CN115490781B

CN115490781B - 一种提高免疫功能的鲜食葡萄多糖及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN115490781B
Application number: CN202211249052.3A
Authority: CN
Inventors: 李秋; 黄小丽; 缪炆均; 曲丽华; 刘聪敏; 冷翔鹏
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2021-11-01
Filing date: 2022-10-12
Publication date: 2023-07-21
Anticipated expiration: 2042-10-12
Also published as: CN115490781A; CN113861304A

Abstract

本发明提供了一种提高免疫功能的鲜食葡萄多糖及其制备方法和应用，属于鲜食葡萄提取技术领域。本发明通过响应面法筛选出了鲜食葡萄多糖提取的最优提取方法，并且按照该方法提取出了鲜食葡萄多糖。通过实验，本发明发现北醇鲜食葡萄多糖可以有效的提高巨噬细胞的增殖能力；提高巨噬细胞NO的产生；促进巨噬细胞中细胞周期蛋白cyclin D1和cyclin E1的mRNA表达；抑制巨噬细胞中细胞周期蛋白cyclin B1；促进巨噬细胞分泌炎症因子TNF‑α和IL‑6；恢复环磷酰胺导致的脾脏免疫功能损伤，因此，其在医药领域应用前景十分广阔。

Description

一种提高免疫功能的鲜食葡萄多糖及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于鲜食葡萄提取技术领域，尤其涉及一种提高免疫功能的鲜食葡萄多糖及其制备方法和应用。

背景技术

鲜食葡萄为葡萄科葡萄属木质藤本植物，小枝圆柱形，有纵棱纹，无毛或被稀疏柔毛，叶卵圆形，圆锥花序密集或疏散，基部分枝发达。葡萄是世界最古老的果树树种之一，葡萄的植物化石发现于第三纪地层中，说明当时已遍布于欧、亚及格陵兰。葡萄原产亚洲西部，世界各地均有栽培，世界各地的葡萄约95％集中分布在北半球。目前，提取植物多糖的方法有热水浸提法、酸碱溶液提取法、微波提取法、超声提取法等多种方法，其中超声提取法操作简单，并且可以在较低温度、较短时间下获得较高的得率，已被开发运用在多种植物活性成分的提取中。超声提取法需考察的影响因素较多，而设计结合响应面法可确定影响得率的关键因素，并对其进行优化。响应面实验设计是一种回归试验设计方法，通过相关实验采集数据，采取多元二次回归方程进行拟合自变量(试验因素)和响应值(试验指标)之间的函数关系，建立相应的数学模型，对二次多项式回归方程的计算分析来寻求最优工艺参数，是解决多变量问题的一种统计方法，其预测结果可信度高，能够快速确定多因素系统的最佳实验条件。

鲜食葡萄中含有丰富的糖类，但目前鲜食葡萄中糖类成分药理活性研究资源缺乏。本发明通过体内体外实验验证鲜食葡萄多糖的免疫调节作用，对新的免疫药物开发提供研究方向。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高免疫功能的鲜食葡萄多糖及其制备方法和应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

本发明提供了一种提高免疫功能的鲜食葡萄多糖的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

(1)在干燥并粉碎的鲜食葡萄中按照1:3的料液比加入蒸馏水，浸泡2h后，采用400w超声提取30min，得到鲜食葡萄提取液；

(2)采用减压浓缩的方式将鲜食葡萄提取液浓缩为原体积的20％，加入无水乙醇至乙醇终浓度为80％，4℃醇沉24h；

(3)离心后收集沉淀，利用Sevage法脱蛋白，AB-8型大孔树脂除色素；

(4)使用截留分子量3500Da的透析袋流水透析48h，最后冻干得到鲜食葡萄粗多糖。

优选地，所述鲜食葡萄为北醇、黑香峰、黑香蜜、沁香、玉波2号、玫瑰香、藤稔、卓越玫瑰、阳光玫瑰中的一种。

本发明提供了鲜食葡萄多糖在制备提高免疫功能的药物中的应用，所述鲜食葡萄多糖的制备方法包括如下步骤：

优选地，所述药物具有如下功能：

提高巨噬细胞的增殖能力；提高巨噬细胞NO的产生；促进巨噬细胞中细胞周期蛋白cyclin D1和cyclin E1的mRNA表达；抑制巨噬细胞中细胞周期蛋白cyclin B1；促进巨噬细胞分泌炎症因子TNF-α和IL-6；恢复环磷酰胺导致的脾脏免疫功能损伤；

所述鲜食葡萄为北醇、黑香峰、黑香蜜、沁香、玉波2号、玫瑰香、藤稔、卓越玫瑰、阳光玫瑰中的一种。

本发明提供了鲜食葡萄多糖在制备提高巨噬细胞增殖能力的生物制剂中的应用。

本发明提供了鲜食葡萄多糖在制备提高巨噬细胞NO产生的生物制剂中的应用。

本发明提供了鲜食葡萄多糖在制备促进巨噬细胞中细胞周期蛋白cyclin D1和cyclin E1的mRNA表达和抑制巨噬细胞中细胞周期蛋白cyclin B1的mRNA表达的生物制剂中的应用。

本发明提供了鲜食葡萄多糖在制备促进巨噬细胞分泌炎症因子TNF-α和IL-6的生物制剂中的应用。

本发明提供了鲜食葡萄多糖在制备恢复环磷酰胺导致的脾脏免疫功能损伤的生物制剂中的应用。

优选地，所述鲜食葡萄多糖的制备方法包括如下步骤：

(4)使用截留分子量3500Da的透析袋流水透析48h，最后冻干得到鲜食葡萄粗多糖；

本发明的有益效果是：

本发明通过响应面法优化出了鲜食葡萄多糖的最优提取方式，而且本发明通过实验发现北醇鲜食葡萄多糖可以有效的提高巨噬细胞的增殖能力；提高巨噬细胞NO的产生；促进巨噬细胞中细胞周期蛋白cyclin D1和cyclin E1的mRNA表达；抑制巨噬细胞中细胞周期蛋白cyclin B1；促进巨噬细胞分泌炎症因子TNF-α和IL-6；恢复环磷酰胺导致的脾脏免疫功能损伤。

附图说明

图1为本发明所述料液比对北醇鲜食葡萄多糖得率的影响示意图；

图2为本发明超声时间对北醇鲜食葡萄多糖得率的影响示意图；

图3为本发明超声功率对北醇鲜食葡萄多糖得率的影响示意图；

图4为本发明北醇鲜食葡萄多糖红外吸收图谱；

图5为本发明北醇鲜食葡萄多糖的SEM；

图6为本发明北醇鲜食葡萄多糖对RAW 264.7细胞增殖活性的影响；

图7为本发明北醇鲜食葡萄多糖对NO分泌的影响；

图8为本发明北醇鲜食葡萄多糖对细胞周期蛋白cyclin B1、cyclin D1和cyclinE1的mRNA表达的影响；

图9为本发明北醇鲜食葡萄多糖对TNF-α细胞因子分泌的影响；

图10为本发明北醇鲜食葡萄多糖对IL-细胞因子分泌的影响；

图11为本发明北醇鲜食葡萄多糖对免疫抑制小鼠免疫器官脾脏的影响。

具体实施方式

所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

通过响应面发筛选北醇鲜食葡萄多糖的最佳制备方法

1.不同料液比对多糖提取的影响

(1)在干燥并粉碎的鲜食葡萄中按照1:1；1:2，1:3，1:4，1:5的料液比加入蒸馏水，浸泡2h后，采用400w超声提取30min，得到鲜食葡萄提取液；

(4)使用截留分子量3500Da的透析袋流水透析48h，最后冻干得到北醇鲜食葡萄多糖。

(5)采用硫酸—苯酚法测定多糖含量。鲜食葡萄多糖提取得率(Y)公式:Y(％)＝(M/W)×100％，其中M是多糖的含量，W代表样品净重。以葡萄糖浓度(C)为横坐标，吸光度(Abs)为纵坐标，线性拟合绘制葡萄糖标准曲线，获得回归方程为：

Abs＝0.05912C-0.02647(R²＝0.998)

2.不同提取时间对于多糖提取的影响

考察不同提取时间为10、20、30、40、50min，每组平行重复三次，并计算产率。其他操作与料液比对北醇鲜食葡萄多糖提取的影响的操作相同，最后冷冻干燥并计算多糖提取率。

3.不同提取功率对于多糖提取的影响

考察不同提取功率100W、200W、300W、400W、500W，每组平行重复三次，并计算产率。其他操作与料液比对鲜食葡萄多糖提取的影响的操作相同，最后冷冻干燥并计算多糖提取率。

在单因素试验的基础上，采用Box－Benhnken的中心组合设计对超声辅助提取鲜食葡萄多糖工艺进行优化，响应面优化实验因素和水平表见表1。根据响应面优化设计实验结果进行验证实验，并比较预测多糖得率与实际多糖得率。

表1响应面水平实验设计

在单因素试验结果的基础上利用Box－Behnken Design(BBD)中心组合设计，以鲜食葡萄多糖提取得率Y(％)为响应值，考察三个独立变量:料液比(A)、超声时间(B)和超声功率(C)(每个因素取3个水平)对提取得率的影响。响应面试验优化北醇鲜食葡萄提取条件的结果如表2所示，所有试验均进行3次；并利用Design Expert(8.0版)软件进行数据分析。采用ANOVA法进行方差分析。在P＜0.05时有统计学意义。

料液比对超声波辅助北醇鲜食葡萄多糖得率的影响见图1。由图1可知：随着料液比的增加，鲜食葡萄多糖得率逐渐升高，当料液比为1:3时，多糖得率最高。这是因为，当料液比较低时，溶剂与样品接触不充分从而导致提取不彻底。随着料液比的继续增加，多糖的得率呈下降趋势，这可能是因为随着料液比的增加使随后的料液的分离浓缩操作难度增加，导致多糖的损失增加。因此，最优料液比为1:3。

超声时间对超声波辅助北醇鲜食葡萄多糖得率的影响见图2。由图2可知：随着超声时间的增加，鲜食葡萄多糖得率逐渐升高，当超声时间为30min时，鲜食葡30min时，多糖已经基本溶出，随着超声时间的增加，不会提高鲜食葡萄多糖的得率，反而使部分小分子多糖降解，导致得率下降。因此最优的超声时间为30min。

超声功率对超声波辅助北醇鲜食葡萄多糖得率的影响见图3。由图3可知，随着超声功率的增加，鲜食葡萄多糖得率逐渐升高，当超声功率为400W时，多糖得率最高，这是因为随着超声波产生的空穴效应和震动利于多糖的溶解。随着超声功率的继续增加，多糖得率呈下降趋势，这是因为过高的超声波功率会导致多糖的降解,因此最优的超声功率为400W。

表2响应面实验设计及结果

5.回归方程拟合及方差分析

对北醇鲜食葡萄多糖得率的响应面实验结果进行回归分析，结果见表(2)。对三个因素进行回归拟合后得到回归方程：

提取率＝7.99+1.63*A+0.68*B+0.32*C-0.083*A*B-0.042*A*C+0.042*B*C-1.11A²-1.22B²-1.14C²

由方差分析可知，校正系数R²＝0.9777,R²模型的P值小于0.0001，为极显著；失拟项P值大于0.05，不显著。这说明模型拟合度较好，说明实验的二次模型拟合度较高，可正确反映个因素与响应值之间的变化关系。由模型的方差分析可得出料液比(A)、超声时间(B)、超声功率(C)、料液比与料超声时间交互项(AB)、超声时间与超声功率交互项(BC)、料液比与超声功率交互项(AC)及个因素的二次项对响应值有显著影响。各因素对响应值的影响显著性排序为B＞C＞A。

由响应面和等高线图可知，各因素之间的响应面均较陡峭，说明各因素之间的交互作用均较强。根据所得到的模型，预测最优工艺条件为提取时间为料液比为1:3，提取时间为31.88min，提取功率为416.05W。

经Design-Expert8.0.6预测模型极值点，结果显示最佳提取条件为液比为1:3，提取时间为31.88min，提取功率为416.05W，根据实际操作设计验证实验，其提取条件为：料液比为1:3，提取时间为30min，提取功率为400.00W，取条件进行3次平行实验，实验结果为在次条件下的多糖得率为8.39％，验证实验结果与预测值接近，表明该模型拟合度良好，对此提取条件取鲜食葡萄多糖的工艺优化合理、有效。

实施例2

(1)检测北醇鲜食葡萄多糖的红外吸收图谱和SEM；

(2)检测得到的结果被展示在图4和图5中。

如图4所示，在3600～3000cm^-1处，一个吸收较强的宽峰：3390.16cm^-1为-OH伸缩振动峰。1630cm^-1处的吸收峰是-OH的弯曲震动吸收峰，在1400cm^-1处吸收峰存在-CH₂变形吸收峰，在1200～1000cm^-1处的吸收峰是由吡喃糖环的醚键(C-O-C)和-OH伸缩振动引起的，1080cm^-1处则是醇羟基-OH的变角吸收峰，617m^-1是O-H面外弯曲振动吸收峰，其吸收峰是吸收峰均是糖类物质的特征吸收峰，说明本实验方法获得的提取物均为多糖类物质。

如图5所示，

SEM图像显示北醇鲜食葡萄多糖表面形态为海绵状，具有高度的絮状分支。

实施例3

北醇鲜食葡萄多糖对RAW264.7的增殖作用

(1)RAW264.7巨噬细胞采用DMEM高糖培养基(其中含有10％ FBS)在37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养.将RAW264.7巨噬细胞接种到96孔板中(5×10⁵细胞/孔)；

(2)用不同浓度5、20、80、320μg/mL北醇鲜食葡萄多糖处理24h，添加1μg/mL的LPS作为阳性对照。

(3)处理结束后，在每个孔中加入MTT工作溶液再孵育4小时，然后弃去培养基，加入100μL DMSO溶解各孔中的甲臜晶体，最后，使用酶标仪在570nm处测量吸光度值。

实验得到的结果如6所示，可以看出，与对照组相比，不同浓度的鲜食葡萄对巨噬细胞没有致死作用，此外，从5、20、80、320μg/mL不同浓度的鲜食葡萄多糖呈剂量依赖性显著促进了RAW 264.7巨噬细胞的生长，说明北醇鲜食葡萄多糖对RAW 264.7巨噬细胞无细胞毒性，可以促进RAW 264.7巨噬细胞的增殖。

实施例4

北醇鲜食葡萄多糖对巨噬细胞产生NO的影响

(1)在RAW 264.7巨噬细胞接种好的96孔板中添加不同浓度5、20、80、320μg/mL北醇鲜食葡萄多糖溶液及LPS(1μg/mL，阳性对照)继续培养24h；

(2)然后取上清液，采用Griess法检测处理24h后NO含量。

结果如图7所示，与对照组相比，鲜食葡萄多糖的添加以剂量依赖性方式显著刺激了RAW 264.7细胞中NO的产生，但与LPS阳性对照免疫促进作用还存在一定差距。

实施例5

北醇鲜食葡萄多糖对细胞周期蛋白cyclin B1、cyclin D1和cyclin E1的影响

(1)收集对数期RAW264.7巨噬细胞接种于六孔培养板中在37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养。

(2)设置不同梯度5、20、80、320μg/mL北醇鲜食葡萄多糖溶液及空白对照组于恒温培养箱中培养12h。

(3)提取上清液，加入250μL三氯甲烷充分混匀静置4min，4℃下高速离心10min。异丙醇与上清液4:5颠倒混匀。-20℃放置20min后再高速离心取沉淀即为提取的总RNA

(4)以cDNA为模板，用PCR检测目标基因mRNA的表达水平。

cyclin B1基因引物序列，上游引物：5’-AGA GCT ATC CTC ATT GAC TGG C-3’下游引物：5’-AAC CTG GCC CTT ACA CCG AC-3’

Cyclin D1基因引物序列，上游引物：5’-GCG TAC CCT GAC ACC AAT CTC-3’下游引物：5’-ACT TGA AGT AAG ATA CGG AGG GC-3’

Cyclin E1基因引物序列，上游引物：5’-CTC CGA CCT TTC AGT CCG C-3’下游引物：5’-CAC CAG TCT TGT CAA TCT TGG CA-3’

结果如图8所示，与对照组相比，北醇鲜食葡萄多糖能不同程度促进RAW264.7巨噬细胞诱导cyclin D1和cyclin E1的mRNA表达进而促进细胞分裂增殖，而cyclin B1表达则降低，导致RAW2647细胞在G2/M期细胞减少，在正常情况下，使得RAW 264.7巨噬细胞增多而发挥起抗炎作用。

实施例6

北醇鲜食葡萄多糖对TNF-α和IL-6的影响

(2)收集上清液，采用ELISA试剂盒检测北醇鲜食葡萄多糖对RAW 264.7巨噬细胞分泌TNF-α和IL-6炎症因子的影响。

结果如图9、10所示，同样，与对照组相比，鲜食葡萄多糖可以以剂量依赖性方式提高炎性细胞因子的表达量，说明北醇鲜食葡萄多糖可以调节细胞的免疫能力。

实施例7

(1)24只小鼠随机分为4组，分别为空白组、阴性对照组、低浓度试验组和高浓度试验组，每组6只，分笼饲养试验周期为14d。试验第3d起，空白对照组腹腔注射生理盐水溶液；除空白对照组外，其余各组小鼠腹腔注射80mg/kg剂量的CTX溶液造模3d；造模成功后，低浓度试验组灌胃给予为100mg/kg的北醇鲜食葡萄多糖；高浓度试验组灌胃给予为200mg/kg的北醇鲜食葡萄多糖；末次给药后脱颈处死，取脾脏保存于4％的多聚甲醛溶液中，以制备组织切片进行HE染色。

结果如图11所示，脾脏组织切片HE染色，于普通光学显微镜下观察并拍照(200×)，黑色箭头代表髓外造血；红色箭头代表细胞萎缩；黄色箭头代表多核巨细胞；绿色箭头代表中性粒细胞浸润。组织学结果显示，对照组中小鼠脾脏结构完整，白髓红髓界限清晰；CTX模型组中，排列疏松，细胞萎缩严重，细胞肿胀，白髓和红髓难以区分，中性粒细胞浸润，并出现较多的多核巨细胞；加入鲜食葡萄多糖后，脾脏中中性粒细胞浸润多核巨细胞减少，细胞结构趋于正常，因此鲜食葡萄多糖呈剂量依赖性恢复脾脏结构进而增强机体免疫功能。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.北醇鲜食葡萄多糖在制备促进巨噬细胞中细胞周期蛋白cyclin D1和cyclin E1的mRNA表达的生物制剂中的应用，所述北醇鲜食葡萄多糖的制备方法包括如下步骤：

（1）在干燥并粉碎的鲜食葡萄中按照1:3的料液比加入蒸馏水，浸泡2h后，采用400w超声提取30min，得到鲜食葡萄提取液；

（2）采用减压浓缩的方式将鲜食葡萄提取液浓缩为原体积的20%，加入无水乙醇至乙醇终浓度为80%，4℃醇沉24h；

（3）离心后收集沉淀，利用Sevage法脱蛋白，AB-8型大孔树脂除色素；

（4）使用截留分子量3500Da的透析袋流水透析48h，最后冻干得到鲜食葡萄粗多糖。