CN115463127A

CN115463127A - 鸦胆子苦醇联合17-aag作为pd-l1抑制剂的应用

Info

Publication number: CN115463127A
Application number: CN202211211969.4A
Authority: CN
Inventors: 陈亮; 朱燕; 许莹莹
Original assignee: Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Current assignee: Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Priority date: 2022-09-30
Filing date: 2022-09-30
Publication date: 2022-12-13

Abstract

本发明公开鸦胆子苦醇联合17‑AAG作为PD‑L1抑制剂的应用。本发明公开了鸦胆子苦醇和17‑AAG的组合物在制备PD‑L1抑制剂中的应用，鸦胆子苦醇和17‑AAG的组合物在制备肿瘤治疗药物中的应用，鸦胆子苦醇和17‑AAG的组合物在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用，鸦胆子苦醇在制备17‑AAG的抗肿瘤效果增强剂中的应用。本发明首次发现BRU能够协同17‑AAG激活机体免疫能力从而在治疗肝细胞癌中发挥作用。

Description

鸦胆子苦醇联合17-AAG作为PD-L1抑制剂的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及鸦胆子苦醇联合17-AAG作为PD-L1抑制剂的应用。

背景技术

截至2020年，肝细胞癌(HCC)已成为全球第六大常见的癌症并且其死亡率排列所有肿瘤中的第三高，约占8.3％，仅次于肺癌和结直肠癌。然而，肝细胞癌肿瘤生长和存活的机制仍未被阐明，但是最主要的诱因还是由于HBV病毒的感染导致的慢性肝炎。由于缺乏肝细胞癌诊断的早期生物标志物，大部分病人在确诊时已处于肿瘤发展的中后期，并不适合通过手术治疗以及肝移植进行治疗。临床上，约15％的HCC病人对化疗及靶向治疗敏感性极低。而传统中药(Traditional Chinese medicine,TCM)作为一个多靶标的辅助药物，在许多研究中都展现出了喜人的抗肿瘤效果。因此，进一步研究和理解TCM抗肿瘤效果产生的具体机制对于发展目前治疗肝细胞癌的疗法至关重要。

近几年的研究表明，许多中草药中的组成成分对多种疾病包括癌症都有喜人的治疗效果。鸦胆子苦醇(Brusatol,BRU)是一种从鸦胆子(Bruceajavanica)中提纯出来的小分子药物，目前已被开发为治疗人类恶性肿瘤的实验性药物，包括白血病，肺癌和胰腺癌。研究表明， BRU能够抑制STAT3Y705的磷酸化，从而抑制肿瘤发展和转移，促进肿瘤细胞的凋亡。并且BRU能够改变EMT相关蛋白的表达水平，从而抑制肝细胞癌的转移。BRU也能够抑制肝癌细胞的细胞活性并通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路促进肿瘤细胞的凋亡。BRU，作为一个Nrf2的抑制剂，能够通过抑制Nrf2信号通路提高吉西他滨治疗胰腺癌的化疗效果。然而肿瘤细胞会持续发挥Nrf2的活性，从而促进肿瘤的进一步发展，并由此产生治疗抵抗性。因此，进一步探究BRU化疗敏感度降低的具体机制，对于BRU进一步应用于临床肿瘤治疗至关重要。

Hsp90是一个依赖ATP的管家分子伴侣蛋白，其功能在于协助细胞内蛋白折叠并阻止未折叠的蛋白产生聚集体。研究表明，Hsp90在多种肿瘤中过度表达并且有望成为癌症治疗的新靶点。Hsp90可以结合并稳定多种自噬相关的蛋白或激酶，例如Beclin1，Bcl-2，Raf-1和Akt等，从而协助肿瘤细胞应对应激的微环境。因此，使用Hsp90的抑制剂有望成为提高化疗药物敏感度的新选择。

17-烯丙基氨基格尔德霉素(17-Allylamino-17-demethoxygeldanamycin，tanespimycin， 17-AAG)，是格尔德霉素的一种衍生物，是目前已被广泛研究的Hsp90抑制剂之一，其在临床治疗中单独使用的疗效甚微，但已被证实在多种肿瘤中能显著提高其他药物的治疗敏感性。 17-AAG可以抑制HSP90分子伴侣的活性并使后者的底物蛋白稳定性降低，包括黑色素瘤相关的致癌蛋白，突变的BRAF和AKT。有研究表明，17-AAG可以有效抑制肿瘤中Akt活性和表达，并协同紫杉酚(Taxol)治疗肿瘤。另外，17-AAG可以协同顺铂(Cisplatin，CDDP) 促进肿瘤细胞的凋亡。几项临床一期至三期研究正在进一步研究其临床有效性及药物耐受性，以期为肿瘤的化疗治疗提供更多的临床治疗方案。并且，针对17-AAG在单独应用于癌症治疗时，疗效低的问题，大量针对其耐药性机制的研究也在陆续展开。研究表明，肿瘤细胞对 17-AAG的治疗敏感度，部分是由于Her-2蛋白表达水平的升高；另外，使用Hsp90抑制剂后，细胞内压力应答蛋白如Hsp70和Hsp27蛋白的表达上调可能与17-AAG在临床中治疗效果不佳有关。因此，进一步探究17-AAG产生耐药性的具体分子机制对于提高其在临床治疗中的效果至关重要。

目前，肿瘤免疫治疗已在多种肿瘤治疗中展现出了诱人的前景。近几年，免疫检查点阻断疗法的出现已经重新定义了肿瘤治疗。尤其是在一些强侵袭性的肿瘤中，如黑色素瘤和头颈部肿瘤等。程序性细胞死亡配体1(PD-L1)作为一个跨膜蛋白，已被鉴定为在多种恶性肿瘤中扮演重要角色，能够抑制机体对肿瘤细胞的免疫杀伤的能力。免疫检查点阻断疗法能够有效的激活T细胞的功能并起始机体内的抗肿瘤应答。然而，免疫疗法发挥作用依赖于体内较高水平的肿瘤免疫原性。肿瘤细胞常常处于一种缺氧状态下，而肿瘤细胞往往能够活化多条促存活的信号通路并促进肿瘤的进一步发展甚至产生化疗耐药性。而缺氧状态下，缺氧诱导因子如HIF-1α会诱导肿瘤细胞表面PD-L1的高表达，从而对免疫疗法产生治疗抵抗性。因此寻找有效的联合治疗方法对提高PD-L1治疗效果具有重要意义。

发明内容

为了解决现有技术中的不足，本发明旨在提供鸦胆子苦醇联合17-AAG作为PD-L1抑制剂的应用。

申请人先前的研究证实，当细胞发生致癌性转化时，细胞内维持蛋白质稳态的能力增强。从而缓解肿瘤细胞内的氧化应激压力，促进肿瘤的发生。而肿瘤细胞内维持蛋白质稳态能力的增强都得益于Nrf2蛋白介导蛋白酶体以及TRIM家族蛋白的表达上调，尤其是TRIM11蛋白，后者可以有效维持细胞内氧化还原稳态从而促进肿瘤细胞的生长。由于肿瘤细胞经常处于紊乱的微环境中，因此常常会发生内质网应激。由于肝脏会产生大量的分泌蛋白，加上肝癌细胞快速的增殖能力，提示肝癌细胞需要高度的维持内质网稳态的能力。申请人之前研究已证实，在内质网应激发生时，TRIM25表达上调，并通过调控Keap1-Nrf2信号通路，促进 Nrf2入核，激活其下游抗氧化基因的表达，从而降低细胞内ROS水平，促进肝癌细胞的存活。另外有研究表明，Nrf2在4-6％的HCC中发生突变活化。提示肝细胞癌的发生发展需要较强的抗氧化能力和蛋白质质量控制能力。此外申请人前期的研究结果表明BRU能够通过激活机体免疫从而达到杀伤肝癌细胞的效果。免疫疗法发挥作用依赖于体内较高水平的肿瘤免疫原性，抑制HSP90活性可以促进肿瘤抗原释放，17-AAG作为Hsp90抑制剂之一，但是17-AAG 单独使用的疗效甚微，因此，申请人考虑联合使用BRU药物和17-AAG药物，以提高二者治疗肝细胞癌的治疗效果并缓解产生的耐药性以及敏感度低的问题。

本发明的具体技术方案如下：

本发明第一方面提供鸦胆子苦醇和17-AAG的组合物在制备PD-L1抑制剂中的应用。

本发明第二方面提供鸦胆子苦醇和17-AAG的组合物在制备肿瘤治疗药物中的应用。

本发明第三方面提供鸦胆子苦醇和17-AAG的组合物在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。

上述应用中，所述肿瘤为肝细胞癌。

本发明第四方面提供鸦胆子苦醇在制备17-AAG的抗肿瘤效果增强剂中的应用。

本发明第五方面提供一种肿瘤治疗药物，所述药物包括鸦胆子苦醇和17-AAG。

进一步地，所述药物还包括肿瘤免疫治疗药物和/或化疗药物。

进一步地，所述肿瘤为肝细胞癌。

本发明第六方面提供一种PD-L1抑制剂，所述PD-L1抑制剂包括鸦胆子苦醇和17-AAG。

进一步地，所述PD-L1抑制剂抑制PD-L1的表达。

本发明的有益效果为：

1.本发明首次发现BRU能够协同17-AAG激活机体免疫能力从而在治疗肝细胞癌中发挥作用：使用BRU联合17-AAG治疗后，相较于单独给药组，能够减少肿瘤组织中PD-L1 的表达情况，增加肿瘤细胞的凋亡情况，从而抑制肿瘤生长。

2.本发明揭示BRU能够增强17-AAG的抗肿瘤效果，并提高17-AAG的治疗敏感性。

附图说明

图1为鼠源肝癌细胞Hepa1-6经BRU和17-AAG处理后PD-L1表达情况的流式测定。A图为使用流式细胞术检测PD-L1表达情况；B图为图A中各组荧光值的统计柱状图。呈现的数据代表平均值±SEM，显著性差异的确定采用双侧T检验分析和非参数检验分析。*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001。

图2为黑鼠C57BL/6J肿瘤生长和重量的测定与比较。(A-B)C57BL/6J肿瘤生长的测定。呈现的数据代表平均值±SEM，显著性差异的确定采用双侧T检验分析和非参数检验分析。*, P<0.05；**,P<0.01；n.s,无显著性差异。

图3第一行为肿瘤组织通过免疫组化测定PD-L1表达变化情况，第二行为通过免疫荧光测定Cleaved Caspase-3表达变化情况。

具体实施方式

为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。

实施例1

在体外通过流式细胞术检测BRU、17-AAG以及二者联合使用处理鼠源肝癌细胞Hepa1-6 后，对其PD-L1表达情况的影响。具体操作为：鼠源肝癌细胞Hepa1-6使用12孔板铺板，待细胞密度达到60％时，分别使用IFN-γ(100ng/ml)和BRU(1nM)、17-AAG(0.5μM)、或联用BRU(1nM)和17-AAG(0.5μM)处理24小时后，胰酶消化细胞后PBS清洗1遍，使用一定量PBS重悬后通过流式细胞术检测细胞PD-L1表达情况。IFN-γ用水溶解，BRU、 17-AAG用DMSO溶解。

结果如图1，纵坐标代表细胞数，横坐标代表荧光值，数值越大，代表PD-L1表达水平越高。Control为使用1nM DMSO处理组。Isotype代表空白组，只有细胞，不做任何处理。每一实验组所使用的处理方式如图所示。流式结果表明，相较于单独给药组，BRU和17-AAG 联用能够显著降低肝细胞癌细胞表面PD-L1表达水平。

实施例2

使用鼠源肝癌细胞Hepa1-6(5*10^6)建立黑鼠C57BL/6J皮下肿瘤模型，待肿瘤体积达到100-200mm³后，使用BRU(2mg/kg)，17-AAG(25mg/kg)，以及联合给药(BRU 2 mg/kg+17-AAG 25mg/kg)进行腹腔注射给药，间隔一天给药，依据肿瘤生长情况判断，共给药6次。监测小鼠肿瘤生长情况，间隔一天测量肿瘤体积，最后处死小鼠，取瘤组织称重。取肿瘤组织进行石蜡包埋后切片，通过免疫组化分析肿瘤组织中PD-L1表达情况，并通过免疫荧光测定Cleaved Caspase-3表达变化情况，以探究BRU及17-AAG对肿瘤细胞凋亡情况的影响。

黑鼠C57BL/6J肿瘤生长和重量的测定与比较结果如图2，结果表明，相较于单独给药组， BRU和17-AAG联合给药组，能够显著抑制肿瘤生长。提示BRU能够协同17-AAG发挥其抗肿瘤特性。

PD-L1表达变化情况，Cleaved Caspase-3表达变化情况如图3，结果表明，联合给药组，相较于单独给药组(BRU或17-AAG)，肿瘤组织中PD-L1表达水平明显降低；肿瘤组织细胞凋亡水平明显增加。提示联合给药后，肿瘤组织中机体免疫水平提高。说明BRU能够协同17-AAG提高机体免疫水平杀伤肿瘤细胞。由于抗肿瘤免疫经常伴随着肿瘤组织中的细胞凋亡的发生。本发明检测了肿瘤组织中cleaved caspase-3(CCA3)的表达水平，发现联合处理组中肿瘤细胞的凋亡程度相较于单独给药组显著增加，提示BRU能够协同17-AAG通过抗肿瘤免疫发挥其疗效。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims

1.鸦胆子苦醇和17-AAG的组合物在制备PD-L1抑制剂中的应用。

2.鸦胆子苦醇和17-AAG的组合物在制备肿瘤治疗药物中的应用。

3.鸦胆子苦醇和17-AAG的组合物在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。

4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为肝细胞癌。

5.鸦胆子苦醇在制备17-AAG的抗肿瘤效果增强剂中的应用。

6.一种肿瘤治疗药物，其特征在于，所述药物包括鸦胆子苦醇和17-AAG。

7.根据权利要求6所述的肿瘤治疗药物，其特征在于，所述药物还包括肿瘤免疫治疗药物和/或化疗药物。

8.根据权利要求6所述的肿瘤治疗药物，其特征在于，所述肿瘤为肝细胞癌。

9.一种PD-L1抑制剂，其特征在于，所述PD-L1抑制剂包括鸦胆子苦醇和17-AAG。

10.根据权利要求9所述的PD-L1抑制剂，其特征在于，所述PD-L1抑制剂抑制PD-L1的表达。