CN115505612A - 一种石莼多糖及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种石莼多糖及其制备方法和应用，属于抗氧化活性物质提取技术领域；本发明提供石莼多糖的制备方法包括以下步骤：将石莼粉末与水混合研磨后加入纤维素酶进行第一酶解、离心，收集上清液并加入中性蛋白酶进行第二酶解、离心，收集上清液并醇沉、离心，收集沉淀并干燥，得石莼粗多糖；将石莼粗多糖溶解于水中，加入β‑葡聚糖酶进行第三酶解、离心，收集上清液并醇沉、离心，收集沉淀并干燥，得石莼多糖。本发明得到的石莼多糖具有特定粘度范围且其含量高、抗氧化活性高、能够应用于制备具有抗氧化活性组合物上，且本发明提供的石莼多糖的制备方法简单，适用于实际生产。
Description
技术领域
本发明属于抗氧化活性物质提取技术领域，尤其涉及一种石莼多糖及其制备方法和应用。
背景技术
皮肤作为人体的第一道屏障，是覆盖和保护身体免受损伤最突出的器官，经常与空气污染物、紫外光直接接触。长期处于空气污染环境会使皮肤变薄，加速皮肤老化和皱纹形成。而紫外线中的UVA、UVB波段会导致细胞凋亡，加速皮肤老化，甚至引发皮肤炎症与损伤影响皮肤正常生理代谢。因此，寻找具有优异的抗自由基、抗氧化能力的天然产物修复皮肤屏障成为研究热点。
随着海洋资源的开发，海藻作为一类种类繁多、用途广泛的海洋植物资源被人们熟知。石莼是一类可食用的绿藻，主要分布在温带和亚热带海洋中，其主要成分石莼多糖具有抗炎、抗氧化、抑制酪氨酸酶活性、防紫外线辐射等活性。目前，石莼多糖的提取大多通过热水和超声波辅助一步提取，多糖的含量、活性容易受到多组分共同作用的干扰，无法获得高含量、抗氧化性高的石莼多糖。同时，缺少对石莼多糖进一步酶解，释放出抗氧化活性更好的多糖片段的方法。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种含量高、抗氧化活性高的石莼多糖及其制备方法和应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种石莼多糖的制备方法，所述制备方法包括以下步骤:
(1)将石莼粉末与水混合研磨后加入纤维素酶进行第一酶解，纤维素酶与石莼粉末的质量比为(0.28～0.32)：30，第一酶解结束后离心，收集上清液；
(2)往步骤(1)所述上清液中加入中性蛋白酶进行第二酶解，中性蛋白酶与步骤(1)中的石莼粉末的质量比为(0.08～0.12)：30，第二酶解结束后离心，往离心后的上清液中加入乙醇进行醇沉，醇沉结束后离心，收集沉淀并冷冻干燥，得石莼粗多糖；
(3)将步骤(2)所述石莼粗多糖溶解于水中，加入β-葡聚糖酶进行第三酶解，β-葡聚糖酶与石莼粗多糖的质量比为(0.04～0.06)：5，第三酶解结束后离心，往离心后的上清液中加入乙醇进行醇沉，醇沉结束后离心，收集沉淀并冷冻干燥，得石莼多糖。
本发明提供的一种石莼多糖的制备方法中，通过依次采用一定量的纤维素酶、中性蛋白酶和β-葡聚糖酶进行酶解，其中先使用纤维素酶辅助热水提取多糖，接着采用中性蛋白酶酶解去除蛋白杂质，得到石莼粗多糖，最后采用β-葡聚糖酶对石莼粗多糖进行酶解，从而能够得到具有一定酶解程度，即特定粘度范围的石莼多糖；采用本发明的制备方法得到的石莼多糖的含量高、抗氧化活性高，具有优异的清除DPPH自由基的能力；其中石莼多糖的含量在74.70～77.26％之间，半数清除率在0.0543～0.0545mg/mL之间，与标准品维生素C(半数清除率为0.0258mg/mL)相比，其抗氧化能力在2.105～2.112之间。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述纤维素酶与石莼粉末的质量比为0.3：30；所述中性蛋白酶与步骤(1)中的石莼粉末的质量比为0.1：30；所述β-葡聚糖酶与石莼粗多糖的质量比为0.05：5。
发明人研究发现，当石莼粉末与纤维素酶、石莼粉末与中性蛋白酶以及石莼粗多糖与β-葡聚糖酶的质量比为上述值时，得到的石莼多糖的含量最高，且对得到的石莼多糖进行抗氧化能力检测，发现在上述范围内得到的石莼多糖的抗氧化能力最优异；其中石莼多糖的含量为77.26％，半数清除率为0.0545mg/mL，与标准品维生素C(半数清除率为0.0258mg/mL)相比，其抗氧化能力为2.112。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述第一酶解的温度为53～57℃，时间为2～4h；所述第二酶解的温度为53～57℃，时间为1～3h；所述第三酶解的温度为53～57℃，时间为2.8～3.2h。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述醇沉的温度为2～4℃，时间为8～14h；所述上清液与乙醇的质量比为上清液：乙醇＝1：(3.8～4.2)。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述离心的转速为7000～9000r/min，时间为8～12min。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(3)中，将石莼粗多糖溶解于水中的溶解温度为94～96℃；溶解前还包括将石莼粗多糖粉碎的步骤。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述冷冻干燥具体包括以下步骤：将沉淀于(-80)℃的冰箱中冷冻3～5h，随后真空冷冻干燥10～14h。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(1)中，石莼粉末与水的质量体积比为30g：(1.2～1.5)L。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(1)中，研磨的时间为8～12min。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(3)中，石莼粗多糖与水的质量体积比为5g：(200～250)mL。
另外，本发明还提供了一种石莼多糖，所述石莼多糖采用本发明所述制备方法制备得到。
作为本发明所述石莼多糖的优选实施方式，所述石莼多糖的粘度为2.10～4.56mPa·s。
采用本发明的制备方法得到的石莼多糖具有特定的粘度范围，代表着其具有特定的分子量范围，发明人研究发现，在本发明提供的粘度范围内的石莼多糖具有优异的抗氧化能力。
另外，本发明还提供了石莼多糖在制备具有抗氧化活性组合物上的应用。
本发明提供的石莼多糖具有优异的抗氧化活性，从而能够作为具有抗氧化活性组合物的组分；其中，具有抗氧化活性组合物中可以包括本发明所述石莼多糖以及其他辅料，或者是包括本发明所述石莼多糖以及其他活性物质，得到的具有抗氧化活性组合物能够作为整体以功效组分的方式添加进化妆品的制备中。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的一种石莼多糖的制备方法中，通过依次采用一定量的纤维素酶、中性蛋白酶和β-葡聚糖酶进行酶解，从而能够得到具有特定粘度范围的石莼多糖；采用本发明的制备方法得到的石莼多糖的含量高、抗氧化活性高；其中石莼多糖的含量在74.70～77.26％之间，半数清除率在0.0543～0.0545mg/mL之间，与标准品维生素C(半数清除率为0.0258mg/mL)相比，其抗氧化能力在2.105～2.112之间，因此，得到的石莼多糖能够应用于制备具有抗氧化活性组合物上，得到的抗氧化活性组合物能够进一步用于化妆品的制备上；同时，本发明提供的石莼多糖的制备方法简单，适用于实际生产。
附图说明
图1为本发明实施例1制备得到的石莼多糖的外观状态图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
本发明所采用的试剂、方法和设备，如无特殊说明，均为本领域常规试剂、方法和设备。
实施例1
本发明实施例提供一种石莼多糖，所述石莼多糖的制备方法包括以下步骤：
(1)称取30g石莼粉末与1.2L纯水混合均匀后放入胶体磨中研磨10min，研磨结束后加入0.3g纤维素酶，并于55℃条件下搅拌酶解2h，酶解结束后，于8000r/min的转速下趁热离心10min，收集上清液；
(2)往步骤(1)所述上清液中加入0.1g中性蛋白酶，并于55℃条件下搅拌酶解2h，酶解结束后，于8000r/min的转速下趁热离心10min，收集上清液并按照上清液与95％乙醇的质量比为1：4的比例加入95％乙醇，得醇沉液，随后将醇沉液于4℃下放置12h进行醇沉，醇沉结束后，于8000r/min的转速下离心10min，收集沉淀，将沉淀于(-80)℃的冰箱中冷冻4h，随后置于真空冷冻干燥机中真空冷冻干燥24h，得石莼粗多糖；
(3)将步骤(2)所述石莼粗多糖粉碎，并称取5g溶解于温度为95℃的200mL纯水中，待溶解完毕，将体系降温至55℃后加入0.05gβ-葡聚糖酶酶解3h，酶解结束后，于8000r/min的转速下趁热离心10min，收集上清液并按照上清液与95％乙醇的质量比为1：4的比例加入95％乙醇，得醇沉液，随后将醇沉液于4℃下放置12h进行醇沉，醇沉结束后，于8000r/min的转速下离心10min，收集沉淀，将沉淀于(-80)℃的冰箱中冷冻4h，随后置于真空冷冻干燥机中真空冷冻干燥12h，得石莼多糖；
得到的石莼多糖的外观状态如图1所示。
实施例2
本发明实施例提供一种石莼多糖，所述石莼多糖的制备方法包括以下步骤：
(1)称取30g石莼粉末与1.5L纯水混合均匀后放入胶体磨中研磨10min，研磨结束后加入0.25g纤维素酶，并于55℃条件下搅拌酶解2h，酶解结束后，于8000r/min的转速下趁热离心10min，收集上清液；
(2)往步骤(1)所述上清液中加入0.08g中性蛋白酶，并于55℃条件下搅拌酶解2h，酶解结束后，于8000r/min的转速下趁热离心10min，收集上清液并按照上清液与95％乙醇的质量比为1：4的比例加入95％乙醇，得醇沉液，随后将醇沉液于4℃下放置12h进行醇沉，醇沉结束后，于8000r/min的转速下离心10min，收集沉淀，将沉淀于(-80)℃的冰箱中冷冻4h，随后置于真空冷冻干燥机中真空冷冻干燥24h，得石莼粗多糖；
(3)将步骤(2)所述石莼粗多糖粉碎，并称取5g溶解于温度为95℃的200mL纯水中，待溶解完毕，将体系降温至55℃后加入0.06gβ-葡聚糖酶酶解3h，酶解结束后，于8000r/min的转速下趁热离心10min，收集上清液并按照上清液与95％乙醇的质量比为1：4的比例加入95％乙醇，得醇沉液，随后将醇沉液于4℃下放置12h进行醇沉，醇沉结束后，于8000r/min的转速下离心10min，收集沉淀，将沉淀于(-80)℃的冰箱中冷冻4h，随后置于真空冷冻干燥机中真空冷冻干燥12h，得石莼多糖。
实施例3
本发明实施例提供一种石莼多糖，所述石莼多糖的制备方法包括以下步骤：
(1)称取30g石莼粉末与1.2L纯水混合均匀后放入胶体磨中研磨10min，研磨结束后加入0.25g纤维素酶，并于55℃条件下搅拌酶解4h，酶解结束后，于8000r/min的转速下趁热离心10min，收集上清液；
(2)往步骤(1)所述上清液中加入0.08g中性蛋白酶，并于55℃条件下搅拌酶解2h，酶解结束后，于8000r/min的转速下趁热离心10min，收集上清液并按照上清液与95％乙醇的质量比为1：4的比例加入95％乙醇，得醇沉液，随后将醇沉液于4℃下放置12h进行醇沉，醇沉结束后，于8000r/min的转速下离心10min，收集沉淀，将沉淀于(-80)℃的冰箱中冷冻4h，随后置于真空冷冻干燥机中真空冷冻干燥24h，得石莼粗多糖；
(3)将步骤(2)所述石莼粗多糖粉碎，并称取5g溶解于温度为95℃的250mL纯水中，待溶解完毕，将体系降温至55℃后加入0.04gβ-葡聚糖酶酶解3h，酶解结束后，于8000r/min的转速下趁热离心10min，收集上清液并按照上清液与95％乙醇的质量比为1：4的比例加入95％乙醇，得醇沉液，随后将醇沉液于4℃下放置12h进行醇沉，醇沉结束后，于8000r/min的转速下离心10min，收集沉淀，将沉淀于(-80)℃的冰箱中冷冻4h，随后置于真空冷冻干燥机中真空冷冻干燥12h，得石莼多糖。
对比例1
本发明对比例提供一种石莼多糖，所述石莼多糖的制备方法包括以下步骤：
(1)称取30g石莼粉末与1.2L纯水混合均匀后放入胶体磨中研磨10min，研磨结束后加入0.3g纤维素酶，并于55℃条件下搅拌酶解2h，酶解结束后，于8000r/min的转速下趁热离心10min，收集上清液；
(2)往步骤(1)所述上清液中加入0.1g中性蛋白酶，并于55℃条件下搅拌酶解2h，酶解结束后，于8000r/min的转速下趁热离心10min，收集上清液并按照上清液与95％乙醇的质量比为1：4的比例加入95％乙醇，得醇沉液，随后将醇沉液于4℃下放置12h进行醇沉，醇沉结束后，于8000r/min的转速下离心10min，收集沉淀，将沉淀于(-80)℃的冰箱中冷冻4h，随后置于真空冷冻干燥机中真空冷冻干燥24h，得石莼粗多糖。
对比例2
本发明对比例提供一种石莼多糖，所述石莼多糖的制备方法包括以下步骤：
(1)称取30g石莼粉末与1.2L纯水混合均匀后放入胶体磨中研磨10min，研磨结束后加入0.1g中性蛋白酶，并于55℃条件下搅拌酶解2h，酶解结束后，于8000r/min的转速下趁热离心10min，收集上清液并按照上清液与95％乙醇的质量比为1：4的比例加入95％乙醇，得醇沉液，随后将醇沉液于4℃下放置12h进行醇沉，醇沉结束后，于8000r/min的转速下离心10min，收集沉淀，将沉淀于(-80)℃的冰箱中冷冻4h，随后置于真空冷冻干燥机中真空冷冻干燥24h，得石莼粗多糖；
(2)将步骤(1)所述石莼粗多糖粉碎，并称取5g溶解于温度为95℃的200mL纯水中，待溶解完毕，将体系降温至55℃后加入0.05gβ-葡聚糖酶酶解3h，酶解结束后，于8000r/min的转速下趁热离心10min，收集上清液并按照上清液与95％乙醇的质量比为1：4的比例加入95％乙醇，得醇沉液，随后将醇沉液于4℃下放置12h进行醇沉，醇沉结束后，于8000r/min的转速下离心10min，收集沉淀，将沉淀于(-80)℃的冰箱中冷冻4h，随后置于真空冷冻干燥机中真空冷冻干燥12h，得石莼多糖。
对比例3
本发明对比例提供一种石莼多糖，所述石莼多糖的制备方法包括以下步骤：
(1)称取30g石莼粉末与1.2L纯水混合均匀后放入胶体磨中研磨10min，研磨结束后加入0.3g纤维素酶，并于55℃条件下搅拌酶解2h，酶解结束后，于8000r/min的转速下趁热离心10min，收集上清液并按照上清液与95％乙醇的质量比为1：4的比例加入95％乙醇，得醇沉液，随后将醇沉液于4℃下放置12h进行醇沉，醇沉结束后，于8000r/min的转速下离心10min，收集沉淀，将沉淀于(-80)℃的冰箱中冷冻4h，随后置于真空冷冻干燥机中真空冷冻干燥24h，得石莼粗多糖；
(2)将步骤(1)所述石莼粗多糖粉碎，并称取5g溶解于温度为95℃的200mL纯水中，待溶解完毕，将体系降温至55℃后加入0.05gβ-葡聚糖酶酶解3h，酶解结束后，于8000r/min的转速下趁热离心10min，收集上清液并按照上清液与95％乙醇的质量比为1：4的比例加入95％乙醇，得醇沉液，随后将醇沉液于4℃下放置12h进行醇沉，醇沉结束后，于8000r/min的转速下离心10min，收集沉淀，将沉淀于(-80)℃的冰箱中冷冻4h，随后置于真空冷冻干燥机中真空冷冻干燥12h，得石莼多糖。
对比例4
本发明对比例提供一种石莼多糖，所述石莼多糖的制备方法与实施例1的唯一差别在于步骤(3)中用果胶酶替代β-葡聚糖酶。
对比例5
本发明对比例提供一种石莼多糖，所述石莼多糖的制备方法与实施例1的唯一差别在于步骤(3)中加入的β-葡聚糖酶酶解1h。
对比例6
本发明对比例提供一种石莼多糖，所述石莼多糖的制备方法与实施例1的唯一差别在于步骤(3)中加入的β-葡聚糖酶酶解2h。
效果例
本效果例测试实施例1～3和对比例1～6制备得到的石莼多糖的粘度，石莼多糖的含量以及蛋白质的含量，同时测试得到的石莼多糖的抗氧化活性；其中，石莼多糖含量是按照苯酚硫酸法进行测试得到的；蛋白质含量是按照凯氏定氮法进行测试得到的；抗氧化活性的测试方法是：参考中华人民共和国国家标准GB/T 39100-2020《多肽抗氧化性测定DPPH和ABTS法》，以浓度自然对数为横坐标，清除率为纵坐标建立海藻多糖自然对数值与清除率的线性方程(R2≥0.9500)，计算半数清除率EC50；按下式计算多糖样品的抗氧化能力AO值。
式中，AO：抗氧化能力；
EC50(S)：石莼多糖的半数清除率，单位为毫克每升(mg/mL)；
EC50(R)：抗坏血酸的半数清除率，单位为毫克每升(mg/mL)，具体为0.0258mg/mL；
得到的结果如表1所示；
表1
从表1中可以看出，采用本发明的技术方案得到的石莼多糖含量在74.70％以上，其中石莼多糖的粘度在2.10～4.63之间，半数清除率在0.0543mg/mL以上，具有优异的抗氧化活性。
从实施例1和对比例1～3中可以看出，无论是减少本发明中的三个酶解中的任意一个酶解步骤，得到石莼多糖的含量都呈现出明显的下降趋势，并且得到的石莼多糖的粘度也增加，即具体的石莼多糖的片段已经发生变化，且对比例1～3得到的石莼多糖的抗氧化活性相较于实施例1呈现出显著的下降趋势，对比例1～3的AO值相较于实施例1的下降幅度为19.60～21.26％；从实施例1和对比例4中可以看出，当采用其他酶替代β-葡聚糖酶时，也达不到本发明中的效果；
从实施例1和对比例5～6中可以看出，当减少β-葡聚糖酶的酶解时间时，得到的石莼多糖的粘度呈现出上升的趋势，说明得到的石莼多糖片段也不相同了，且得到的产品中石莼多糖的含量也少了，同时其抗氧化活性也呈现出下降的趋势。
最后应当说明的是，以上实施例以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种石莼多糖的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将石莼粉末与水混合研磨后加入纤维素酶进行第一酶解，纤维素酶与石莼粉末的质量比为(0.28～0.32)：30，第一酶解结束后离心，收集上清液；
(2)往步骤(1)所述上清液中加入中性蛋白酶进行第二酶解，中性蛋白酶与步骤(1)中的石莼粉末的质量比为(0.08～0.12)：30，第二酶解结束后离心，往离心后的上清液中加入乙醇进行醇沉，醇沉结束后离心，收集沉淀并冷冻干燥，得石莼粗多糖；
(3)将步骤(2)所述石莼粗多糖溶解于水中，加入β-葡聚糖酶进行第三酶解，β-葡聚糖酶与石莼粗多糖的质量比为(0.04～0.06)：5，第三酶解结束后离心，往离心后的上清液中加入乙醇进行醇沉，醇沉结束后离心，收集沉淀并冷冻干燥，得石莼多糖。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述纤维素酶与石莼粉末的质量比为0.3：30；所述中性蛋白酶与步骤(1)中的石莼粉末的质量比为0.1：30；所述β-葡聚糖酶与石莼粗多糖的质量比为0.05：5。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述第一酶解的温度为53～57℃，时间为2～4h；所述第二酶解的温度为53～57℃，时间为1～3h；所述第三酶解的温度为53～57℃，时间为2.8～3.2h。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述醇沉的温度为2～4℃，时间为8～14h；所述上清液与乙醇的质量比为上清液：乙醇＝1：(3.8～4.2)。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述离心的转速为7000～9000r/min，时间为8～12min。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，将石莼粗多糖溶解于水中的溶解温度为94～96℃；溶解前还包括将石莼粗多糖粉碎的步骤。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述冷冻干燥具体包括以下步骤：将沉淀于(-80)℃的冰箱中冷冻3～5h，随后真空冷冻干燥10～14h。
8.一种石莼多糖，其特征在于，所述石莼多糖采用如权利要求1～7任一项所述的制备方法制备得到。
9.根据权利要求8所述的石莼多糖，其特征在于，所述石莼多糖的粘度为2.10～4.56mPa·s。
10.如权利要求8或9所述的石莼多糖在制备具有抗氧化活性组合物上的应用。
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