的例子可以在下面基因疗法递送系统的描述中找到。用于质粒的制备和宿主生物体的转化中的各种方法是本领域中熟知的。对于用于原核和真核细胞两者的其他合适的表达系统，以及一般的重组程序，参见例如Molecular Cloning A Laboratory Manual,第3版,Sambrook,Fritsch和Maniatis编(Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001)。在一些情形中，可能需要通过使用杆状病毒表达系统来表达重组多肽。此类杆状病毒表达系统的例子包括pVL衍生的载体(诸如pVL1392、pVL1393和pVL941)、pAcUW衍生的载体(诸如pAcUW1)和pBlueBac衍生的载体(诸如含有β-gal的pBlueBac III)。
在优选的实施方案中，载体将被设计用于在CHO细胞中生产主题ActRIIA或ActRIIB多肽、相互作用对的第一成员和/或第二成员(例如，来自IgG重链的恒定区)和/或单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体，诸如Pcmv-Script载体(Stratagene，加利福尼亚州拉霍亚市(La Jolla,Calif.))、pcDNA4载体(Invitrogen，加利福尼亚州卡尔斯巴德市(Carlsbad,Calif.))和pCI-neo载体(Promega，威斯康星州麦迪逊市(Madison,Wisc.))。将显而易见的是，主题基因构建体可以用于致使主题ActRIIA或ActRIIB多肽、相互作用对的第一成员和/或第二成员(例如，来自IgG重链的恒定区)、和/或单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体在培养物中增殖的细胞中表达，例如，以生产用于纯化的蛋白质，包括融合蛋白或变体蛋白。
本公开文本还涉及用重组基因转染的宿主细胞，所述重组基因包括主题ActRIIA或ActRIIB多肽、相互作用对的第一成员和/或第二成员(例如，来自IgG重链的恒定区)和/或单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体中的一种或多种的编码序列。所述宿主细胞可以是任何原核或真核细胞。例如，本公开文本的ActRIIA或ActRIIB多肽、相互作用对的第一成员和/或第二成员(例如，来自IgG重链的恒定区)和/或单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体可以在细菌细胞诸如大肠杆菌(E.coli)、昆虫细胞(例如，使用杆状病毒表达系统)、酵母或哺乳动物细胞[例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系]中表达。其他合适的宿主细胞是本领域技术人员已知的。
因此，本公开文本还涉及生产主题ActRIIA或ActRIIB多肽、相互作用对的第一成员和/或第二成员(例如，来自IgG重链的恒定区)和/或单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的方法。例如，可以在适当条件下培养用编码ActRIIA或ActRIIB多肽、相互作用对的第一成员和/或第二成员(例如，来自IgG重链的恒定区)和/或单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的表达载体转染的宿主细胞，以允许ActRIIA或ActRIIB多肽、相互作用对的第一成员和/或第二成员(例如，来自IgG重链的恒定区)和/或单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的表达发生。所述一种或多种多肽可以分泌并从细胞和含有所述一种或多种多肽的培养基的混合物中分离。可替代地，ActRIIA或ActRIIB多肽、相互作用对的第一成员和/或第二成员(例如，来自IgG重链的恒定区)和/或单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体可以从获得自收获和裂解的细胞的细胞质或膜部分分离。细胞培养物包括宿主细胞、培养基和其他副产物。用于细胞培养的合适的培养基是本领域中熟知的。可以使用本领域中已知的纯化蛋白质的技术从细胞培养基、宿主细胞或两者中分离主题多肽，所述技术包括离子交换色谱法；凝胶过滤色谱法；超滤法；电泳法；用对ActRIIA或ActRIIB多肽、相互作用对的第一成员和/或第二成员(例如，来自IgG重链的恒定区)、和/或单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的特定表位具有特异性的抗体的免疫亲和纯化法；以及用结合与ActRIIA或ActRIIB多肽、相互作用对第一成员和/或第二成员(例如，IgG重链的恒定区)和/或单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体融合的结构域的药剂的亲和纯化法(例如，蛋白A柱可以用于纯化本文所公开的任何多肽)。在一些实施方案中，ActRIIA或ActRIIB多肽、相互作用对的第一成员和/或第二成员(例如，来自IgG重链的恒定区)和/或单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体包含促进纯化的结构域。
在一些实施方案中，通过一系列柱色谱步骤实现纯化，包括例如以任何顺序的以下步骤中的三步或更多步：蛋白A色谱、Q琼脂糖色谱、苯基琼脂糖色谱、尺寸排阻色谱和阳离子交换色谱。可以用病毒过滤和缓冲液置换完成纯化。可以将例如单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体纯化至如通过尺寸排除色谱法确定的>90％、>91％、>92％、>93％、>94％、>95％、>96％、>97％、>98％或>99％的纯度，以及如通过SDS PAGE确定的>90％、>91％、>92％、>93％、>94％、>95％、>96％、>97％、>98％或>99％的纯度。目标纯度水平应是足以在哺乳动物系统(特别是非人灵长类动物、啮齿动物(小鼠)和人)中获得期望的结果的纯度水平。
在另一个实施方案中，编码纯化前导序列的融合基因可以允许使用Ni2+金属树脂通过亲和色谱法纯化表达的构建体，所述纯化前导序列诸如在重组ActRIIA或ActRIIB多肽、相互作用对的第一成员和/或第二成员(例如，来自IgG重链的恒定区)和/或单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的所需部分N末端处的聚-(His)/肠激酶切割位点序列。随后可以通过用肠激酶处理除去纯化前导序列，以提供纯化的ActRIIA或ActRIIB多肽或蛋白质复合物。参见例如，Hochuli等人(1987)J.Chromatography 411:177；以及Janknecht等人(1991)PNAS USA 88:8972。
制备融合基因的技术是熟知的。实质上，编码不同多肽序列的各种DNA片段的连接按照常规技术进行，所述常规技术采用平端或错端末端进行连接、进行限制酶消化以提供适当的末端、适当地填充粘性末端、进行碱性磷酸酶处理以避免不期望的连接以及进行酶促连接。在另一个实施方案中，融合基因可以通过包括自动化DNA合成仪的常规技术合成。可替代地，可以使用锚定引物进行基因片段的PCR扩增，所述锚定引物在两个连续基因片段之间产生互补突出端，所述两个连续基因片段随后可以退火以产生嵌合基因序列。参见例如，Current Protocols in Molecular Biology,编辑Ausubel等人,John Wiley&Sons:1992。
5.筛选测定
在某些方面，本公开文本涉及使用单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体来鉴定作为ActRIIA或ActRIIB激动剂或拮抗剂的化合物(药剂)。可以对通过这种筛选鉴定出的化合物进行测试，以评估其治疗肾脏疾病或病症(例如，奥尔波特综合征、局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)、多囊肾病、慢性肾脏疾病)的能力。可以在例如动物模型中测试这些化合物。
在某些方面，本公开文本涉及使用主题单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体来鉴定可以用于治疗、预防肾脏疾病或病症或降低肾脏疾病或病症的进展速率和/或严重性，特别是治疗、预防一种或多种肾脏相关并发症或降低一种或多种肾脏相关并发症的进展速率和/或严重性的化合物(药剂)。
存在通过一种或多种ActRIIA或ActRIIB配体的靶向信号传导(例如Smad信号传导)来筛选治疗肾脏疾病或病症的治疗剂的许多方法。在某些实施方案中，可以进行化合物的高通量筛选以鉴定扰乱ActRIIA或ActRIIB配体介导的对所选细胞系的作用的药剂。在某些实施方案中，进行测定以筛选和鉴定特异性地抑制或减少ActRIIA或ActRIIB配体(例如，激活素A、激活素B、GDF11、GDF8、GDF3、BMP5、BMP6或BMP10)与其结合配偶体(诸如ActRIIA或ActRIIB)结合的化合物。可替代地，所述测定可以用于鉴定增强ActRIIA或ActRIIB配体与其结合配偶体(诸如ActRIIA或ActRIIB)结合的化合物。在另一实施方案中，所述化合物可以通过其与ActRIIA或ActRIIB相互作用的能力被鉴定。
各种测定形式将能满足本领域普通技术人员，并且根据本公开文本，本文未明确描述的测定形式将能被本领域普通技术人员所理解。如本文所述，本发明的测试化合物(药剂)可以通过任何组合化学方法来产生。可替代地，主题化合物可以是在体内或在体外合成的天然存在的生物分子。要针对其充当组织生长调节剂的能力测试的化合物(药剂)可以例如由细菌、酵母、植物或其他生物体产生(例如，天然产物)，化学地产生(例如，小分子，包括肽模拟物)，或重组地产生。本发明考虑的测试化合物包括非肽基有机分子、肽、多肽、肽模拟物、糖、激素和核酸分子。在某些实施方案中，测试剂是分子量低于约2,000道尔顿的有机小分子。
本公开文本的测试化合物可以作为单个的离散实体提供，或者在诸如通过组合化学制备的复杂性较高的文库中提供。这些文库可以包含例如醇、烷基卤、胺、酰胺、酯、醛、醚和其他类别的有机化合物。尤其是在初始筛选步骤中，测试化合物可以呈分离的形式或作为化合物的混合物被呈递给测试系统。任选地，所述化合物可以任选地用其他化合物衍生化并具有促进化合物分离的衍生基团。衍生基团的非限制性例子包括生物素、荧光素、地高辛(digoxygenin)、绿色荧光蛋白、同位素、多组氨酸、磁珠、谷胱甘肽S转移酶(GST)、可光活化的交联剂或其任何组合。
在测试化合物和天然提取物的文库的许多药物筛选程序中，需要高通量测定以使在给定时间段中观测的化合物的数目最大化。在无细胞系统(诸如可以用纯化的或半纯化的蛋白质衍生的)中进行的测定通常优选作为“主要”筛选，因为它们可以产生以允许快速发展并且相对容易地检测到由测试化合物介导的分子靶标中的改变。此外，测试化合物的细胞毒性或生物利用度的影响通常可以在体外系统中忽略，而所述测定主要集中于药物对分子靶标的影响，这可能表现为在ActRIIA或ActRIIB配体(例如，激活素A、激活素B、GDF11、GDF8、GDF3、BMP5、BMP6或BMP10)与其结合配偶体(诸如ActRIIA或ActRIIB)之间的结合亲和力的改变。
仅用于说明，在本公开文本的示例性筛选测定中，出于测定的目的适当时使感兴趣的化合物与通常能够结合ActRIIB配体的分离和纯化的ActRIIB多肽接触。然后向化合物和ActRIIB多肽的混合物中添加含有ActRIIB配体(例如，GDF11)的组合物。ActRIIB/ActRIIB配体复合物的检测和定量提供了用于确定化合物在抑制(或加强)ActRIIB多肽与其结合蛋白之间的复合物形成方面的功效的方法。所述化合物的功效可以通过从使用各种浓度的测试化合物获得的数据产生剂量-反应曲线来评估。此外，还可以进行对照测定以提供用于比较的基线。例如，在对照测定中，将分离和纯化的ActRIIB配体添加至包含ActRIIB多肽(例如，单臂ActRIIB异多聚体)的组合物中，并且在不存在测试化合物的情况下定量ActRIIB/ActRIIB配体复合物的形成。应理解，一般而言，可以改变可混合反应物的顺序，并且可以同时混合。此外，代替纯化的蛋白质，细胞提取物和溶解产物可以用于提供合适的无细胞测定系统。
ActRIIA或ActRIIB配体与其结合蛋白之间的复合物形成可以通过多种技术检测。例如，可以使用例如可检测标记的蛋白质(诸如放射性标记的(例如，32P、35S、14C或3H)、荧光标记的(例如，FITC)或酶标记的ActRIIB多肽和/或其结合蛋白)通过免疫测定或通过色谱检测来定量复合物形成的调节。
在某些实施方案中，本公开文本考虑了使用荧光偏振测定和荧光共振能量转移(FRET)测定来直接或间接地测量ActRIIA或ActRIIB配体与其结合蛋白之间相互作用的程度。此外，其他检测模式(诸如基于光波导的检测模式(参见例如PCT公开WO 96/26432和美国专利号5,677,196)、表面等离子体共振(SPR)、表面电荷传感器和表面力传感器)与本公开文本的许多实施方案是相容的。
此外，本公开文本考虑使用相互作用捕获测定，也称为“双杂交测定”，用于鉴定破坏或加强ActRIIA或ActRIIB配体与其结合配偶体之间的相互作用的药剂。参见例如，美国专利号5,283,317；Zervos等人(1993)Cell 72:223-232；Madura等人(1993)J Biol Chem268:12046-12054；Bartel等人(1993)Biotechniques 14:920-924；以及Iwabuchi等人(1993)Oncogene 8:1693-1696。在具体的实施方案中，本公开文本考虑使用反向双杂交系统来鉴定解离在ActRIIA或ActRIIB配体与其结合蛋白之间的相互作用的化合物(例如，小分子或肽)[参见例如，Vidal和Legrain,(1999)Nucleic Acids Res 27:919-29；Vidal和Legrain,(1999)Trends Biotechnol 17:374-81；以及美国专利号5,525,490、5,955,280和5,965,368]。
在某些实施方案中，主题化合物通过其与ActRIIA或ActRIIB配体相互作用的能力被鉴定。化合物与ActRIIA或ActRIIB配体之间的相互作用可以是共价的或非共价的。例如，这种相互作用可以在蛋白质水平上使用体外生物化学方法来鉴定，所述方法包括光交联、放射性标记配体结合和亲和色谱法[参见例如Jakoby WB等人(1974)Methods inEnzymology 46:1]。在某些情况下，可以在基于机制的测定(诸如用于检测与ActRIIA或ActRIIB配体结合的化合物的测定)中筛选化合物。这可以包括固相或流体相结合事件。可替代地，编码ActRIIA或ActRIIB配体的基因可以用报告系统(例如，β-半乳糖苷酶、萤光素酶或绿色荧光蛋白)转染到细胞中，并且优选地通过高通量筛选或用文库的单独成员针对文库进行筛选。可以使用其他基于机制的结合测定；例如，检测自由能变化的结合测定。结合测定可以用固定至孔、珠粒或芯片或通过固定化抗体捕获的靶标进行或通过毛细管电泳进行解析。通常可以使用比色终点或荧光或表面等离子体共振来检测结合的化合物。
6.治疗用途
部分地，本公开文本涉及治疗肾脏疾病或病症(例如，奥尔波特综合征、局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)、多囊肾病、慢性肾脏疾病)的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的本公开文本的单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体、或单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的组合。在一些实施方案中，本公开文本的单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体、或单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的组合可以用于治疗或预防与ActRIIA或ActRIIB多肽和/或ActRIIA或ActRIIB配体(例如，激活素A、激活素B、GDF11、GDF8、GDF3、BMP5、BMP6和BMP10)的异常活性相关的疾病或病症。
在某些实施方案中，本发明提供了通过向有需要的个体施用治疗有效量的如本文所述的单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体、或单臂ActRIIA异多聚体或单臂的ActRIIB异多聚体的组合任选地与一种或多种另外的活性剂和/或支持疗法组合治疗所述个体的方法。
术语“肾”和“肾脏”在本文中可互换使用。
术语“治疗(treatment/treating)”、“减轻”等在本文中通常意指获得所需的药理学和/或生理学作用，并且还可以用于指改善、减轻和/或降低所治疗病症的一种或多种临床并发症的严重性。就完全或部分延迟疾病、病症或其并发症的发作或复发而言，所述作用可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病或病症和/或可归因于所述疾病或病症的不良作用而言，所述作用可以是治疗性的。如本文所用，“治疗”包括对哺乳动物(特别是人)的疾病或病症的任何治疗。如本文所用，“预防”障碍或病症的治疗剂是指如下化合物，所述化合物在统计样品中相对于未经治疗的对照样品降低经治疗的样品中所述疾病或病症的发生，或相对于未经治疗的对照样品延迟了所述疾病或病症的发作。
一般而言，如本公开文本所述的疾病或病症的治疗或预防通过施用有效量的单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体来实现。药剂的有效量是指在必要的剂量和持续必要的时间段的情况下有效实现所需的治疗或预防结果的量。本公开文本的药剂的治疗有效量可以根据诸如以下等因素而变化：疾病状态，个体的年龄、性别和体重，以及药剂诱发个体的所需反应的能力。预防有效量是指在必要的剂量和持续必要的时间段的情况下有效实现所需的预防结果的量。
术语“患者”、“受试者”或“个体”在本文中可互换使用，并且是指人、或非人动物。这些术语包括哺乳动物，诸如人、非人灵长类动物、实验动物、牲畜(包括牛、猪、骆驼等)、伴侣动物(例如犬、猫、其他家养动物等)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。在特定的实施方案中，患者、受试者或个体是人。
如本文所用的术语“基线”是指可以比较的初始测量。在一些情形中，基线测量可以是在向受试者仅施用标准护理(SOC)时进行的测量。在一些情形中，可以在不向受试者施用SOC的情况下进行基线测量。基线测量也可以是在施用本公开文本的单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体和/或SOC之前进行的测量。
在某些方面，本公开文本考虑了单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体与一种或多种另外的活性剂或其他支持疗法组合治疗或预防疾病或病症(例如，奥尔波特综合征、局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)、多囊肾病、慢性肾脏疾病)的用途。如本文所用，“与……组合”(“in combination with”或“combined with”)、“……的组合”或“联合”施用是指任何形式的施用，使得另外的活性剂或支持疗法(例如，第二、第三、第四等)在体内仍然有效(例如，多种化合物在某一时间段内同时对患者有效，这可以包括那些化合物的协同作用)。有效性可能与药剂在血液、血清或血浆中的可测量浓度无关。例如，不同的治疗化合物可以在相同的制剂中或在单独的制剂中同时或依序施用，并且可以按不同的时间表施用。因此，接受这种治疗的受试者可以受益于不同活性剂或疗法的组合作用。本公开文本的一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体可以与一种或多种其他另外的药剂或支持疗法(诸如本文所公开的那些)同时、在其之前或之后施用。一般而言，每种活性剂或疗法将按照针对该特定药剂确定的剂量和/或时间表施用。方案中使用的特定组合将考虑本公开文本的单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体与另外的活性剂或疗法和/或所需效果的相容性。
在一些实施方案中，本公开文本考虑了治疗肾脏疾病或病症的一种或多种并发症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体。在一些实施方案中，本公开文本考虑了预防肾脏疾病或病症的一种或多种并发症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体。在一些实施方案中，本公开文本考虑了降低肾脏疾病或病症的进展速率的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体。在一些实施方案中，本公开文本考虑了降低肾脏疾病或病症的一种或多种并发症的进展速率的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体。在一些实施方案中，本公开文本考虑了降低肾脏疾病或病症的严重性的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体。在一些实施方案中，本公开文本考虑了降低肾脏疾病或病症的一种或多种并发症的严重性的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体。在一些实施方案中，肾脏疾病或病症选自奥尔波特综合征、局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)、多囊肾病和慢性肾脏疾病。在一些实施方案中，肾脏疾病或病症是奥尔波特综合征。在一些实施方案中，肾脏疾病或病症是局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)。在一些实施方案中，肾脏疾病或病症是多囊肾病。在一些实施方案中，肾脏疾病或病症是慢性肾脏疾病。在一些实施方案中，受试者具有肾功能下降。在一些实施方案中，本公开文本的方法减缓肾功能下降。
在某些方面，本公开文本涉及治疗、预防或降低肾脏疾病或病症的进展速率和/或严重性的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体。在一些实施方案中，所述方法涉及治疗患有奥尔波特综合征的受试者。在一些实施方案中，所述方法涉及治疗患有经证实的遗传诊断的奥尔波特综合征的受试者。
奥尔波特综合征也称为遗传性肾炎，是由编码IV型胶原α-3、α-4和α-5链的基因突变引起的一种遗传异质性疾病。IV型胶原α链通常位于包括肾脏在内的全身各种基膜中。这些链的异常可以导致这些部位的基膜有缺陷，进而导致奥尔波特综合征的临床特征(例如，进行性肾小球疾病)。
奥尔波特综合征的传递可以是X连锁的、常染色体隐性的或常染色体显性的。在一些实施方案中，受试者患有X连锁奥尔波特综合征。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗患有X连锁奥尔波特综合征的受试者的方法。X连锁传递占受累患者的大多数，并且由X染色体上的COL4A5基因突变引起。在一些实施方案中，受试者具有COL4A5基因的遗传缺陷。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗具有COL4A5基因的一个或多个遗传缺陷的受试者的方法。常染色体隐性变体占奥尔波特综合征患者的大约15％，并且由COL4A3或COL4A4基因的遗传缺陷引起。在一些实施方案中，受试者患有常染色体隐性奥尔波特综合征。常染色体显性疾病似乎占奥尔波特综合征患者的约20％与约30％之间，并且由COL4A3或COL4A4基因的杂合突变引起。在一些实施方案中，受试者患有常染色体显性奥尔波特综合征。在一些实施方案中，受试者具有COL4A3基因的杂合突变。在一些实施方案中，受试者具有COL4A4基因的杂合突变。在一些实施方案中，受试者具有COL4A3基因的遗传缺陷。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗具有COL4A3基因的一个或多个遗传缺陷的受试者的方法。在一些实施方案中，受试者具有COL4A4基因的遗传缺陷。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗具有COL4A4基因的一个或多个遗传缺陷的受试者的方法。在一些实施方案中，受试者具有COL4A3和COLA4A基因的遗传缺陷。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗具有COL4A3和COL4A4基因的一个或多个遗传缺陷的受试者的方法。一些家族由于三个基因(COL4A3、COL4A4、COL4A5)中的两个基因的突变传递而展现出二基因遗传。在一些实施方案中，受试者具有三个基因(COL4A3、COL4A4、COL4A5)中的两个基因的突变。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗具有COL4A3、COL4A4和/或COL4A5基因的一个或多个遗传缺陷的受试者的方法。
奥尔波特综合征的典型表现是基于患有X连锁疾病的受累男性的临床表现。在一些实施方案中，患有X连锁疾病的受试者具有进展为终末期肾脏疾病(ESRD)的肾小球疾病。患有常染色体隐性疾病的患者的临床表现和病程与患有X连锁疾病的患者相似。患有常染色体显性疾病的患者通常展现出更逐渐的肾功能丧失。
最初，奥尔波特综合征的肾脏表现为典型的无症状持续性显微镜下血尿(例如，尿中存在血)，其通常出现在受累患者的儿童早期。由于在常规儿科初级护理中很少进行筛查性尿分析，除非患者因为受累的家庭成员而进行筛查或在偶然发现另一问题时发现，否则可能无法检测到显微镜下血尿。肉眼可见血尿可能是最初的呈现结果，并且通常发生在上呼吸道感染后。然而，肉眼可见血尿的反复发作并不罕见，尤其是在儿童期内。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗患有无症状持续性显微镜下血尿的受试者的方法。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗患有肉眼可见血尿的受试者的方法。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗具有肉眼可见血尿反复发作的受试者的方法。在一些实施方案中，本公开文本涉及降低有需要的受试者(例如，患有奥尔波特综合征的受试者)的无症状持续性显微镜下血尿、肉眼可见血尿或持续性显微镜下血尿的严重性、发生率和/或持续时间的方法。
患有奥尔波特综合征的患者通常具有正常的C3水平，C3是在身体免疫防御中起着不可或缺的作用的补体途径组分。C3降低可能与急性肾小球肾炎、膜增生性肾小球肾炎、免疫复合物疾病、活动性系统性红斑狼疮、感染性休克和终末期肝病等病症相关。在儿童早期，血清肌酐和血压测量通常也处于正常水平。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗具有正常C3水平的奥尔波特综合征受试者的方法。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗与基线测量相比具有降低的C3水平的奥尔波特综合征受试者的方法。在一些实施方案中，本公开文本涉及增加有需要的受试者(例如，患有奥尔波特综合征的受试者)的C3水平的方法。
患有奥尔波特综合征的受试者中可能出现蛋白尿、高血压和进行性肾功能不全。蛋白尿包括尿中存在过量蛋白质。白蛋白是由肝脏产生的蛋白质，其大致占血液中蛋白质的50％-60％。因此，与常规蛋白尿检查相比，尿中的白蛋白浓度是任何肾脏疾病的最敏感指标之一，特别是对于患有糖尿病或高血压的受试者。此测量通常被称为白蛋白尿。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗患有蛋白尿的受试者的方法。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗患有高血压的受试者的方法。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗患有进行性肾功能不全的受试者的方法。在一些实施方案中，本公开文本涉及降低有需要的受试者(例如，患有奥尔波特综合征的受试者)的蛋白尿、高血压和进行性肾功能不全中的一种或多种的严重性、发生率和/或持续时间的方法。
患有奥尔波特综合征的受试者可能发展为终末期肾脏疾病(ESRD)。在许多其他肾脏疾病和病症中，患有X连锁或常染色体隐性奥尔波特综合征的患者中，ESRD通常发生在16岁与35岁的年龄之间。在一些家族中，尤其是在患有常染色体显性奥尔波特综合征的那些中，病程更为缓慢，肾衰竭延迟直到年龄45至60岁。患有X连锁奥尔波特综合征的女性可能具有与更小年龄时的更严重的肾功能障碍和ESRD相关的肉眼可见血尿、蛋白尿和弥漫性肾小球基膜(GBM)增厚的反复发作。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗患有ESRD的奥尔波特综合征受试者的方法。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗患有X连锁奥尔波特综合征的女性的方法。在一些实施方案中，本公开文本涉及降低有需要的受试者(例如，患有奥尔波特综合征的受试者)中与更严重的肾功能障碍和ESRD相关的肉眼可见血尿、蛋白尿和弥漫性肾小球基膜(GBM)增厚中的一种或多种的严重性、发生率和/或持续时间的方法。
奥尔波特综合征的诊断可以通过分子遗传学测试或通过皮肤或肾活检来进行。分子遗传学下一代分析是对具有持续性血尿和/或终末期肾脏疾病(ESRD)阳性家族史的患者和患有慢性肾脏疾病(CKD)(无论其家族史如何)的患者进行诊断的优选方法。可以通过肾活检样品中肾小球基膜(GBM)分层的特征性发现的存在、或通过免疫染色确定的IV型胶原的异常或通过鉴定COL4A3、COL4A4或COL4A5中的一个或多个突变将奥尔波特综合征与其他肾小球疾病区别开。无论是否有FSGS表现，具有COL4A3、COL4A4或COL4A5突变的受试者中薄的肾小球基膜被正确诊断为奥尔波特综合征。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗具有持续性血尿和/或终末期肾脏疾病(ESRD)阳性家族史的奥尔波特综合征受试者和/或治疗患有慢性肾脏疾病(CKD)的患者的方法。
在某些方面，本公开文本涉及治疗、预防或降低肾脏疾病或病症的进展速率和/或严重性的方法，所述方法包括向有需要的受试者、患有局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)的受试者施用有效量的单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体。在一些实施方案中，受试者患有原发性FSGS。在一些实施方案中，受试者患有遗传性FSGS。
FSGS是一种肾小球瘢痕形成疾病，其特征在于肾活检中足细胞足突的消失。当分析患有FSGS的患者的尿液样品时，通常会观察到大量尿蛋白丢失，这可能会进展为肾衰竭。FSGS是美国患有特发性肾病综合征的成人中常见的组织病理学病变，占所有病例的约35％。FSGS也是美国患有终末期肾脏疾病(ESRD)的患者中鉴定的最常见的原发性肾小球疾病。FSGS作为ESRD相关病变的患病率已上升。当通过光学显微镜(LM)、免疫荧光(IF)或电子显微镜(EM)检查时，FSGS的特征在于肾活检标本中至少一个肾小球(局灶)的部分(节段)出现硬化。在一些实施方案中，本公开文本涉及降低有需要的受试者(例如，患有FSGS的受试人)的尿蛋白丢失的严重性、发生率和/或持续时间的方法。在一些实施方案中，本公开文本涉及降低有需要的受试者(例如，患有FSGS的受试人)的肾衰竭的严重性、发生率和/或持续时间的方法。在一些实施方案中，本公开文本涉及降低有需要的受试者(例如，患有FSGS的受试者)的终末期肾脏疾病(ESRD)的严重性、发生率和/或持续时间的方法。在一些实施方案中，本公开文本涉及降低有需要的受试者(例如，患有FSGS的受试者)的肾脏肾小球硬化症的严重性、发生率和/或持续时间的方法。
FSGS是由于多种途径单独或共同导致足细胞损伤的结果引起的，足细胞是肾脏鲍曼囊中包裹在肾小球毛细血管周围的细胞。有五种已知的与FSGS相关的病因和建议的第六种病因。FSGS的病因包括原发性(例如特发性)、继发性(例如适应性)、遗传性、病毒相关的、药物相关的和APOL1风险等位基因相关的。原发性或特发性FSGS与血浆因子相关，对免疫抑制疗法有反应性，并且在肾移植后有复发风险。在原发性FSGS中，对足细胞有毒性的假定循环因子导致广泛的足细胞功能障碍。原发性FSGS最常表现为肾病系统。继发性(例如适应性)FSGS与因身体尺寸增大、肾单位容量减少或与某些疾病相关的单个肾小球超滤过而导致的肾单位工作负荷量过大相关。继发性FSGS通常作为由肾单位质量减少引起的适应性现象出现，或者可以被认为是由药物(例如，海洛因、干扰素和帕米膦酸盐)直接毒性所致的药物诱导的或由病毒感染(例如HIV)所致的病毒诱导的。继发性FSGS通常表现为非肾病性蛋白尿和/或某种程度的肾功能不全。继发性FSGS最常是指发展为对肾小球肥大或超滤过的适应性反应的FSGS。另外的病因学被公认为FSGS的驱动因素，包括由于近40个基因之一的突变导致的高外显率遗传性FSGS(遗传性FSGS)、病毒相关FSGS和药物相关FSGS。新兴的数据支持第六种病因的鉴定：具有亚撒哈拉血统的个体中APOL1风险等位基因相关的FSGS。有时，继发性FSGS包括病毒相关FSGS和/或药物相关FSGS。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗患有原发性或特发性FSGS的受试者的方法。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗患有继发性或适应性FSGS的受试者的方法。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗患有遗传性FSGS的受试者的方法。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗患有病毒相关FSGS的受试者的方法。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗患有药物相关FSGS的受试者的方法。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗患有APOL1风险等位基因相关的FSGS的受试者的方法。
原发性FSGS包含几个原型特征。原发性FSGS是青少年和年轻人中最常见的FSGS形式，并且通常与肾病范围的蛋白尿(有时大量蛋白尿，例如尿中>10g蛋白质/天)、血浆白蛋白水平降低和/或高脂血症相关。在一些实施方案中，肾病范围的蛋白尿包括>3.5g蛋白质/天的蛋白尿和/或<3.5g白蛋白/dL尿(<35g/L)的低白蛋白血症和/或肾病综合征的其他表现(例如，水肿、高脂血症)。在一些实施方案中，本公开文本涉及降低有需要的受试者(例如，患有原发性FSGS的受试者)的肾病范围的蛋白尿、血浆白蛋白水平降低或高脂血症中的一种或多种的严重性、发生率和/或持续时间的方法。在一些实施方案中，本公开文本涉及降低有需要的受试者(例如，患有原发性FSGS的受试人)的蛋白尿的严重性、发生率和/或持续时间的方法。
患有继发性或适应性FSGS的受试者通常表现为随着时间的推移蛋白尿缓慢增加和肾功能不全。患有继发性FSGS的受试者的蛋白尿通常表现为在非肾病范围内(例如，肾病范围通常是每天尿中蛋白质损失3克或更多、和/或尿中每克肌酐存在2克蛋白质)。有时，患有继发性FSGS的受试者的蛋白尿包含正常的血清白蛋白水平。患有继发性FSGS的受试者可能具有升高的肾小球滤过率(GFR)，其是滤过液流经肾脏的流速的测量。在一些实施方案中，患有继发性FSGS和GFR增加的受试者可能患有选自以下的一种或多种另外的和/或相关病症：先天性紫绀型心脏病、镰状细胞贫血、肥胖症、雄激素滥用、睡眠呼吸暂停和高蛋白饮食。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗具有正常GFR的患有继发性FSGS的受试者的方法。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗GFR降低的患有继发性FSGS的受试者的方法。在一些实施方案中，本公开文本涉及降低有需要的受试者(例如，患有原发性FSGS的受试人)的蛋白尿和/或肾功能不全的严重性、发生率和/或持续时间的方法。
病毒与引起FSGS有关。HIV-1可能与FSGS(特别是塌陷性肾小球病变体)相关。与引起FSGS有关的其他病毒包括但不限于巨细胞病毒、细小病毒B19和爱泼斯坦-巴尔病毒。寄生虫也与FSGS相关，其包括但不限于疟原虫(Plasmodium)(疟疾)、曼森血吸虫(Schistosoma mansoni)和丝虫病(filiariasis)。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗患有与HIV-1相关的FSGS的受试者的方法。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗患有与HIV-1、巨细胞病毒、细小病毒B19和爱泼斯坦-巴尔病毒中的一种或多种相关的FSGS的受试者的方法。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗患有与寄生虫相关的FSGS的受试者的方法，所述寄生虫包括但不限于疟原虫(疟疾)、曼森血吸虫和丝虫病。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗患有与感染相关的FSGS的受试者的方法，所述感染包括但不限于HIV、巨细胞病毒、细小病毒B19、爱泼斯坦-巴尔病毒、肺结核、利什曼病和疟疾。
在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗患有与自身免疫性障碍相关的FSGS的受试者的方法，所述自身免疫性障碍与引起FSGS有关，包括但不限于成人斯蒂尔病、系统性红斑狼疮和混合结缔组织障碍。
在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗患有与恶性肿瘤相关的FSGS的受试者的方法，所述恶性肿瘤与引起FSGS有关，包括但不限于噬血细胞性淋巴组织细胞增多症、多发性骨髓瘤和急性单核细胞白血病。
在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗患有与急性肾小球缺血相关的FSGS的受试者的方法，所述急性肾小球缺血与引起FSGS有关，包括但不限于血栓性微血管病、肾梗死、动脉栓塞和亲水性聚合物栓塞。
在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗患有与遗传障碍相关的FSGS的受试者的方法，所述遗传障碍与引起FSGS有关，包括但不限于APOL1高风险等位基因、镰状细胞疾病、线粒体障碍(辅酶Q缺乏)、急性肌阵挛-肾衰竭综合征和Galloway-Mowat综合征。
在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗患有与移植后事件相关的FSGS的受试者的方法，所述移植后事件与引起FSGS有关，包括但不限于动脉病/血栓性微血管病、急性排斥和病毒感染(巨细胞病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、BK多瘤病毒)。
在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗患有与某些药物相关的FSGS的受试者的方法。在一些实施方案中，IFN-α、-β或-γ疗法已与塌陷性肾小球病的发展相关。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗患有与一种或多种足细胞损伤相关的FSGS(包括MCD、FSGS、以及特别是塌陷性FSGS(塌陷性肾小球病))的受试者的方法，所述受试者已经服用和/或仍在服用双膦酸盐。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗患有FSGS的受试者的方法，所述受试者已经接受和/或目前正在接受锂疗法。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗患有FSGS的受试者的方法，所述受试者已经服用和/或仍在服用西罗莫司。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗患有FSGS的受试者的方法，所述受试者已经服用和/或仍在服用蒽环类药物，包括多柔比星(阿霉素)和柔红霉素。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗患有FSGS的受试者的方法，所述受试者已经服用和/或仍在服用与引起FSGS有关的药物，包括但不限于二膦酸盐、干扰素(α、β或γ)、合成代谢类固醇、钙调磷酸酶抑制剂、以及雷帕霉素(mTOR)抑制剂的哺乳动物(机械)靶标。
遗传性FSGS采取两种形式。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗患有与易感基因的一个或多个变体相关的遗传性FSGS(即，具有特定变体的一些个体将发展为FSGS，而其他个体不会)的受试者的方法。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗患有与一个或多个易感基因相关的FSGS的受试者的方法，所述易感基因包括但不限于APOL1和PDSS1。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗患有与一个或多个高外显率突变相关的遗传性FSGS的受试者的方法，所述高外显率突变表现为孟德尔遗传(对于核基因)或母体遗传(对于由线粒体DNA编码的基因)。与FSGS相关的基因数量每年都在上升，在很大程度上是因为整个外显子组定序的散布。已经鉴定了至少38个与遗传性FSGS有关的基因。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗患有与涉及遗传性FSGS的一个或多个基因相关的FSGS的受试者的方法，所述一个或多个基因包括COL4A3、COL4A4、COL4A5、ITGB4、LAMB2、NPHS、NPHS2、CD2AP、PTPRO、MYO1E、ACTN4、INF2、AHRGP24、AHRGDIA、MYH9、INF1、MT-TL1、MT-TL2、MT-TY、COQ2、COQ6、PDSS2、ADCK、WT1、NUP95、NUP203、XP05、NXF5、PAX2、LMX1B、SMARCAL1、NXF5、EYA1、WDR73、LMNA、PLCE1、TRPC6、KANK4、SCARB2和TTC21B。
在一些实施方案中，对怀疑患有FSGS的受试者给予肾活检。肾活检可以通过光学显微镜进行分析，以确定肾小球尺寸、FSGS的组织学变体、微囊性肾小管变化和肾小管肥大中的一个或多个。此外，肾活检可以通过免疫荧光进行分析以排除其他原发性肾小球病和/或通过电子显微镜进行分析以确定足细胞足突消失的程度、足细胞微绒毛转化和微管蛋白网状包涵物中的一个或多个。对肾脏组织学的完整评估对于确定节段性肾小球硬化症的实质背景、将与许多其他肾小球疾病之一相关的FSGS与FSGS的临床病理综合征区分开来非常重要。在一些实施方案中，基因检测用于进一步分析受试者的遗传性FSGS病因学。
在传统上，将FSGS根据哥伦比亚(Columbia)分类法进行分类，所述哥伦比亚分类法根据LM检查定义了FSGS病变的五种形态学变体。此分类系统被设计为仅依赖于病理标准，并且不将这些发现与临床和/或遗传信息整合。一般而言，肾活检上所见的形态学特征无法在FSGS的遗传形式和非遗传形式之间作出区分。例外情况包括与NPHS1和辅肌动蛋白α4基因突变相关的独特特征以及法布里病、奥尔波特综合征和卵磷脂胆固醇酰基转移酶缺乏症的疾病特异性病变。FSGS的组织学变体包括未另外指定的FSGS(NOS)(以前称为经典FSGS，这是最常见的形式)；塌陷性变体、尖端变体；门周变体；和细胞变体。虽然根据定义，LM上肾小球的外观在这些类型中不同，但它们全部都共有足细胞改变的超微结构发现。尖端病变影响肾小球簇与肾小管极并列的部分，并且尖端病变异常包括尖端鲍曼囊粘连、细胞过多、存在泡沫细胞和/或硬化中的一个或多个。塌陷性变体显示与毛细血管外上皮肥大和/或增生相关的节段性或全局性系膜实变和毛细血管内通畅性丧失。门周和NOS变体分别通过无法确定毛细血管袢的节段性硬化/节段性闭塞伴有基质增多(有或没有玻璃样变性)是否涉及门附近的节段或特定节段来确定。细胞病变是最难可再现地鉴定的病变。细胞病变显示节段性毛细血管内细胞增多阻塞性管腔，伴有或不伴有泡沫细胞和核破裂。
在某些方面，本公开文本涉及治疗、预防或降低肾脏疾病或病症的进展速率和/或严重性的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体，其中所述肾脏疾病或病症是多囊肾病(PKD)。
多囊肾病以两种形式出现：常染色体隐性(ARPKD)和常染色体显性(ADPKD)。这两种形式的疾病具有不同的遗传基础，并且已经鉴定了两个参与ADPKD的基因，并且已经鉴定了一个参与ARPKD的基因。这两种不同类型的疾病的表现非常相似，并且两者都是由于肾小管上皮细胞过度增生，最终导致肾小管结构破坏，形成囊肿，导致慢性肾衰竭引起的。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗患有常染色体隐性多囊肾病(ARPKD)的受试者的方法。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗患有常染色体显性多囊肾病(ADPKD)的受试者的方法。
常染色体显性多囊肾病(ADPKD)是肾的遗传性障碍，其特征在于肾明显增大伴有广泛的囊肿形成。随着年龄的增长，这些囊肿逐渐增大，同时肾功能逐渐下降。ADPKD的诊断基于家族史和超声检查评估。在多达25％的ADPKD患者中，没有鉴定出家族史，这可能与亚临床疾病或约5％的此类病例中的新基因突变有关。ADPKD的一个确定特征是双侧肾明显增大。ADPKD患者通常在生命的第五或第六个十年进展为终末期肾脏疾病(ESRD)。ADPKD的进展速率与肾体积直接相关，并且疗法旨在减缓肾体积的下降以延缓进展。在一些实施方案中，本公开文本涉及降低有需要的受试者的肾囊肿的严重性、发生率和/或持续时间的方法。在一些实施方案中，本公开文本涉及降低有需要的受试者的肾增大的严重性、发生率和/或持续时间的方法。在一些实施方案中，本公开文本涉及降低有需要的受试者的肾体积(例如，肾总体积)增加的严重性、发生率和/或持续时间的方法。
ADPKD可以归因于染色体16(PKD1基因座)或染色体4(PKD2基因座)的异常。PKD1突变包含约78％的ADPKD病例，而PKD2突变包含约14％的病例。PKD1患者往往比PKD2患者在更小的年龄进展为ESRD。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗在PKD1基因座有突变的ADPKD受试者的方法。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗在PKD2基因座有突变的ADPKD受试者的方法。
PKD1和PKD2基因分别编码蛋白质多囊蛋白1和多囊蛋白2。这些多囊蛋白是完整的膜蛋白，并且存在于肾小管上皮中。据推测，多囊蛋白1的异常损害肾小管上皮的细胞-细胞和细胞-基质相互作用，而多囊蛋白2的异常损害细胞内的钙信号传导。
由于PKD引起的肾病理生理学组合变化包括但不限于血尿(通常是肉眼可见的)、浓缩缺陷(导致多尿和口渴增加)、轻度蛋白尿、肾结石(在约25％的ADPKD患者中)、胁腹痛和腹痛。此外，囊肿破裂、出血和感染是常见的并发症。进行性肾衰退常常导致终末期肾脏疾病。高血压是最常见的初始临床表现，在约50％至约70％的病例中发生，并且是与ESRD和心血管并发症的下降率直接相关的最常见特征。在一些实施方案中，本公开文本涉及降低有需要的受试者的血尿、浓缩缺陷、蛋白尿、肾结石、胁腹痛和腹痛中的一种或多种的严重性、发生率和/或持续时间的方法。在一些实施方案中，本公开文本涉及降低有需要的受试者的囊肿破裂、出血和感染中的一种或多种的严重性、发生率和/或持续时间的方法。在一些实施方案中，本公开文本涉及降低有需要的受试者的终末期肾脏疾病(ESRD)的严重性、发生率和/或持续时间的方法。在一些实施方案中，本公开文本涉及降低有需要的受试者的高血压的严重性、发生率和/或持续时间的方法。
患有多囊肾病的受试者中常常出现多种肾外表现。颅内动脉瘤发生在约5％的年轻人中以及多达20％的60岁以上患者中。具有相同家族史的受试者中脑动脉瘤或蛛网膜下腔出血的风险最高。肾外囊肿在ADPKD中很常见。常常在这些患者中观察到肝囊肿，并且患病率随年龄增长而增加。已经报道多达94％的35岁以上患者患有肝囊肿。女性中囊肿的总患病率和体积高于男性。ADPKD患者中的肝囊肿很少引起肝功能障碍。很少有患者因急性囊肿感染或出血而发生疼痛。此外，约7％与约36％之间的ADPKD患者发生胰腺囊肿，其中在具有PKD2突变的ADPKD患者中患病率较高。已经在25％至30％的ADPKD患者中观察到心脏瓣膜病。心血管并发症(特别是心脏肥大和冠状动脉疾病)是ADPKD患者死亡的主要原因。在一些实施方案中，本公开文本涉及降低有需要的受试者的脑动脉瘤的严重性、发生率和/或持续时间的方法。在一些实施方案中，本公开文本涉及降低有需要的受试者的肾外囊肿的严重性、发生率和/或持续时间的方法。在一些实施方案中，本公开文本涉及降低有需要的受试者的肝囊肿的严重性、发生率和/或持续时间的方法。在一些实施方案中，本公开文本涉及降低有需要的受试者的胰腺囊肿的严重性、发生率和/或持续时间的方法。在一些实施方案中，本公开文本涉及降低有需要的受试者的心血管并发症(例如心脏肥大、冠状动脉疾病)的严重性、发生率和/或持续时间的方法。
常染色体隐性多囊肾病(ARPKD)是儿童中的肾和肝相关发病率和死亡率显著的原因。大多数ARPKD受试者在新生儿时期表现为肾回声增强。肾脏疾病的特征在于肾肿大、高血压和不同程度的肾功能障碍。超过50％的ARPKD受累个体在生命的第一个十年内进展为终末期肾脏疾病(ESRD)，并且进展为ESRD的ARPKD受试者可能需要肾移植。在一些实施方案中，本公开文本涉及降低有需要的受试者的肾肥大、高血压和肾功能障碍中的一种或多种的严重性、发生率和/或持续时间的方法。在一些实施方案中，本公开文本涉及降低有需要的受试者的终末期肾脏疾病的严重性、发生率和/或持续时间以防止肾移植的需要的方法。
ARPKD可以归因于位于染色体6p21上的PKHD1基因的突变，所述PKHD1基因含有至少66个外显子并且编码一种大的完整膜蛋白纤维囊蛋白(fibrocystin)(也称为多管蛋白(polyductin))。尽管纤维囊蛋白的功能目前未知，但其存在于肾的皮质和髓质集合管、和髓袢升支粗段(thick ascending limb)中以及肝胆管上皮细胞中。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗患有与PKHD1的一个或多个突变相关的ARPKD的受试者的方法。
由于PKHD1突变的多样性，在ARPKD病例中将基因型与表型关联起来可能具有挑战。具有两个截短突变的受试者可能具有更严重的肾脏受累，并且可能有新生儿早期死亡的风险。对于错义突变为纯合子或具有错义突变与截短突变配对的受试者也可能具有严重的表型。对于两个错义突变为杂合子的受试者通常具有较轻的疾病。存活于新生儿期的受试者最通常具有至少一个错义突变。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗包含两个截短突变的ARPKD受试者的方法。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗包含一个或多个错义突变的ARPKD受试者的方法。
在ARPKD中受累的两个主要器官系统是肾和肝胆道。肾的尺寸可能增大和/或具有从髓质放射至皮质的微囊(通常尺寸小于2mm)，并且在囊状表面上可见极小的点。肾脏疾病的严重性与受囊肿累及的肾单位百分比成比例。出现较大的肾囊肿(高达1cm)和间质纤维化，这导致存活超过新生儿期的受试者中可见的肾功能进行性恶化。ARPKD与胆管发育不全相关，因为发育缺陷包括肝内胆管不同程度的扩张和肝纤维化。在一些实施方案中，本公开文本涉及降低肾尺寸增大和/或囊肿存在的严重性、发生率和/或持续时间的方法。
ARPKD的临床表现根据症状发作的年龄和肝或肾受累的主导地位而变化。ARPKD通常在妊娠24周之后通过常规产前超声检查胎儿来进行检测。假定性诊断是基于存在明显肾回声增强伴有皮髓质分化不良的特征性发现。可以检测到直径为5至7mm尺寸范围内的离散囊肿；然而，较大的囊肿并不常见，尤其是直径>10mm的那些囊肿。通常监测ARPKD受试者的血压变化、肾功能、血清电解质浓度、水合状态、营养状态和生长。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗患有ARPKD的受试者的方法，所述方法还包括监测血压、肾功能、血清电解质浓度、水合状态、营养状态和生长中的一个或多个。
在新生儿期中，婴儿可能出现肾脏表现，其可能伴有或不伴有呼吸窘迫。患有ARPKD的婴儿可能出现双侧肾明显增大，这可能会影响肺功能或由于肾压迫胃而导致喂养困难。患有ARPKD的婴儿可能出现肾功能损害，其由血清/血浆肌酐浓度和血尿素氮(BUN)增加所反映。患有终末期肾脏疾病(ESRD)的新生儿可能需要肾替代疗法(RRT)才能存活。患有ARPKD的婴儿可能出现高血压和低钠血症(由于无法最大限度地稀释尿)中的一种或多种。在一些实施方案中，本公开文本涉及降低有需要的受试者的肾功能损害的严重性、发生率和/或持续时间的方法，所述肾功能损害由血清/血浆肌酐浓度和血尿素氮(BUN)增加所反映。在一些实施方案中，本公开文本涉及降低有需要的受试者的高血压和/或低钠血症的严重性、发生率和/或持续时间的方法。
对于存活超过新生儿期的患者，由于持续的肾成熟，肾功能可能改善。然而，随着时间的推移，可能发生肾功能进行性恶化，其可能快速或缓慢并可能导致ESRD。患有ARPKD的青少年受试者可能具有以下中的一种或多种：肾功能进行性恶化(通常开始于由于浓缩能力降低引起的肾小管功能障碍或损伤、多尿和/或多饮的体征，最大尿渗透压低于500mosmol/kg)、由于尿酸化能力降低引起的代谢性酸中毒、高血压、泌尿道感染的反复发作、泌尿异常(包括但不限于轻度蛋白尿、糖尿、高磷酸盐尿和/或尿镁排泄增加)、进行性肾损害以及肾脏生长速率和/或肾尺寸减小。在一些实施方案中，本公开文本涉及降低有需要的受试者的肾功能进行性恶化、进行性肾损害和肾生长速率和/或肾尺寸减小中的一种或多种的严重性、发生率和/或持续时间的方法。
ARPKD的超声发现的特征在于双侧肾回声大伴有皮髓质分化不良。在仅有髓质受累的患者中，标准分辨率的超声检查可能是正常的；然而，高分辨率超声检查能够检测到局限于髓质的导管扩张。巨囊肿通常见于患有常染色体显性疾病的受试者，在患有ARPKD的患者的婴儿期间通常不存在，但可能出现在较大的儿童中。因此，在年长的受试者中，通过超声对ARPKD与常染色体显性多囊肾病(ADPKD)作出区分可能更具挑战性。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗患有ARPKD或ADPKD的受试者的方法，所述方法还包括通过超声区分疾病。
在某些方面，本公开文本涉及治疗、预防或降低肾脏疾病或病症的进展速率和/或严重性的方法，所述方法包括向有需要的受试者、患有慢性肾脏疾病(CKD)的受试者施用有效量的单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体。
慢性肾脏疾病(CKD)是肾脏受损并且不能像健康肾脏那样过滤血液的一种病症。患有CKD的受试者在身体内通常残留有多余的液体和血液废物。在一些实施方案中，本公开文本提供了治疗患有CKD的受试者的方法。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗患有CKD的受试者，其中所述受试者还具有选自以下的一种或多种其他健康状况：贫血或红细胞数量少、感染发生率增加、钙水平低、钾水平高和血液中磷水平高、食欲不振或吃得少、抑郁或生活质量较低。
CKD具有不同的严重性水平，并且通常会随着时间的推移而恶化，尽管治疗已经证明可减缓进展。如果不治疗，CKD可以进展为肾衰竭、终末期肾脏疾病(ESRD)和/或早期心血管疾病，可能导致透析或肾移植才能存活。在一些实施方案中，本公开文本涉及降低有需要的受试者的肾衰竭、终末期肾脏疾病(ESRD)和/或早期心血管疾病的严重性、发生率和/或持续时间的方法。
CKD的诊断通常通过验血测量估计肾小球滤过率(eGFR)和/或通过验尿测量尿中的白蛋白和/或总蛋白质来完成。通常，尿中蛋白质的增加指示CKD。可以进行超声或肾活检以确定潜在的原因。
在一些实施方案中，CKD最初表现为无症状，并且通常通过血清肌酐和/或尿中蛋白质的增加在常规筛查血液工作中检测到。随着CKD受试者的肾功能降低，由于液体超载和肾通过肾素-血管紧张素系统产生血管作用激素而血压升高，由此增加发生高血压和心力衰竭的风险。随着CKD受试者中尿素积累，可能发生氮血症和最终的尿毒症(范围从嗜睡到心包炎和脑病的症状)。由于其全身浓度高，尿素以高浓度在小汗腺汗中排出，并在汗蒸发时在皮肤上结晶(例如“尿素霜”)。在患有CKD的受试者中，钾可能在血液中积累(例如，高钾血症伴有包括不适和可能致命的心律失常的一系列症状)。高钾血症通常直到肾小球滤过率(GFR)降至低于约20至约25ml/min/1.73m2才在患有CKD的受试者中发生，此时肾具有降低的钾排泄能力。CKD中的高钾血症可能因酸血症(其导致钾的细胞外转移)和胰岛素缺乏而加重。患有CKD的受试者可能患有高磷酸盐血症，这可能是由于肾中的磷酸盐清除不良引起的。高磷酸盐血症通过引起血管钙化而导致心血管风险增加。患有CKD的受试者可能患有低钙血症。患有CKD的受试者可能具有矿物质和骨代谢的一种或多种变化，其可能导致钙、磷(磷酸盐)、甲状旁腺激素或维生素D代谢异常；骨转化、矿化、体积、线性生长或强度异常(肾性骨发育不全)；和/或血管或其他软组织钙化。患有CKD的受试者可能患有代谢性酸中毒，这可能是由于从近端小管细胞产生足够氨的能力降低引起的。患有CKD的受试者可能患有贫血。在CKD的后期，受试者可能发生恶病质，导致无意识体重减轻、肌肉萎缩、虚弱和厌食。患有CKD的受试者比普通人群更可能发生动脉粥样硬化伴必然的心血管疾病。在一些实施方案中，本公开文本涉及降低CKD的一种或多种病症或并发症的严重性、发生率和/或持续时间的方法，所述一种或多种病症或并发症选自血压升高、高血压和/或心力衰竭；氮血症；尿毒症；“尿毒霜”；高钾血症；肾排泄钾能力下降；酸血症；高磷酸盐血症；血管钙化；低钙血症；矿物质和骨代谢的变化(特别是可能导致钙、磷(磷酸盐)、甲状旁腺激素或维生素D代谢异常的变化)；骨转化、矿化、体积、线性生长或强度的异常(肾性骨发育不全)；血管或其他软组织钙化；代谢性酸中毒；贫血；恶病质(特别是可能导致无意识体重减轻、肌肉萎缩、虚弱和厌食的恶病质)；和动脉粥样硬化(其可能导致心血管疾病)。
CKD的常见原因是糖尿病、高血压和肾小球肾炎。约五分之一的患有高血压的成人和三分之一的患有糖尿病的成人患有CKD。CKD也可能由以下中的一种或多种引起：血管疾病(包括但不限于诸如双侧肾动脉狭窄等大血管疾病以及诸如缺血性肾病、溶血性尿毒症综合征、血管炎等小血管疾病)、原发性肾小球疾病(局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)和/或IgA肾病(或肾炎))、继发性肾小球疾病(诸如糖尿病性肾病和狼疮肾炎)、肾小管间质性疾病(其包括药物和毒素诱发的慢性肾小管间质性肾炎和反流性肾病)、梗阻性肾病(如双侧肾结石和前列腺良性前列腺增生所例证)和先天性疾病(诸如多囊肾病)。罕见地，感染肾的蛲虫可能导致阻塞性肾病。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗患有由以下中的一种或多种引起的CKD的受试者的方法：糖尿病、高血压和肾小球肾炎、血管疾病(包括但不限于诸如双侧肾动脉狭窄等大血管疾病以及诸如缺血性肾病、溶血性尿毒症综合征、血管炎等小血管疾病)、原发性肾小球疾病(局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)和/或IgA肾病(或肾炎))、继发性肾小球疾病(诸如糖尿病性肾病和狼疮肾炎)、肾小管间质性疾病(其包括药物和毒素诱发的慢性肾小管间质性肾炎和反流性肾病)、梗阻性肾病(如双侧肾结石和前列腺良性前列腺增生所例证)和先天性疾病(诸如多囊肾病)。罕见地，感染肾的蛲虫可能导致阻塞性肾病。
在一些实施方案中，本公开文本涉及监测患有肾脏疾病或病症(例如，奥尔波特综合征、局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)、多囊肾病、慢性肾脏疾病)的受试者的白蛋白尿和/或蛋白尿的方法。尿中蛋白质水平升高是许多肾脏疾病或病症的标志。从一岁开始对有风险的儿童开始进行白蛋白尿和蛋白尿的年度监测。蛋白尿包括尿中异常量的蛋白质的存在。蛋白尿的最敏感的标记是尿白蛋白升高(例如白蛋白尿)。白蛋白通常在血液中循环，并且在没有肾脏疾病或病症的受试者的尿中只发现微量的白蛋白。中度白蛋白尿通常被称为微量白蛋白尿，而重度白蛋白尿通常被称为巨白蛋白尿。白蛋白水平高于上限值被称为重度白蛋白尿或巨白蛋白尿。在一些实施方案中，本公开文本提供了治疗患有白蛋白尿、蛋白尿、微量白蛋白尿和巨白蛋白尿中的一种或多种的受试者的方法。在一些实施方案中，本公开文本涉及降低有需要的受试者的白蛋白尿、蛋白尿、微量白蛋白尿和巨白蛋白尿中的一种或多种的严重性、发生率和/或持续时间的方法。
白蛋白的测量可以具有不同的单位，这取决于此类测量是如何进行的。在一些实施方案中，尿中的白蛋白被测量为白蛋白质量/收集尿的时间段(例如，mg/24小时)。在一些实施方案中，尿中的白蛋白被测量为白蛋白质量/收集的尿体积(例如，mg/L)。在一些实施方案中，尿中的白蛋白被测量为尿中的白蛋白质量/肌酐质量(例如，μg/mg肌酐，称为白蛋白-肌酐比率或ACR)。
在一些实施方案中，对受试者给予验血以确定是否存在肾脏疾病或病症(例如，奥尔波特综合征、局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)、多囊肾病、慢性肾脏疾病)。在一些实施方案中，验尿包括在特定时间段(例如，24小时)对尿进行收集。中度白蛋白尿或微量白蛋白尿包括在24小时尿收集的尿中检测到在约30与约300mg白蛋白/24小时之间的白蛋白水平、和/或在一分钟尿收集的尿中检测到在约20与约200μg白蛋白/1分钟之间的白蛋白水平。重度白蛋白尿或巨白蛋白尿包括在24小时尿收集的尿中检测到高于约300mg白蛋白/24小时的白蛋白水平、和/或在1分钟尿收集的尿中检测到高于约200μg白蛋白/1分钟的白蛋白水平。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗患有中度白蛋白尿或微量白蛋白尿的受试者的方法，所述中度白蛋白尿或微量白蛋白尿包括在24小时尿收集的尿中检测到在约30与约300mg白蛋白/24小时之间的白蛋白水平。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗患有中度白蛋白尿或微量白蛋白尿的受试者的方法，所述中度白蛋白尿或微量白蛋白尿包括在一分钟尿收集的尿中检测到在约20与约200μg白蛋白/1分钟之间的白蛋白水平。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗患有重度白蛋白尿或巨白蛋白尿的受试者的方法，所述中度白蛋白尿或微量白蛋白尿包括在24小时尿收集的尿中检测到高于约300mg白蛋白/24小时的白蛋白水平。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗患有重度白蛋白尿或巨白蛋白尿的受试者的方法，所述中度白蛋白尿或微量白蛋白尿包括在1分钟尿收集的尿中检测到高于约200μg白蛋白/1分钟的白蛋白水平。
在一些实施方案中，验尿包括使用单个尿样品进行斑点试验。在一些实施方案中，验尿包括浸渍片测试。在一些实施方案中，尿浸渍片测试可以提供白蛋白尿水平的估计。在一些实施方案中，中度白蛋白尿或微量白蛋白尿包括从点样品的尿中检测到在约20与约200mg白蛋白/L尿之间的白蛋白水平。在一些实施方案中，重度白蛋白尿或巨白蛋白尿包括从点样品的尿中检测到高于约200mg白蛋白/L尿的白蛋白水平。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗患有中度白蛋白尿或微量白蛋白尿的受试者的方法，所述中度白蛋白尿或微量白蛋白尿包括从点样品的尿中检测到在约20与约200mg白蛋白/L尿之间的白蛋白水平。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗患有重度白蛋白尿或巨白蛋白尿的受试者的方法，所述中度白蛋白尿或微量白蛋白尿包括从点样品的尿中检测到高于约200mg白蛋白/L尿的白蛋白水平。
为了补偿抽检样品(相对于较大的样品收集和/或随时间推移的样品收集)中尿浓度的变化，比较样品中白蛋白的量与肌酐的尿浓度是有用的。这被称为白蛋白/肌酐比率(ACR)。在一些实施方案中，白蛋白尿的存在和/或严重性由尿中白蛋白与肌酐的比率(例如，白蛋白-肌酐比率、ACR，有时称为尿白蛋白-肌酐比率或uACR)确定。ACR下限和上限可以在男性与女性之间有所不同。ACR以尿中白蛋白质量单位/肌酐质量单位进行测量。在一些实施方案中，本公开文本提供了治疗患有中度白蛋白尿或微量白蛋白尿的受试者的方法，所述中度白蛋白尿或微量白蛋白尿包含在约30与约300mg白蛋白/g肌酐之间的ACR。在一些实施方案中，本公开文本提供了治疗患有重度白蛋白尿或巨白蛋白尿的受试者的方法，所述重度白蛋白尿或巨白蛋白尿包含高于约300mg白蛋白/g肌酐的ACR。在一些实施方案中，正常ACR通常低于30mg白蛋白/g肌酐。值得注意的是，任何白蛋白尿测量的测量单位都可能不同。例如，ACR可以测量为μg白蛋白/mg肌酐。ACR也可以测量为g白蛋白/g肌酐。mg白蛋白/g肌酐的单位可与μg白蛋白/mg肌酐的单位互换。如果将白蛋白和肌酐两者都作为质量测量提供，有时提供无单位的ACR。
可以将ACR以尿中白蛋白质量/肌酐浓度来测量。在一些实施方案中，本公开文本提供了治疗有需要的受试者的中度白蛋白尿或微量白蛋白尿的方法，所述中度白蛋白尿或微量白蛋白尿包含在约2.5与约35mg白蛋白/mmol肌酐之间的ACR。在一些实施方案中，本公开文本提供了治疗有需要的受试者的重度白蛋白尿或巨白蛋白尿的方法，所述重度白蛋白尿或巨白蛋白尿包含高于约35mg白蛋白/mmol肌酐的ACR。
描述受试者的肾损伤和功能丧失程度的疾病分期通常被分配给患有肾脏疾病或病症的受试者。白蛋白尿分期通常以ACR来测量。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗患有A1期白蛋白尿的受试者的方法。A1期白蛋白尿包括尿中白蛋白的正常水平至中度升高水平，其中ACR小于30mg白蛋白/g肌酐(或小于3mg白蛋白/mmol肌酐)。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗患有A2期白蛋白尿的受试者的方法。A2期包括中度白蛋白尿或微量白蛋白尿，其中ACR在约30与约300mg白蛋白/g肌酐之间(或在约3与约30mg白蛋白/mmol肌酐之间)。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗患有A3期白蛋白尿的受试者的方法。A3期包括重度白蛋白尿或巨白蛋白尿，其中ACR大于300mg白蛋白/g肌酐(或大于30mg白蛋白/mmol肌酐)。在一些实施方案中，向患有肾脏疾病或病症的受试者施用疗法将延迟或防止发展终末期肾脏疾病。在一些实施方案中，向患有肾脏疾病或病症的受试者施用疗法将降低所述受试者的白蛋白尿分期。在一些实施方案中，本公开文本涉及降低A1期白蛋白尿的严重性、发生率和/或持续时间的方法。在一些实施方案中，本公开文本涉及降低A2期白蛋白尿的严重性、发生率和/或持续时间的方法。在一些实施方案中，本公开文本涉及降低A3期白蛋白尿的严重性、发生率和/或持续时间的方法。在一些实施方案中，本公开文本提供了治疗患有A1期白蛋白尿的受试者的方法，所述方法延迟或防止进展为A2期白蛋白尿。在一些实施方案中，本公开文本提供了治疗患有A2期白蛋白尿的受试者的方法，所述方法延迟或防止进展为A3期白蛋白尿。在一些实施方案中，本公开文本提供了延迟和/或防止有需要的受试者的白蛋白尿分期进展恶化的方法。在一些实施方案中，本公开文本提供了改善有需要的受试者的肾损伤和/或使白蛋白尿分期分类降级的方法。在一些实施方案中，本公开文本提供了将受试者的白蛋白尿分类改善一期或多期的方法。
在一些实施方案中，受试者患有肾病范围内的蛋白尿。在一些实施方案中，肾病范围内的蛋白尿包含在尿中约3与约3.5g之间的蛋白质/24小时/1.73m2体表面积。在一些实施方案中，患有肾病综合征的受试者具有大于3.5g/24小时/1.73m2的蛋白尿。
在一些实施方案中，本公开文本涉及降低患有肾脏疾病或病症的受试者的ACR的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的ACR降低了约0.1与约2.5mg之间的白蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的ACR降低了约2.5与约3.5mg之间的白蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的ACR降低了约3.5与约5.0mg之间的白蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的ACR降低了约5.0与约7.5mg之间的白蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的ACR降低了约7.5与约10.0mg之间的白蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的ACR降低了约10.0与约15.0mg之间的白蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的ACR降低了约15.0与约20.0mg之间的白蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的ACR降低了约20.0与约25.0mg之间的白蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的ACR降低了约30.0与约35.0mg之间的白蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的ACR降低了约40.0与约45.0mg之间的白蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的ACR降低了约45.0与约50.0mg之间的白蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的ACR降低了约50.0与约60.0mg之间的白蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的ACR降低了约60.0与约70.0mg之间的白蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的ACR降低了约70.0与约80.0mg之间的白蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的ACR降低了约80.0与约90.0mg之间的白蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的ACR降低了约90.0与约100.0mg之间的白蛋白/g肌酐。
在一些实施方案中，本公开文本涉及降低患有肾脏疾病或病症的受试者的ACR的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的ACR降低了大于或等于0.5g白蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的绝对ACR降低至小于0.5g白蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的绝对ACR降低至小于0.3g白蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的ACR降低了约0.1与约2.5g之间的白蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的ACR降低了约0.3与约2.5g之间的白蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的ACR降低了约0.5与约2.5g之间的白蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的ACR降低了约0.5与约3.0g之间的白蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的ACR降低了约2.5与约3.5g之间的白蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的ACR降低了约3.5与约5.0g之间的白蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的ACR降低了约5.0与约7.5g之间的白蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的ACR降低了约7.5与约10.0g之间的白蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的ACR降低了约10.0与约15.0g之间的白蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的ACR降低了约15.0与约20.0g之间的白蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的ACR降低了约20.0与约25.0g之间的白蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的ACR降低了约30.0与约35.0g之间的白蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的ACR降低了约40.0与约45.0g之间的白蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的ACR降低了约45.0与约50.0g之间的白蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的ACR降低了约50.0与约60.0g之间的白蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的ACR降低了约60.0与约70.0g之间的白蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的ACR降低了约70.0与约80.0g之间的白蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的ACR降低了约80.0与约90.0g之间的白蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的ACR降低了约90.0与约100.0g之间的白蛋白/g肌酐。
在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的ACR降低了至少2.5％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量(例如，SOC)相比将受试者的ACR降低了至少5％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的ACR降低了至少10％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的ACR降低了至少15％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的ACR降低了至少20％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的ACR降低了至少25％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的ACR降低了至少30％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的ACR降低了大于或等于30％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的ACR降低了至少40％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的ACR降低了大于或等于30％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的ACR降低了至少50％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的ACR降低了大于或等于50％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的ACR降低了至少60％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的ACR降低了至少70％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的ACR降低了至少80％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的ACR降低了至少90％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的ACR降低了至少95％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的ACR降低了至少99％。
在一些实施方案中，可以测量总尿蛋白并且与尿中存在的肌酐进行比较(例如，UPCR)。在一些实施方案中，UPCR是蛋白尿的测量。在一些实施方案中，蛋白尿包含大于0.2mg/mg的尿蛋白-肌酐比率(UPCR)。在一些实施方案中，蛋白尿包含每小时大于4mg/m2的尿蛋白排泄量。在一些实施方案中，肾脏疾病或病症的完全缓解(CR)被定义为小于0.2g蛋白质/g肌酐的持续UPCR测量。在一些实施方案中，肾脏疾病或病症的部分缓解(PR)被定义为具有从基线蛋白尿的约50％减少，并且小于约2g蛋白质/g肌酐的持续UPCR。
在一些实施方案中，本公开文本涉及降低患有肾脏疾病或病症的受试者的UPCR的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体。在一些实施方案中，所述方法涉及将受试者的UPCR降低了约0.2与约1mg之间的尿蛋白/mg肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及将受试者的UPCR降低了小于0.5mg尿蛋白/mg肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及将受试者的UPCR降低了约0.1与约100.0mg之间的尿蛋白/mg肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及将受试者的UPCR降低了约0.1与约2.5mg之间的尿蛋白/mg肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及将受试者的UPCR降低了约2.5与约3.5mg之间的尿蛋白/mg肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及将受试者的UPCR降低了约3.5与约5.0mg之间的尿蛋白/mg肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及将受试者的UPCR降低了约5.0与约7.5mg之间的尿蛋白/mg肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及将受试者的UPCR降低了约7.5与约10.0mg之间的尿蛋白/mg肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及将受试者的UPCR降低了约10.0与约15.0mg之间的尿蛋白/mg肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及将受试者的UPCR降低了约15.0与约20.0mg之间的尿蛋白/mg肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及将受试者的UPCR降低了约20.0与约25.0mg之间的尿蛋白/mg肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及将受试者的UPCR降低了约30.0与约35.0mg之间的尿蛋白/mg肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及将受试者的UPCR降低了约40.0与约45.0mg之间的尿蛋白/mg肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及将受试者的UPCR降低了约45.0与约50.0mg之间的尿蛋白/mg肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及将受试者的UPCR降低了约50.0与约60.0mg之间的尿蛋白/mg肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及将受试者的UPCR降低了约60.0与约70.0mg之间的尿蛋白/mg肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及将受试者的UPCR降低了约70.0与约80.0mg之间的尿蛋白/mg肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及将受试者的UPCR降低了约80.0与约90.0mg之间的尿蛋白/mg肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及将受试者的UPCR降低了约90.0与约100.0mg之间的尿蛋白/mg肌酐。
在一些实施方案中，本公开文本涉及降低患有肾脏疾病或病症的受试者的UPCR的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体。在一些实施方案中，所述方法涉及将受试者的UPCR降低了约0.2与约1g之间的尿蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及将受试者的UPCR降低了小于0.5g尿蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的UPCR降低大于或等于0.5g尿蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的绝对UPCR降低至小于0.5g尿蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的绝对UPCR降低至小于0.3g尿蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及将受试者的UPCR降低了约0.1与约100.0g之间的尿蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及将受试者的UPCR降低了约0.1与约2.5g之间的尿蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及将受试者的UPCR降低了约2.5与约3.5g之间的尿蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及将受试者的UPCR降低了约3.5与约5.0g之间的尿蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及将受试者的UPCR降低了约5.0与约7.5g之间的尿蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及将受试者的UPCR降低了约7.5与约10.0g之间的尿蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及将受试者的UPCR降低了约10.0与约15.0g之间的尿蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及将受试者的UPCR降低了约15.0与约20.0g之间的尿蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及将受试者的UPCR降低了约20.0与约25.0g之间的尿蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及将受试者的UPCR降低了约30.0与约35.0g之间的尿蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及将受试者的UPCR降低了约40.0与约45.0g之间的尿蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及将受试者的UPCR降低了约45.0与约50.0g之间的尿蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及将受试者的UPCR降低了约50.0与约60.0g之间的尿蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及将受试者的UPCR降低了约60.0与约70.0g之间的尿蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及将受试者的UPCR降低了约70.0与约80.0g之间的尿蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及将受试者的UPCR降低了约80.0与约90.0g之间的尿蛋白/g肌酐。在一些实施方案中，所述方法涉及将受试者的UPCR降低了约90.0与约100.0g之间的尿蛋白/g肌酐。
在一些实施方案中，疗法的施用降低尿蛋白排泄。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的UPCR降低了至少2.5％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的UPCR降低了至少5％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的UPCR降低了至少10％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的UPCR降低了至少15％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的UPCR降低了至少20％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的UPCR降低了至少25％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的UPCR降低了至少30％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的UPCR降低了大于或等于30％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的UPCR降低了至少40％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的UPCR降低了大于或等于40％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的UPCR降低了至少50％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的UPCR降低了大于或等于50％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的UPCR降低了至少60％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的UPCR降低了至少70％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的UPCR降低了至少80％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的UPCR降低了至少90％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的UPCR降低了至少95％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的UPCR降低了至少99％。
通过确定肾脏过滤血液的情况如何，可以对受试者给予验血以确定是否存在肾脏疾病或病症(例如，奥尔波特综合征、局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)、多囊肾病、慢性肾脏疾病)。通常，确定肾小球滤过率(GFR)，其测量滤过液(例如血液)通过肾脏进入鲍曼囊的流速。GFR等于任何溶质自由过滤并且既不被肾吸收也不被肾分泌时的清除率。因此，GFR是对尿中从可计算血液体积来源的物质量的测量，并且通常以体积单位/次记录，例如毫升/分钟(mL/min)。针对体表面积调整后，男性中的GFR正常范围为约100与约130mL/min/1.73m2之间，男性中的平均GFR为125mL/min/1.73m2。针对体表面积调整后，40岁以下女性中的GFR正常范围为约90与约120mL/min/1.73m2之间。在2岁以下儿童中通过菊糖清除率测量的GFR为约110mL/min/1.73m2，其渐进地降低。40岁之后，GFR随着年龄的增长而渐进地降低，每年降低了约0.4与约1.2mL/min之间。GFR也可以通过血液和尿中物质的比较测量来计算，使用验血结果来估计(例如eGFR)。在一些实施方案中，使用血清肌酐、年龄、种族和性别变量来测量eGFR。在一些实施方案中，使用Cockcroft-Gault公式、肾脏疾病饮食改良(Modification of Diet in Renal Disease，MDRD)公式、CKD-EPI公式、Mayo二次公式和Schwartz公式中的一种或多种来测量eGFR。
如果不存在肾损伤(其包括在的血液、尿或成像研究中所见的损伤迹象，这包括实验室白蛋白/肌酐比率(ACR)≥30)，在没有慢性肾脏疾病的受试者中，肾小球滤过率(GFR)≥60ml/min/1.73m2被视为正常。GFR<60ml/min/1.73m2持续至少3个月的受试者被诊断为患有慢性肾脏疾病。
一般而言，尿中的蛋白质被视为肾功能下降和心血管疾病的独立标记，并且慢性肾脏疾病的分期(通常用于一般肾脏疾病和/或病症)通过测量受试者的GFR来确定。在一些实施方案中，本公开文本提供了治疗1期CKD的方法。1期CKD包括正常肾功能、肾损伤伴有正常或相对较高的GFR(例如，≥90ml/min/1.73m2)和较低的肌酐水平。肾损伤可以被定义为病理异常或损伤标记，包括验血或验尿或成像研究中的异常。在一些实施方案中，本公开文本提供了治疗2期CKD的方法。2期CKD包括轻度肾功能降低和(例如，在约60与约89ml/min/1.73m2之间)的GFR，伴有肾损伤。在一些实施方案中，本公开文本提供了治疗3期CKD的方法。3期CKD包括轻度至中度肾功能降低和(例如，在约30与约59ml/min/1.73m2之间)的GFR。3期CKD可以被分为3a期(例如，轻度至中度肾功能降低和在约45与约59ml/min/1.73m2之间的GFR)和3b期(例如，中度至重度肾功能降低和在约30与约44ml/min/1.73m2之间的GFR)。在一些实施方案中，本公开文本提供了治疗3a期CKD的方法。在一些实施方案中，本公开文本提供了治疗3b期CKD的方法。在一些实施方案中，本公开文本提供了治疗4期CKD的方法。4期CKD包括重度肾功能降低和(例如，在约15与约29ml/min/1.73m2之间)的GFR。在一些实施方案中，本公开文本提供了治疗5期CKD的方法。5期CKD包括已确立的肾衰竭(例如，约<15ml/min/1.73m2的GFR)、永久性肾替代疗法、终末期肾脏疾病(ESRD)和高肌酐水平。在一些实施方案中，本公开文本涉及降低1期CKD的严重性、发生率和/或持续时间的方法。在一些实施方案中，本公开文本涉及降低2期CKD的严重性、发生率和/或持续时间的方法。在一些实施方案中，本公开文本涉及降低3期CKD的严重性、发生率和/或持续时间的方法。在一些实施方案中，本公开文本涉及降低3a期CKD的严重性、发生率和/或持续时间的方法。在一些实施方案中，本公开文本涉及降低3b期CKD的严重性、发生率和/或持续时间的方法。在一些实施方案中，本公开文本涉及降低4期CKD的严重性、发生率和/或持续时间的方法。在一些实施方案中，本公开文本涉及降低5期CKD的严重性、发生率和/或持续时间的方法。在一些实施方案中，本公开文本提供了治疗患有1期CKD的受试者的方法，所述方法延迟或防止进展为2期CKD。在一些实施方案中，本公开文本提供了治疗患有2期CKD的受试者的方法，所述方法延迟或防止进展为3期CKD。在一些实施方案中，本公开文本提供了治疗患有2期CKD的受试者的方法，所述方法延迟或防止进展为3a期CKD。在一些实施方案中，本公开文本提供了治疗患有2期CKD的受试者的方法，所述方法延迟或防止进展为3b期CKD。在一些实施方案中，本公开文本提供了治疗患有3a期CKD的受试者的方法，所述方法延迟或防止进展为3b期CKD。在一些实施方案中，本公开文本提供了治疗患有3期CKD的受试者的方法，所述方法延迟或防止进展为4期CKD。在一些实施方案中，本公开文本提供了治疗患有3a期CKD的受试者的方法，所述方法延迟或防止进展为4期CKD。在一些实施方案中，本公开文本提供了治疗患有3b期CKD的受试者的方法，所述方法延迟或防止进展为4期CKD。在一些实施方案中，本公开文本提供了治疗患有4期CKD的受试者的方法，所述方法延迟或防止进展为5期CKD。在一些实施方案中，本公开文本提供了延迟和/或防止有需要的受试者的CKD分期进展恶化的方法。在一些实施方案中，本公开文本提供了改善有需要的受试者的肾损伤和/或使CKD分期分类降级的方法。在一些实施方案中，本公开文本提供了将受试者的CKD分类改善一期或多期的方法。
在某些方面，本公开文本涉及治疗、预防或降低肾脏疾病或病症(例如，奥尔波特综合征、局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)、多囊肾病、慢性肾脏疾病)的进展速率和/或严重性的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体。在一些实施方案中，受试者患有1期CKD。在一些实施方案中，受试者患有2期CKD。在一些实施方案中，受试者患有3期CKD。在一些实施方案中，受试者患有3a期CKD。在一些实施方案中，受试者患有3b期CKD。在一些实施方案中，受试者患有4期CKD。在一些实施方案中，受试者患有5期CKD。
在一些实施方案中，本公开文本涉及增加患有肾脏疾病或病症的受试者的GFR和/或eGFR的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的GFR和/或eGFR增加了至少2.5％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的GFR和/或eGFR增加了至少5％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的GFR和/或eGFR增加了至少10％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的GFR和/或eGFR增加了至少15％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的GFR和/或eGFR增加了至少20％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的GFR和/或eGFR增加了至少25％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的GFR和/或eGFR增加了至少30％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的GFR和/或eGFR增加了大于或等于30％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的GFR和/或eGFR增加了至少40％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的GFR和/或eGFR增加了大于或等于40％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的GFR和/或eGFR增加了至少50％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的GFR和/或eGFR增加了至少60％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的GFR和/或eGFR增加了至少70％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的GFR和/或eGFR增加了至少80％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的GFR和/或eGFR增加了至少90％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的GFR和/或eGFR增加了至少95％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的GFR和/或eGFR增加了至少99％。
在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的eGFR和/或GFR和/或eGFR和/或GFR增加了约1mL/min/1.73m2。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的eGFR和/或GFR增加了约3mL/min/1.73m2。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的eGFR和/或GFR增加了约5mL/min/1.73m2。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的eGFR和/或GFR增加了约7mL/min/1.73m2。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的eGFR和/或GFR增加了约9mL/min/1.73m2。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的eGFR和/或GFR增加了约10mL/min/1.73m2。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的eGFR和/或GFR增加了约15mL/min/1.73m2。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的eGFR和/或GFR增加了约20mL/min/1.73m2。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的eGFR和/或GFR增加了约25mL/min/1.73m2。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的eGFR和/或GFR增加了约30mL/min/1.73m2。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的eGFR和/或GFR增加了约35mL/min/1.73m2。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的eGFR和/或GFR增加了约40mL/min/1.73m2。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的eGFR和/或GFR增加了约45mL/min/1.73m2。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的eGFR和/或GFR增加了约50mL/min/1.73m2。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的eGFR和/或GFR增加了约55mL/min/1.73m2。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的eGFR和/或GFR增加了约60mL/min/1.73m2。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的eGFR和/或GFR增加了约65mL/min/1.73m2。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的eGFR和/或GFR增加了约70mL/min/1.73m2。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的eGFR和/或GFR增加了约75mL/min/1.73m2。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的eGFR和/或GFR增加了约80mL/min/1.73m2。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的eGFR和/或GFR增加了约85mL/min/1.73m2。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的eGFR和/或GFR增加了约90mL/min/1.73m2。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的eGFR和/或GFR增加了约95mL/min/1.73m2。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的eGFR和/或GFR增加了约100mL/min/1.73m2。
在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量(例如，SOC)相比将受试者的eGFR和/或GFR增加了约1mL/min/年。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的eGFR和/或GFR增加了大于或等于1mL/min/年。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的eGFR和/或GFR增加了约2mL/min/年。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的eGFR和/或GFR增加了约3mL/min/年。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的eGFR和/或GFR增加了大于或等于3mL/min/年。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的eGFR和/或GFR增加了约5mL/min/年。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的eGFR和/或GFR增加了约7mL/min/年。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的eGFR和/或GFR增加了约9mL/min/年。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的eGFR和/或GFR增加了约10mL/min/年。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的eGFR和/或GFR增加了约15mL/min/年。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的eGFR和/或GFR增加了约20mL/min/年。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的eGFR和/或GFR增加了约25mL/min/年。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的eGFR和/或GFR增加了约30mL/min/年。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的eGFR和/或GFR增加了约35mL/min/年。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的eGFR和/或GFR增加了约40mL/min/年。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的eGFR和/或GFR增加了约45mL/min/年。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的eGFR和/或GFR增加了约50mL/min/年。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的eGFR和/或GFR增加了约55mL/min/年。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的eGFR和/或GFR增加了约60mL/min/年。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的eGFR和/或GFR增加了约65mL/min/年。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的eGFR和/或GFR增加了约70mL/min/年。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的eGFR和/或GFR增加了约75mL/min/年。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的eGFR和/或GFR增加了约80mL/min/年。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的eGFR和/或GFR增加了约85mL/min/年。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的eGFR和/或GFR增加了约90mL/min/年。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的eGFR和/或GFR增加了约95mL/min/年。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的eGFR和/或GFR增加了约100mL/min/年。在一些实施方案中，所述方法涉及将受试者的eGFR和/或GFR维持在基线测量(例如，SOC)或接近基线测量的水平。
在一些实施方案中，可以通过向血浆中注射菊糖或菊糖类似物海葱糖来确定GFR和/或eGFR。由于菊糖和海葱糖两者在肾小球滤过后既不被肾重新吸收也不被肾分泌，因此它们的排泄率与水和溶质在肾小球滤过器中的滤过率成比例。在一些实施方案中，使用放射性物质测量GFR和/或eGFR。在一些实施方案中，使用铬-51测量GFR和/或eGFR。在一些实施方案中，使用51Cr-EDTA的肾或血浆清除率来测量GFR和/或eGFR。在一些实施方案中，使用锝-99m测量GFR和/或eGFR。在一些实施方案中，使用99mTc-DTPA测量GFR和/或eGFR。使用放射性物质的益处是它们接近菊糖的理想性质(仅经历肾小球滤过)，但可以用仅少量尿或血液样品更实际地测量。与菊糖相比，51Cr-EDTA的肾和血浆清除率已被证明是准确的。在一些实施方案中，菊糖清除率略微高估肾小球功能。在早期肾脏疾病中，由于剩余肾单位的超滤过，菊糖清除率可能保持正常。尿收集不完整是菊糖清除率测量误差的重要来源。
肌酐清除率(CCr或CrCl)是每单位时间清除肌酐的血浆体积，并且是近似GFR的有用量度。由于肌酐分泌，肌酐清除率超过GFR，这可以被西咪替丁阻断。GFR和CCr两者都可以通过血液和尿中物质的比较测量来准确计算，或者通过仅使用验血结果的公式来估计(eGFR和eCCr)。
在一些实施方案中，本公开文本涉及降低患有肾脏疾病或病症的受试者的肾总体积的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体。在一些实施方案中，通过超声测量肾总体积。在一些实施方案中，通过磁共振成像(MRI)测量肾总体积。在一些实施方案中，肾总体积反映了肾脏疾病或障碍(例如，ADPKD)中肾和囊肿的体积总和。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的肾总体积减少了至少2.5％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的肾总体积减少了至少5％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的肾总体积减少了至少10％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的肾总体积减少了至少15％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的肾总体积减少了至少20％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的肾总体积减少了至少25％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的肾总体积减少了至少30％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的肾总体积减少了至少40％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的肾总体积减少了至少50％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的肾总体积减少了至少60％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的肾总体积减少了至少70％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的肾总体积减少了至少80％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的肾总体积减少了至少90％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的肾总体积减少了至少95％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的肾总体积减少了至少99％。
在一些实施方案中，测量了血尿素氮(BUN)。在一些实施方案中，BUN测试测量血液中尿素氮的量。在一些实施方案中，如果肾受损，尿素氮的量可能更高。在一些实施方案中，本公开文本涉及降低患有肾脏疾病或病症的受试者的BUN的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体。在一些实施方案中，人的正常BUN水平在约7mg/dL与约20mg/dL之间。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的BUN降低了至少2.5％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的BUN降低了至少5％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的BUN降低了至少10％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的BUN降低了至少15％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的BUN降低了至少20％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的BUN降低了至少25％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的BUN降低了至少30％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的BUN降低了至少40％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的BUN降低了至少50％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的BUN降低了至少60％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的BUN降低了至少70％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的BUN降低了至少80％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的BUN降低了至少90％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的BUN降低了至少95％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的BUN降低了至少99％。
尿中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)浓度是急性肾损伤的早期生物标志物，其对早期损伤高度敏感并且被称作肾小管特异性损伤的标记。尿NGAL(或uNGAL)往往在血清肌酐水平之前升高，从而允许预测肾小管损伤。uNGAL根据肾结构性急性肾损伤的严重性定量地和成比例地增加。在一些实施方案中，<50ng/mL的uNGAL测量值是低急性肾损伤风险的指示。在一些实施方案中，在约50与约149ng/mL之间的uNGAL测量值指示模棱两可的急性肾损伤风险。在一些实施方案中，在约150与约300ng/mL之间的uNGAL测量值指示中度急性肾损伤风险。在一些实施方案中，>300ng/mL的uNGAL测量值指示高急性肾损伤风险。
在一些实施方案中，本公开文本涉及降低患有肾脏疾病或病症的受试者的uNGAL的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体。在一些实施方案中，所述方法涉及将受试者的uNGAL减少了约0.1与约50ng/mL之间。在一些实施方案中，所述方法涉及将受试者的uNGAL减少了约0.1与约100.0ng/mL之间。在一些实施方案中，所述方法涉及将受试者的uNGAL减少了约0.1与约150.0ng/mL之间。在一些实施方案中，所述方法涉及将受试者的uNGAL减少了约0.1与约200.0ng/mL之间。在一些实施方案中，所述方法涉及将受试者的uNGAL减少了约0.1与约250.0ng/mL之间。在一些实施方案中，所述方法涉及将受试者的uNGAL减少了约0.1与约300.0ng/mL之间。在一些实施方案中，所述方法涉及将受试者的uNGAL减少了约0.1与约25ng/mL之间。在一些实施方案中，所述方法涉及将受试者的uNGAL减少了约25与约50ng/mL之间。在一些实施方案中，所述方法涉及将受试者的uNGAL减少了约50与约100ng/mL之间。在一些实施方案中，所述方法涉及将受试者的uNGAL减少了约100与约150ng/mL之间。在一些实施方案中，所述方法涉及将受试者的uNGAL减少了约150与约200ng/mL之间。在一些实施方案中，所述方法涉及将受试者的uNGAL减少了约200与约250ng/mL之间。在一些实施方案中，所述方法涉及将受试者的uNGAL减少了约250与约300ng/mL之间。在一些实施方案中，所述方法涉及将受试者的uNGAL减少了超过300ng/mL。在一些实施方案中，所述方法涉及将受试者的uNGAL减少了约0.1与约300ng/mL之间。
在一些实施方案中，本公开文本涉及降低患有肾脏疾病或病症的受试者的uNGAL的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的uNGAL降低了至少2.5％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的uNGAL降低了至少5％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的uNGAL降低了至少10％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的uNGAL降低了至少15％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的uNGAL降低了至少20％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的uNGAL降低了至少25％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的uNGAL降低了至少30％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的uNGAL降低了至少40％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的uNGAL降低了至少50％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的uNGAL降低了至少60％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的uNGAL降低了至少70％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的uNGAL降低了至少80％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的uNGAL降低了至少90％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的uNGAL降低了至少95％。在一些实施方案中，所述方法涉及与基线测量相比将受试者的uNGAL降低了至少99％。
任选地，本文所公开的用于治疗、预防或降低肾脏疾病或病症(例如，奥尔波特综合征、局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)、多囊肾病、慢性肾脏疾病)的进展速率和/或严重性(特别是治疗、预防或降低肾脏疾病或病症的一个或多个并发症的进展速率和/或严重性)的方法还可以包括向受试者施用一种或多种另外的活性剂和/或支持疗法以治疗肾脏疾病或病症。在一些实施方案中，向受试者施用另外的活性剂和/或支持疗法以治疗肾脏疾病或病症(例如，奥尔波特综合征、局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)、多囊肾病、慢性肾脏疾病)。在一些实施方案中，ARB和ACE抑制剂是用于肾脏疾病和病症(例如，奥尔波特综合征、局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)、多囊肾病、慢性肾脏疾病)的主要疗法，其中β-肾上腺素能阻断剂(beta-blockade)和钙通道阻滞剂作为二线疗法。在一些实施方案中，作为三线疗法，噻嗪类药物在肾功能正常的受试者中是优选的，而髓袢利尿剂在肾功能受损的受试者中是优选的。
在一些实施方案中，向患有肾脏疾病或病症(例如，奥尔波特综合征、局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)、多囊肾病、慢性肾脏疾病)的受试者施用肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)拮抗剂。在一些实施方案中，RAAS抑制剂包括但不限于：血管紧张素拮抗剂(例如，血管紧张素阻断疗法、血管紧张素系统抑制剂、肾素-血管紧张素系统抑制剂、血管紧张素II阻断剂、血管紧张素II 1型受体阻滞剂、ARB、血管紧张素II受体拮抗剂、AT1受体拮抗剂或沙坦(sartan))和血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂。在一些实施方案中，RAAS拮抗作用以及特别是ACE抑制剂和ARB的组合将通过以下方式来降低GFR：降低输出小动脉血管张力，并且因而降低肾小球内毛细血管压力(其是肾小球滤过的驱动力)。因此，GFR的适度降低可以是耐受的，提供了RAAS拮抗作用得以实现的证据。
在一些实施方案中，当受试者显示蛋白尿的体征时，向受试者施用血管紧张素拮抗剂(例如，血管紧张素受体阻滞剂，ARB)。在一些实施方案中，ARB降低患有肾脏疾病或病症的受试者的蛋白尿。在一些实施方案中，血管紧张素拮抗剂降低患有肾脏疾病或病症的受试者的肾小球硬化速率。在一些实施方案中，ARB的施用降低肾脏疾病进展。在一些实施方案中，向受试者施用选自以下的一种或多种ARB：氯沙坦、厄贝沙坦、奥美沙坦、坎地沙坦、缬沙坦、非马沙坦、阿齐沙坦、沙普立沙坦和替米沙坦。在一些实施方案中，向受试者施用氯沙坦。在一些实施方案中，向受试者施用厄贝沙坦。在一些实施方案中，向受试者施用奥美沙坦。在一些实施方案中，向受试者施用坎地沙坦。在一些实施方案中，向受试者施用缬沙坦。在一些实施方案中，向受试者施用非马沙坦。在一些实施方案中，向受试者施用阿齐沙坦。在一些实施方案中，向受试者施用沙普立沙坦。在一些实施方案中，向受试者施用替米沙坦。
在一些实施方案中，向患有肾脏疾病或病症的受试者施用ACE抑制剂。在一些实施方案中，ACE抑制剂选自贝那普利、卡托普利、依那普利、赖诺普利、培哚普利、雷米普利(例如，ramipen)、群多普利和佐芬普利。在一些实施方案中，向受试者施用贝那普利。在一些实施方案中，向受试者施用卡托普利。在一些实施方案中，向受试者施用依那普利。在一些实施方案中，向受试者施用赖诺普利。在一些实施方案中，向受试者施用培哚普利。在一些实施方案中，向受试者施用雷米普利。在一些实施方案中，向受试者施用群多普利。在一些实施方案中，向受试者施用佐芬普利。在一些实施方案中，ACE抑制剂的施用延迟患有蛋白尿和肾功能正常的受试者的透析。在一些实施方案中，ACE抑制剂的施用减缓受试者的肾功能下降。在一些实施方案中，ACE抑制剂的施用降低受试者的蛋白尿。在一些实施方案中，ACE抑制剂的施用减少受试者的肾损伤。
在一些实施方案中，向患有肾脏疾病或病症的受试者施用ARB和ACE抑制剂。在一些实施方案中，向患有包括蛋白尿和/或微量蛋白尿的肾脏疾病或病症的受试者施用ARB和ACE抑制剂。
在一些实施方案中，血管紧张素拮抗作用的替代方法是将ACE抑制剂和/或ARB与醛固酮拮抗剂组合。
在一些实施方案中，向患有肾脏疾病或病症(例如，原发性FSGS)的受试者施用免疫抑制治疗。在一些实施方案中，用免疫抑制药物治疗患有肾脏疾病或病症的受试者。在一些实施方案中，不将免疫抑制施用于患有继发性FSGS的受试者。在一些实施方案中，不将免疫抑制剂施用于未患有原发性FSGS的受试者。在一些实施方案中，免疫抑制剂选自皮质类固醇、钙调磷酸酶抑制剂、JAK激酶抑制剂、雷帕霉素(mTOR)抑制剂的哺乳动物靶标、IMDH抑制剂和生物制剂(包括但不限于单克隆抗体)。
在一些实施方案中，向患有肾脏疾病或病症的受试者施用皮质类固醇。在一些实施方案中，糖皮质激素是皮质类固醇。在一些实施方案中，向患有肾脏疾病或病症的受试者施用一种或多种糖皮质激素。在一些实施方案中，施用糖皮质激素是初始疗法。在一些实施方案中，糖皮质激素选自倍氯米松、倍他米松、布地奈德、可的松、地塞米松、氢化可的松、甲泼尼龙、泼尼松龙、甲基泼尼松、泼尼松和曲安西龙。在一些实施方案中，向患有肾脏疾病或病症的受试者施用泼尼松。在一些实施方案中，向患有肾脏疾病或病症的受试者施用泼尼松龙。
在一些实施方案中，钙调磷酸酶抑制剂选自环孢菌素(例如，环孢霉素(cyclosporin)、环孢素(ciclosporin)、环孢素(ciclosporine)、新体睦(Neoral)、山地明(Sandimune)、SangCya)和他克莫司(例如，Astagraf XL、Envarsus XR、Prograf)。在一些实施方案中，将钙调磷酸酶抑制剂施用于不能耐受持续类固醇疗法的类固醇过敏受试者和/或患有类固醇抗性肾脏疾病(例如，类固醇抗性FSGS)的受试者。在一些实施方案中，向患有肾脏疾病或病症的受试者施用环孢菌素。在一些实施方案中，向患有肾脏疾病或病症的受试者施用他克莫司。
在一些实施方案中，可以向患有肾脏疾病或病症的受试者施用一种或多种皮质类固醇和/或钙调磷酸酶抑制剂的组合。在一些实施方案中，可以向患有肾脏疾病或病症的受试者施用环孢菌素和泼尼松。在一些实施方案中，向患有肾脏疾病或病症的受试者施用他克莫司和泼尼松。在一些实施方案中，施用环孢菌素和泼尼松来保护以肌酐清除率评估的肾功能。
在一些实施方案中，在不能服用钙调磷酸酶抑制剂的受试者中用麦考酚酸莫酯(MMF)与糖皮质激素组合治疗可能有益。在一些实施方案中，向患有肾脏疾病或病症的受试者施用麦考酚酸莫酯(MMF)与一种或多种糖皮质激素的组合。在一些实施方案中，向患有肾脏疾病或病症的受试者施用MMF和泼尼松。在一些实施方案中，向患有肾脏疾病或病症的受试者施用泼尼松龙和MMF。
在一些实施方案中，向患有肾脏疾病或病症的受试者施用环磷酰胺和/或泼尼松。在一些实施方案中，向患有肾脏疾病或病症的受试者施用泼尼松龙和/或苯丁酸氮芥。在一些实施方案中，向患有肾脏疾病或病症的受试者施用环磷酰胺。在一些实施方案中，向患有肾脏疾病或病症的受试者施用苯丁酸氮芥。
在一些实施方案中，JAK激酶抑制剂是托法替尼(例如，Xeljanz)。
在一些实施方案中，mTOR抑制剂选自西罗莫司(例如，雷帕鸣)和依维莫司(例如，Afinitor、Zortress)。
在一些实施方案中，IMDH抑制剂选自硫唑嘌呤(例如，Azasan、依木兰(Imuran))、来氟米特(例如，Arava)和霉酚酸酯(例如，骁悉(CellCept)、米芙(Myfortic))。
在一些实施方案中，生物制剂选自阿巴西普(例如，Orencia)、阿达木单抗(例如，Humira)、阿那白滞素(例如，Kineret)、巴利昔单抗(例如，舒莱(Simulect))、赛妥珠单抗(例如，Cimzia)、达克利珠单抗(例如，Zinbryta)、依那西普(例如，Enbrel)、非苏木单抗、戈利木单抗(例如，Simponi)、英夫利昔单抗(例如，类克(Remicade))、伊卡组单抗(例如，Taltz)、那他珠单抗(例如，Tysabri)、利妥昔单抗(例如，Rituxan)、司库奴单抗(例如，Cosentyx)、托珠单抗(例如，Actemra)、乌司奴单抗(例如，Stelara)和维多珠单抗(例如，Entyvio)。
在一些实施方案中，向患有肾脏疾病或病症(例如，奥尔波特综合征、局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)、多囊肾病、慢性肾脏疾病)的受试者施用他汀类药物(例如，贝那普利、缬沙坦、氟伐他汀、普伐他汀)。
在一些实施方案中，向患有肾脏疾病或病症(例如，奥尔波特综合征、局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)、多囊肾病、慢性肾脏疾病)的受试者施用lademirsen。Lademirsen是一种抗miRNA-21。
在一些实施方案中，向患有肾脏疾病或病症(例如，奥尔波特综合征、局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)、多囊肾病、慢性肾脏疾病)的受试者施用甲基巴多索龙。甲基巴多索隆是KEAP1-Nrf2途径的激活剂，并且甲基巴多索隆还抑制促炎性转录因子NF-κB。
在一些实施方案中，向患有肾脏疾病或病症(例如，奥尔波特综合征、局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)、多囊肾病、慢性肾脏疾病)的受试者施用Achtar凝胶。Achtar凝胶于20世纪50年代被美国食品和药物管理局(US Food and Drug Administration)批准用于肾病综合征，其标准比今天所要求的更宽松。在一些实施方案中，一些案例研究表明Acthar对患有FSGS的一些受试者的功效有限。在一些实施方案中，向患有FSGS的受试者施用Achtar凝胶。
在一些实施方案中，向患有ADPKD的受试者施用托伐普坦(例如，OPC-41061)。在一些实施方案中，托伐普坦证明在患有晚期慢性肾脏疾病的患者中在一年时间段内eGFR下降速度慢于安慰剂，但与胆红素和丙氨酸转氨酶水平的升高相关。
在一些实施方案中，向患有肾脏疾病或病症(例如，奥尔波特综合征、局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)、多囊肾病、慢性肾脏疾病)的受试者施用以下中的一种或多种：阿巴西普与司帕生坦的组合、阿利吉仑、别嘌呤醇、ANG-3070、阿托伐他汀、布来鲁单抗、博舒替尼、CCX140-B、CXA-10、D6-25-羟基维生素D3、达格列净、地塞米松与MMF的组合、大黄素、FG-3019、FK506、FK-506和MMF、FT-011、半乳糖、GC1008、GFB-887、异维甲酸、兰瑞肽、左旋咪唑、利希普坦、洛吡莫德、二甲双胍、咪唑立宾、N-乙酰甘露糖胺、奥曲肽、帕立骨化醇、PF-06730512、吡格列酮、丙帕锗、丙帕锗和厄贝沙坦、雷帕鸣、雷帕霉素、RE-021(例如，司帕生坦)、RG012、罗格列酮(例如，文迪雅(Avandia))、沙奎那韦、SAR339375、生长抑素、螺内酯、特伐替尼(KD019)、替可克、雷公藤多甙(TW)、丙戊酸、VAR-200、文鲁司他(GZ402671)、维利努雷、伏环孢素和VX-147。
在一些实施方案中，对患有肾脏疾病或病症(例如，奥尔波特综合征、局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)、多囊肾病、慢性肾脏疾病)的受试者进行肾透析。在一些实施方案中，对患有肾脏疾病或病症(例如，奥尔波特综合征、局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)、多囊肾病、慢性肾脏疾病)的受试者进行肾移植。在一些实施方案中，对患有ESRD的受试者进行肾移植。在一些实施方案中，具有肾移植的受试者不经历复发性肾脏疾病。在一些实施方案中，具有肾移植的受试者患上抗肾小球基膜抗体疾病。在一些实施方案中，抗肾小球基膜抗体疾病发生在肾移植后的一年内。在一些实施方案中，向患有抗肾小球基膜抗体疾病的受试者施用甲基泼尼松和/或环磷酰胺。在一些实施方案中，对患有抗肾小球基膜抗体疾病的受试者进行血浆单采术。
在一些实施方案中，向患有肾脏疾病或病症(例如，奥尔波特综合征、局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)、多囊肾病、慢性肾脏疾病)的受试者施用间充质干细胞疗法。在一些实施方案中，向患有肾脏疾病或病症(例如，奥尔波特综合征、局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)、多囊肾病、慢性肾脏疾病)的受试者施用骨髓干细胞。在一些实施方案中，对患有肾脏疾病或病症(例如，奥尔波特综合征、局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)、多囊肾病、慢性肾脏疾病)的受试者进行脂蛋白去除。在一些实施方案中，向患有肾脏疾病或病症(例如，奥尔波特综合征、局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)、多囊肾病、慢性肾脏疾病)的受试者施用Liposorber LA-15装置。在一些实施方案中，对患有肾脏疾病或病症(例如，奥尔波特综合征、局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)、多囊肾病、慢性肾脏疾病)的受试者进行血浆单采术。在一些实施方案中，对患有肾脏疾病或病症(例如，奥尔波特综合征、局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)、多囊肾病、慢性肾脏疾病)的受试者进行血浆置换。在一些实施方案中，对患有肾脏疾病或病症(例如，奥尔波特综合征、局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)、多囊肾病、慢性肾脏疾病)的受试者进行饮食改变(例如，饮食钠摄入)。
在一些实施方案中，本公开文本的方法延迟受试者的肾脏疾病或病症(例如，奥尔波特综合征、局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)、多囊肾病、慢性肾脏疾病)的临床恶化。在一些实施方案中，本公开文本的方法降低了因与肾脏疾病或病症(例如，奥尔波特综合征、局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)、多囊肾病、慢性肾脏疾病)相关的一种或多种并发症住院的风险。
7.药物组合物
在某些方面，本公开文本的单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体可以单独施用或作为药物配制品(也称为治疗组合物或药物组合物)的组分施用。药物配制品是指如下制剂，其呈使得其中所含活性成分(例如，本公开文本的药剂)的生物活性有效的形式，并且不含有对施用配制品的受试者具有不可接受的毒性的另外组分。主题化合物可以配制用于以任何方便的方式施用以供在人或兽医医学中使用。例如，本公开文本的一种或多种药剂可以与药学上可接受的载体一起配制。药学上可接受的载体是指药物配制品中除活性成分之外的成分，其通常对受试者无毒。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂和/防腐剂。一般而言，当施用于受试者时，用于本公开文本的药物配制品呈无热原的、生理学上可接受的形式。可任选地包含在如上所述配制品中的除了本文所述药剂之外的治疗上有用的药剂可以在本公开文本的方法中与主题药剂组合施用。
在某些实施方案中，本公开文本的治疗方法包括以植入物或装置形式系统地或局部地施用所述组合物。在施用时，用于本公开文本的治疗性组合物呈基本上无热原或无热原质的生理学上可接受的形式。也可以任选地包括在如上所述的组合物中的除了单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体之外的治疗上有用的药剂可以在本文所公开的方法中与主题化合物同时或依序施用。
通常，本文公开的蛋白质治疗剂将经肠胃外施用，并且特别是静脉内或皮下施用。在一些实施方案中，肠胃外施用途径选自肌内、腹膜内、真皮内、玻璃体内、硬膜外、脑内、动脉内、关节内、海绵内、病变内、骨内、眼内、鞘内、静脉内、经皮、经粘膜、羊膜外施用、皮下及其组合。在一些实施方案中，肠胃外施用途径是皮下的。在一些实施方案中，肠胃外施用途径是皮下注射。在一些实施方案中，通过皮下注射施用本公开文本的组合物。适用于肠胃外施用的药物组合物可以包含一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体与一种或多种药学上可接受的无菌等渗水性或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳液或可以在临使用前重构成无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末的组合，所述溶液、分散液、悬浮液或乳液或无菌粉末可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使配制品与预期接受者的血液等渗的溶质、或助悬剂或增稠剂。可以用于本公开文本的药物组合物中的合适的水性和非水性载体的例子包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油(诸如橄榄油)和可注射的有机酯(诸如油酸乙酯)。可以例如通过使用诸如卵磷脂等包衣材料、在分散液的情况下通过维持所需的粒度、以及通过使用表面活性剂来维持适当流动性。
如果需要，可以在包装或分配器装置中提供组合物和配制品，所述包装或分配器装置可以包含一种或多种含有活性成分的单位剂型。包装可以例如包含金属或塑料箔，诸如泡罩包装。包装或分配器装置可以附有施用说明书。
此外，所述组合物可以以用于递送至标靶组织位点的形式包封或注射。在某些实施方案中，本发明的组合物可以包含能够将一种或多种治疗性化合物(例如，单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体)递送至靶组织部位的基质，从而为正在发育的组织提供结构并且最佳地能够再吸收到体内。例如，基质可以提供单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的缓慢释放。此类基质可以由目前用于其他植入医疗应用的材料形成。
基质材料的选择是基于生物相容性、生物可降解性、机械特性、装饰性外观和界面特性。主题组合物的特定应用将限定适当的制剂。所述组合物的潜在基质可以是可生物降解的且在化学上定义的硫酸钙、磷酸三钙、羟基磷灰石、聚乳酸和聚酸酐。其他潜在的材料是生物可降解的且在生物学上明确定义的，诸如骨或真皮胶原。其他基质由纯蛋白质或细胞外基质组分组成。其他潜在基质是不可生物降解的且在化学上定义的，诸如烧结的羟基磷灰石、生物玻璃、铝酸盐或其他陶瓷。基质可以由任何上述类型的材料的组合构成，所述材料诸如聚乳酸和羟基磷灰石或胶原和磷酸三钙。生物陶瓷的组成可以改变，诸如在铝酸钙-磷酸钙中，并且可以被加工以改变孔径、粒度、颗粒形状和生物降解性。
在用于口服的固体剂型(胶囊、片剂、丸剂、糖衣丸、粉末、颗粒等)中，可以将一种或多种本发明的治疗性化合物与一种或多种药学上可接受的载体诸如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或以下中的任一种混合：(1)填充剂或增量剂，诸如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(2)粘合剂，诸如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)湿润剂，诸如甘油；(4)崩解剂，诸如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；(5)溶液阻滞剂，诸如石蜡；(6)吸收促进剂，诸如季铵化合物；(7)润湿剂，诸如像鲸蜡醇和甘油单硬脂酸酯；(8)吸收剂，诸如高岭土和膨润土；(9)润滑剂，诸如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠及其混合物；以及(10)着色剂。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，所述药物组合物还可以包含缓冲剂。类似类型的固体组合物也可作为填充剂用于使用诸如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等的赋形剂的软和硬填充明胶胶囊中。
用于口服施用的液体剂型包括药学上可接受的乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除了活性成分之外，液体剂型还可以含有在本领域中常用的惰性稀释剂，诸如水，或其他溶剂、增溶剂和乳化剂，诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯以及其混合物。除了惰性稀释剂之外，口服组合物还可以包括佐剂，诸如润湿剂、乳化剂和助悬剂、甜味剂、调味剂、着色剂、芳香剂和防腐剂。
除了活性化合物之外，悬浮液还可以含有助悬剂，诸如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇和脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄芪胶以及其混合物。
本发明的组合物还可以含有佐剂，诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂以及分散剂。可以通过包括各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等来确保阻止微生物作用。还可能需要在组合物中包含等渗剂，诸如糖、氯化钠等。此外，可以通过包含延迟吸收的试剂(诸如单硬脂酸铝和明胶)来实现可注射药物形式的延长吸收。
应当理解，剂量方案将由主治医师考虑改变本公开文本的主题化合物(例如，单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体)的作用的各种因素来确定。所述各种因素包括但不限于受试者的年龄、性别和饮食、疾病的严重性、施用时间和其他临床因素。任选地，剂量可以随重构中使用的基质类型和组合物中化合物的类型而变化。向最终组合物中添加其他已知的生长因子也可能影响剂量。可以通过定期评估骨生长和/或修复，例如通过X射线(包括DEXA)、组织形态测定法和四环素标记来监测进展。
在某些实施方案中，本发明还提供用于体内产生单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的基因疗法。通过将单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体多核苷酸序列引入患有上文列出的障碍的细胞或组织中，这种疗法将实现其治疗作用。使用重组表达载体诸如嵌合病毒或胶体分散系统，可以实现单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体多核苷酸序列的递送。对于单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体多核苷酸序列的治疗性递送优选的是靶向脂质体的使用。
在某些实施方案中，本公开文本还提供了用于体内产生本公开文本的一种或多种药剂的基因疗法。这种疗法将通过将药剂序列引入具有上文列出的一种或多种障碍的细胞或组织中来实现其治疗作用。例如，通过使用重组表达载体诸如嵌合病毒或胶体分散系统，可以实现药剂序列的递送。本公开文本的一种或多种药剂序列的优选治疗性递送是靶向脂质体的使用。
可以如本文所教导用于基因疗法的各种病毒载体包括腺病毒、疱疹病毒、天花病毒或优选RNA病毒诸如逆转录病毒。优选地，逆转录病毒载体是鼠或禽逆转录病毒的衍生物。可以插入单个外源基因的逆转录病毒载体的例子包括但不限于：莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV)、哈维鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺瘤病毒(MuMTV)和劳斯肉瘤病毒(RSV)。许多其他逆转录病毒载体可以掺入多个基因。所有这些载体都可以转移或掺入可选择标记的基因，使得可以鉴定和产生经转导的细胞。逆转录病毒载体可以通过附接例如糖、糖脂或蛋白质而成为标靶特异性的。优选的靶向通过使用抗体来实现。本领域技术人员应认识到，可以将特定多核苷酸序列插入逆转录病毒基因组中或附着于病毒包膜，以允许含有单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的逆转录病毒载体的靶标特异性递送。在优选的实施方案中，载体靶向骨或软骨。
可替代地，可以通过常规的磷酸钙转染，用编码逆转录病毒结构基因gag、pol和env的质粒直接转染组织培养细胞。然后用含有感兴趣基因的载体质粒转染这些细胞。所得的细胞将逆转录病毒载体释放至培养基中。
单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体多核苷酸的另一种靶向递送系统是胶体分散系统。胶体分散系统包括大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠粒和基于脂质的系统，所述系统包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。本发明的优选胶体系统是脂质体。脂质体是人工膜囊泡，其在体外和体内可用作递送媒介物。RNA、DNA和完整病毒粒子可以包封在水性内部并且以生物活性形式递送至细胞(参见例如，Fraley等人,TrendsBiochem.Sci.,6:77,1981)。使用脂质体媒介物进行有效基因转移的方法是本领域中已知的，参见例如，Mannino等人,Biotechniques,6:682,1988。脂质体的组成通常是磷脂的组合，通常与类固醇、尤其是胆固醇的组合。也可以使用其他磷脂或其他脂质。脂质体的物理特性取决于pH、离子强度和二价阳离子的存在。
可用于脂质体产生的脂质的例子包括磷脂酰化合物，诸如磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘脂、脑苷脂和神经节苷脂。说明性磷脂包括卵磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱和二硬脂酰磷脂酰胆碱。基于例如器官特异性、细胞特异性和细胞器特异性，脂质体的靶向也是可能的，并且是本领域中已知的。
本公开文本提供如下配制品，其可以经改变以包括酸和碱来调节pH；并且包括缓冲剂以将pH值保持在狭窄范围内。
应当理解，剂量方案将由主治医师考虑改变本公开文本主题化合物(例如，单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体)的作用的各种因素来确定。所述各种因素包括但不限于患者的年龄、性别和/或饮食、疾病的严重性、施用时间和/或其他临床因素。任选地，剂量可以随重构中使用的基质类型和/或组合物中化合物的类型而变化。向最终组合物中添加其他已知的生长因子也可能影响剂量。
在一些实施方案中，以一个或多个剂量施用本公开文本的一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体。在一些实施方案中，一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量包含0.25mg/kg的所述一种或多种异多聚体。在一些实施方案中，一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量包含0.50mg/kg的所述一种或多种异多聚体。在一些实施方案中，一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量包含0.75mg/kg的所述一种或多种异多聚体。在一些实施方案中，一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量包含1.00mg/kg的所述一种或多种异多聚体。在一些实施方案中，一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量包含1.25mg/kg的所述一种或多种异多聚体。在一些实施方案中，一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量包含1.50mg/kg的所述一种或多种异多聚体。在一些实施方案中，一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量包含1.75mg/kg的所述一种或多种异多聚体。在一些实施方案中，一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量包含2.00mg/kg的所述一种或多种异多聚体。在一些实施方案中，一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量包含2.25mg/kg的所述一种或多种异多聚体。在一些实施方案中，一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量包含2.50mg/kg的所述一种或多种异多聚体。在一些实施方案中，一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量包含2.75mg/kg的所述一种或多种异多聚体。在一些实施方案中，一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量包含3.00mg/kg的所述一种或多种异多聚体。在一些实施方案中，一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量包含3.25mg/kg的所述一种或多种异多聚体。在一些实施方案中，一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量包含3.50mg/kg的所述一种或多种异多聚体。在一些实施方案中，一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量包含3.75mg/kg的所述一种或多种异多聚体。在一些实施方案中，一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量包含4.00mg/kg的所述一种或多种异多聚体。在一些实施方案中，一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量包含4.25mg/kg的所述一种或多种异多聚体。在一些实施方案中，一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量包含4.50mg/kg的所述一种或多种异多聚体。在一些实施方案中，一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量包含4.75mg/kg的所述一种或多种异多聚体。在一些实施方案中，一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量包含5.00mg/kg的所述一种或多种异多聚体。在一些实施方案中，一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量包含5.00mg/kg的所述一种或多种异多聚体。在一些实施方案中，一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量包含6.00mg/kg的所述一种或多种异多聚体。在一些实施方案中，一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量包含7.00mg/kg的所述一种或多种异多聚体。在一些实施方案中，一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量包含8.00mg/kg的所述一种或多种异多聚体。在一些实施方案中，一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量包含9.00mg/kg的所述一种或多种异多聚体。在一些实施方案中，一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量包含10.00mg/kg的所述一种或多种异多聚体。在一些实施方案中，一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量包含20.00mg/kg的所述一种或多种异多聚体。在一些实施方案中，一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量包含30.00mg/kg的所述一种或多种异多聚体。在一些实施方案中，一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量包含至少0.25mg/kg的所述一种或多种异多聚体。在一些实施方案中，一种或多种TβRII融合拮抗剂的剂量包含约0.25mg/kg至约30.00mg/kg之间的所述一种或多种异多聚体。
在一些实施方案中，每天施用一次本公开文本的一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量。在一些实施方案中，每两天施用一次本公开文本的一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量。在一些实施方案中，每三天施用一次本公开文本的一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量。在一些实施方案中，每四天施用一次本公开文本的一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量。在一些实施方案中，每五天施用一次本公开文本的一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量。在一些实施方案中，每六天施用一次本公开文本的一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量。在一些实施方案中，每周施用一次本公开文本的一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量。在一些实施方案中，每两周施用一次本公开文本的一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量。在一些实施方案中，每三周施用一次本公开文本的一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量。在一些实施方案中，每四周施用一次本公开文本的一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量。在一些实施方案中，每隔一周施用一次本公开文本的一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量。在一些实施方案中，每月施用一次本公开文本的一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量。在一些实施方案中，每两个月施用一次本公开文本的一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量。在一些实施方案中，每三个月施用一次本公开文本的一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量。在一些实施方案中，每四个月施用一次本公开文本的一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量。在一些实施方案中，每五个月施用一次本公开文本的一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量。在一些实施方案中，每六个月施用一次本公开文本的一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量。在一些实施方案中，每年施用一次本公开文本的一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量。
在一些实施方案中，每天施用两次本公开文本的一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量。在一些实施方案中，每两天施用两次本公开文本的一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量。在一些实施方案中，每三天施用两次本公开文本的一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量。在一些实施方案中，每四天施用两次本公开文本的一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量。在一些实施方案中，每五天施用两次本公开文本的一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量。在一些实施方案中，每六天施用两次本公开文本的一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量。在一些实施方案中，每周施用两次本公开文本的一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量。在一些实施方案中，每两周施用两次本公开文本的一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量。在一些实施方案中，每三周施用两次本公开文本的一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量。在一些实施方案中，每四周施用两次本公开文本的一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量。在一些实施方案中，每隔一周施用两次本公开文本的一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量。在一些实施方案中，每月施用两次本公开文本的一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量。在一些实施方案中，每两个月施用两次本公开文本的一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量。在一些实施方案中，每三个月施用两次本公开文本的一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量。在一些实施方案中，每四个月施用两次本公开文本的一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量。在一些实施方案中，每五个月施用两次本公开文本的一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量。在一些实施方案中，每六个月施用两次本公开文本的一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量。在一些实施方案中，每年施用两次本公开文本的一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量。
在一些实施方案中，每天施用三次本公开文本的一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量。在一些实施方案中，每两天施用三次本公开文本的一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量。在一些实施方案中，每三天施用三次本公开文本的一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量。在一些实施方案中，每四天施用三次本公开文本的一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量。在一些实施方案中，每五天施用三次本公开文本的一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量。在一些实施方案中，每六天施用三次本公开文本的一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量。在一些实施方案中，每周施用三次本公开文本的一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量。在一些实施方案中，每两周施用三次本公开文本的一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量。在一些实施方案中，每三周施用三次本公开文本的一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量。在一些实施方案中，每四周施用三次本公开文本的一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量。在一些实施方案中，每隔一周施用三次本公开文本的一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量。在一些实施方案中，每月施用三次本公开文本的一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量。在一些实施方案中，每两个月施用三次本公开文本的一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量。在一些实施方案中，每三个月施用三次本公开文本的一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量。在一些实施方案中，每四个月施用三次本公开文本的一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量。在一些实施方案中，每五个月施用三次本公开文本的一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量。在一些实施方案中，每六个月施用三次本公开文本的一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量。在一些实施方案中，每年施用三次本公开文本的一种或多种单臂ActRIIA异多聚体或单臂ActRIIB异多聚体的剂量。
在一些实施方案中，本公开文本提供了治疗肾脏疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用单臂ActRIIB异多聚体，其中将所述单臂ActRIIB异多聚体以约0.25mg/kg与约30.00mg/kg之间的剂量施用于有需要的受试者。在一些实施方案中，每周施用至少一次单臂ActRIIB异多聚体。在一些实施方案中，每三周施用至少一次单臂ActRIIB异多聚体。在一些实施方案中，每四周施用至少一次单臂ActRIIB异多聚体。在一些实施方案中，皮下施用单臂ActRIIB异多聚体。
范例
现在大体上描述了本发明，通过参考以下实施例将更容易地理解本发明，包括所述实施例仅仅是出于说明本发明的某些实施方案的目的，并且不意图限制本发明。
实施例1.单臂ActRIIB异二聚体Fc融合物的产生和表征
申请人构建了可溶性单臂ActRIIB异二聚体Fc融合物，其包含具有短的N末端延伸的来自IgG重链的恒定区(例如，Fc结构域)以及其中人ActRIIB的细胞外结构域通过接头融合至来自IgG重链的单独恒定区(例如，Fc结构域)的第二多肽，所述接头位于所述细胞外结构域与来自IgG重链的该第二恒定区(例如，Fc结构域)之间。单独的构建体分别被称为单体Fc多肽和单臂ActRIIB Fc融合单体，并且下面提供各自的序列。
促进单臂ActRIIB异二聚体Fc融合物的形成而不是ActRIIB同二聚体Fc融合物或Fc同二聚体融合物的形成的方法是在Fc结构域氨基酸序列中引入改变，以引导不对称异聚体复合物的形成。在本公开文本中描述了使用Fc结构域制备不对称相互作用对的许多不同方法。
在一种方法中，在分别为SEQ ID NO:46-48、84和49-51、85的单臂ActRIIB Fc融合单体和单体Fc多肽序列中所示，改变一个Fc结构域以在相互作用面引入阳离子氨基酸，而改变另一个Fc结构域以在相互作用面引入阴离子氨基酸。单臂ActRIIB Fc融合单体和单体Fc多肽各自使用组织纤溶酶原激活物(TPA)前导序列：MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP(SEQ IDNO:45)。
单臂ActRIIB Fc融合单体序列(SEQ ID NO:46)如下所示：
Figure BDA0003929492720000741
前导(信号)序列和接头加下划线。为了促进单臂ActRIIB异二聚体Fc融合物的形成而不是可能的同二聚体复合物(ActRIIB同二聚体Fc融合物或同二聚体Fc融合物)中的任一种的形成，可以将两个氨基酸取代(用赖氨酸置换酸性氨基酸)引入ActRIIB融合蛋白的Fc结构域中，如上面的
Figure BDA0003929492720000742
所指示。可以任选地提供除去C末端赖氨酸(K)的氨基酸序列SEQ ID NO:46。
此单臂ActRIIB Fc融合单体由以下核酸序列(SEQ ID NO:47)编码：
Figure BDA0003929492720000743
Figure BDA0003929492720000751
成熟的单臂ActRIIB Fc融合单体(SEQ ID NO:48)如下。
Figure BDA0003929492720000752
可以任选地提供除去C末端赖氨酸的成熟单臂ActRIIB Fc融合单体(SEQ ID NO:84)，如下面所描绘。
Figure BDA0003929492720000753
互补的人G1Fc多肽(SEQ ID NO:49)使用TPA前导序列，并且为如下：
Figure BDA0003929492720000754
前导序列加下划线，并且Fc多肽的任选N末端延伸由
Figure BDA0003929492720000755
指示。为了促进单臂ActRIIB异二聚体Fc融合物的形成而不是可能的同二聚体融合物中的任一种的形成，可以将两个氨基酸取代(用阴离子残基置换赖氨酸)引入单体Fc多肽中，如上面的
Figure BDA0003929492720000756
所指示。可以任选地提供除去C末端赖氨酸的氨基酸序列SEQ ID NO:49。
此互补的Fc多肽由以下核酸(SEQ ID NO:50)编码。
Figure BDA0003929492720000757
Figure BDA0003929492720000761
成熟单体Fc多肽的序列如下(SEQ ID NO:51)。
Figure BDA0003929492720000762
可以任选地提供除去C末端赖氨酸的成熟单体Fc多肽的序列(SEQ ID NO:85)，如下面所描绘。
Figure BDA0003929492720000763
分别为SEQ ID NO:48(或SEQ ID NO:84)和SEQ ID NO:51(或SEQ ID NO:85)的单臂ActRIIB Fc融合单体和单体Fc多肽可以从CHO细胞系中共同表达和纯化，以产生单臂ActRIIB异二聚体Fc融合物。
在使用不对称Fc融合多肽促进异多聚体形成的另一种方法中，改变Fc结构域以引入互补的疏水性相互作用和另外的分子间二硫键，如分别为SEQ ID NO:60-61、86、90-91和62-63、87的单臂ActRIIB Fc融合单体和单体Fc多肽序列中所示。
单臂ActRIIB Fc融合单体序列(SEQ ID NO:60)使用TPA前导序列，并且如下所示：
Figure BDA0003929492720000764
前导序列和接头加下划线。为了促进单臂ActRIIB异二聚体Fc融合物的形成而不是可能的同二聚体复合物中的任一种的形成，可以将两个氨基酸取代(用半胱氨酸置换丝氨酸并用色氨酸置换苏氨酸)引入融合蛋白的Fc结构域中，如上面的
Figure BDA0003929492720000765
所指示。可以任选地提供除去C末端赖氨酸的氨基酸序列SEQ ID NO:60。
成熟的单臂ActRIIB Fc融合单体如下。
Figure BDA0003929492720000766
替代性成熟单臂ActRIIB Fc融合单体如下：
Figure BDA0003929492720000771
可以任选地提供除去C末端赖氨酸的成熟单臂ActRIIB Fc融合单体，如下面所描绘。
Figure BDA0003929492720000772
替代性成熟单臂ActRIIB Fc融合单体如下：
Figure BDA0003929492720000773
单体Fc多肽的互补形式(SEQ ID NO:62)使用TPA前导序列，并且为如下：
Figure BDA0003929492720000774
前导序列加下划线，并且Fc多肽的任选N末端延伸由
Figure BDA0003929492720000775
指示。为了促进单臂ActRIIB异二聚体Fc融合物的形成而不是可能的同二聚体复合物中的任一种的形成，可以将四个氨基酸取代引入单体Fc多肽中，如上面的
Figure BDA0003929492720000776
所指示。可以任选地提供除去C末端赖氨酸的氨基酸序列SEQ ID NO:62。
成熟单体Fc多肽序列(SEQ ID NO:63)如下。
Figure BDA0003929492720000777
可以任选地提供除去C末端赖氨酸的成熟单体Fc多肽序列(SEQ ID NO:87)，如下面所描绘。
Figure BDA0003929492720000778
Figure BDA0003929492720000781
分别为SEQ ID NO:61(或SEQ ID NO:86)和SEQ ID NO:63(或SEQ ID NO:87)的单臂ActRIIB Fc融合单体和单体Fc多肽可以从CHO细胞系中共同表达和纯化，以产生单臂ActRIIB异二聚体Fc融合物。
分别为SEQ ID NO:90(或SEQ ID NO:91)和SEQ ID NO:63(或SEQ ID NO:87)的单臂ActRIIB Fc融合单体和单体Fc多肽可以从CHO细胞系中共同表达和纯化，以产生单臂ActRIIB异二聚体Fc融合物。
可以通过一系列柱色谱步骤实现各种单臂ActRIIB异二聚体Fc融合物的纯化，包括例如以任何顺序的以下步骤中的三步或更多步：蛋白A色谱、Q琼脂糖色谱、苯基琼脂糖色谱、尺寸排阻色谱和阳离子交换色谱。可以用病毒过滤和缓冲液置换完成纯化。
将基于BiacoreTM的结合测定用于将上述单臂ActRIIB异二聚体Fc融合物的配体结合选择性与ActRIIB同二聚体Fc融合物的配体结合选择性进行比较。使用抗Fc抗体将单臂ActRIIB同二聚体Fc融合物和ActRIIB同二聚体Fc融合物独立地捕获到系统上。注射配体并使其流过所捕获的受体蛋白。结果总结于下表中，其中通常与最有效的配体捕获物相关的配体解离速率(kd)由灰色阴影表示。
Figure BDA0003929492720000782
这些比较结合数据证明，单臂ActRIIB异二聚体Fc融合物比ActRIIB同二聚体Fc融合物具有更大的配体选择性。虽然ActRIIB同二聚体Fc融合物强结合五种重要的配体(参见图5中的激活素A、激活素B、BMP10、GDF8和GDF11的簇)，但是单臂ActRIIB异二聚体Fc融合物更容易区分这些配体。因此，单臂ActRIIB异二聚体Fc融合物与激活素B和GDF11强结合，并且以中等强度与GDF8和激活素A结合。与ActRIIB同二聚体Fc融合物进一步形成对比，单臂ActRIIB异二聚体Fc融合物仅显示与BMP10的弱结合并且不结合BMP9。参见图5。
这些结果表明，单臂ActRIIB异二聚体Fc融合物是比ActRIIB同二聚体Fc融合物更具选择性的拮抗剂。因此，在这种选择性拮抗作用有利的某些应用中，单臂ActRIIB异二聚体Fc融合物将比ActRIIB同二聚体Fc融合物更有用。例子包括需要保留激活素A、激活素B、GDF8和GDF11中的一种或多种的拮抗作用而使BMP9、BMP10、BMP6和GDF3中的一种或多种的拮抗作用降至最低的治疗应用。前一组中配体的选择性抑制在治疗上特别有利，因为它们构成往往在功能上与后一组及其相关临床条件组不同的亚家族。
实施例2.单臂ActRIIA异二聚体Fc融合物的产生和表征
申请人构建了可溶性单臂ActRIIA异二聚体Fc融合物，其包含具有短的N末端延伸的单体Fc多肽以及其中人ActRIIA的细胞外结构域通过接头融合至单独的Fc结构域的第二多肽，所述接头位于所述细胞外结构域该第二Fc结构域之间。单独的构建体分别被称为单体Fc多肽和单臂ActRIIA Fc融合单体，并且下面提供各自的序列。
单臂ActRIIA异二聚体Fc融合物的形成可以由与实施例1中针对单臂ActRIIB异二聚体Fc融合物所描述的那些方法类似的方法指导。在第一方法中，在分别为SEQ ID NO:55-57、88和49-51、85的单臂ActRIIA Fc融合单体和单体Fc多肽序列中所示，改变一个Fc结构域以在相互作用面引入阳离子氨基酸，而改变另一个Fc结构域以在相互作用面引入阴离子氨基酸。
单臂ActRIIA Fc融合单体使用TPA前导序列，并且为如下：
Figure BDA0003929492720000791
前导序列和接头序列加下划线。为了促进单臂ActRIIA异二聚体Fc融合物的形成而不是可能的同二聚体复合物(ActRIIA同二聚体Fc融合物或Fc同二聚体融合物)中的任一种的形成，可以将两个氨基酸取代(用赖氨酸置换阴离子残基)引入融合多肽的Fc结构域中，如上面的
Figure BDA0003929492720000792
所指示。可以任选地提供除去C末端赖氨酸的氨基酸序列SEQ ID NO:55。
此单臂ActRIIA Fc融合单体由以下核酸序列(SEQ ID NO:56)编码。
Figure BDA0003929492720000793
成熟的单臂ActRIIA Fc融合单体序列如下(SEQ ID NO:57)。
Figure BDA0003929492720000794
Figure BDA0003929492720000801
可以任选地提供如下除去C末端赖氨酸的成熟单臂ActRIIA Fc融合单体序列(SEQID NO:88)。
Figure BDA0003929492720000802
如实施例1中所述，单体人G1Fc多肽的互补形式(SEQ ID NO:49)使用TPA前导序列并且包含任选的N末端延伸。为了促进单臂ActRIIA异二聚体Fc融合物的形成而不是可能的同二聚体复合物中的任一种的形成，可以将两个氨基酸取代(用阴离子残基置换赖氨酸)引入单体Fc多肽中。可以任选地提供没有C末端赖氨酸的氨基酸序列SEQ ID NO:49。此互补的Fc多肽由SEQ ID NO:50的核酸编码，并且可以任选地提供除去C末端赖氨酸的成熟单体Fc多肽(SEQ ID NO:51或SEQ ID NO:85)。
分别为SEQ ID NO:57(或SEQ ID NO:88)和SEQ ID NO:51(或SEQ ID NO:85)的单臂ActRIIA Fc融合单体和单体Fc多肽可以从CHO细胞系中共同表达和纯化，以产生单臂ActRIIA异二聚体Fc融合物。
在使用不对称Fc融合多肽促进异多聚体形成的另一种方法中，改变Fc结构域以引入互补的疏水性相互作用和另外的分子间二硫键，如分别为SEQ ID NO:58-59、89和62-63、87的单臂ActRIIA Fc融合单体和Fc多肽序列中所示。
单臂ActRIIA Fc融合单体(SEQ ID NO:58)使用TPA前导序列，并且为如下：
Figure BDA0003929492720000803
前导序列和接头加下划线。为了促进单臂ActRIIA异二聚体Fc融合物的形成而不是可能的同二聚体复合物中的任一种的形成，可以将两个氨基酸取代(用半胱氨酸置换丝氨酸并用色氨酸置换苏氨酸)引入单臂ActRIIA Fc融合单体的Fc结构域中，如上面的
Figure BDA0003929492720000804
所指示。SEQ ID NO:58的氨基酸序列可以任选地提供为除去C末端赖氨酸的(SEQID NO:89)。
成熟的单臂ActRIIA Fc融合单体(SEQ ID NO:59)如下。
Figure BDA0003929492720000805
Figure BDA0003929492720000811
可以任选地提供如下除去C末端赖氨酸的成熟单臂ActRIIA Fc融合单体(SEQ IDNO:89)。
Figure BDA0003929492720000812
如实施例1中所述，单体人G1Fc多肽的互补形式(SEQ ID NO:62)使用TPA前导序列并且包含任选的N末端延伸。为了促进单臂ActRIIA异二聚体Fc融合物的形成而不是可能的同二聚体复合物中的任一种的形成，可以将四个氨基酸取代引入所指示的单体Fc多肽中。SEQ ID NO:62的氨基酸序列和成熟G1Fc多肽(SEQ ID NO:63)可以任选地提供为除去C末端赖氨酸的(SEQ ID NO:87)。
分别为SEQ ID NO:59(或SEQ ID NO:89)和SEQ ID NO:63(或SEQ ID NO:87)的单臂ActRIIA Fc融合单体和单体Fc多肽可以从CHO细胞系中共同表达和纯化，以产生单臂ActRIIA同二聚体Fc融合物。
可以通过一系列柱色谱步骤实现各种单臂ActRIIA异二聚体Fc融合物的纯化，包括例如以任何顺序的以下步骤中的三步或更多步：蛋白A色谱、Q琼脂糖色谱、苯基琼脂糖色谱、尺寸排阻色谱和阳离子交换色谱。可以用病毒过滤和缓冲液置换完成纯化。
将基于BiacoreTM的结合测定用于将上述单臂ActRIIA异二聚体Fc融合物的配体结合选择性与ActRIIA同二聚体Fc融合物的配体结合选择性进行比较。使用抗Fc抗体将单臂ActRIIA异二聚体Fc融合物和ActRIIA同二聚体Fc融合物独立地捕获到系统上。注射配体并使其流过所捕获的受体蛋白。结果总结于下表中，其中通常与最有效的配体捕获物相关的配体解离速率(kd)由灰色阴影表示。
Figure BDA0003929492720000813
这些比较结合数据表明，单臂ActRIIA-Fc异二聚体Fc融合物与ActRIIA同二聚体Fc融合物具有不同的配体选择性(并且也不同于单臂同聚体ActRIIB-Fc–参见实施例1)。ActRIIA同二聚体Fc融合物展现出与激活素B的优先结合以及与激活素A和GDF11的强结合，然而单臂ActRIIA异二聚体Fc融合物具有相比于激活素B对激活素A的逆优先选择，并且相比于GDF11(弱结合剂)对激活素A的选择性大大增强。参见图6。此外，单臂ActRIIA异二聚体Fc融合物主要保留与GDF8和BMP10的中等结合，如用ActRIIA同二聚体Fc融合物观察到的。
这些结果表明，与ActRIIA同二聚体Fc融合物相比，单臂ActRIIA异二聚体Fc融合物是配体选择性显著改变的拮抗剂。因此，在这种拮抗作用有利的某些应用中，单臂ActRIIA异二聚体Fc融合物将比ActRIIA同二聚体Fc融合物更有用。例子包括其中需要相比于激活素B对激活素A优先拮抗，同时使GDF11的拮抗作用降至最低的治疗应用。
总之，前述例子证明，当ActRIIA或ActRIIB多肽置于单臂异聚体蛋白质复合物的上下文中时形成新的结合口袋，所述新的结合口袋相对于任一种类型的同聚体蛋白质复合物展现出改变的选择性，允许形成可能用作治疗剂的新的蛋白质药剂。
实施例3.单臂ActRIIB异二聚体Fc融合蛋白治疗会抑制肾纤维化和炎症并减少肾损伤。
在小鼠单侧输尿管梗阻(UUO)模型中评估单臂ActRIIB异二聚体Fc融合蛋白对肾脏疾病的作用。参见例如Klahr和Morrissey(2002)Am J Physiol Renal Physiol 283:F861-F875。
十六只12周龄的C57BL/6雄性小鼠在肾的下极水平下进行两次左侧单侧输尿管结扎。3天后，将小鼠随机分为两组：i)“UUO/PBS”(八只小鼠在手术后第3天、第7天、第10天和第14天皮下注射媒介物对照磷酸盐缓冲盐水(PBS))和ii)“UUO/sa-IIB-hd”(八只小鼠在手术后第3天、第7天、第10天和第14天皮下注射10mg/kg剂量的单臂ActRIIB异二聚体Fc融合蛋白)。根据相关的动物护理指南，在第17天处死两组小鼠。将从UUO肾和对侧肾(“对照”)收集来自各个动物的半个肾用于组织学分析(H&E和马松三色(Masson’s Trichrome)染色)，并且将1/4肾用于RNA提取(RNeasy Midi Kit，Qiagen,IL)。
对UUO肾样品进行基因表达分析以评估各个基因的水平。在CFX ConnectTM实时PCR检测系统(Bio-Rad,CA)上执行QRT-PCR以评估以下基因的表达：各种纤维化基因(纤连蛋白、PAI-1、CTGF、Col-I、Col-III和a-SMA)(分别为图7A-图7F)、炎性基因(MCP-1和TNFα)(分别为图7G-图7H)、凝血酶敏感蛋白1(Thbs1)(图7I)、肾损伤基因(NGAL)(图7J)和TGFβ超家族配体(TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3和激活素A)(分别为图7K-图7N)。这些TGFβ超家族配体的上调与肾纤维化/肾功能障碍高度相关，并且它们用作肾损伤的良好指示器。一般而言，在纤维化期间TGFβ上调几个纤维化基因，包括此处测试的那些。Thbs1是TGFβ的直接下游靶标，并且也在调节TGFβ激活中发挥作用(包括在纤维化期间)。测量Thbs1的表达水平提供纤维化水平的指示，因为Thbs1表达的增加可能意味着TGFβ表达的增加。相对于“UUO/PBS”治疗的小鼠，“UUO/sa-IIB-hd”治疗的小鼠表现出显著降低的纤维化和炎性基因表达，减少的TGFβ1/2/3、激活素A和Thbs1上调，以及降低的肾损伤基因表达。
总之，这些数据证明，单臂ActRIIB异二聚体Fc融合蛋白治疗会抑制肾纤维化和炎症，并减少肾损伤。此外，这些数据表明，其他单臂ActRII异二聚体Fc融合蛋白可能可用于治疗或预防肾脏疾病或病症，包括例如单臂ActRIIA异二聚体Fc融合蛋白。
实施例4.在奥尔波特小鼠模型中，单臂ActRIIB异二聚体Fc融合蛋白治疗会减少白蛋白尿并改善肾功能。
在小鼠奥尔波特模型(Col4a3-/-)中评估单臂ActRIIB异二聚体Fc融合蛋白对肾脏疾病的作用。参见例如Cosgrove D等人(1996)Genes Dev 10(23):2981-92。
将十三只4周龄的Col4a3-/-小鼠随机分为两组：i)“Col4a3媒介物”(七只小鼠皮下注射媒介物对照磷酸盐缓冲盐水(PBS)，每周两次)和ii)“Col4a3 sa-IIB-hd(30mpk)”(六只小鼠以30mg/kg的剂量皮下注射单臂ActRIIB异二聚体Fc融合蛋白，每周两次)。在治疗开始前一天(4周)和在第53天(7.5周)从六只Col4a3+/+小鼠(“WT”)、七只Col4a3-/-小鼠(“Col4a3媒介物”)以及六只用单臂ActRIIB异二聚体Fc融合蛋白治疗的Col4a3-/-小鼠(“Col4a3 sa-IIB-hd(30mpk)”)收集尿样品，以测量白蛋白(小鼠白蛋白ELISA试剂盒，Molecular Innovations,MI)和肌酐(肌酐测定试剂盒，BioAssay Systems,CA)水平。ACR是尿中白蛋白与肌酐比率的测量。白蛋白是通常存在于血液中的主要蛋白质，并且当肾正常发挥功能时尿中通常存在很少、甚至没有白蛋白。计算白蛋白与肌酐比率(ACR)以更准确地指示有多少白蛋白被释放到尿中。肌酐是肌肉新陈代谢的副产品，通常以恒定的速率释放到尿中，使肌酐测量用作在测量随机尿样品中的白蛋白时校正尿浓度的一种方式。较高的ACR测量值指示肾无法正常发挥功能。在治疗开始前一天(4周)和在第53天(7.5周)从六只Col4a3+/+小鼠(“WT”)、七只Col4a3-/-小鼠(“Col4a3媒介物”)以及六只用单臂ActRIIB异二聚体Fc融合蛋白治疗的Col4a3-/-小鼠(“Col4a3 sa-IIB-hd(30mpk)”)收集血液样品，以确定血尿素氮(BUN)测量值(DRI-CHEM 7000化学分析仪，HESKA,CO)。BUN是由废物尿素产生的血液中氮的量的测量值。尿素通常通过尿排出体外。血液中尿素水平较高指示肾无法正常发挥功能。根据相关的动物护理指南，在第53天(7.5周)处死两组小鼠。
计算尿白蛋白与肌酐比率(ACR)以测量白蛋白尿。参见图8A。在Col4a3-/-小鼠(“Col4a3媒介物”)小鼠中从4周到7.5周白蛋白尿显著增加。相对于Col4a3媒介物小鼠，用单臂ActRIIB异二聚体Fc融合蛋白治疗小鼠(Col4a3 sa-IIB-hd小鼠)将白蛋白尿显著减少了49.9％(p<0.01)，这与Col4a3 sa-IIB-hd小鼠中的BUN降低相关(图8B)。
总之，这些数据证明，在奥尔波特小鼠模型中，单臂ActRIIB异二聚体Fc融合蛋白治疗会减少白蛋白尿并改善肾功能。此外，这些数据表明，其他单臂ActRII异二聚体Fc融合蛋白可能可用于治疗或预防肾脏疾病或病症(例如奥尔波特疾病)，包括例如单臂ActRIIA异二聚体Fc融合蛋白。
实施例5.在Col4a3-/-奥尔波特小鼠模型中在ACEi(雷米普利)的存在下单臂ActRIIB异二聚体Fc融合蛋白治疗会减少白蛋白尿并延长存活期。
在小鼠奥尔波特模型(Col4a3-/-)中评估单臂ActRIIB异二聚体Fc融合蛋白对肾脏疾病的作用。参见例如Cosgrove D等人(1996)Genes Dev 10(23):2981-92。
将五十八只6周龄的Col4a3-/-小鼠用在饮用水中的雷米普利(ACEi，10mg/kg/天)治疗，并且随机分为三组：i)“Col4a3媒介物”(二十七只小鼠皮下注射媒介物对照磷酸盐缓冲盐水(PBS)，每周两次)；ii)“Col4a3 sa-IIB-hd(10mpk)”(十一只小鼠以10mg/kg的剂量皮下注射单臂ActRIIB异二聚体Fc融合蛋白，每周两次)；和iii)“Col4a3 sa-IIB-hd(30mpk)”(二十只小鼠以30mg/kg的剂量皮下注射单臂ActRIIB异二聚体Fc融合蛋白，每周两次)。“WT”小鼠是未经治疗的Col4a3+/+小鼠。在治疗开始前一天(在6周)、在第53天(在7.5周)、在第63天(在9周)和在第70天(在10周)收集尿样品，以测量白蛋白(小鼠白蛋白ELISA试剂盒，Molecular Innovations,MI)、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)(Abcam,MA)和肌酐(肌酐测定试剂盒，BioAssay Systems,CA)水平。ACR是尿中白蛋白与肌酐比率的测量。白蛋白是通常存在于血液中的主要蛋白质，并且当肾正常发挥功能时尿中通常存在很少、甚至没有白蛋白。计算白蛋白与肌酐比率(ACR)以更准确地指示有多少白蛋白被释放到尿中。NGAL是肾损伤的标记，并且尿NGAL水平的升高与肾损伤的严重性相关。较高的ACR测量值指示肾无法正常发挥功能。根据相关动物护理指南(Animal CareGuidelines)，继续进行治疗以评估每个组的存活期。
计算尿白蛋白与肌酐比率(ACR)以测量白蛋白尿。参见图9A。无论ACEi治疗如何，在Col4a3-/-小鼠(“Col4a3媒介物”)中从6周到10周白蛋白尿显著增加。相对于Col4a3媒介物小鼠，在ACEi的存在下用10mg/pk和30mg/kg两个剂量的单臂ActRIIB异二聚体Fc融合蛋白治疗小鼠(Col4a3 sa-IIB-hd小鼠)显著减少白蛋白尿。此外，在ACEi的存在下，30mg/kg治疗显著降低尿NGAL(例如，uNGAL)水平(图9B)。
如图9C所示，在ACEi的存在下，“Col4a3媒介物”小鼠的中值存活期为76天。用10mg/kg的单臂ActRIIB异二聚体Fc融合蛋白(Col4a3 sa-IIB-hd小鼠)治疗小鼠增加了寿命，其中中值存活期为93天。用30mg/kg的单臂ActRIIB异二聚体Fc融合蛋白(Col4a3 sa-IIB-hd小鼠)治疗小鼠显著增加了寿命，其中中值存活期为109天(p<0.001)。
总之，这些数据证明，在奥尔波特小鼠模型中在ACEi的存在下单臂ActRIIB异二聚体Fc融合蛋白治疗会减少白蛋白尿并延长存活期。此外，这些数据表明，其他单臂ActRII异二聚体Fc融合蛋白可能可用于治疗或预防肾脏疾病或病症(例如奥尔波特疾病)，包括例如单臂ActRIIA异二聚体Fc融合蛋白。
通过引用并入
本文提及的所有出版物和专利均通过引用以其整体特此并入，如同每个单独的出版物或专利被明确且单独地指出通过引用并入一样。
虽然已经讨论了主题的特定实施方案，但是上述说明书是说明性的而非限制性的。在回顾本说明书和以下权利要求后，许多变化对于本领域技术人员将变得显而易见。本发明的全部范围应通过参考权利要求和其等效物的全部范围以及说明书和此类变化来确定。

Claims (123)

1.一种治疗肾脏疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用单臂ActRIIB异多聚体，所述异多聚体包含与第二多肽共价或非共价缔合的第一多肽，其中：
a.所述第一多肽包含相互作用对的第一成员的氨基酸序列和ActRIIB的氨基酸序列；并且
b.所述第二多肽包含所述相互作用对的第二成员的氨基酸序列，并且其中所述第二多肽不包含ActRIIB的氨基酸序列。
2.一种治疗肾脏疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用单臂ActRIIA异多聚体，所述异多聚体包含与第二多肽共价或非共价缔合的第一多肽，其中：
a.所述第一多肽包含相互作用对的第一成员的氨基酸序列和ActRIIA的氨基酸序列；并且
b.所述第二多肽包含所述相互作用对的第二成员的氨基酸序列，并且其中所述第二多肽不包含和ActRIIA的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述ActRIIB多肽包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列：
a.与SEQ ID NO:1、2、3、4、5和6中任一个的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；或
b.与开始于SEQ ID NO:1的氨基酸20、21、22、23、24、25、26、27、28或29中的任一个并且结束于SEQ ID NO:1的氨基酸109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134中的任一个的多肽至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述ActRIIB多肽在与SEQ ID NO:1的L79对应的位置处不包含酸性氨基酸。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述ActRIIB多肽在与SEQ ID NO:1的L79对应的位置处不包含天冬氨酸(D)。
6.根据权利要求2所述的方法，其中所述ActRIIA多肽包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列：
a.与SEQ ID NO:9、10和11中任一个的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；或
b.与开始于SEQ ID NO:9的氨基酸21、22、23、24、25、26、27、28、29或30中的任一个并且结束于SEQ ID NO:9的氨基酸110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134或135中的任一个的多肽至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述异多聚体是异二聚体。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中相互作用对的所述第一成员包含来自IgG重链的第一恒定区。
9.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中相互作用对的所述第二成员包含来自IgG重链的第二恒定区。
10.根据权利要求8所述的方法，其中来自IgG重链的所述第一恒定区是第一免疫球蛋白Fc结构域。
11.根据权利要求9所述的方法，其中来自IgG重链的所述第二恒定区是第一免疫球蛋白Fc结构域。
12.根据权利要求8所述的方法，其中来自IgG重链的所述第一恒定区包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO:14-28中任一个的序列至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
13.根据权利要求9所述的方法，其中来自IgG重链的所述第二恒定区包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO:14-28中任一个的序列至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述第一多肽包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO:46、48、55、57、58、59、60、61、84、86、88、89、90和91中任一个的序列至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述第二多肽包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO:49、51、62、63、85和87中任一个的序列至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
16.根据权利要求1、3-5或7-15中任一项所述的方法，其中所述单臂ActRIIB异多聚体包含定位于所述ActRIIB多肽与相互作用对的所述第一成员之间的接头结构域。
17.根据权利要求2、6或7-15中任一项所述的方法，其中所述单臂ActRIIA异多聚体包含定位于所述ActRIIA多肽与相互作用对的所述第一成员之间的接头结构域。
18.根据权利要求16或17中任一项所述的方法，其中所述接头结构域包含选自SEQ IDNO:29-44中任一个的氨基酸序列。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述第一多肽和/或所述第二多肽包含一个或多个经修饰的氨基酸残基，所述一个或多个经修饰的氨基酸残基选自：糖基化氨基酸、PEG化氨基酸、法尼基化氨基酸、乙酰化氨基酸、生物素化氨基酸和与脂质部分缀合的氨基酸。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述第一多肽和/或所述第二多肽是糖基化的，并且具有可从所述第一多肽和/或所述第二多肽在CHO细胞中的表达获得的糖基化模式。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述异多聚体结合选自以下的一种或多种配体：激活素A、激活素B、GDF11、GDF8、GDF3、BMP5、BMP6和BMP10。
22.根据权利要求1、3-5或7-16、18-21中任一项所述的方法，其中所述单臂ActRIIB异多聚体结合激活素B和GDF11。
23.根据权利要求1、3-5或7-16、18-21中任一项所述的方法，其中所述单臂ActRIIB异多聚体结合GDF8和激活素A。
24.根据权利要求2、6、7-15或17-21中任一项所述的方法，其中所述单臂ActRIIA异多聚体结合激活素A。
25.根据权利要求2、6、7-15或17-21中任一项所述的方法，其中所述单臂ActRIIA异多聚体结合GDF8。
26.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中在基于细胞的测定中所述异多聚体抑制一种或多种配体的活性。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述肾脏疾病或病症是奥尔波特综合征。
28.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述肾脏疾病或病症是局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述FSGS是原发性FSGS。
30.根据权利要求28所述的方法，其中所述FSGS是继发性FSGS。
31.根据权利要求28所述的方法，其中所述FSGS是遗传性FSGS。
32.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述肾脏疾病或病症是多囊肾病。
33.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述肾脏疾病或病症是常染色体显性多囊肾病(ADPKD)。
34.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述肾脏疾病或病症是常染色体隐性多囊肾病(ARPKD)。
35.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述肾脏疾病或病症是慢性肾脏疾病(CKD)。
36.根据权利要求1-35中任一项所述的方法，其中所述受试者患有肾功能下降。
37.根据权利要求1-35中任一项所述的方法，其中所述方法减缓肾功能下降。
38.根据权利要求1-37中任一项所述的方法，所述方法包括向所述受试者进一步施用用于治疗肾脏疾病或病症的另外的活性剂和/或支持疗法。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述用于治疗肾脏疾病或病症的另外的活性剂和/或支持疗法选自：血管紧张素受体阻滞剂(ARB)(例如，氯沙坦、厄贝沙坦、奥美沙坦、坎地沙坦、缬沙坦、非马沙坦、阿齐沙坦、沙普立沙坦和替米沙坦)、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂(例如，贝那普利、卡托普利、依那普利、赖诺普利、培哚普利、雷米普利、群多普利和佐芬普利)、糖皮质激素(例如，倍氯米松、倍他米松、布地奈德、可的松、地塞米松、氢化可的松、甲泼尼龙、泼尼松龙、甲基泼尼松、泼尼松和曲安西龙)、钙调磷酸酶抑制剂(例如，环孢菌素、他克莫司)、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、JAK激酶抑制剂(例如，托法替尼)、mTOR抑制剂(例如，西罗莫司、依维莫司)、IMDH抑制剂(例如，硫唑嘌呤、来氟米特、霉酚酸酯)、生物制剂(例如，阿巴西普、阿达木单抗、阿那白滞素、巴利昔单抗、赛妥珠单抗、达克利珠单抗、依那西普、非苏木单抗、戈利木单抗、英夫利昔单抗、伊卡组单抗、那他珠单抗、利妥昔单抗、司库奴单抗、托珠单抗、乌司奴单抗、维多珠单抗)、他汀类药物(例如，贝那普利、缬沙坦、氟伐他汀、普伐他汀)、lademirsen(抗miRNA-21)、甲基巴多索隆、Achtar凝胶、托伐普坦、阿巴西普与司帕生坦的组合、阿利吉仑、别嘌呤醇、ANG-3070、阿托伐他汀、布来鲁单抗、波舒替尼、CCX140-B、CXA-10、D6-25-羟基维生素D3、达格列净、地塞米松与MMF的组合、大黄素、FG-3019、FK506、FK-506和MMF、FT-011、半乳糖、GC1008、GFB-887、异维甲酸、兰瑞肽、左旋咪唑、利希普坦、洛吡莫德、二甲双胍、咪唑立宾、N-乙酰甘露糖胺、奥曲肽、帕立骨化醇、PF-06730512、吡格列酮、丙帕锗、丙帕锗和厄贝沙坦、雷帕鸣、雷帕霉素、RE-021(例如，司帕生坦)、RG012、罗格列酮(例如，文迪雅)、沙奎那韦、SAR339375、生长抑素、螺内酯、特伐替尼(KD019)、替可克(tetracosactin)、雷公藤多甙(tripterygium wilfordii)(TW)、丙戊酸、VAR-200、文鲁司他(GZ402671)、维立诺雷、伏环孢素、VX-147、肾透析、肾移植、间充质干细胞疗法、骨髓干细胞、脂蛋白去除、Liposorber LA-15装置、血浆单采术、血浆置换和饮食改变(例如饮食钠摄入)。
40.根据权利要求38所述的方法，其中所述用于治疗肾脏疾病或病症的另外的活性剂和/或支持疗法是选自以下的血管紧张素受体阻滞剂(ARB)：氯沙坦、厄贝沙坦、奥美沙坦、坎地沙坦、缬沙坦、非马沙坦、阿齐沙坦、沙普立沙坦和替米沙坦。
41.根据权利要求38所述的方法，其中所述用于治疗肾脏疾病或病症的另外的活性剂和/或支持疗法是选自以下的血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂：贝那普利、卡托普利、依那普利、赖诺普利、培哚普利、雷米普利、群多普利和佐芬普利。
42.根据权利要求38所述的方法，其中所述用于治疗肾脏疾病或病症的另外的活性剂和/或支持疗法是ARB和ACE抑制剂的组合。
43.根据权利要求1-42中任一项所述的方法，其中所述受试者患有蛋白尿。
44.根据权利要求1-42中任一项所述的方法，其中所述受试者患有白蛋白尿。
45.根据权利要求1-42中任一项所述的方法，其中所述受试者患有中度白蛋白尿。
46.根据权利要求1-42中任一项所述的方法，其中所述受试者患有重度白蛋白尿。
47.根据权利要求1-46中任一项所述的方法，其中所述方法降低有需要的受试者的白蛋白尿、蛋白尿、微量白蛋白尿和巨白蛋白尿中的一种或多种的严重性、发生率和/或持续时间。
48.根据权利要求45所述的方法，其中所述受试者具有在约30与约300mg白蛋白/24小时尿收集之间的白蛋白-肌酐比率(ACR)。
49.根据权利要求45所述的方法，其中所述受试者具有在约30与约300mg白蛋白/g肌酐之间的ACR。
50.根据权利要求46所述的方法，其中所述受试者具有高于约300mg白蛋白/24小时的白蛋白-肌酐比率(ACR)。
51.根据权利要求46所述的方法，其中所述受试者具有高于约300mg白蛋白/g肌酐的ACR。
52.根据权利要求1-44中任一项所述的方法，其中所述受试者患有A1期白蛋白尿。
53.根据权利要求1-44中任一项所述的方法，其中所述受试者患有A2期白蛋白尿。
54.根据权利要求1-44中任一项所述的方法，其中所述受试者患有A3期白蛋白尿。
55.根据权利要求1-44中任一项所述的方法，其中所述方法降低A1期白蛋白尿的严重性、发生率和/或持续时间。
56.根据权利要求1-44中任一项所述的方法，其中所述方法降低A2期白蛋白尿的严重性、发生率和/或持续时间。
57.根据权利要求1-44中任一项所述的方法，其中所述方法降低A3期白蛋白尿的严重性、发生率和/或持续时间。
58.根据权利要求1-44中任一项所述的方法，其中所述方法延迟或防止患有A1期白蛋白尿的受试者进展为A2期白蛋白尿。
59.根据权利要求1-44中任一项所述的方法，其中所述方法延迟或防止患有A2期白蛋白尿的受试者进展为A3期白蛋白尿。
60.根据权利要求1-44中任一项所述的方法，其中所述方法延迟和/或防止有需要的受试者的白蛋白尿分期进展的恶化。
61.根据权利要求1-44中任一项所述的方法，其中所述方法将受试者的白蛋白尿分类改善了一期或多期。
62.根据权利要求1-61中任一项所述的方法，其中所述方法降低所述受试者的ACR。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述方法将所述受试者的ACR降低了约0.1与约100.0mg之间的白蛋白/g肌酐(例如，降低了约0.1与约2.5mg之间的白蛋白/g肌酐、约2.5与约3.5mg之间的白蛋白/g肌酐、约3.5与约5.0mg之间的白蛋白/g肌酐、约5.0与约7.5mg之间的白蛋白/g肌酐、约7.5与约10.0mg之间的白蛋白/g肌酐、约10.0与约15.0mg之间的白蛋白/g肌酐、约15.0与约20.0mg之间的白蛋白/g肌酐、约20.0与约25.0mg之间的白蛋白/g肌酐、约30.0与约35.0mg之间的白蛋白/g肌酐、约40.0与约45.0mg之间的白蛋白/g肌酐、约45.0与约50.0mg之间的白蛋白/g肌酐、约50.0与约60.0mg之间的白蛋白/g肌酐、约60.0与约70.0mg之间的白蛋白/g肌酐、约70.0与约80.0mg之间的白蛋白/g肌酐、约80.0与约90.0mg之间的白蛋白/g肌酐、约90.0与约100.0mg之间的白蛋白/g肌酐)。
64.根据权利要求62所述的方法，其中与基线测量相比，所述方法将所述受试者的ACR降低了至少2.5％(例如，5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％)。
65.根据权利要求1-64中任一项所述的方法，其中所述方法降低所述受试者的尿蛋白-肌酐比率(UPCR)。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述方法将所述受试者的UPCR降低了约0.1与约100.0mg之间的尿蛋白/mg肌酐(例如，降低了约0.1与约2.5mg之间的尿蛋白/mg肌酐、约2.5与约3.5mg之间的尿蛋白/mg肌酐、约3.5与约5.0mg之间的尿蛋白/mg肌酐、约5.0与约7.5mg之间的尿蛋白/mg肌酐、约7.5与约10.0mg之间的尿蛋白/mg肌酐、约10.0与约15.0mg之间的尿蛋白/mg肌酐、约15.0与约20.0mg之间的尿蛋白/mg肌酐、约20.0与约25.0mg之间的尿蛋白/mg肌酐、约30.0与约35.0mg之间的尿蛋白/mg肌酐、约40.0与约45.0mg之间的尿蛋白/mg肌酐、约45.0与约50.0mg之间的尿蛋白/mg肌酐、约50.0与约60.0mg之间的尿蛋白/mg肌酐、约60.0与约70.0mg之间的尿蛋白/mg肌酐、约70.0与约80.0mg之间的尿蛋白/mg肌酐、约80.0与约90.0mg之间的尿蛋白/mg肌酐、约90.0与约100.0mg之间的尿蛋白/mg肌酐)。
67.根据权利要求65所述的方法，其中所述方法将所述受试者的UPCR降低了约0.1与约100.0g之间的尿蛋白/g肌酐(例如，降低了约0.1与约2.5g之间的尿蛋白/g肌酐、约2.5与约3.5g之间的尿蛋白/g肌酐、约3.5与约5.0g之间的尿蛋白/g肌酐、约5.0与约7.5g之间的尿蛋白/g肌酐、约7.5与约10.0g之间的尿蛋白/g肌酐、约10.0与约15.0g之间的尿蛋白/g肌酐、约15.0与约20.0g之间的尿蛋白/g肌酐、约20.0与约25.0g之间的尿蛋白/g肌酐、约30.0与约35.0g之间的尿蛋白/g肌酐、约40.0与约45.0g之间的尿蛋白/g肌酐、约45.0与约50.0g之间的尿蛋白/g肌酐、约50.0与约60.0g之间的尿蛋白/g肌酐、约60.0与约70.0g之间的尿蛋白/g肌酐、约70.0与约80.0g之间的尿蛋白/g肌酐、约80.0与约90.0g之间的尿蛋白/g肌酐、约90.0与约100.0g之间的尿蛋白/g肌酐)。
68.根据权利要求65所述的方法，其中与基线测量相比，所述方法将所述受试者的绝对UPCR降低了大于或等于0.5g尿蛋白/g肌酐。
69.根据权利要求65所述的方法，其中与基线测量相比，所述方法将所述受试者的UPCR降低至小于0.5g尿蛋白/g肌酐。
70.根据权利要求65所述的方法，其中与基线测量相比，所述方法将所述受试者的UPCR降低至小于0.3g尿蛋白/g肌酐。
71.根据权利要求65所述的方法，其中与基线测量相比，所述方法将所述受试者的UPCR降低了至少2.5％(例如，5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％)。
72.根据权利要求65所述的方法，其中与基线测量相比，所述方法将所述受试者的UPCR降低了大于或等于30％。
73.根据权利要求65所述的方法，其中与基线测量相比，所述方法将所述受试者的UPCR降低了大于或等于40％。
74.根据权利要求65所述的方法，其中与基线测量相比，所述方法将所述受试者的UPCR降低了大于或等于50％。
75.根据权利要求1-74中任一项所述的方法，其中所述方法增加所述受试者的估计肾小球滤过率(eGFR)和/或肾小球滤过率(GFR)。
76.根据权利要求75所述的方法，其中使用血清肌酐、年龄、种族和性别变量来测量所述eGFR。
77.根据权利要求75所述的方法，其中使用Cockcroft-Gault公式、肾脏疾病饮食改良(MDRD)公式、CKD-EPI公式、Mayo二次公式和Schwartz公式中的一种或多种来测量所述eGFR。
78.根据权利要求75所述的方法，其中与基线测量相比，所述eGFR和/或所述GFR增加了至少2.5％(例如，5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％)。
79.根据权利要求75所述的方法，其中与基线测量相比，所述eGFR和/或所述GFR增加了大于或等于30％。
80.根据权利要求75所述的方法，其中与基线测量相比，所述eGFR和/或所述GFR增加了大于或等于40％。
81.根据权利要求75所述的方法，其中与基线测量相比，所述eGFR和/或所述GFR增加了约1mL/min/1.73m2(例如，3、5、7、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100mL/min/1.73m2)。
82.根据权利要求75所述的方法，其中与基线测量相比，所述eGFR和/或所述GFR增加了约1mL/min/年(例如，2、3、5、7、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100mL/min/年)。
83.根据权利要求75所述的方法，其中与基线测量相比，所述eGFR和/或所述GFR增加了大于或等于1mL/min/年。
84.根据权利要求75所述的方法，其中与基线测量相比，所述eGFR和/或所述GFR增加了大于或等于3mL/min/年。
85.根据权利要求1-84中任一项所述的方法，其中以慢性肾脏疾病(CKD)分期评估所述肾脏疾病或病症。
86.根据权利要求1-84中任一项所述的方法，其中所述受试者患有一期慢性肾脏疾病(CKD)。
87.根据权利要求1-84中任一项所述的方法，其中所述受试者患有二期慢性肾脏疾病(CKD)。
88.根据权利要求1-84中任一项所述的方法，其中所述受试者患有三期慢性肾脏疾病(CKD)。
89.根据权利要求1-84中任一项所述的方法，其中所述受试者患有四期慢性肾脏疾病(CKD)。
90.根据权利要求1-84中任一项所述的方法，其中所述受试者患有五期慢性肾脏疾病(CKD)。
91.根据权利要求1-84中任一项所述的方法，其中所述方法降低1期CKD的严重性、发生率和/或持续时间。
92.根据权利要求1-84中任一项所述的方法，其中所述方法降低2期CKD的严重性、发生率和/或持续时间。
93.根据权利要求1-84中任一项所述的方法，其中所述方法降低3期CKD的严重性、发生率和/或持续时间。
94.根据权利要求1-84中任一项所述的方法，其中所述方法降低3a期CKD的严重性、发生率和/或持续时间。
95.根据权利要求1-84中任一项所述的方法，其中所述方法降低3b期CKD的严重性、发生率和/或持续时间。
96.根据权利要求1-84中任一项所述的方法，其中所述方法降低4期CKD的严重性、发生率和/或持续时间。
97.根据权利要求1-84中任一项所述的方法，其中所述方法降低5期CKD的严重性、发生率和/或持续时间。
98.根据权利要求1-84中任一项所述的方法，其中所述方法防止或延迟患有1期CKD的受试者进展为2期CKD。
99.根据权利要求1-84中任一项所述的方法，其中所述方法防止或延迟患有2期CKD的受试者进展为3期CKD。
100.根据权利要求1-84中任一项所述的方法，其中所述方法防止或延迟患有2期CKD的受试者进展为3a期CKD。
101.根据权利要求1-84中任一项所述的方法，其中所述方法防止或延迟患有3a期CKD的受试者进展为3b期CKD。
102.根据权利要求1-84中任一项所述的方法，其中所述方法防止或延迟患有3期CKD的受试者进展为4期CKD。
103.根据权利要求1-84中任一项所述的方法，其中所述方法防止或延迟患有3b期CKD的受试者进展为4期CKD。
104.根据权利要求1-84中任一项所述的方法，其中所述方法防止或延迟患有4期CKD的受试者进展为5期CKD。
105.根据权利要求1-104中任一项所述的方法，其中所述方法延迟和/或防止有需要的受试者的CKD分期进展的恶化。
106.根据权利要求1-105中任一项所述的方法，其中所述方法将受试者的肾损伤CKD分类改善了一期或多期。
107.根据权利要求1-106中任一项所述的方法，其中所述方法减少受试者的肾总体积。
108.根据权利要求107所述的方法，其中与基线测量相比，所述肾总体积减少了至少2.5％(例如，5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％)。
109.根据权利要求1-108中任一项所述的方法，其中所述方法减少所述受试者的血尿素氮(BUN)。
110.根据权利要求109所述的方法，其中与基线测量相比，所述BUN减少了至少2.5％(例如，5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％)。
111.根据权利要求1-110中任一项所述的方法，其中所述方法降低所述受试者的尿中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(uNGAL)浓度。
112.根据权利要求111所述的方法，其中与基线测量相比，所述uNGAL降低了至少2.5％(例如，5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％)。
113.根据权利要求1-112中任一项所述的方法，其中所述受试者具有<50ng/mL的uNGAL测量值，指示低急性肾损伤风险。
114.根据权利要求1-112中任一项所述的方法，其中所述受试者具有在约50与约149ng/mL之间的uNGAL测量值，指示模棱两可的急性肾损伤风险。
115.根据权利要求1-112中任一项所述的方法，其中所述受试者具有在约150与约300ng/mL之间的uNGAL测量值，指示中度急性肾损伤风险。
116.根据权利要求1-112中任一项所述的方法，其中所述受试者具有>300ng/mL的uNGAL测量值，指示高急性肾损伤风险。
117.根据权利要求1-116中任一项所述的方法，其中所述方法将所述受试者的uNGAL降低了约0.1与300.0ng/mL之间(例如，降低了约0.1与约50ng/mL之间、约0.1与约100.0ng/mL之间、约0.1与约150.0ng/mL之间、约0.1与约200.0ng/mL之间、约0.1与约250.0ng/mL之间、约0.1与约300.0ng/mL之间、约0.1与约25ng/mL之间、约25与约50ng/mL之间、约50与约100ng/mL之间、约100与约150ng/mL之间、约150与约200ng/mL之间、约200与约250ng/mL之间、约250与约300ng/mL之间、超过300ng/mL)。
118.根据权利要求1-117中任一项所述的方法，其中所述方法防止或延迟肾脏疾病或病症的临床恶化。
119.根据权利要求1-118中任一项所述的方法，其中所述方法降低因与肾脏疾病或病症相关的一种或多种并发症而住院的风险。
120.根据权利要求1-119中任一项所述的方法，其中皮下施用所述单臂ActRIIB异多聚体或所述单臂ActRIIA异多聚体。
121.根据权利要求1-120中任一项所述的方法，其中每两周施用一次所述单臂ActRIIB异多聚体或所述单臂ActRIIA异多聚体。
122.根据权利要求1-120中任一项所述的方法，其中每三周施用一次所述单臂ActRIIB异多聚体或所述单臂ActRIIA异多聚体。
123.根据权利要求1-120中任一项所述的方法，其中每四周施用一次所述单臂ActRIIB异多聚体或所述单臂ActRIIA异多聚体。
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