CN115477299B - 一种手性抗菌碳点、其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于纳米材料及生物功能材料技术领域，更具体地，涉及一种手性抗菌碳点、其制备方法和应用。将手性源与带有阳离子的水溶性抗菌活性分子以及用于提高手性碳点光学性能的第三反应原料混合，发生水热反应，提纯即可得到手性抗菌碳点，该方法制备手性碳点的量子产率高，方法简单。所制得的手性碳点具有较好的抗菌作用，且不同手性的碳点存在抗菌差异性，为新靶点抗菌提供了有效途径，为多功能纳米材料的制备和应用提供了研究基础。
Description
技术领域
本发明属于纳米材料及生物功能材料技术领域，更具体地，涉及一种手性抗菌碳点、其制备方法和应用。
背景技术
碳点，作为一种新型纳米碳材料，广泛受到人们的关注。碳点，广义上的定义为：直径一般在2～10nm，经表面钝化后会发射不同的荧光，发射波长可“调谐”。碳点在检测、催化、传感、医学治疗以及生物成像方面都具有广泛的应用。
手性碳点的制备方法分为直接合成法及两步偶联法。现有制备方法存在的技术缺陷：(1)手性碳点制备过程较为复杂，不利于大批量制备；(2)制备碳点的原料种类单一，多为氨基酸，没有多样性。而且现有技术制备得到的手性碳点应用单一，主要集中在检测方面；手性碳点有抗菌能力，但是不同手性碳点的抗菌能力没有体现差异性；具备酶活性的手性碳点较少。
生物系统在摄取、传感、合成、代谢等生化过程中表现出极大的立体特异性和手性特异性，而手性是生物系统中一个重要的生化特性。手性碳点作为手性纳米药物在生物医疗领域表现出极大的应用前景。部分氨基酸的D型和L型在对微生物的抗性上表现出一定的差异，可以利用这种差异制备针对某些细菌特定的抗性药物，然而，氨基酸本身对细菌的抗性效果不佳，氨基酸本身不具有抗菌性或需要毫克级才能体现出手性抗菌差异性。为了实现精准靶向用药，避免非抗菌活性药物带来的生物毒性，如何制备得到抗菌效果好(比如MIC达到微克级别的)且具有手性抗菌差异性的手性碳点是当前亟需解决的技术问题。
生物组织本身容易对短波长荧光有较强的吸收,甚至有的蛋白质本身就可以发射蓝色荧光,使检测受到严重的背景干扰,这极大地限制了碳点在生物方面的应用。长波长碳点在可见光区激发,发射波长较长,具有强的组织穿透性及宽的光谱吸收范围,更有利于将碳点应用到实际的应用中。但长波长碳点也存在一些问题,如合成长波长碳点的方法及种类较少,合成复杂等。这些问题的存在限制了长波长碳点的应用。因此,迫切需要开发简单的制备长波长碳点的方法，并且将其用于实际应用中。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明提供了一种手性抗菌碳点、其制备方法和应用，解决了现有技术手性碳点制备过程复杂、抗菌活性不佳、不具有手性抗菌差异性、制备得到的碳点波长短等的技术问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种手性碳点的制备方法，将手性源、第二反应原料和第三反应原料混合得到混合原料，加热使所述混合原料发生水热反应，反应结束后经纯化得到手性碳点；其中：
所述手性源为手性氨基酸、D/L-酒石酸、D/L-葡萄糖、D/L-苹果酸和D/L-薄荷醇中的一种或多种；所述第二反应原料为带有阳离子的水溶性抗菌活性分子；所述第三反应原料用于提高制备得到的手性碳点的光学性能。
优选地，所述混合原料中所述手性源的浓度为10-80mg/mL；所述手性氨基酸为D/L-谷氨酸、D/L-赖氨酸、D/L-苯丙氨酸、D/L-半胱氨酸、D/L-色氨酸和D/L-精氨酸中的一种或多种。
优选地，所述第二反应原料为PEI、亚精胺和壳聚糖季铵盐中的一种或多种；所述第二反应原料在所述混合原料中的浓度为10-80mg/mL。
优选地，所述第三反应原料为柠檬酸、柠檬酸钠、硫脲、尿素、乙二胺、4-氨基水杨酸和EDTA中的一种或多种；所述第三反应原料在所述混合原料中的浓度在20-100mg/mL。
优选地，所述水热反应其反应温度为120-200℃；反应时间为0.5-3小时。
进一步优选地，所述水热反应其反应温度为150-180℃；反应时间为0.8-1.5小时。
优选地，所述纯化具体为：将所述水热反应的产物进行离心分离，去除溶液中未反应的反应原料，将得到的溶液冷冻干燥，得到固体状的手性碳点。
按照本发明的另一个方面，提供了一种所述的制备方法制备得到的手性碳点。
按照本发明的另一个方面，提供了一种所述的手性碳点在抑制细菌中的应用；所述细菌为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌或枯草芽孢杆菌。
按照本发明的另一个方面，提供了一种所述的手性碳点在抑制MurA酶中的应用。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
(1)本发明提供的一种手性碳点的制备方法，将手性源与带有阳离子的水溶性抗菌活性分子及用于提高手性碳点光学性能的第三反应原料混合，发生水热反应，提纯即可得到手性碳点，该方法制备手性碳点的量子产率高，方法简单。
(2)本发明制备的手性碳点表面带有正电荷，能够与细胞壁的负电荷结合，起到电荷破膜的作用。同时本发明所制备的手性碳点手性不同时，对酶的抑制作用存在着抗菌差异性。因此本发明制得的手性碳点具有较好的选择性抗菌作用，为新靶点抗菌提供了有效途径，为多功能纳米材料的制备和应用提供了研究基础。
(3)本发明优选实施例中，一步水热法相对于现有技术微波加热法或两步偶联法获得的手性碳点的量子产率要高约25％左右，且本发明实施例中在使用相同的手性来源即Glu时，一步合成得到的DGU对S.aureus的抑制效果可以达到25μg/mL，为两步偶联所得的NDGU的4倍、NLGU的12倍。
(4)现有技术长波长碳点制备方法复杂，制备过程中需要引入强酸强碱，反应条件苛刻且反应过程剧烈，本发明实施例中通过简单地将特定的手性氨基酸、第二和第三反应原料混合水热，反应原料简单，反应条件温和，一步即制备得到发射波长为530nm且没有出现激发波长依赖性的长波长手性碳点，同时该长波长手性碳点也具备较好的抗菌能力，为长波长碳点的制备提供了新的思路，因此本发明也提供了一种长波长碳点的制备方法。
附图说明
图1为实施例1制备得到的手性碳点DGU的内容(a)TEM及内容(b)粒径分布图像。
图2为实施例1和实施例2制备得到的手性碳点DGU和LGU的红外图谱。
图3为实施例1和实施例2制备得到的手性碳点DGU和LGU的zeta电位。
图4为实施例1和实施例2制备得到的手性碳点DGU和LGU的发射光谱、紫外吸收光谱和荧光图谱。
图5为内容(a)为Glu原料的圆二色谱图，内容(b)为实施例1和实施例2分别通过一步水热法所制备的DGU和LGU的圆二色谱图。
图6为实施例3和实施例4制备得到的手性碳点LCS和DCS的zeta电位。
图7为实施例3和实施例4制备得到的手性碳点LCS和DCS的发射光谱、紫外吸收光谱和荧光图谱。
图8为内容(a)为Cys原料的圆二色谱图，内容(b)为实施例3和实施例4分别通过一步水热法所制备的LCS和DCS的圆二色谱图。
图9为对比例1制备的手性碳点NDGU的内容(a)TEM及内容(b)粒径分布图像。
图10为对比例1和对比例2制备的手性碳点ND/LGU的红外图谱。
图11为对比例1和对比例2制备的手性碳点ND/LGU的zeta电位。
图12为对比例1和对比例2制备的手性碳点ND/LGU的发射光谱、紫外吸收光谱和荧光图谱。
图13内容(a)和内容(b)分别为L/D-Glu原料的圆二色谱图，以及通过两步法所制备的NLGU和NDGU的圆元二色谱图。
图14内容(a)为LAMA的荧光图谱；内容(b)为DAMA的荧光图谱；内容(c)为LATA的荧光图谱；内容(d)为DATA的荧光图谱。
图15内容(a)为D/LAMA的圆二色谱图，内容(b)为D/LATA的圆二色谱图。
图16为不同CDs的MurA酶抑制效果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供的一种手性碳点的制备方法，将手性源、第二反应原料和第三反应原料混合得到混合原料，加热使所述混合原料发生水热反应，反应结束后经纯化得到手性碳点；其中：所述手性源为手性氨基酸、D/L-酒石酸、D/L-葡萄糖、D/L-苹果酸和D/L-薄荷醇中的一种或多种；这里D/L中的“/”表示“或”。比如D/L-酒石酸为D-酒石酸或L-酒石酸。所述混合原料中所述手性源的浓度为10-80mg/mL，较佳为30-50mg/mL；所述第二反应原料为带有阳离子的水溶性抗菌活性分子；所述第二反应原料在所述混合原料中的浓度为10-80mg/mL，较佳为30-50mg/mL；所述第二反应原料为PEI、亚精胺和壳聚糖季铵盐中的一种或多种；较佳为分子量为600-1000的聚乙烯亚胺，较佳分子量为600-3000。所述第三反应原料用于提高制备得到的手性碳点的光学性能，所述第三反应原料在所述混合原料中的浓度在20-100mg/mL，较佳为50-70mg/mL。所述第三反应原料为柠檬酸、柠檬酸钠、硫脲、尿素、乙二胺、4-氨基水杨酸和EDTA中的一种或多种。
一些实施例中，所述手性氨基酸为D/L-谷氨酸、D/L-赖氨酸、D/L-苯丙氨酸、D/L-半胱氨酸、D/L-色氨酸、D/L-精氨酸中的一种或多种。
一些实施例中，所述水热反应其反应温度为120-200℃；反应时间为0.5-3小时。较佳实施例中，所述水热反应其反应温度为150-180℃；反应时间为0.8-1.5小时。
一些实施例中，所述纯化具体为：将所述水热反应的产物进行超滤，去除溶液中未反应的手性源小分子及未反应的原料小分子，将得到的溶液冷冻干燥，得到固体状的手性碳点。
实验中将本发明一步水热法制备得到的手性碳点与其他两种方法，即微波加热法和两步法(通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺结合的两步偶联法)制得的手性碳点进行比较，实验发现，一步水热法相对于其他两种方法获得的手性碳点的量子产率要高约25％左右，实验还发现，本发明制备得到的手性碳点还能够抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌以及铜绿假单胞菌，抑制MurA酶，且抑制效果远优于微波法或两步法制备得到的手性碳点。优选实施例中，本发明制备得到的同一氨基酸对应的手性碳点在抗菌效果上体现出较大的差异，这一结果为开发新型手性纳米抗菌药物奠定坚实基础，使得靶向精准用药成为可能。
本发明一些实施例中通过对手性源、第一反应原料和第二反应原料进行特别选择，制备得到了具有抗菌性的长波长手性碳点，相对于现有技术长波长手性碳点的制备，本发明制备方法简单，反应条件温和。
实施例1
一步法制备以谷氨酸D-Glu为手性源的手性碳点。
在5mL水中加入0.3g CA、0.2g D-Glu，再加入0.2g PEI1800，搅拌至溶解，混合均匀后将混合溶液转移到25mL聚四氟乙烯不锈钢高压釜中，160℃反应1h。得到的浅黄色溶液用3000D超滤管4000r离心20min，去除溶液中未反应的小分子。将得到的溶液冷冻干燥，最后得到所需固体。所得的D-Glu-CDs命名为DGU。DGU的量子产率可以达到30％。
实施例2
一步法制备以谷氨酸L-Glu为手性源的手性碳点。
在5mL水中加入0.3g CA、0.2g L-Glu，再加入0.2g PEI1800，搅拌至溶解，混合均匀后将混合溶液转移到25mL聚四氟乙烯不锈钢高压釜中，160℃反应1h。得到的浅黄色溶液用3000D超滤管4000r离心20min，去除溶液中未反应的小分子。将得到的溶液冷冻干燥，最后得到所需固体。得到的L-Glu-CDs命名为LGU。LGU的量子产率可以达到29.8％。
上述制备方法获得的手性碳点的透射电镜观察：
将纯化的实施例1制备的DGU样品用去离子水分散溶解，取10μL滴在300目的铜网上，用透射电镜(JEM-2100,JEOL Ltd.,Japan)进行观察；图像结果及定量结果如附图1内容(a)和内容(b)所示。图1内容(b)为制备得到的碳点CDs的粒径分布直方图。利用透射电镜对所制备的CDs进行粒度和分布情况进行了表征。如图1内容(a)所示，制备的CDs呈球形，尺寸均匀，分散性良好。采用一步合成法所得到的DGU的平均粒径为2.64nm。
上述制备方法获得的手性碳点的红外光谱扫描：
冻干的样品DGU和LGU采用FTIR(Nicolet 6700,Thermo Scientific,USA)对不同波长(Wavenumber)下的透过率(Transmittance)进行检测，结果如附图2所示。使用FT-IR对所制备CDs表面的官能团进行了表征。如图2所示，2842cm–1、2960cm–1和1390cm–1附近的峰是C-H的特征峰，而C＝O的特征峰在1704cm–1处。1280cm–1处的峰值则表示为C-O振动峰值。1578cm–1和1400cm–1附近的峰值表示N-H和C-H的振动。根据FT-IR的结果可以知道，在实施例1和实施例2一步合成法所得到的CDs中，CDs表面含有丰富的-NH2，这使得CDs具有较高量子产率，且具有很好的与金属离子结合的能力。
上述制备方法获得的手性碳点的Zeta电位检测：
将获得的样品DGU和LGU用去离子水分散溶解，使用Zetasizer(Nano ZS,MalvernInstruments,Worcestershire,UK)进行评估，结果如附图3所示。通过zeta电位对所制备的手性碳点进行测量，测得结果为DGU+7.09mV,LGU+2.38mV，这种正电性有利于抗菌应用中的破膜作用(细菌细胞壁富含磷壁酸，为负电性，正电性的碳点与之结合，可以起到破膜作用)。
上述制备方法获得的手性碳点的荧光和紫外光谱扫描：
将获得的样品用去离子水分散溶解，分别置于荧光分光光度计(LS55,PerkinElmer Company)检测池中测定发射波长(Wavelength)及荧光强度(PL intensity)，以及紫外-可见光分光光度计(Lambda-35,PerkinElmer Company)检测池中对不同波长(Wavenumber)下的吸光度(Absorbance)进行检测，检测结果如附图4所示。其中图4内容(a)为的发射光谱和紫外吸收光谱图；内容(b)为LGU的发射光谱和紫外吸收光谱插图；内容(a)和内容(b)左上角为CDs溶液在日光下和365nm波长的紫外线下的图像。内容(c)和内容(d)分布为DGU和LGU在不同激发波长下的荧光图谱。
两种CDs的最佳吸收峰均出现在360nm处，这可能是由于C＝O的n-π*跃迁所导致，其最佳发射波长均为450nm。由DGU和LGU在不同激发下的荧光光谱可知，两种CDs在320-400nm的广泛的激发波长范围内，没有出现激发波长依赖性。
上述制备方法获得的手性碳点的圆二色谱扫描：
将获得的样品用去离子水分散溶解，置于智利康加光谱偏振仪(Applied OpticalPhysics,Inc.)检测池中测定其圆二色性(circular dichroism)，检测结果如附图5所示。内容(a)为Glu原料的圆二色谱图，可以看出L/D Glu原料在203nm处出现了相反的Cotton效应。而实施例1和实施例2分别通过一步水热法所制备的DGU和LGU的圆二色谱图。如图5内容(b)所示，其在210nm左右表现出了高度对称的相互作用，这可能归因于CDs的高能电子态与Glu能量的杂化引起的Cotton效应。
实施例3
一步法制备以半胱氨酸L-Cys为手性源的手性碳点。
在5mL水中加入0.3g CA、0.2g L-Cys，再加入0.2g PEI1800，搅拌至溶解，混合均匀后将混合溶液转移到25mL聚四氟乙烯不锈钢高压釜中，160℃反应1h。得到的浅黄色溶液用3000D超滤管4000r离心20min，去除溶液中未反应的小分子。将得到的溶液冷冻干燥，最后得到所需固体。所得的L-Cys-CDs命名为LCS。LCS的量子产率可以达到32.41％。
实施例4
一步法制备以半胱氨酸D-Cys为手性源的手性碳点。
在5mL水中加入0.3g CA、0.2g D-Cys，再加入0.2g PEI1800，搅拌至溶解，混合均匀后将混合溶液转移到25mL聚四氟乙烯不锈钢高压釜中，160℃反应1h。得到的浅黄色溶液用3000D超滤管4000r离心20min，去除溶液中未反应的小分子。将得到的溶液冷冻干燥，最后得到所需固体。所得的D-Cys-CDs命名为DCS。DCS的量子产率可以达到30.16％。
上述制备方法获得的手性碳点的Zeta电位检测：
将获得的样品LCS和DCS用去离子水分散溶解，使用Zetasizer(Nano ZS,MalvernInstruments,Worcestershire,UK)进行评估，结果如附图6所示。通过zeta电位对所制备的手性碳点进行测量,测得结果为DCS+19.09mV,LCS+20.16mV，这种正电性有利于抗菌应用中的破膜作用。
上述制备方法获得的手性碳点的荧光和紫外光谱扫描：
将获得的样品用去离子水分散溶解，分别置于荧光分光光度计(LS55,PerkinElmer Company)检测池中测定发射波长(Wavelength)及荧光强度(PL intensity)，以及紫外-可见光分光光度计(Lambda-35,PerkinElmer Company)检测池中对不同波长(Wavenumber)下的吸光度(Absorbance)进行检测，检测结果如附图7所示。其中图7内容(a)为LCS的发射光谱和紫外吸收光谱图；内容(b)为DCS的发射光谱和紫外吸收光谱插图；内容(a)和内容(b)左上角为CDs溶液在日光下和365nm波长的紫外线下的图像。内容(c)和内容(d)分布为LCS和DCS在不同激发波长下的荧光图谱。
两种CDs的最佳吸收峰均出现在360nm处，这可能是由于C＝O的n-π*跃迁所导致，其最佳发射波长均为450nm。由DGU和LGU在不同激发下的荧光光谱可知，两种CDs在320-400nm的广泛的激发波长范围内，没有出现激发波长依赖性。
上述制备方法获得的手性碳点的圆二色谱扫描：
将获得的样品用去离子水分散溶解，置于智利康加光谱偏振仪(Applied OpticalPhysics,Inc.)检测池中测定其圆二色性(circular dichroism)，检测结果如附图8所示。内容(a)为Cys原料的圆二色谱图，可以看出L/D-Cys原料在203nm处出现了相反的Cotton效应。而实施例3和实施例4分别通过一步水热法所制备的LCS和DCS的圆二色谱图。如图8内容(b)所示，其在210及260nm左右表现出了高度对称的相互作用，这可能归因于CDs的高能电子态与Glu能量的杂化引起的Cotton效应。
对比例1
两步法制备以谷氨酸为手性源的手性碳点。
采用两步法合成了N D-Glu。包括如下步骤：
(1)将0.2g PEI1800，0.2g葡萄糖以及0.5CA溶于3mL超纯水中，在80℃下反应一小时，透析结束后冷冻干燥获得N-CDs。
(2)将步骤(1)获得的N-CDs分散于超纯水中，取3mL 50mg/mL的N-CDs溶液，加入100mg的EDC和NHS，搅拌30min后，加入100mg的D-Glu，加入NaOH使其溶解，全部溶解后，通N2搅拌10min，在室温下再搅拌24h。将搅拌好的溶液置于1000D超滤管中进行纯化，得到的液体冷冻干燥得到固体。得到的N-CDs-D-Glu命名为NDGU。
对比例2
两步法制备以谷氨酸为手性源的手性碳点。
采用两步法合成了N L-Glu。包括如下步骤：
(1)将0.2gPEI，0.2g葡萄糖以及0.5CA(柠檬酸)溶于3mL超纯水中，在80℃下反应一小时，透析结束后冷冻干燥获得N-CDs。
(2)将步骤(1)获得的N-CDs分散于超纯水中，取3mL 50mg/mL的N-CDs溶液，加入100mg的EDC和NHS，搅拌30min后，加入100mg的L-Glu，加入NaOH使其溶解，全部溶解后，通N2搅拌10min，在室温下再搅拌24h。将搅拌好的溶液置于1000D超滤管中进行纯化，得到的液体冷冻干燥得到固体。得到的N-CDs-L-Glu命名为NLGU。
将对比例1获得的手性碳点NDGU进行透射电镜观察：将纯化的样品用去离子水分散溶解，取10μL滴在300目的铜网上，用透射电镜(JEM-2100,JEOL Ltd.,Japan)进行观察；图像结果及定量结果如附图9内容(a)和内容(b)所示。图9内容(b)为NDGU CDs的粒径分布直方图。利用透射电镜对所制备的CDs进行粒度和分布情况进行了表征。如图9内容(a)所示，制备的CDs呈球形，尺寸均匀，分散性良好。采用两步合成法所得到的NDGU的平均粒径为2.25nm。
对比例1和对比例2获得的手性碳点的红外光谱扫描：
冻干的样品采用FTIR(Nicolet 6700,Thermo Scientific,USA)对不同波长(Wavenumber)下的透过率(Transmittance)进行检测，结果如附图10所示。如图10所示，3270cm–1处的峰值表示-NH2和-OH的振动，1580cm–1附近和1400cm–1处的峰值表示N-H和C-H的振动。2960cm–1和1390cm–1处的峰是C-H的特征峰，C＝O的特征峰在1706cm–1处。两步法所得到的CDs，表面含有很多-OH及-COOH，使得得到的CDs水溶性很好，但是与离子结合的能力以及量子产率大幅下降。NDGU和NLGU的量子产率分别为5％和6％。
对比例1和对比例2获得的手性碳点的Zeta电位检测：
将获得的样品用去离子水分散溶解，使用Zetasizer(Nano ZS,MalvernInstruments,Worcestershire,UK)进行评估，结果如附图11所示。通过zeta电位对所制备的手性碳点进行测量,测得结果为NDGU+8.37mV，NLGU+1.31mV,这种正电性有利于抗菌应用中的破膜作用。
对比例1和对比例2获得的手性碳点的荧光和紫外光谱扫描：
将获得的样品用去离子水分散溶解，分别置于荧光分光光度计(LS55,PerkinElmer Company)检测池中测定发射波长(Wavelength)及荧光强度(PL intensity)，以及紫外-可见光分光光度计(Lambda-35,PerkinElmer Company)检测池中对不同波长(Wavenumber)下的吸光度(Absorbance)进行检测，检测结果如附图12所示。图12内容(a)和内容(b)分别为NLGU和NDGU的发射光谱和紫外吸收光谱，内容(a)和内容(b)的左上角内容为两种CDs溶液在日光下和365nm波长的紫外线下的图像。图12内容(c)和内容(d)分别为NLGU和NDGU CDs在不同激发波长下的荧光图谱。
NLGU/NDGU两种CDs也同样在360nm处出现最佳的吸收峰，最佳的发射波长为475nm。在320-400nm的广泛的激发波长下NLGU/NDGU的发射波长由475nm移至465nm，出现了微弱的蓝移。这可能是因为两步偶联法所得的CDs的结构均匀性较差，所以在不同的激发下存在着不均匀的发射。
对比例1和对比例2获得的手性碳点的圆二色谱扫描：
将获得的样品用去离子水分散溶解，置于智利康加光谱偏振仪(Applied OpticalPhysics,Inc.)检测池中测定其圆二色性(circular dichroism)，检测结果如附图13所示。图13内容(a)和内容(b)分别为L/D-Glu原料的圆二色谱图，以及通过两步法所制备的NLGU和NDGU的圆二色谱图，虽然在210nm处出现了相反的信号，但是与同浓度的L/D-Glu原料以及L/DGU的响应值相比，吸收值较低。
实施例5
采用水热合成法得到LPE。
在5mL水中加入0.3g CA、0.2g L-苯丙氨酸(L-Phe)，再加入0.2g PEI1800，搅拌至溶解，混合均匀后将混合溶液转移到25mL聚四氟乙烯不锈钢高压釜中，160℃反应1h。得到的浅黄色溶液用3000D超滤管4000r离心20min，去除溶液中未反应的小分子。将得到的溶液冷冻干燥，最后得到所需固体。所得的L-Phe-CDs命名为LPE。量子产率为27.89％。
实施例6
采用水热合成法得到DPE。
在5mL水中加入0.3g CA、0.2g D-苯丙氨酸(D-Phe)，再加入0.2g PEI1800，搅拌至溶解，混合均匀后将混合溶液转移到25mL聚四氟乙烯不锈钢高压釜中，160℃反应1h。得到的浅黄色溶液用3000D超滤管4000r离心20min，去除溶液中未反应的小分子。将得到的溶液冷冻干燥，最后得到所需固体。所得的D-Phe-CDs命名为DPE。量子产率为28.20％。
实施例7
采用水热合成法得到LAMA。
在20mL水中加入0.06g 4-氨基水杨酸、0.1gPEI600、0.1g L-MA(苹果酸)，搅拌至溶解，混合均匀后通入N2，5min后将混合溶液转移到25mL聚四氟乙烯不锈钢高压釜中，180℃反应2h。得到的溶液用1000D超滤管4000r离心20min，去除溶液中未反应的小分子。将得到的溶液冷冻干燥，最后得到所需固体。所得的L-ASA-MA-CDs命名为LAMA。量子产率为14.20％。
实施例8
采用水热合成法得到DAMA。
在20mL水中加入0.06g 4-氨基水杨酸、0.1gPEI600、0.1g D-MA(苹果酸)，搅拌至溶解，混合均匀后通入N2，5min后将混合溶液转移到25mL聚四氟乙烯不锈钢高压釜中，180℃反应2h。得到的溶液用1000D超滤管4000r离心20min，去除溶液中未反应的小分子。将得到的溶液冷冻干燥，最后得到所需固体。所得的D-ASA-MA-CDs命名为DAMA。量子产率为15.60％。
实施例9
采用水热合成法得到LATA。
在20mL水中加入0.06g 4-氨基水杨酸、0.1gPEI600、0.1g L-TA(酒石酸)，搅拌至溶解，混合均匀后通入N2，5min后将混合溶液转移到25mL聚四氟乙烯不锈钢高压釜中，180℃反应2h。得到的溶液用1000D超滤管4000r离心20min，去除溶液中未反应的小分子。将得到的溶液冷冻干燥，最后得到所需固体。所得的L-ASA-TA-CDs命名为LATA。量子产率为15.40％。
实施例10
采用水热合成法得到DATA。
在20mL水中加入0.06g 4-氨基水杨酸、0.1gPEI600、0.1g D-TA(酒石酸)，搅拌至溶解，混合均匀后通入N2，5min后将混合溶液转移到25mL聚四氟乙烯不锈钢高压釜中，180℃反应2h。得到的溶液用1000D超滤管4000r离心20min，去除溶液中未反应的小分子。将得到的溶液冷冻干燥，最后得到所需固体。所得的D-ASA-TA-CDs命名为DATA。量子产率为16.30％。
上述制备方法获得的手性碳点的荧光和紫外光谱扫描：
将获得的样品用去离子水分散溶解，分别置于荧光分光光度计(LS55,PerkinElmer Company)检测池中测定发射波长(Wavelength)及荧光强度(PL intensity)，检测结果如附图14所示。其中图14内容(a)为LAMA的发射光谱，内容(b)为DAMA的发射光谱；内容(c)为LATA的发射光谱，内容(d)为DATA的发射光谱。
从图14可知，实施例7、实施例8、实施例9和实施例10制备得到的四种CDs(LAMA、DAMA、LATA和DATA)的最佳吸收峰均出现在530nm处，其最佳发射波长均为390nm，且在360-420nm的激发波长范围内，并没有出现激发波长依赖性。
上述制备方法获得的手性碳点的圆二色谱扫描：
将获得的样品用去离子水分散溶解，置于智利康加光谱偏振仪(Applied OpticalPhysics,Inc.)检测池中测定其圆二色性(circular dichroism)，检测结果如附图15所示。图15内容(a)为D/LAMA的圆二色谱图，内容(b)为D/LATA的圆二色谱图。由图可知，在210nm处，相对应的手性碳点都出现了相反的信号，表明成功制备了几种手性碳点。
实施例11
手性碳点对不同类型的细菌的抑制作用：
碳点的MIC是用96孔细胞培养板用微稀释法测定的。过夜的细菌细胞培养被调整到2×107CFU/mL的浓度。每孔含有50μL细菌细胞悬液和50μL不同浓度的D/LGU(即实施例1和实施例2分别制备得到的DGU和LGU)和NLGU/NDGU(即对比例1和对比例2分别制备得到的NDGU和NLGU)，最终体积为100μL/孔。处理后的细菌样品在37℃下培养12小时。培养结束后，将100μL的悬浮液与5μL的MTT共同培养20分钟。将形成的沉淀物溶解在DMSO中进行目视观察。将最终结果绘制为表格，如表1所示。
表1不同碳点CDs的抗菌效果
从表1可以看出，在使用相同的手性来源即Glu时，一步合成得到的DGU对S.aureus的抑制效果可以达到25μg/mL，为两步偶联所得的NDGU的4倍、NLGU的12倍。这表明合成方法对于CDs的抗菌活性存在着极大的影响。
对于相同类型的细菌不同的手性碳点存在着不同的抗菌能力，如表2所示。
表2对于S.aureus的抗菌能力
从表2可以看出，虽然我们制备的其他较高QYs的手性CDs存在抗性，但是不存在差异性，只有DGU、LGU、DCS、LCS存在较好的抗菌差异性。而且，实验过程中对于这些碳点各自对应的氨基酸都曾测试了抗菌性，实验发现，即使将这些氨基酸各自浓度提高至2.5mg/mL，也没有表现出抗菌性。说明将本身抗菌性很弱或没有抗菌性的氨基酸按照本发明具体实施例的方法制备得到碳点后，可以得到具有不同抗菌性的荧光碳点，而且同一种氨基酸不同手性分子对应的碳点也表现出了明显的抗菌差异性，为新靶点抗菌提供了有效途径，为多功能纳米材料的制备和应用提供了研究基础。
实施例7、实施例8、实施例9和实施例10制备得到的四种长波长手性CDs(LAMA、DAMA、LATA和DATA)，虽然量子产率没有以氨基酸为手性源所得到的手性CDs高，但是发射波长为530nm，为长波长手性碳点，同时也具备较好的抗菌能力，拓宽了长波长碳点的应用。
实施例12
D/LGU及ND/LGU四种手性碳点对于MurA酶的不同的抑制效果：
MurA酶，即UDP-N-乙酰葡萄糖胺烯醇式丙酮酸转移酶，是肽聚糖合成过程中的一个关键酶，根据酶的催化反应可以得知，酶促反应后会产生游离磷酸，而钼酸铵能有效地与磷酸结合，形成磷钼酸络合物，该络合物还能与显色剂孔雀石绿结合，使孔雀石绿的颜色由黄绿色变为蓝绿色。因此，这种方法可以用来检测磷酸的产生或存在。由MurA酶催化的反应是 GlcNAc为N-乙酰葡萄糖胺。
在96孔板中，依次加入10μL ddH2O(双蒸水)、UNAG(D-葡萄糖-6-磷酸二钠盐)和MurA(UDP-N-乙酰葡萄糖胺烯醇式丙酮酸转移酶)，然后在37℃下孵育5分钟，接着加入不同浓度的待测样品和PEP(磷酸烯醇形式的丙酮酸盐)，在37℃下孵育30分钟。加入50μL孔雀石绿-钼酸铵显色剂终止反应后，37℃避光培养20分钟，用酶标仪在620nm处测量OD值。测定结果见图16所示。
从图16可以看出，实施例1和实施例2一步水热法分别制备得到的碳点DGU和LGU，相对于对比例1和对比例2分别制备得到的碳点NDGU和LDGU，DGU和LGU对于MurA酶的抑制率在1250μg/mL时均可达到50％以上，效果优异。但是两步法所得到的的NLGU和NDGU在同浓度时抑制率仅有25％和26％，与一步法所得到的抑制效果相差较多，这也与我们所得的MIC结果相匹配。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种手性抗菌碳点的制备方法，其特征在于，将手性源、第二反应原料和第三反应原料混合得到混合原料，加热使所述混合原料发生水热反应，反应结束后经纯化得到手性碳点；其中：
所述手性源为D/L-酒石酸、手性氨基酸、D/L-苹果酸和D/L-薄荷醇中的一种或多种；所述手性氨基酸为D/L-谷氨酸、D/L-赖氨酸、D/L-苯丙氨酸、D/L-半胱氨酸、D/L-色氨酸和D/L-精氨酸中的一种或多种；
所述第二反应原料为PEI和/或亚精胺；
所述第三反应原料为柠檬酸、柠檬酸钠和4-氨基水杨酸中的一种或多种。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述混合原料中所述手性源的浓度为10-80 mg/mL。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述第二反应原料在所述混合原料中的浓度为10-80 mg/mL。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述第三反应原料在所述混合原料中的浓度在20-100 mg/mL。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述水热反应其反应温度为120-200℃；反应时间为0.5-3小时。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述水热反应其反应温度为150-180℃；反应时间为0.8-1.5小时。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述纯化具体为：将所述水热反应的产物进行离心分离，去除溶液中未反应的反应原料，将得到的溶液冷冻干燥，得到固体状的手性碳点。
8.如权利要求1至7任一项所述的制备方法制备得到的手性碳点。
9.如权利要求8所述的手性碳点在抑制细菌中的应用；所述细菌为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌或枯草芽孢杆菌。
10.如权利要求8所述的手性碳点在抑制MurA酶中的应用。
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| GR01 | Patent grant | ||
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