CN115490755A - 一种主动靶向型分支多肽、纳米药物载体、抗肿瘤纳米药及其制备方法与应用 - Google Patents

一种主动靶向型分支多肽、纳米药物载体、抗肿瘤纳米药及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种主动靶向型分支多肽、纳米药物载体、抗肿瘤纳米药及其制备方法与应用，属于生物医药技术领域。本发明的主动靶向型分支多肽为氨基酸序列为(FHF)2KRGD，在K处分支的两亲性分支多肽，或所述两亲性分支多肽经替换、添加或删除一个或几个氨基酸衍生的具有同等载药功能的氨基酸序列，或包含(FHF)2KRGD序列的同源多肽；多肽纳米药物载体为两亲性分支多肽自组装形成的纳米级囊泡；两亲性分支多肽通过合成、半合成或者重组合成的方法制备，两亲性分支多肽通过自组装将抗肿瘤药物包载在疏水空腔中，得到主动靶向抗肿瘤纳米药；该分支多肽无毒且生物相容性好、稳定性高，纳米药物载体载药量高，用于抗肿瘤药物载药，抗肿瘤效果佳。

Description

一种主动靶向型分支多肽、纳米药物载体、抗肿瘤纳米药及其 制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种主动靶向型分支多肽、纳米药物载体、抗肿瘤纳米药及其制备方法与应用。
背景技术
肿瘤作为严重威胁人类生命和健康的疾病，目前主要采用手术、放疗和化疗等手段进行治疗，但是，上述疗法对于改善患者远期预后，提高生存率并不理想。鉴于此，许多研究者将研究注意力转移到了活性高、不良反应小、不易产生耐药性的抗癌药物小分子上。但是一些高活性的抗肿瘤药物小分子存在着低稳定性、低选择性、水不溶性等问题，由于肾的滤过作用、蛋白酶的降解作用等影响，导致抗肿瘤药物小分子的稳定性差、半衰期短、血药浓度低、生物利用度低；同时由于抗肿瘤药物小分子的选择性差，可导致人体正常的细胞和组织损伤，对人体有一定的毒副作用。
针对上述技术弊端，科学家们又研究了许多药物载体来帮助抗肿瘤药物小分子进入人体内，并且提高其稳定性，加强其水溶性，帮助定位的靶向性。类似的药物载体包括有脂质体、胶束、囊泡、水凝胶等，这些药物递送体系各有利弊，选取相应的稳定高效的药物递送体系，是一项十分具有意义的工作。
多肽分子是一种多功能分子，通过分子设计可以使多肽分子呈现类似磷脂分子的两亲性，同时还可以增加靶向序列，提高多肽的肿瘤靶向性。两亲性多肽包裹抗肿瘤药物，具有缓释和药物靶向递送的作用。
申请号为201910571060.1的中国专利公开了一种主动靶向型两亲性多肽纳米药物载体及其制备与应用，该纳米载体为具有主动靶向功能的多肽链的N端偶联疏水性烷基链，且在多肽链的侧链修饰荧光功能分子，该两亲性多肽自组装得到纳米载体。该纳米载体能够主动靶向肿瘤细胞，并通过受体介导的内吞进入肿瘤细胞，且两亲性多肽与磷脂分子具有较强的相互作用，促进肿瘤细胞对纳米药物的吞噬，但是，该纳米载体的包封率仅在64％左右，仍有待提高。
发明内容
本发明的技术目的是提供一种主动靶向型分支多肽、由两亲性分支多肽在水溶液中通过自组装形成的主动靶向型纳米药物载体、由主动靶向型纳米药物载体包载抗肿瘤药物得到的主动靶向抗肿瘤纳米药及其制备方法，以及主动靶向型分支多肽和主动靶向型纳米药物载体在制备抗肿瘤药物中的应用。
为实现上述技术目的，本发明采取的技术方案为：
一种主动靶向型分支多肽，所述主动靶向型分支多肽为两亲性分支多肽，或所述两亲性分支多肽经替换、添加或删除一个或多个氨基酸形成的具有同等载药功能的氨基酸序列，或包含两亲性分支多肽氨基酸序列的同源多肽；所述两亲性分支多肽的氨基酸序列为(FHF)2KRGD，在K处分支，从N端到C端的结构式为：
Figure BDA0003118924200000021
进一步地，所述同源多肽与氨基酸序列(FHF)2KRGD具有85％～100％的氨基酸序列一致性。
本发明还提供了一种主动靶向型纳米药物载体，所述主动靶向型纳米药物载体为上述两亲性分支多肽自组装形成的纳米级囊泡。
本发明还提供了一种主动靶向抗肿瘤纳米药，所述主动靶向抗肿瘤纳米药为上述主动靶向型纳米药物载体中包载抗肿瘤药物。
进一步地，所述抗肿瘤药物为脂溶性天然活性小分子。
本发明还提供了上述主动靶向抗肿瘤纳米药的制备方法，包括以下步骤：
S1、制备两亲性分支多肽，所述两亲性分支多肽的氨基酸序列为(FHF)2KRGD，在K处分支；
S2、将步骤S1制备的两亲性分支多肽与抗肿瘤药物同时溶解，所述两亲性分支多肽通过自组装将抗肿瘤药物包载在疏水空腔中，得到主动靶向抗肿瘤纳米药。
进一步地，步骤S1中，两亲性分支多肽通过多肽固相合成或液相合成或重组合成。
进一步地，步骤S2中，通过自组装制备主动靶向抗肿瘤纳米药的具体步骤为：
S21、将抗肿瘤药物和两亲性分支多肽共同溶解于能与水互溶的有机溶剂中，并封闭搅拌，得到混合液A；
S22、向混合液A中逐滴加入ddH2O，混合搅拌后得到混合液B；
S23、将搅拌好的混合液B旋蒸除去有机溶剂，两亲性分支多肽在旋蒸过程中形成包裹抗肿瘤药物的囊泡；
S24、将包裹抗肿瘤药物的囊泡超速离心除去未包裹抗肿瘤药物，得到主动靶向抗肿瘤纳米药。
进一步地，步骤S21中，所述有机溶剂为甲醇，抗肿瘤药物和两亲性分支多肽的混合摩尔比例为1：1，封闭搅拌时间为30min；
步骤S22中，混合搅拌时间为2h；
步骤S24中，包裹抗肿瘤药物的囊泡在12000rpm下超速离心5min，加水定容后4℃保存或冻干后-20℃保存，得到主动靶向抗肿瘤纳米药。
本发明还提供了上述主动靶向型分支多肽或主动靶向型纳米药物载体在制备抗肿瘤药物中的应用。
进一步地，所述抗肿瘤药物中包括治疗量的上述主动靶向型分支多肽或主动靶向型纳米药物载体以及其他药学上可接受的辅料。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供了一种主动靶向型分支多肽，主动靶向型分支多肽为两亲性分支多肽，或所述两亲性分支多肽经替换、添加或删除一个或多个氨基酸形成的具有同等载药功能的氨基酸序列，或包含两亲性分支多肽氨基酸序列的同源多肽，两亲性分支多肽可采用常用的固相合成方法制备，纯度可达到95％以上，该两亲性分支多肽从N端到C端的序列为(FHF)2KRGD，在K处分支，是一种全新的多肽分子，不包含其它任何修饰，其N端疏水，C端亲水，使得该多肽分子具有两亲性，有利于自组装形成囊泡结构，而且该两亲性分支多肽序列简单，易于合成；
(2)本发明的主动靶向型纳米药物载体通过自组装包载药物，可对多种抗肿瘤药物进行包载，包封率在60％-90％，满足临床需要；该主动靶向型纳米药物载体由两亲性分支多肽自组装形成，材料无毒、生物相容性好，具有肿瘤部位特异靶向性，是一种生物安全、理想的药物载体；
(3)本发明的主动靶向抗肿瘤纳米药为纳米级囊泡，直径在200nm左右，可通过肿瘤的EPR效应，在肿瘤部位形成滞留，有助于肿瘤细胞内吞，实现更好的肿瘤细胞杀伤效果；
(4)本发明的两亲性分支多肽的序列中含有主动靶向性功能序列Arg-Gly-Asp(RGD)，以肿瘤细胞表面过度表达的整合素受体为靶点，由该两亲性分支多肽制备的多肽纳米药物载体可以特异性识别整合素受体，通过受体介导的内吞进入肿瘤细胞内部；相较于传统的小分子药物，提高了肿瘤细胞对于小分子药物的摄取，从而提高了小分子药物的细胞毒性；
(5)本发明的两亲性分支多肽的序列疏水端中含有碱性氨基酸His(组氨酸)，组氨酸可以在酸性条件下带电，导致囊泡(PepV多肽载药纳米囊泡)崩解和药物释放，从而基于两亲性分支多肽的PepV多肽载药纳米囊泡对于酸性pH具有响应性，在肿瘤酸性微环境中，药物释放更快；
(6)与常规抗肿瘤药物相比，本发明制备的主动靶向抗肿瘤纳米药具有更加平缓的药物释放速率，包载不同药物的PepV多肽载药纳米囊泡在12h的药物释放率在50％-65％。
附图说明
图1是本发明实施例1制备的PepV多肽的液相色谱图；
图2是本发明实施例1制备的PepV多肽的质谱图；
图3是本发明实施例2的PepV多肽自组装形态的TEM图；
图4是本发明实施例3中包载不同药物的PepV多肽载药纳米囊泡的实物图，其中，(a)为包载阿霉素的PepV多肽载药纳米囊泡，(b)为包载姜黄素的PepV多肽载药纳米囊泡，(c)为包载喜树碱的PepV多肽载药纳米囊泡，(d)为包载槲皮素的PepV多肽载药纳米囊泡；
图5是本发明实施例3中包载不同药物的PepV多肽载药纳米囊泡的TEM图，其中，(a)为包载阿霉素的PepV多肽载药纳米囊泡的TEM图，(b)为包载姜黄素的PepV多肽载药纳米囊泡的TEM图，(c)为包载喜树碱的PepV多肽载药纳米囊泡的TEM图，(d)为包载槲皮素的PepV多肽载药纳米囊泡的TEM图；
图6是本发明实施例4中包载不同药物的PepV多肽载药纳米囊泡的药物释放曲线图，其中，(a)为包载阿霉素的PepV多肽载药纳米囊泡的药物释放曲线图，(b)为包载姜黄素的PepV多肽载药纳米囊泡的药物释放曲线图，(c)为包载喜树碱的PepV多肽载药纳米囊泡的药物释放曲线图，(d)为包载槲皮素的PepV多肽载药纳米囊泡的药物释放曲线图；
图7是本发明实施例4中包载不同药物的PepV多肽载药纳米囊泡在不同pH下的药物释放曲线图，其中，(a)为包载阿霉素的PepV多肽载药纳米囊泡在不同pH下的药物释放曲线图，(b)为包载姜黄素的PepV多肽载药纳米囊泡在不同pH下的药物释放曲线图，(c)为包载喜树碱的PepV多肽载药纳米囊泡在不同pH下的药物释放曲线图，(d)为包载槲皮素的PepV多肽载药纳米囊泡在不同pH下的药物释放曲线图；
图8是本发明实施例5中包载不同药物的PepV多肽载药纳米囊泡对HeLa细胞的IC50；
图9是本发明实施例6中HeLa细胞对包载阿霉素的PepV多肽纳米囊泡摄取效果的激光共聚焦显微镜图。
具体实施方式
本发明提供了一种主动靶向型分支多肽，该主动靶向型分支多肽为两亲性分支多肽，或所述两亲性分支多肽经替换、添加或删除一个或多个氨基酸形成的具有同等载药功能的氨基酸序列，或包含两亲性分支多肽氨基酸序列的同源多肽，所述同源多肽至少包含85％同源性的氨基酸序列(FHF)2KRGD，更优选100％同源性(序列同一性)的氨基酸序列；所述两亲性分支多肽从N端到C端的结构式为：
Figure BDA0003118924200000051
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所用的试剂、方法和设备，如无特殊说明，均为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1：两亲性分支多肽(下述简记“PepV多肽”)的制备
本发明的PepV多肽可以是合成的、半合成的或者重组产生的，例如：通过多肽固相合成、液相合成或重组合成。
本实施例采用固相合成法，以Fmoc-Wang树脂为固体基质，从C端向N端依照多肽序列依次加入不同的氨基酸来合成PepV多肽(浓度为100μM)，该PepV多肽的结构式为：
Figure BDA0003118924200000052
具体合成步骤如下：
(1)活化树脂：将连接Fmoc保护的天门冬氨酸的Wang树脂(购自吉尔生化(上海)有限公司)称量100μM(39.44mg)重量，倒入干净无水的固相反应器中，加入5mL DCM(二氯甲烷)溶解活化，过夜；
(2)清洗树脂：抽干固相反应器中的液体，加入4mL DMF(N,N-二甲基甲酰胺)充分振荡1min，抽干，如此反复操作8次；收集少量活化后的树脂留待做Kaiser检测；
(3)脱Fmoc保护：抽干溶剂后，加入4mL含有20％哌啶的DMF溶液，置于摇床，振荡5min后抽干溶剂；再加入4mL含20％哌啶的DMF溶液，置于摇床，振荡20min；
(4)清洗树脂、除去哌啶：抽干溶剂后，加入4mL DMF溶液，置于摇床，振荡1min后抽干；如此反复，重复8次直至哌啶被完全除去；
(5)电子天平称取待接入的氨基酸(此处为Fmoc保护的甘氨酸)和耦合试剂：将4倍摩尔量的氨基酸(即Fmoc保护的甘氨酸，400μM)、4倍摩尔量的HBTU(苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐，400μM)、4倍摩尔量的HOBT(1-羟基苯并三唑，400μM)溶于4mL DMF中，混合至完全溶解后，加入到固相反应器中与步骤(4)除去哌啶的树脂充分混合，摇床振荡5min；
(6)振荡到时后，加入步骤(5)制备的树脂的8倍摩尔量的DIEA(N,N-二异丙基乙胺)，充分混合后，置于摇床中，计时反应2h；
(7)重复步骤(2)～(6)依次接入Fmoc保护的精氨酸和双Fmoc保护的赖氨酸；
(8)再称取步骤(5)中2倍摩尔量(即800μM)的苯丙氨酸，其他试剂(HBTU、HOBT、DIEA)均为两倍摩尔量(即800μM)，混合至完全溶解后，加入到固相反应器中与树脂充分混合，摇床振荡5min；
(9)重复步骤(2)～(6)依次接入组氨酸和苯丙氨酸，然后操作步骤(8)；
(10)Kaiser检测，茚三酮与氨或一级胺产生紫红色络合物；Kaiser试剂包括：6％的茚三酮乙醇溶液；80％的苯酚乙醇溶液；2％0.001M的KCN吡啶溶液，取少量步骤(6)中反应完成时的树脂和步骤(2)中的树脂，加Kaiser试剂中的三种成分各2～3滴，100℃加热1～2min，若呈现兰色或红褐色表明还有游离的氨基，反之表示肽链连接完全；
(11)肽链接合完毕时，清洗树脂后，用哌啶脱保护两次；
(12)用DMF清洗树脂10次，每次4mL；再用DCM清洗树脂10次，每次4mL；
(13)真空干燥样品；
(14)待样品干燥完毕之后，将树脂转移到鸡心瓶中，装好磁力搅拌器，将鸡心瓶固定好，缓慢加入混合好的切割试剂(三氟乙酸：超纯水：苯甲硫醚：苯酚：乙二硫醇＝82.5:5:5:5:2.5)，加入磁子进行充分搅拌，室温下反应12小时；
(15)待反应完成，将反应物转移至固相反应器中，以反应固相反应器中未转移的树脂，如此静置10min，用TFA(三氟乙酸)冲洗鸡心瓶，将所有树脂和溶液倒入新的固相反应器中，后将混合物在氮气流下过滤，滤液置于圆底烧瓶中，在氮气流下吹干；
(16)待圆底烧瓶中的样品吹至粘稠，撤下氮气，在圆底烧瓶中倒入约20mL冰乙醚沉淀多肽，将不溶物充分打散，然后配平，置于冷冻离心机内，4℃下8000rpm离心15min，弃上清液，再溶于20mL冰乙醚中打散，离心；如此重复操作离心3次，将沉淀真空干燥，得到PepV多肽粗品；
(17)PepV多肽粗品用制备型HPLC进行纯化，后利用分析型HPLC进行纯度分析，结果如图1所示；
(18)对纯化后的目标多肽利用ESI高分辨质谱进行鉴定，其质谱图如图2所示；由图2测得所合成的PepV多肽的分子量为1337.49，与序列为(FHF)2KRGD的多肽的分子量相一致，说明本实施例制备的多肽为目的多肽，即PepV多肽，其氨基酸序列为(FHF)2KRGD，在K处分支，从N端到C端的结构式为：
Figure BDA0003118924200000071
实施例2：PepV多肽的自组装纳米囊泡(主动靶向型纳米药物载体)制备及其观测以实施例1制备的PepV多肽为例，制备PepV多肽自组装纳米囊泡，其操作步骤如下：
(1)配制浓度为250μM的PepV多肽溶液，在室温下静置过夜使其自组装；
(2)配制20mg/mL的磷钨酸(PTA)，并用0.1M氢氧化钠调节pH为6.0～7.0；
(3)取TEM专用铜网，滴加一滴自组装后的PepV多肽样品于铜网上，形成水滴，静置1min后，用滤纸在铜网边缘吸去溶剂，使铜网成半湿润状态；然后滴加一滴磷钨酸染液(pH为6.0～7.0)，染色1.5min左右，用滤纸吸干；再滴加一滴超纯水，静置10s，吸去超纯水；重复用超纯水洗两次；最后将铜网放置于培养皿中干燥；
(4)利用透射电镜观察PepV多肽自组装纳米囊泡的形态；
如图3所示，可见本发明的PepV多肽在室温孵育过夜可自组装形成纳米级囊泡，且此空白PepV多肽纳米囊泡粒径较为均一，约为30～60nm。
实施例3：PepV多肽载药纳米囊泡(主动靶向抗肿瘤纳米药)的制备
以实施例1制备的PepV多肽为例，PepV多肽载药纳米囊泡的制备步骤如下：
(1)称取适量的药物与PepV多肽一起加入甲醇中，密封搅拌30min；
(2)逐滴加入ddH2O，再次搅拌2h；
(3)将步骤(2)搅拌好的产品旋蒸除去有机溶剂甲醇，PepV多肽在此过程中将形成囊泡包裹住药物；
(4)在12000rpm下超速离心5min除去未包裹药物，加ddH2O定容至5mL，保存在4℃，或者冻干后保存在-20℃。
包裹药物的PepV多肽载药纳米囊泡实物图如图4所示，其中图4(a)～(d)中左右两图分别为直接溶解的药物和PepV多肽载药纳米囊泡包裹的药物；
(5)采用TEM观察制备好的PepV多肽载药纳米囊泡形态，如图5所示，PepV多肽载药纳米囊泡直径为200～400nm；
(6)将步骤(4)的冻干粉重新溶解于甲醇中，采用高效液相色谱法测定包裹药物的含量，采用下列公式计算载药量(DE％)和包封率(EE％)，结果如表1所示。
载药量和包封率计算公式如下：
Figure BDA0003118924200000081
Figure BDA0003118924200000082
表1 PepV多肽对四种药物的载药量和包封率
Figure BDA0003118924200000083
由表1结果可见，PepV多肽对不同药物的载药量和包封率不同，载药量范围为15％-22％，包封率可以达到60％-92％，说明本发明设计的两亲性分支多肽可以包载多种疏水性药物小分子，包载能力较强。
实施例4：PepV多肽载药纳米囊泡的体外药物释放实验
采用透析法研究PepV多肽载药纳米囊泡的体外药物释放，具体步骤如下：
(1)用去离子水将冻干的PepV多肽载药纳米囊泡配制成3mL分散液，置于14kD透析袋中，用50mL含有1％吐温80的PBS作为释放介质(pH为7.4)；
(2)将透析袋置于37℃恒温振荡培养箱中，在指定时间点吸取300μL释放介质用于检测，同时补充300μL释放介质；
(3)通过测定吸光度计算释放的药物含量，并绘制药物释放率-时间曲线；不同药物从PepV载药纳米囊泡中释放的曲线如图6所示；
(4)以1％吐温80的PBS作为释放介质(pH为5.5)，重复步骤(1)～(3)，绘制酸性条件下PepV多肽载药纳米囊泡的药物释放率-时间曲线，结果如图7所示。
由图6可见，相对常规抗肿瘤药物，PepV多肽载药纳米囊泡可在12h内持续释放，包载不同药物的PepV多肽载药纳米囊泡在12h的药物释放率在50％-65％，具有缓释作用。
由图7可见，在pH5.5的酸性溶液环境中，PepV多肽载药纳米囊泡释放药物的速率比在pH为7.4的溶液环境中释放药物的速率更快，说明PepV多肽载药纳米囊泡具有pH响应性。
实施例5：PepV多肽载药纳米囊泡的细胞活性实验
PepV多肽载药纳米囊泡的细胞活性实验采用MTT法检测，具体操作步骤如下：
(1)配制试剂和培养基
MTT溶液的配制：用PBS配制5mg·mL-1的MTT(噻唑蓝，购自Sigma公司，货号：M5655)，用锡箔纸包裹好，在室温下搅拌30min，完全溶解后用0.22μM的滤膜过滤，在4℃下避光保存；
三联试剂的配制：将SDS(十二烷基硫酸钠)10g、异丁醇5mL、10M盐酸0.12mL，用双蒸水溶解配成100mL溶液；
细胞培养基的配制：由90％的DMEM培养基(购自Gibco公司，货号：GMS12052.3.1)和10％的FBS配制而成；
细胞培养基用于培养HeLa细胞(人宫颈癌细胞系，购自中科院上海细胞库)；
(2)待培养瓶中的HeLa细胞长到了80％以上融合，加入1mL 0.25％胰酶(购自Sigma公司)消化，放置在37℃，5％CO2培养箱孵育，当倒置显微镜下观察到细胞消化完成，加入4mL细胞培养基终止后离心，离心条件为1000rpm下离心4min；弃上清液，加入细胞培养基轻轻吹打，使细胞均匀地分散在培养基中；
(3)用细胞计数器计算细胞个数，并添加细胞培养基调整细胞浓度至5×104个/mL；
(4)取步骤(3)的细胞悬液铺板，每个孔中加入体积为100μL，每孔细胞数目5000个，然后放置5％CO2，37℃培养箱中孵育过夜，使细胞贴壁；
(5)孵育结束后，用无血清培养基(DMEM，购自Gibco公司，货号：GMS12052.3.2)配制不同浓度的PepV多肽载药纳米囊泡，并加入96孔板，与步骤(4)的HeLa细胞共同孵育24小时；
其中，空白组：仅添加细胞培养基；药物组：HeLa细胞加入含有药物的细胞培养基(采用含有0.5％DMSO的培养基溶解药物，如：阿霉素、姜黄素、喜树碱或槲皮素；PepV载药纳米囊泡组：HeLa细胞加入载有不同抗肿瘤药物的PepV多肽载药纳米囊泡；
(6)孵育24小时后，吸出培养基；将之前配好的MTT溶液用无酚红的DMEM完全培养基稀释十倍，然后每孔加入100μL；再将96孔板放入5％CO2，37℃细胞培养箱中；
(7)反应4小时后，每孔加入100μL的三联试剂(10％SDS+5％异丁醇+0.012mol/LHCl)，在室温下，置于摇床上振荡12～24小时混匀，用酶标仪检测溶液在570nm的OD值；用SPSS软件计算各种药物及PepV多肽载药纳米囊泡对HeLa细胞的IC50值，结果见图8。
IC50值可用于衡量药物对肿瘤细胞的毒性，即细胞毒性越强，该数值越低；由图8结果可见，包载不同药物的PepV多肽载药纳米囊泡对HeLa细胞的毒性不同，且它们对HeLa细胞的毒性均显著高于其对应的抗肿瘤药物，这也进一步说明了本发明制备的PepV多肽载药纳米囊泡可高效递送药物至肿瘤细胞，进而提高抗肿瘤效果。
实施例6：激光共聚焦显微镜观察PepV多肽载药纳米囊泡的摄取实验
(1)待培养瓶中的HeLa细胞长到了80％以上融合，加入1mL 0.25％胰酶(购自Sigma公司)消化，放置在37℃，5％CO2培养箱孵育，当倒置显微镜下观察到细胞消化完成，加入4mL细胞培养基终止消化后离心，离心条件为1000rpm下离心4min；弃上清液，加入细胞培养基轻轻吹打，使细胞均匀地分散在培养基中；
(2)用细胞计数器计算细胞个数，并添加细胞培养基调整细胞浓度至106个/mL；
(3)取步骤(2)的细胞悬液加入激光共聚焦显微镜专用培养皿，每个孔中加入体积为400μL，即每孔细胞数目40万个，然后放置在5％CO2，37℃培养箱中孵育过夜，使细胞贴壁；
(4)吸去培养基，加入400μL非完全培养基稀释的包载阿霉素的PepV多肽纳米囊泡溶液，药物浓度为5μg/mL；阿霉素为对照组；
(5)药物与细胞孵育4h后，吸去培养基，用PBS冲洗2-3遍，将未摄取的药物洗去，然后加入Hoechst 33342染料，避光染色30min；
(6)用激光共聚焦显微镜观察成像情况；在操作软件Leica Application Suite X中设置通道一激发波长(λex)为488nm，发射波长(λem)为575-585nm，观测阿霉素荧光(图中DOX组)；设置通道二激发波长(λex)为350nm，发射波长(λem)为450-470nm，观测Hoechst33342染料荧光(图中Hoechst组)；拍照保存，自动生成通道一、通道二以及二者叠加的图像(图中Merge组)。
由图9可见，包载阿霉素的PepV多肽纳米囊泡处理细胞后，细胞对阿霉素的摄取效率明显高于对纯阿霉素的摄取，在细胞核中也有明显的阿霉素荧光；这说明PepV多肽纳米囊泡能够提高细胞对药物的摄取效果。
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。

Claims (11)

1.一种主动靶向型分支多肽，其特征在于，所述主动靶向型分支多肽为两亲性分支多肽，或所述两亲性分支多肽经替换、添加或删除一个或多个氨基酸形成的具有同等载药功能的氨基酸序列，或包含两亲性分支多肽氨基酸序列的同源多肽；所述两亲性分支多肽的氨基酸序列为(FHF)2KRGD，在K处分支，从N端到C端的结构式为：
Figure FDA0003118924190000011
2.根据权利要求1所述的主动靶向型分支多肽，其特征在于：所述同源多肽与氨基酸序列(FHF)2KRGD具有85％～100％的氨基酸序列一致性。
3.一种主动靶向型纳米药物载体，其特征在于，所述主动靶向型纳米药物载体为权利要求1中所述的两亲性分支多肽自组装形成的纳米级囊泡。
4.一种主动靶向抗肿瘤纳米药，其特征在于，所述主动靶向抗肿瘤纳米药为权利要求3所述的主动靶向型纳米药物载体中包载抗肿瘤药物。
5.根据权利要求4所述的主动靶向抗肿瘤纳米药，其特征在于：所述抗肿瘤药物为脂溶性天然活性小分子。
6.权利要求4或5所述的主动靶向抗肿瘤纳米药的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、制备两亲性分支多肽，所述两亲性分支多肽的氨基酸序列为(FHF)2KRGD，在K处分支；
S2、将步骤S1制备的两亲性分支多肽与抗肿瘤药物同时溶解，所述两亲性分支多肽通过自组装将抗肿瘤药物包载在疏水空腔中，得到主动靶向抗肿瘤纳米药。
7.根据权利要求6所述的主动靶向抗肿瘤纳米药的制备方法，其特征在于：步骤S1中，两亲性分支多肽通过多肽固相合成或液相合成或重组合成。
8.根据权利要求6所述的主动靶向抗肿瘤纳米药的制备方法，其特征在于：步骤S2中，通过自组装制备主动靶向抗肿瘤纳米药的具体步骤为：
S21、将抗肿瘤药物和两亲性分支多肽共同溶解于能与水互溶的有机溶剂中，并封闭搅拌，得到混合液A；
S22、向混合液A中逐滴加入ddH2O，混合搅拌后得到混合液B；
S23、将搅拌好的混合液B旋蒸除去有机溶剂，两亲性分支多肽在旋蒸过程中形成包裹抗肿瘤药物的囊泡；
S24、将包裹抗肿瘤药物的囊泡超速离心除去未包裹抗肿瘤药物，得到主动靶向抗肿瘤纳米药。
9.根据权利要求8所述的主动靶向抗肿瘤纳米药的制备方法，其特征在于：
步骤S21中，所述有机溶剂为甲醇，抗肿瘤药物和两亲性分支多肽的混合摩尔比例为1：1，封闭搅拌时间为30min；
步骤S22中，混合搅拌时间为2h；
步骤S24中，包裹抗肿瘤药物的囊泡在12000rpm下超速离心5min，加水定容后4℃保存或冻干后-20℃保存，得到主动靶向抗肿瘤纳米药。
10.权利要求1或2所述的主动靶向型分支多肽或权利要求3所述的主动靶向型纳米药物载体在制备抗肿瘤药物中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于：所述抗肿瘤药物中包括治疗量的上述主动靶向型分支多肽或主动靶向型纳米药物载体以及其他药学上可接受的辅料。
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