CN115501226A - 一种化合物在制备促进t细胞浸润的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及免疫治疗技术领域，具体涉及一种化合物在制备促进T细胞浸润的药物中的应用。该化合物的结构式如式(1)所示。发明人对几百种化合物进行了体外筛选，发现化学式如式(1)的化合物具有较强的促进T细胞活化的能力，可启动筛选系统的NFAT通路的转录激活。发明人进而将该化合物用于小鼠体内实验，发现该化合物可以有效促进C26肿瘤细胞荷瘤小鼠模型的T细胞在肿瘤组织处的浸润。因此，该化合物可用于调整肿瘤免疫环境，并促进T细胞浸润实体瘤组织，为免疫治疗创造物质基础。将本技术方案可以解决实体瘤难以被免疫细胞浸润，以及现有技术的CAR‑T疗法不能有效治疗实体瘤的技术问题，在新兴免疫治疗中，具有理想的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及免疫治疗技术领域，具体涉及一种化合物在制备促进T细胞浸润的药物中的应用。
背景技术
以CAR-T疗法(嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy)为代表的细胞治疗手段，近几年通过优化改良在临床肿瘤治疗上取得很好的效果。CAR-T疗法是一种非常有前景的，能够精准、快速、高效，且有可能治愈癌症的新型肿瘤免疫治疗方法。CAR-T疗法与传统药物有着很大的区别，通过基因工程技术将T细胞激活，并整合肿瘤嵌合抗原受体，形成CAR-T细胞(即经过基因改造和激活的T细胞)，专门识别体内肿瘤细胞，并高效杀灭肿瘤细胞，从而达到治疗恶性肿瘤的目的。CAR-T疗法在血液瘤上取得了很好的效果，目前上市的CAR-T疗法仅针对白血病、淋巴瘤和骨髓瘤等，但CAR-T疗法在实体肿瘤中的效果一直很有限。由于实体肿瘤存在肿瘤免疫微环境、靶点不均一以及免疫抑制性受体等原因，导致CAR-T无法对实体瘤进行有效治疗。研究人员尝试从各个角度取得突破，比如改造CAR，联用细胞因子，联用免疫调节剂等，以提高T细胞浸润以及CAR-T抗实体肿瘤活性，均取得了一定的进展。但是，目前仍然缺少能够增强CAR-T抗实体肿瘤活性的手段以及相应的T细胞浸润实体瘤的激活物质。
发明内容
本发明意在提供一种化合物在制备促进T细胞浸润的药物中的应用，以解决实体瘤难以被免疫细胞浸润以及现有技术的CAR-T疗法不能有效治疗实体瘤的技术问题。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种化合物在制备促进T细胞浸润的药物中的应用，其化学式如式(1)所示，或者为式(1)所示化合物的异构体或药学上可接受的盐：
本方案的原理及优点是：
发明人前期建立了Jurkat-NFAT-Luciferase检测筛选系统，用于检测T细胞活化。基于上述筛选系统，发明人对几百种化合物进行了筛选和研究，发现化学式如式(1)的化合物具有较强的促进T细胞活化的能力，可启动筛选系统的NFAT通路的转录激活，表达萤火虫荧光素酶。发明人进而将该化合物用于小鼠体内实验，发现该化合物可以有效促进C26肿瘤细胞荷瘤小鼠模型的T细胞在肿瘤组织处的浸润，提升T细胞(CD3+细胞，CD3是T细胞表面的一类抗原，CD3+是指成熟的T细胞)在肿瘤组织中的比例，进而激活T细胞介导的特异性免疫。并且，该化合物也对肿瘤组织呈现出一定的直接抑制效果。上述研究结果说明，化学式如式(1)的化合物具有较强的免疫激活效果，特别是具有T细胞活化的能力，使得肿瘤组织处的成熟的T细胞的比例上升。包括T细胞在内的免疫细胞具有一定的识别以及杀灭肿瘤细胞的能力，成熟的T细胞的比例上升在调整肿瘤组织的免疫环境上具有一定的积极效果。所以，本技术方案筛选出的化合物可以作为促进T细胞浸润实体瘤组织的药物(调整实体瘤组织的免疫微环境的药物)，应用在免疫治疗的实践操作中，直接改善肿瘤组织的免疫微环境，保证活化的T细胞富集在肿瘤组织的周围，为后续的免疫治疗(例如施加免疫调节剂)创造物质基础。
另外，本方案发现的增强T细胞浸润的化合物，可以进一步应用于CAR-T疗法中，提升成熟的嵌合抗原受体T细胞在实体瘤处的富集，增加治疗效果。现有技术的免疫疗法仅仅只能针对于白血病、淋巴瘤和骨髓瘤等非实体瘤，主要原因在于实体瘤处的免疫微环境难以调节。采用本技术方案的化合物可以实现对实体瘤处的免疫微环境的调节，增加实体瘤处成熟T细胞的比例，进而提升免疫疗法的治疗效果。
其中，T(淋巴)细胞浸润是指有大量T细胞出现在病灶(实体瘤)内部或周围。肿瘤免疫微环境(Tumor immune microenvironment)是指肿瘤细胞存在的周围微环境，包括周围的血管、免疫细胞、成纤维细胞、骨髓源性炎性细胞、各种信号分子和细胞外基质。肿瘤和周围环境密切相关，不断进行交互作用，肿瘤可以通过释放细胞信号分子影响其微环境，促进肿瘤的血管生成和诱导免疫耐受，而微环境中的免疫细胞可影响癌细胞增长和发育。肿瘤在临床上有实体瘤和非实体瘤之分，实体瘤即有形瘤，可通过临床检查如x线摄片、CT扫描，B超、或触诊扪及到的有形肿块称实体瘤，非实体瘤、X线、CT扫描，B超及触诊无法看到或扪及到的肿瘤如血液病中的白血病就属于非实体瘤。
进一步，所述药物还包括嵌合抗原受体T细胞。由于本技术方案筛选获得的化合物具有促进T细胞浸润实体瘤组织的效果，所以其可以与嵌合抗原受体T细胞(经过人工改造后的T细胞)联合使用，促进嵌合抗原受体T细胞对肿瘤组织的浸润增加治疗效果。
进一步，所述药物用于促进T细胞浸润实体瘤。本技术方案筛选获得的化合物可以促进T细胞在实体瘤内和周围的大量富集，进而利用免疫疗法治疗实体瘤。包括成熟的T细胞在内的免疫细胞具有一定的识别以及杀灭肿瘤细胞的能力。但是，与血液瘤相比，实体瘤更加复杂，例如，实体瘤靶向抗原与T细胞难以在血液系统中相遇(抗原位于肿瘤内部)；即使少量的T细胞进入，T细胞也可能因为肿瘤微环境活性受到抑制而耗竭，没有得到有效激活而无法显著增殖。本技术方案的化合物可以显著促进成熟的T细胞在实体瘤中的富集，克服了上述技术问题。因此，本技术方案的化合物可以作为T细胞浸润实体瘤促进剂，进而作为治疗实体瘤的一种药物或者辅助药物(例如，辅助CAR-T细胞)应用于实体瘤的治疗的实践操作中。
进一步，所述实体瘤为结直肠癌肿瘤。本技术方案通过构建小鼠结直肠癌肿瘤模型，研究了本技术方案筛选获得的化合物的促进T细胞浸润的效果。并且，该化合物对实体瘤显示出一定的抑制作用。据2021年全球最新癌症负担数据显示，全球常见新发癌症中，结直肠癌位居第三位，全球新发193万例。在中国，结直肠癌肿瘤发病率排名第三、死亡率排名第五。在动物实验中，本技术方案提供的化合物可以有效促进成熟T细胞在结直肠癌肿瘤中浸润，对治疗上述癌症具有较大的实际意义。
进一步，所述T细胞为CD3表面抗原为阳性的T细胞。本技术方案筛选获得的化合物主要可以促进CD3+T细胞(即成熟T淋巴细胞)对于实体瘤组织的浸润，促进T淋巴细胞的分化成熟。
进一步，如式(1)所示的化合物由如下方法制备：
S1：如式(2)所示的化合物与如式(3)所示的化合物经合成反应，获得如式(4)所示的中间体；
S2：如式(4)所示的中间体与如式(5)所示的化合物经合成反应，获得如式(1)所示的化合物；
进一步，在S1中，将如式(2)所示的化合物溶于四氢呋喃中，经加热再降温后，加入如式(3)所示的化合物，经合成反应、萃取、浓缩和纯化后，获得如式(4)所示的中间体。
进一步，在S1中，将0.01mol如式(2)所示的化合物溶于30ml四氢呋喃中，再加入0.01moL氢化钠，经加热至60℃再降温至室温并再搅拌30min后，加入如式(3)所示的化合物，经合成反应、萃取、浓缩和纯化后，获得如式(4)所示的中间体。
进一步，在S2中，将如式(5)所示的化合物和如式(4)所示的中间体溶解于四氢呋喃中，再加入三乙胺，经过回流反应、浓缩和纯化，获得如式(1)所示化合物。
进一步，在S2中，将400mg的如式(5)所示的化合物和800mg的如式(4)所示的中间体溶于40ml四氢呋喃中，再加入1.5当量的三乙胺，经过回流反应、浓缩和纯化，获得如式(1)所示的化合物。
采用上述技术方案，可以实现目的化合物的有效合成。通过核磁共振氢谱图、高效液相色谱图以及质谱检测确定，上述工艺过程合成的化合物的结构式为式(1)所示。
附图说明
图1为实施例1的式(1)所示化合物的核磁共振氢谱图。
图2为实施例1的式(1)所示化合物的高效液相色谱图(210nm)。
图3为实验例1的式(1)所示化合物的高效液相色谱图(270nm)。
图4为实施例1的式(1)所示化合物的质谱图。
图5为实验例3的肿瘤生长抑制效果图片。
图6为实验例3的肿瘤组织流式圈门分析示意图。
图7为实验例3的肿瘤组织中T细胞(CD3+)比例统计图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例以及实验例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，且所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。
实施例1：化合物的合成以及表征
一种具有促进T细胞浸润的化合物，化学式如式Ⅰ所示：
式Ⅰ所示的化合物由如下方法合成：
整体合成路线参见式(6)：
A.如式(4)所示的中间体的合成参见式(7)
在100mL单口瓶中，将式(2)所示的化合物原料2.3g(0.01mol)溶于30ml干燥的四氢呋喃(THF)中，加入0.4g氢化钠(NaH，0.01moL),加热至60℃后降到室温搅拌30min。然后向其中加入1.5倍当量的氯甲酸苯酯(式(3)所示化合物)，TLC检测反应完毕后，加入水淬灭反应，用乙酸乙酯萃取，减压浓缩，粗品经柱层析纯化(洗脱剂乙酸乙酯：石油醚1：4)，得式(4)所示化合物2.5g(纯度95％)，收率71％。
B.如式(1)所示的终产物的合成过程参见式(8)
将400mg的式(5)所示化合物和800mg的式(4)所示的中间体溶于40ml THF，加入1.5当量的三乙胺(Et3N)，回流反应，TLC检测反应完成，浓缩得如式(1)所示的产物粗品1.1g。柱层析纯化(洗脱剂DCM:MeOH 20:1)得纯的产物400mg(纯度97.86％)。
对如式(1)所示的产物进行检测鉴定，核磁共振氢谱图参见图1，高效液相色谱图参见图2(检测波长210nm)和图3(检测波长270nm)，质谱图参见图4。
实施例2：体外筛选实验
(1)铺板细胞：Jurkat-NFAT-Luc细胞，96孔板，5×105个/100μL/孔。并设置空白对照(不加细胞)和阴性对照(加入细胞，但不加药)。
(2)加化合物：用培养基稀释化合物，100μL/孔，药物作用浓度100nM和1μM。化合物先用DMSO配置成10mM母液，再用培养基100倍稀释至100μM，再50倍稀释至2μM，10倍稀释200nM，最后1：1加入96孔板中。
(3)24h后先镜下观察有无明显死亡细胞，细胞无明显死亡开始进行下一步。
(4)每孔加入10μL luciferin(1mg/mL)、5μL PMA(50ng/mL)、5μL iono(2.5μg/mL)，反应4h后置于酶标仪检测。
计算公式：(实验孔A值-空白孔A值)/(对照孔A值-空白孔A值)×100％，加入化合物后发光值较对照上升30％以上，我们认为有进一步促进T细胞活化的作用。
本实施例的体外筛选实验是在发明人在先开发的筛选系统中进行，即用于检测T细胞活化的筛选系统(Jurkat-NFAT-Luciferase检测系统)。该系统对jurkat细胞进行了改造，在细胞中含有一个受NFAT响应元件调控的萤火虫荧光素酶基因，当T细胞受到某些因素被激活时，比如CD3，CD28抗原刺激，启动NFAT通路的转录激活，表达萤火虫荧光素酶，通过在向培养基中添加Luciferase的底物，可以通过酶标仪在450nm波长检测到发光信号，通过发光信号判断T细胞的活化状态。实验证明：当T细胞被CD3，CD28抗原或PMA等刺激后，发光信号值明显增高。发明人用这一套系统对超过200种化合物进行了筛选，选取会进一步提高该通路的活化状态的化合物。经过筛选，我们得到了本方案的具有活化T细胞的新结构的化合物。
实施例3：体内验证实验
(1)培养C26肿瘤细胞(小鼠结直肠癌肿瘤细胞)，培养条件：含10％双抗DMEM培养基。
(2)C26细胞生长至80％融合度时，弃去培养基，PBS润洗1遍后，采用0.25％胰酶对细胞进行消化，静置1-2min。镜下观察细胞轮廓变圆，有团块脱落，加入含10％血清的完全培养基终止消化，1000rpm离心5min收集细胞。预冷PBS洗涤，1000rpm离心5min收集细胞，PBS重悬细胞，细胞计数仪进行细胞计数，并计算细胞存活比例，活细胞比例超过90％方可用于实验。
(3)调整细胞浓度到5×107个/mL，细胞收集完成后，细胞悬液置于冰上。
(4)采用体重18-20g、6周龄的Balb/c小鼠进行实验。提前剔除小鼠接种部位毛发。
(5)肿瘤细胞接种前，固定小鼠，采用75％乙醇擦拭腋下皮肤，皮下注射细胞悬液(100μL)，缓慢旋转退针，以防细胞溢出。细胞接种后，持续观察动物接种部位，当有结块生成后，采用电子游标卡尺测量瘤块的长径和短径，计算瘤块体积，当平均体积达100mm3左右，根据瘤体积进行随机分组。
(6)组别设计：试验共分3个组，采用S型分组法，按肿瘤体积随机分组，包括模型对照组、10mg/kg给药组(低剂量组)、20mg/kg给药组(高剂量组)，药物采用实施例1中合成的如式(1)所示的化合物。
(7)药物配置方法，先加入DMSO溶解化合物，再加入PEG400充分混匀，最后加入生理盐水稀释定容(三者最终的比例为DMSO:PEG400:生理盐水＝5：30：65)，现配现用。终浓度分别为1mg/ml和2mg/ml，小鼠给药体积10ml/kg，给药途径为腹腔注射；给药频率为隔天一次。
(8)21天给药后处死小鼠，取肿瘤拍照，称量肿瘤重量，用于计算肿瘤生长抑制率(IRTW,％)，同时采用数码相机拍摄肿瘤外观图片。
计算公式：肿瘤生长抑制率＝(对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100％。
(9)肿瘤组织除拍照外全程置于冰上，拍照后每块肿瘤组织立即取相同部位一小块进行研磨，获取单细胞悬液，经流式抗体染色后进行流式分析，计算肿瘤组织中T细胞(CD3+)比例。
肿瘤生长抑制效果图片参见图5，该化合物对肿瘤的生长有一定的抑制效果，但无统计学差异。流式分析流程参见图6(肿瘤组织流式圈门分析)，利用FSC和SSC去除掉碎片(图6左)，然后利用死活染料去除掉死细胞，圈出活细胞进行分析(图6中)，最后圈出CD3阳性的细胞(图6右)，即T细胞，统计T细胞占总细胞比例(％)。肿瘤组织中T细胞(CD3+)比例数据统计图参见图7(mean±SD，n＝5；10mg/kg给药组与对照组相比，具有T细胞比例增加的趋势；20mg/kg给药组与对照组有显著差异，t检验，p＜0.01；)，可见经过实施例1中合成的如式(1)所示的化合物处理之后，肿瘤组织中T细胞增多。发明人重复本实施例的体内验证实验多次，均显示出图7的趋势，20mg/kg给药组均与对照组有显著差异。进一步说明了如化学式(1)所示的化合物具有促进成熟T细胞浸润实体瘤的效果，可以应用于实体瘤的免疫治疗的实践操作中。
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
Claims (10)
1.一种化合物在制备促进T细胞浸润的药物中的应用，其特征在于：其化学式如式(1)所示，或者为式(1)所示化合物的异构体或药学上可接受的盐：
2.根据权利要求1所述的一种化合物在制备促进T细胞浸润的药物中的应用，其特征在于：所述药物还包括嵌合抗原受体T细胞。
3.根据权利要求1所述的一种化合物在制备促进T细胞浸润的药物中的应用，其特征在于：所述药物用于促进T细胞浸润实体瘤。
4.根据权利要求3所述的一种化合物在制备促进T细胞浸润的药物中的应用，其特征在于：所述实体瘤为结直肠癌肿瘤。
5.根据权利要求4所述的一种化合物在制备促进T细胞浸润的药物中的应用，其特征在于：所述T细胞为CD3表面抗原为阳性的T细胞。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的一种化合物在制备促进T细胞浸润的药物中的应用，其特征在于：如式(1)所示的化合物由如下方法制备：
S1：如式(2)所示的化合物与如式(3)所示的化合物经合成反应，获得如式(4)所示的中间体；
S2：如式(4)所示的中间体与如式(5)所示的化合物经合成反应，获得如式(1)所示的化合物；
7.根据权利要求6所述的一种化合物在制备促进T细胞浸润的药物中的应用，其特征在于：在S1中，将如式(2)所示的化合物溶于四氢呋喃中，经加热再降温后，加入如式(3)所示的化合物，经合成反应、萃取、浓缩和纯化后，获得如式(4)所示的中间体。
8.根据权利要求7所述的一种化合物在制备促进T细胞浸润的药物中的应用，其特征在于：在S1中，将0.01mol如式(2)所示的化合物溶于30ml四氢呋喃中，再加入0.01moL氢化钠，经加热至60℃再降温至室温并再搅拌30min后，加入如式(3)所示的化合物，经合成反应、萃取、浓缩和纯化后，获得如式(4)所示的中间体。
9.根据权利要求6所述的一种化合物在制备促进T细胞浸润的药物中的应用，其特征在于：在S2中，将如式(5)所示的化合物和如式(4)所示的中间体溶解于四氢呋喃中，再加入三乙胺，经过回流反应、浓缩和纯化，获得如式(1)所示化合物。
10.根据权利要求9所述的一种化合物在制备促进T细胞浸润的药物中的应用，其特征在于：在S2中，将400mg的如式(5)所示的化合物和800mg的如式(4)所示的中间体溶于40ml四氢呋喃中，再加入1.5当量的三乙胺，经过回流反应、浓缩和纯化，获得如式(1)所示的化合物。
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