CN115490660A - 南牡蒿内酯a-d及其药物组合物和其应用 - Google Patents

南牡蒿内酯a-d及其药物组合物和其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供南牡蒿内酯A–D及其药物组合物和其应用，属于药物技术领域。本发明的结构式（I）所示4个倍半萜二聚体，南牡蒿内酯A–D（artemeriopolides A‒D，1–4）对人肝癌细胞株HepG2、Huh7和SK‑Hep‑1具有细胞毒活性，能够与可药用载体或赋型剂组成药物组合物，可用于制备抗肝癌药物。

Description

南牡蒿内酯A-D及其药物组合物和其应用
技术领域：
本发明属于药物技术领域。具体地，涉及4个结构新颖的倍半萜二聚体，南牡蒿内酯A–D(artemeriopolides A-D，1–4)，及其制备方法和应用，以及以化合物1–4为有效成分的药物组合物及其在制备抗肝癌的药物中的应用。
背景技术：
倍半萜二聚体是具有C30骨架一类典型的高度复杂的天然产物。与其单体相比，它们表现出更多的“类药物”和“生物友好”的分子特征，因而引起了更多的关注。在生物遗传学上，倍半萜二聚体是两个相同或不同的倍半萜单体通过Diels-Alder反应、[2+2]环加成、Michael加成、自由基偶联反应或酯化反应衍生而来。近年来，倍半萜类二聚体被认为是潜在的药物候选，引起了天然产物和有机化学家的广泛关注。
菊科蒿属(Artemisia)约有380种，分布在世界各地，其中186种44变种产于我国。其中，一些植物是著名的民间和传统中药，用于治疗疟疾、肝炎、癌症、湿疹、腹泻、瘀伤和风湿病等各种疾病。植物化学研究发现，倍半萜二聚体是蒿属植物中最重要的成分之一。目前已报道的倍半萜二聚体有153个，其中大部分为愈创木倍半萜二聚体。文献报道，其中的一些倍半萜二聚体具有显著的抗肿瘤、抗炎、抗病毒、免疫调节等作用。
南牡蒿(A.eriopoda)是菊科蒿属的一种多年生草本植物，全国各地多有分布。在我国部分地区，南牡蒿可代替中国传统中草药青蒿入药，具有祛风除湿，解毒的功效，常用于治疗风湿关节痛，头痛，浮肿，毒蛇咬伤等。但是一直以来对南牡蒿的研究较少，从中主要分离得到了5个桉烷型倍半萜、2个聚炔、1个谷甾醇和3个脂肪酸。迄今未见南牡蒿中倍半萜倍半萜及其抗肝癌活性报道。
延续前期研究，本发明从南牡蒿中分离得到了4个结构新颖的倍半萜二聚体，南牡蒿内酯A–D(artemeriopolides A-D，1–4)。迄今为止，现有技术中无南牡蒿内酯A–D(artemeriopolides A-D，1–4)的报道，及其在制备治疗肝癌药物中的应用的报道，也没有其作为有效成分的药物组合物的报道，也没有其药物组合物在制备治疗肝癌药物中的应用报道。
发明内容：
本发明的目的在于提供一类新的具有药用价值如式(I)所示的南牡蒿内酯A–D(artemeriopolides A-D，1–4)及其制备方法、含其的药物组合物及其应用。本发明从南牡蒿中分离鉴定了4个结构新颖的倍半萜二聚体，南牡蒿内酯A–D(artemeriopolides A-D，1–4)。该类化合物对人肝癌细胞株HepG2、Huh7和SK-Hep-1具有明显的细胞毒活性，能够用于制备抗肝癌药物。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
本发明提供了一系列倍半萜二聚体类化合物，南牡蒿内酯A–D(artemeriopolidesA-D)(化合物1–4)，结构如下式(I)所示：
Figure BDA0003881870320000021
本发明另外提供了制备式I所示的化合物1–4的方法，取干燥的南牡蒿地上部分，粉碎，用3倍量的90％乙醇提取两次，合并提取液减压浓缩后得到的粗浸膏分散于水中，用乙酸乙酯萃取得到乙酸乙酯萃取部分；随后，将乙酸乙酯萃取部分过硅胶柱层析，并用丙酮-石油醚体积比0:100、5:95、10:90、20:80、40:60和100:0梯度洗脱得到8个流分Frs.A-1～A-8；Fr.A-4过MCI gel CHP 20P柱层析，用甲醇-水50:50、70:30、90:10和100:0洗脱得到了四个亚流分Frs.A-4a-A-4d；Fr.A-4c再使用硅胶柱层析，以丙酮-石油醚5:95、10:90和20:80划分成六个流分Frs.A-4c-1-A-4c-6；Fr.A-4c-4首先经过Sephadex LH-20用甲醇-氯仿50:50洗脱，再用Rp-C18柱层析，以甲醇-水50:50、60:40、70:30和80:20处理，最后经半制备高效液相HPLC在安捷伦XDB-C18柱上以80:20甲醇-水和53:47的乙腈-水依次纯化得到化合物1；Fr.A-4c-6经Sephadex LH-20柱层析，甲醇-氯仿50:50洗脱，再用Rp-C18柱层析，以甲醇-水50:50、60:40、70:30和80:20处理，最后经半制备高效液相HPLC在安捷伦XDB-C18柱上以78:22甲醇-水和60:40的乙腈-水依次纯化得到化合物4；Fr.A-5经MCI gel CHP 20P柱层析，甲醇-水50:50、70:30、90:10和100:0洗脱得到了四个流分Frs.A-5a-A-5d；Fr.A-5c进一步用反相Rp-C18柱层析，用甲醇-水50:50、60:40、70:30和100:0梯度洗脱得到四个亚流分Frs.A-5c-1-A-5c-4；Fr.A-5c-2经过硅胶柱层析，以丙酮-氯仿5:95和10:90洗脱得到了五个流分Frs.A-5c-2a-A-5c-2e；Fr.A-5c-2a经过Sephadex LH-20柱层析，用甲醇-氯仿50:50处理之后，再使用半制备HPLC在Agilent XDB-C18柱用以68:32的乙腈-水纯化得到化合物2；Fr.A-5c-3经反复的硅胶柱层析以丙酮-氯仿10:90和20:80洗脱之后，再过Sephadex LH-20柱层析用甲醇-氯仿50:50处理，最后使用半制备HPLC在安捷伦XDB-C18柱以乙腈-水68:32纯化得到化合物3。
本发明提供了式I所示的化合物1–4在制备抗肝癌药物中的应用。
本发明同时提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括式(I)所示的化合物1-4中的至少一种和药学上可接受的载体或赋型剂。
并此，还提供了所述的药物组合物在制备抗肝癌药物中的应用。并同时提供了所述的药物组合物的制备方法：采用上述制备化合物的方法制备得到本发明化合物1-36，然后加入可药用载体。
当所述化合物1-4中的至少一种用于制备抗肝癌药物时，本发明优选将所述化合物1-4直接使用，或以药物组合物的形式使用
本发明提供的药物组合物，包括上述化合物1-4中的至少一种和药学上可接受的载体或赋型剂。在本发明中，所述药学上可接受的载体或赋型剂优选为固体、半固体或液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。本发明对所述药学上可接受的载体或赋型剂没有特殊的限定，选用本领域熟知的、对人和动物无毒且惰性的药学上可接受的载体和/或赋型剂即可。
本发明对所述药物组合物的制备方法没有特殊的限定，直接将化合物1-4中的至少一种与药学上可接受的载体或赋型剂混合即可，本发明对所述混合的过程没有特殊的限定，选用本领域熟知的过程能够得到药物组合物即可。
本发明提供了上述技术方案所述药物组合物在制备抗肝癌药物中的应用，对所述应用的方法没有特殊的限定，选用本领域熟知的方法即可。
在本发明中，当所述药物组合物用于制备抗肝癌药物时，所述组合物在药物中的含量优选为0.1～99％；在所述药物组合物中，所述化合物1-4中的至少一种在药物组合物中的含量优选为0.5～90％。本发明的药物组合物优选以单位体重服用量的形式使用。在本发明中，所制备的药物优选可经注射(静注、肌注)和口服两种形式给药。
与现有技术相比，本发明具备如下的优益性：
1.本发明提供了4个结构新颖的倍半萜二聚体类化合物，南牡蒿内酯A–D(artemeriopolides A-D，1–4)。
2.本发明提供了制备新化合物1–4的新的方法，该方法原料易得，易于操作，适于工业化生成。
3.本发明提供了新化合物1–4作为有效成分的药物组合物，为新的抗肝癌药物提供了具有较好药用作用的新的药物。
4.本发明的化合物1–4对三株肝癌细胞HepG2、Huh7、SK-Hep-1具有细胞毒活性，其中，化合物1和4对HepG2细胞具有细胞毒活性，其IC50分别为33.6和48.8μM；化合物3对HepG2细胞具有适中的细胞毒活性，其IC50为68.1μM。化合物1对Huh7细胞具有适中的细胞毒活性，其IC50分别为59.9μM。化合物1和4对SK-Hep-1细胞具有适中的细胞毒活性，其IC50分别为56.9和93.5μM。以上结果表明南牡蒿中分离得到的化合物1-4可作为药物用于治疗肝癌相关的疾病。
附图说明：
图1为本发明南牡蒿内酯A–D(化合物1-4)的结构式示意图；
图2为本发明南牡蒿内酯A(化合物1)的X-ray单晶结构示意图；
图3为本发明南牡蒿内酯C(化合物3)的X-ray单晶结构示意图。
具体实施方式：
为了更好地理解本发明的实质，下面结合附图，用本发明的试验例和实施例来进一步说明本发明南牡蒿内酯A–D(artemeriopolides A-D)(化合物1–4)的制备方法、结构鉴定、药理作用，以及本发明的药物组成和其制备方法，但不以此试验例和实施例来限定本发明。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
本发明倍半萜二聚体，南牡蒿内酯A–D(artemeriopolides A-D，1–4)的制备：
取干燥的南牡蒿地上部分15.7kg，粉碎，用3倍量的90％乙醇提取两次，合并提取液减压浓缩后得到的粗浸膏分散于水中，用乙酸乙酯萃取得到乙酸乙酯萃取部分550g；随后，将乙酸乙酯萃取部分过硅胶柱层析，并用丙酮-石油醚体积比0:100、5:95、10:90、20:80、40:60和100:0梯度洗脱得到8个流分Frs.A-1～A-8；Fr.A-4 80g过MCI gel CHP 20P柱层析，用甲醇-水50:50、70:30、90:10和100:0洗脱得到了四个亚流分Frs.A-4a-A-4d；14gFr.A-4c再使用硅胶柱层析，以丙酮-石油醚5:95、10:90和20:80划分成六个流分Frs.A-4c-1-A-4c-6；2.4g Fr.A-4c-4首先经过Sephadex LH-20用甲醇-氯仿50:50洗脱，再用Rp-C18柱层析，以甲醇-水50:50、60:40、70:30和80:20处理，最后经半制备高效液相HPLC在安捷伦XDB-C18柱上以80:20甲醇-水和53:47的乙腈-水依次纯化得到化合物1(31mg)；2.3g Fr.A-4c-6经Sephadex LH-20柱层析，甲醇-氯仿50:50洗脱，再用Rp-C18柱层析，以甲醇-水50:50、60:40、70:30和80:20处理，最后经半制备高效液相HPLC在安捷伦XDB-C18柱上以78:22甲醇-水和60:40的乙腈-水依次纯化得到化合物4(2mg)；123g Fr.A-5经MCI gel CHP 20P柱层析，甲醇-水50:50、70:30、90:10和100:0洗脱得到了四个流分Frs.A-5a-A-5d；18g Fr.A-5c进一步用反相Rp-C18柱层析，用甲醇-水50:50、60:40、70:30和100:0梯度洗脱得到四个亚流分Frs.A-5c-1-A-5c-4；4g Fr.A-5c-2经过硅胶柱层析，以丙酮-氯仿5:95和10:90洗脱得到了五个流分Frs.A-5c-2a-A-5c-2e；1.5g Fr.A-5c-2a经过Sephadex LH-20柱层析，用甲醇-氯仿50:50处理之后，再使用半制备HPLC在Agilent XDB-C18柱用以68:32的乙腈-水纯化得到化合物2(8mg)；2.4g Fr.A-5c-3经反复的硅胶柱层析以丙酮-氯仿10:90和20:80洗脱之后，再过Sephadex LH-20柱层析用甲醇-氯仿50:50处理，最后使用半制备HPLC在安捷伦XDB-C18柱以乙腈-水68:32纯化得到化合物3(5mg)。
化合物1-4的结构数据：
旋光由Autopol VI旋光仪(Rudolph Research Analytical,Hackettstown,USA)测定；红外光谱(IR)采用KBr压片法，由Bio-Rad FTS-135型红外光谱仪(Hercules,California,USA)测定；紫外光谱由UV-2401PC型紫外光谱仪(Shimadzu,Kyoto,Japan)测定；ECD谱由Applied Photophysics圆二色谱仪(Agilent,Santa Clara,United States)测定；核磁共振谱(1D和2D NMR)用Avance III-600型超导核磁共振仪(Bruker,Bremerhaven,Germany)测定，以氘代氯仿作为溶剂；高分辨质谱(HRESIMS)用岛津LCMS-IT-TOF型质谱仪(Shimadzu,Kyoto,Japan)测定；薄层层析硅胶板HSGF254是烟台江友硅胶开发有限公司产品；柱层析硅胶(200～300目)为临沂市海祥化工有限公司生产；葡聚糖凝胶LH-20(Sephadex LH-20)购自GE Healthcare Bio-Sciences AB公司；高效液相色谱仪为岛津公司生产，控制器型号是CBM-20A，泵型号是LC-20AR，检测器型号为SPD-M20A，柱温箱型号为AT-350，使用的色谱柱型号为Agilent-Eclipse XDB-C18(5μm,9.4×250mm)；色谱纯乙腈购自迈瑞达公司；MCI gel CHP20P(75～150μm)购自Mitsubishi Chemical Corporation(Tokyo,Japan)；显色剂为10％H2SO4-EtOH溶液。
Figure BDA0003881870320000061
南牡蒿内酯A(Artemeriopolide A，1)
分子式：C29H40O5
分子量：468
性状：三斜晶体；
HRESIMS m/z:469.2952[M+H]+(calcd.for C29H41O5,469.2949)；
IR(KBr)vmax:3441,1751,1697,1633,1396,1221,1184,1062cm–1；
ECD(c 0.22,MeOH)λmax(Δε):198(+18.07),244(+0.28),295(-2.42)nm；
Figure BDA0003881870320000062
(c 0.11,MeOH)；
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表1和2。
化合物1的X-单晶衍射结构示意图见图2。
化合物1的晶体数据:C29H40O5,M＝468.61,
Figure BDA0003881870320000063
Figure BDA0003881870320000064
α＝94.3130(10)°,β＝101.0300(10)°,γ＝90.1650(10)°,
Figure BDA0003881870320000065
T＝100.(2)K,space group P1,Z＝3,μ(Cu Kα)＝0.668mm-1,58997measured reflections,14179independent reflections(Rint＝0.0424).The finalR1 values were 0.0414(I>2σ(I)).The final wR(F2)values were 0.1065(I>2σ(I)).Thefinal R1 values were 0.0419(all data).The final wR(F2)values were 0.1068(alldata).The goodness of fit on F2 was 1.066.Flack parameter＝0.00(5).
Figure BDA0003881870320000071
南牡蒿内酯B(Artemeriopolide B，2)
分子式：C29H40O6
分子量：484
性状：白色粉末；
HRESIMS m/z:485.2889[M+H]+(calcd.for C29H41O6,485.2898)；
IR(KBr)vmax:3429,1766,1697,1453,1379,1259,1211,1071cm–1；
ECD(c 0.22,MeOH)λmax(Δε):217(–0.66),294(–2.21)nm；
Figure BDA0003881870320000072
(c 0.14,MeOH)；
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表1和2。
Figure BDA0003881870320000073
南牡蒿内酯C(Artemeriopolide C，3)
分子式：C30H38O5
分子量：478
性状：单斜晶体；
HRESIMS m/z:479.2783[M+H]+(calcd.for C30H39O5,479.2792)；
IR(KBr)vmax:1757,1689,1544,1449,1382,1268,1220,1186,1042cm–1；
ECD(c 0.23,MeOH)λmax(Δε):224(+14.45)nm；
UV(MeOH)λmax(logε):221(2.88)nm；
Figure BDA0003881870320000074
(c 0.12,MeOH)；
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表1和2。
化合物3的X-单晶衍射结构示意图见图3。
化合物3的晶体数据:C30H38O5,M＝478.60,
Figure BDA0003881870320000081
Figure BDA0003881870320000082
α＝90°,β＝94.762(13)°,γ＝90°,
Figure BDA0003881870320000083
T＝100.(2)K,spacegroup P1211,Z＝4,μ(Cu Kα)＝0.665mm-1,30700 measured reflections,9060independent reflections(Rint＝0.1034).The final R1 values were 0.0832(I>2σ(I)).The final wR(F2)values were 0.1991(I>2σ(I)).The final R1 values were0.1242(all data).The final wR(F2)values were 0.2199(all data).The goodness offit on F2 was 1.076.Flack parameter＝0.22(13).
Figure BDA0003881870320000084
南牡蒿内酯D(Artemeriopolide D，4)
分子式：C30H38O4
分子量：468
性状：白色粉末；
HRESIMS m/z:463.2844[M+H]+(calcd.for C30H39O4,463.2843)；
IR(KBr)νmax:1753,1731,1688,1635,1448,1384,1165,1066,1046cm–1；
ECD(c 0.21,MeOH)λmax(Δε):198(–4.94),228(+27.04),255(–0.72)nm；
UV(MeOH)λmax(logε):224(2.98)nm；
Figure BDA0003881870320000085
(c 0.20,MeOH)；
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表1和2。
Tabel 1 13C NMR(150MHz,δin ppm)data for compounds 1–4.
Figure BDA0003881870320000086
Figure BDA0003881870320000091
aRecorded in CDCl3；brecorded in CD3OD.
Tabel 2 1H NMR(600MHz,δin ppm,J in Hz)data for compounds 1–4.
Figure BDA0003881870320000092
Figure BDA0003881870320000101
aRecorded in CDCl3；brecorded in CD3OD.
实施例2：
化合物1-4对三株肝癌细胞株的细胞毒活性。
1.材料和方法
1.1材料
HepG2细胞株由中国科学院昆明植物研究所活性筛选中心赠予，SK-Hep-1和Huh7细胞株购自上海纪宁生物科技有限公司；培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium,DMEM)购自Thermo Fisher Scientific(苏州，中国)；血清(fetal bovine serum,FBS)购自Life Technologies(NY,USA)；RPMI-1640购自ThermoFisher Biochemical Products(北京，中国)。
1.2仪器
Flex Station 3台式多功能酶标仪(Bio-RAD 680,美国)；分析天平(AG135,Metler Toledo，中国)；恒温箱(DHP-9082,上海)。
1.3实验过程
1).取对数期生长的肝癌细胞，弃去旧培养基，用PBS清洗两遍，弃去PBS；
2).用0.25％的胰蛋白酶消化细胞，在显微镜下观察到细胞轮廓加深并有变圆趋势时，迅速吸去胰蛋白酶；
3)用含10％FBS的DMEM完全培养基终止消化并重悬细胞，取10μL细胞悬液，用细胞计数仪计数，并用培养基调整细胞浓度至1×104/mL，接种在96孔板上，每孔加入100μL细胞悬液，在37℃，5％CO2的培养箱中孵育24h，使细胞贴壁；
4).吸去培养基，将稀释好的样品加入板中，每孔加入100μL，每个浓度设置3个复孔，培养箱中继续孵育48h；
5).吸去培养基，加入配好的MTT溶液(1mg/mL)，每孔加入100μL，培养箱中孵育4h；
6).吸去MTT溶液，加入DMSO，每孔加入100μL，培养箱中孵育10min；
7).使用酶标仪在490nm波长下测量吸光度值，通过公式抑制率＝(阴性－实验组)/(阴性－空白组)×100％计算细胞抑制率，并用统计软件GraphPad prism 5计算IC50，实验重复3次。
表3化合物1–4的抗肝癌细胞毒活性
Figure BDA0003881870320000111
2.结果
对所有分离得到的进行了抗肝癌细胞毒活性评价，实验结果如表3所示：化合物1–4对三株肝癌细胞HepG2、Huh7、SK-Hep-1具有细胞毒活性，其中，化合物1和4对HepG2细胞具有细胞毒活性，其IC50分别为33.6和48.8μM；化合物3对HepG2细胞具有适中的细胞毒活性，其IC50为68.1μM。化合物1对Huh7细胞具有适中的细胞毒活性，其IC50分别为59.9μM。化合物1和4对SK-Hep-1细胞具有适中的细胞毒活性，其IC50分别为56.9和93.5μM。综上所示，化合物1对三株肝癌细胞HepG2、Huh7和SK-Hep-1的细胞毒活性最好，其IC50分别为33.6,59.9和56.9μM。
3.结论
实验结果显示，化合物1–4对三株肝癌细胞HepG2、Huh7、SK-Hep-1具有细胞毒活性，其中，化合物1和4对HepG2细胞具有细胞毒活性，其IC50分别为33.6和48.8μM；化合物3对HepG2细胞具有适中的细胞毒活性，其IC50为68.1μM。化合物1对Huh7细胞具有适中的细胞毒活性，其IC50分别为59.9μM。化合物1和4对SK-Hep-1细胞具有适中的细胞毒活性，其IC50分别为56.9和93.5μM。综上所示，化合物1对三株肝癌细胞HepG2、Huh7和SK-Hep-1的细胞毒活性最好，其IC50分别为33.6,59.9和56.9μM。以上结果表明南牡蒿中分离得到的化合物1-4可作为药物用于治疗肝癌相关的疾病。
制剂实施例
在以下制剂实施例中，选择常规试剂，并按照现有常规方法进行制剂制备，本应用例仅体现本发明所述化合物1-4中的至少一种能够制备成不同的制剂，对具体试剂和操作不作具体限定：
1.将本发明化合物1-4中的至少一种，用少量的DMSO溶解后，按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液，所述注射液的浓度为0.5～5mg/mL。
2.将本发明化合物1-4中的至少一种，用少量的DMSO溶解后，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶解，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封，得粉针剂。
3.将本发明化合物1-4中的至少一种，按其与赋形剂重量比为9:1的比例加入赋形剂，制成粉剂。
4.将本发明化合物1-4中的至少一种，按其与赋形剂重量比为5:1的比例加入赋形剂，制粒压片。
5.将本发明化合物1-4中的至少一种，按常规口服液制法制成口服液。
6.将本发明化合物1-4中的至少一种，按其与赋形剂重量比为5:1的比例加入赋形剂，制成胶囊。
7.将本发明化合物1-4中的至少一种，按其与赋形剂重量比为5:1的比例加入赋形剂，制成颗粒剂。
由以上实施例可知，本发明提供了一种南牡蒿中化合物及其制备方法和应用，药物组合物及其应用。本发明提供的南牡蒿素，主要包括4个结构新颖的倍半萜二聚体，这些化合物对肝癌细胞具有不同程度的细胞毒活性，能够与可药用载体或赋型剂组成药物组合物，能够用于制备抗肝癌药物。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.如下结构式(I)所示的南牡蒿内酯A–D，
Figure FDA0003881870310000011
2.权利要求1所述的结构式(I)所示的南牡蒿内酯A–D的制备方法：取干燥的南牡蒿地上部分，粉碎，用3倍量的90％乙醇提取两次，合并提取液减压浓缩后得到的粗浸膏分散于水中，用乙酸乙酯萃取得到乙酸乙酯萃取部分；随后，将乙酸乙酯萃取部分过硅胶柱层析，并用丙酮-石油醚体积比0:100、5:95、10:90、20:80、40:60和100:0梯度洗脱得到8个流分Frs.A-1～A-8；Fr.A-4过MCI gel CHP 20P柱层析，用甲醇-水50:50、70:30、90:10和100:0洗脱得到了四个亚流分Frs.A-4a-A-4d；Fr.A-4c再使用硅胶柱层析，以丙酮-石油醚5:95、10:90和20:80划分成六个流分Frs.A-4c-1-A-4c-6；Fr.A-4c-4首先经过Sephadex LH-20用甲醇-氯仿50:50洗脱，再用Rp-C18柱层析，以甲醇-水50:50、60:40、70:30和80:20处理，最后经半制备高效液相HPLC在安捷伦XDB-C18柱上以80:20甲醇-水和53:47的乙腈-水依次纯化得到化合物1南牡蒿内酯A；Fr.A-4c-6经Sephadex LH-20柱层析，甲醇-氯仿50:50洗脱，再用Rp-C18柱层析，以甲醇-水50:50、60:40、70:30和80:20处理，最后经半制备高效液相HPLC在安捷伦XDB-C18柱上以78:22甲醇-水和60:40的乙腈-水依次纯化得到化合物4南牡蒿内酯D；Fr.A-5经MCI gel CHP 20P柱层析，甲醇-水50:50、70:30、90:10和100:0洗脱得到了四个流分Frs.A-5a-A-5d；Fr.A-5c进一步用反相Rp-C18柱层析，用甲醇-水50:50、60:40、70:30和100:0梯度洗脱得到四个亚流分Frs.A-5c-1-A-5c-4；Fr.A-5c-2经过硅胶柱层析，以丙酮-氯仿5:95和10:90洗脱得到了五个流分Frs.A-5c-2a-A-5c-2e；Fr.A-5c-2a经过SephadexLH-20柱层析，用甲醇-氯仿50:50处理之后，再使用半制备HPLC在Agilent XDB-C18柱用以68:32的乙腈-水纯化得到化合物2南牡蒿内酯B；Fr.A-5c-3经反复的硅胶柱层析以丙酮-氯仿10:90和20:80洗脱之后，再过Sephadex LH-20柱层析用甲醇-氯仿50:50处理，最后使用半制备HPLC在安捷伦XDB-C18柱以乙腈-水68:32纯化得到化合物3南牡蒿内酯C。
3.权利要求1所述的结构式(I)所示的南牡蒿内酯A–D在制备抗肝癌药物中的应用。
4.包括权利要求1所述的结构式(I)所示的南牡蒿内酯A–D的至少一种和药学上可接受的载体的药物组合物。
5.权利要求4所述的药物组合物在制备抗肝癌药物中的应用。
6.权利要求4所述的药物组合物的制备方法：取干燥的南牡蒿地上部分，粉碎，用3倍量的90％乙醇提取两次，合并提取液减压浓缩后得到的粗浸膏分散于水中，用乙酸乙酯萃取得到乙酸乙酯萃取部分；随后，将乙酸乙酯萃取部分过硅胶柱层析，并用丙酮-石油醚体积比0:100、5:95、10:90、20:80、40:60和100:0梯度洗脱得到8个流分Frs.A-1～A-8；Fr.A-4过MCI gel CHP 20P柱层析，用甲醇-水50:50、70:30、90:10和100:0洗脱得到了四个亚流分Frs.A-4a-A-4d；Fr.A-4c再使用硅胶柱层析，以丙酮-石油醚5:95、10:90和20:80划分成六个流分Frs.A-4c-1-A-4c-6；Fr.A-4c-4首先经过Sephadex LH-20用甲醇-氯仿50:50洗脱，再用Rp-C18柱层析，以甲醇-水50:50、60:40、70:30和80:20处理，最后经半制备高效液相HPLC在安捷伦XDB-C18柱上以80:20甲醇-水和53:47的乙腈-水依次纯化得到化合物1南牡蒿内酯A；Fr.A-4c-6经Sephadex LH-20柱层析，甲醇-氯仿50:50洗脱，再用Rp-C18柱层析，以甲醇-水50:50、60:40、70:30和80:20处理，最后经半制备高效液相HPLC在安捷伦XDB-C18柱上以78:22甲醇-水和60:40的乙腈-水依次纯化得到化合物4南牡蒿内酯D；Fr.A-5经MCI gelCHP 20P柱层析，甲醇-水50:50、70:30、90:10和100:0洗脱得到了四个流分Frs.A-5a-A-5d；Fr.A-5c进一步用反相Rp-C18柱层析，用甲醇-水50:50、60:40、70:30和100:0梯度洗脱得到四个亚流分Frs.A-5c-1-A-5c-4；Fr.A-5c-2经过硅胶柱层析，以丙酮-氯仿5:95和10:90洗脱得到了五个流分Frs.A-5c-2a-A-5c-2e；Fr.A-5c-2a经过Sephadex LH-20柱层析，用甲醇-氯仿50:50处理之后，再使用半制备HPLC在Agilent XDB-C18柱用以68:32的乙腈-水纯化得到化合物2南牡蒿内酯B；Fr.A-5c-3经反复的硅胶柱层析以丙酮-氯仿10:90和20:80洗脱之后，再过Sephadex LH-20柱层析用甲醇-氯仿50:50处理，最后使用半制备HPLC在安捷伦XDB-C18柱以乙腈-水68:32纯化得到化合物3南牡蒿内酯C；然后取化合物1–4即南牡蒿内酯A-D中的其中一种或其任意组合，加入可药用载体。
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