CN115462386B - 一种杀菌组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种杀菌组合物及其应用，属于农药技术领域。所述杀菌组合物包括活性组分和增效助剂，所述活性组分包括丙硫唑和噻唑锌，所述增效助剂为丙二醇或聚乙二醇。本发明利用丙硫唑和噻唑锌复配，复配后协同作用明显，对梨火疫病和梨树、苹果树腐烂病病原菌的毒力显著增加，两种不同杀菌机理的复配药剂降低药量使用，减缓了病原菌抗药性的产生，更有利于病害的防治。同时添加增效助剂，降低药剂使用量，延长药剂持效期，改善作物耐受性，对作物更安全。噻唑锌和丙硫唑复配后扩大了防治谱，对细菌和真菌的防治效果均增强，一次施药可以防控两种病害，减少施药次数，对环境更加绿色环保。
Description
技术领域
本发明涉及农药技术领域，具体涉及一种含有活性成分丙硫唑和噻唑锌以及增效助剂的杀菌组合物及其在防治植物细菌和真菌性病害中的应用。
背景技术
腐烂病是梨、苹果等果木的重要病害，在世界各地均有发生，尤其以我国东北、华北和西北等地区危害较重。腐烂病是由真菌引起的病害，梨树腐烂病由梨黑腐皮壳菌(Valsaambiens)侵染引起，苹果腐烂病由苹果黑腐皮壳菌(V.mali)侵染引起，该病主要危害梨、苹果等果木的树干、主枝和侧枝的树皮，常造成树体病疤累累，轻则减产，重则死树甚至毁园，给梨、苹果产业造成严重威胁。
梨火疫病是梨树上最具毁灭性的病害，具有突发性、爆发性和毁灭性的特点，是国际检疫性病害。梨火疫病是由细菌引起的病害，病原菌是欧文氏杆菌(Erwiniaamylovora)，主要侵染危害梨、苹果、山楂、海棠、榅桲等蔷薇科仁果类果树，引起花、嫩枝、果实、叶片、大枝和主干变黑枯萎，犹如火烧一般。近年来，梨火疫病在我国新疆、甘肃等地发生危害，给梨、苹果产业造成严重的损失。
防治梨、苹果腐烂病的主要措施之一是冬季刮除病斑涂上药剂，措施之二是在春季和夏季进行喷药防治。目前有效药剂有：戊唑醇、多菌灵、醚菌酯等，但是这些药剂对梨火疫病无效。针对梨火疫病，国际上普遍使用农用链霉素和春雷霉素等药剂进行防治，但是这些药剂对腐烂病无效，且农用链霉素在国内已禁用，春雷霉素持效期较短，需要多次施药才能起到长期预防，增加了病原菌产生抗药性的风险和果农生产成本。
目前在新疆绝大多数梨、苹果、山楂、海棠、榅桲等果树，腐烂病和火疫病同时严重发生，而在实际生产中，要求果农对这二种病害对症用药有难度，因这二种病害的溃疡斑相似，腐烂病病斑上产生很多孢子角，火疫病病斑上会形成细菌丝，二者容易混淆；另外，腐烂病和火疫病都引起枝条枯死，因此多数果农无法区分这二种病害，往往在防治时没有针对性，张冠李戴，或者盲目的多种药剂混配、增加施药次数，增加了生产成本且污染环境，有的却见效甚微，果农对种植梨、苹果等果树失去信心。因此，开发一种能够同时防治梨、苹果腐烂病和火疫病的药剂是该领域亟需解决的问题。
噻唑锌是一种新型杀菌剂，通过噻唑基团和锌离子对细菌起到杀灭作用，主要用于白菜软腐病、柑橘溃疡病、黄瓜细菌性角斑病、水稻细菌性条斑病等植物细菌病害的防治。专利文献CN 101953346 A公开了一种含噻唑锌的杀菌组合物，专利指出噻唑锌与春雷霉素、硫酸链霉素、代森锰锌、福美双、丙森锌、异菌脲、十三吗啉、甲基硫菌灵、烯唑醇、腈菌唑、氟环唑、苯醚甲环唑、多菌灵、甲霜灵、烯酰吗啉、霜霉威盐酸盐、戊唑醇、氟酰胺、井岗霉素中的任意一种混配有增效作用，应用于防治植物真菌、细菌引起的病害。
丙硫唑，又名丙硫咪唑，是一种具有预防保护、内吸治疗、渗透传导作用的杀菌剂，其主要通过阻断真菌线粒体呼吸链电子传递，从而抑制线粒体的呼吸达到杀菌作用，主要用于水稻稻瘟病、水稻纹枯病、麦类赤霉病等植物真菌病害的防治，对多种细菌和病毒也有较好的防治效果。
目前，未见有研究指出噻唑锌和丙硫唑复配能够同时防治梨树腐烂病和梨火疫病。通过深入研究两种药剂以及增效助剂组合进一步提升防治效果，减少药剂施用，降低生产成本，能够同时防治梨、苹果树腐烂病和梨火疫病是本领域技术人员需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种杀菌组合物，以解决梨、苹果树腐烂病和梨火疫病混合发生时存在防治难度大、用药成本高的问题。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种杀菌组合物，包括活性组分和增效助剂，所述活性组分包括丙硫唑和噻唑锌，所述增效助剂为丙二醇或聚乙二醇。
本发明研究表明，丙硫唑对梨火疫病菌和梨树腐烂病菌均有抑制效果，噻唑锌对抑制梨火疫病菌的持效期较长，两者复配后产生显著协同效果。在上述复配药剂基础上添加助剂丙二醇或聚乙二醇后，防治效果显著提升，药剂持效期显著延长。
进一步的，所述活性组分占杀菌组合物总质量的1％～90％，所述丙硫唑和噻唑锌的质量比为1:0.02～50；所述增效助剂占杀菌组合物总质量的5％～20％。
丙硫唑和噻唑锌对梨火疫病菌有很好的杀灭效果，二者混配后表现出优异的协同增效作用。作为优选，所述丙硫唑和噻唑锌的质量比为1:0.5～20。
更为优选，所述丙硫唑和噻唑锌的质量比为1:7～9。研究结果表明，丙硫唑和噻唑锌按质量比1:7～1:9混配时对梨树腐烂病菌菌丝抑制有协同增效作用。
添加助剂显著提升混配药剂对梨火疫病和梨树腐烂病的防治效果，进一步可降低药剂使用量，作为优选，所述活性组分占组合物总质量的10％～40％。更为优选，所述活性组分占组合物总质量的32％，丙硫唑和噻唑锌的质量比为1:7。
增加助剂用量有助于提升混配药剂的防治效果，作为优选，所述增效助剂占杀菌组合物总质量的10％～15％。在该条件下防效达到80％以上，并且药剂持效期显著延长，施药21天后防效还可达到50％以上。
作为优选，所述增效助剂为1,3-丙二醇或聚乙二醇3350。
所述杀菌组合物还包括农药剂型所需要的辅助成分，所述辅助成分包括但不限于溶剂、助溶剂、乳化剂、湿润剂、分散剂、崩解剂、增稠剂、防冻剂、防腐剂、稳定剂、成膜剂、消泡剂、着色剂、填料渗透剂、pH调节剂中的一种或几种。
所述杀菌组合物可以加工成粉剂、可湿性粉剂、可分散粒剂、悬浮剂、微乳剂、乳油、可溶液剂、糊剂等任意一种农药剂型，优选剂型为悬浮剂。
作为优选，以组合物总质量100份计，所述辅助成分还包括：1～8份脂肪醇聚氧乙烯醚、0.1～0.8份黄原胶、0.5～5份硅酸铝镁、0.5～2份有机硅消泡剂，水补齐杀菌组合物至100份。
更为优选，所述杀菌组合物以总质量100份计，其组成包括：4份丙硫唑、28份噻唑锌、4份脂肪醇聚氧乙烯醚、10份1,3-丙二醇或聚乙二醇3350、0.4份黄原胶、1.5份硅酸铝镁、1份有机硅消泡剂，水补齐至100份。
本发明还提供了所述的杀菌组合物在防治作物细菌和/或真菌性病害中的应用。
本发明将噻唑锌和丙硫唑复配后扩大了防治谱，对细菌和真菌的防治效果均增强，一次施药可以防治两种病害。
进一步的，所述作物为蔷薇科仁果类果树。更进一步，所述果树为梨树、苹果树。
进一步的，所述细菌病害为欧文氏杆菌(Erwinia amylovora)侵染引起的病害；所述真菌病害为梨黑腐皮壳菌(Valsa ambiens)或苹果黑腐皮壳菌(V.mali)侵染引起的病害。
更进一步，所述病害为梨火疫病和/或梨树、苹果树腐烂病。
具体的，所述应用包括：分别于初花期、落花期和夏修后向梨树、苹果树地上部分(包括花、幼果、叶、枝和树干)喷施所述杀菌组合物800-1600倍稀释液。喷施量为每亩地150-200升药液。
与现有技术相比，本发明具有以下优势：
(1)本发明利用丙硫唑和噻唑锌复配，复配后协同作用明显，对梨火疫病和梨树腐烂病病原菌的毒力显著增加，两种不同杀菌机理的复配药剂降低药量使用，减缓了病原菌抗药性的产生，更有利于病害的防治。
(2)本发明添加增效助剂，降低药剂使用量，延长药剂持效期，改善作物耐受性，对作物更安全。
(3)噻唑锌和丙硫唑复配后扩大了防治谱，对细菌和真菌的防治效果均增强，一次施药可以防治两种病害，减少施药次数，对环境更加绿色环保，降低农药残留的风险；降低人工成本，增加果农生产利润。
附图说明
图1为菌株AWT003在PDA培养基上25℃光照培养菌落形态，其中(A)为单孢培养48h；(B)为单孢培养5d；(C)为单孢培养15d。
图2为AWT003致病性试验症状图，其中(A)为在香梨树上接种菌饼10d后症状；(B)为AWT003接种两年生离体香梨枝条症状。
图3为梨火疫病菌菌株XJSZ0102在NA培养基上的单菌落形态图。
图4为菌株XJSZ0102在梨花簇上致病性试验症状图。
图5为菌株XJSZ0102在杜梨嫩枝上致病性试验症状图。
图6为2对引物PCR扩增电泳图，其中(A)为引物AMS3/AMS4c的扩增结果，(B)为引物pEA29A/pEA29B的扩增结果，泳道M为Marker，泳道1为梨火疫病标准菌株ATCC29850，泳道2-6分别为XJSZ01、XJSZ02、XJSZ03、XJSZ04、XJSZ05，泳道7为水，泳道8为空白泳道。
图7为MALDI-TOF质谱鉴定报告。
图8为杀菌组合物在温室盆栽杜梨上测试对梨火疫病防效，(A)图为喷施40％丙硫唑·噻唑锌-15PEG 1000倍液14天时的防效，(B)图为阳性对照组14天时的发病情况。
图9为杀菌组合物在香梨树上测试对梨树腐烂病的防效：(A)和(B)分别为40％丙硫唑·噻唑锌-5PG喷施前及喷施后2个月病斑长度，(C)和(D)分别为40％丙硫唑·噻唑锌-15PG喷施前及喷施后2个月病斑长度。
具体实施方式
为更好的解释本发明的目的、技术方案和优点，下面结合具体实施例进行说明，但本发明并不局限于此。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
一、供试材料：梨树腐烂病菌菌株AWT003，由浙江大学楼兵干教授分离鉴定获得。具体分离纯化、鉴定及致病性试验如下：
1、分离培养鉴定
在新疆巴州阿瓦提农场张宝财家果园的香梨主干上采集具有梨树腐烂病典型症状的样本，将黄色疑似孢子角状物装入EP管带回实验室，用无菌水溶解并10倍梯度稀释。在光学显微镜下观察到典型的梨树腐烂病菌形态为腊肠状分生孢子。
取各梯度稀释液100μL于PDA培养基上涂布均匀，置于25℃光照培养箱培养12h，对每皿只有少于10个萌发孢子的培养物，用灭菌打孔器对单菌落打孔并转移到新的PDA培养基上纯化培养，转接3次，共分离到5个菌株：AWT001、AWT002、AWT003、AWT004、AWT005，均表现出典型的腐烂病菌菌落形态，其中AWT003的菌落形态见图1。培养48h前菌丝白色致密，紧贴培养基生长(图1A)；培养5d菌丝长满培养基，有絮状白色气生菌丝，菌落背面从中心向边缘开始变黄褐色(图1B)；培养15d产生分生孢子器(图1C)。
2、致病性测定
将在PDA培养基上转接培养2d的菌株AWT001、AWT002、AWT003、AWT004和AWT005用打孔器打取菌饼，接种到三年生的香梨树主干。10d后，均表现出典型的腐烂病症状。图2为AWT003致病性试验症状图，以接种点为中心，皱缩塌陷形成椭圆形的溃疡斑，病斑深褐色，病健交界明显(图2A)；离体枝条接种15天后产生黄色的孢子角(图2B)。
3、ITS序列鉴定
供试菌株经PDB液体培养6d后离心收集菌丝，提取基因组DNA，使用正向引物ITS1和反向引物ITS4扩增rDNA的ITS1+5.8s+ITS2片段。引物序列：
ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCG-3’；
ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATAT-3’；
扩增体系为：25μL反应体系：2×PCR反应预混液12.5μL，上游引物(10μmol/L)1μL，下游引物(10μmol/L)1μL，模板2μL，补充超纯水至25μL。
扩增条件为：95℃3min；94℃30s，51℃30s，72℃40s，35个循环；72℃5min；4℃保存。
扩增产物使用1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，凝胶成像系统观察、拍照。PCR扩增片段大小为540bp左右，与设计片段大小一致。
使用胶回收试剂盒回收扩增产物，送测序公司使用ITS1和ITS4引物测序。测序结果如SEQ ID NO.1所示。经NCBI序列比对，与已知的梨黑腐皮壳菌Valsaambiens(GenbankNo：MG879501)相似性达100％，鉴定AWT003为梨黑腐皮壳菌(Valsaambiens)。
二、供试材料：梨火疫病菌菌株XJSZ0102，由浙江大学楼兵干教授分离鉴定获得。具体分离纯化、鉴定及致病性试验如下：
1、分离培养鉴定
采集具有典型梨火疫病症状的样本，制成样品悬浮液，在NA培养基平板上划线分离，菌落白色，较大而凸起，光滑呈透镜状。在25℃恒温培养24h～48h，挑取可疑单菌落进行纯化，转接3次后，挑取单菌落5个，分别记为菌株XJSZ0101、XJSZ0102、XJSZ0103、XJSZ0104、XJSZ0105，其中菌株XJSZ0102在NA培养基上单菌落形态如图3所示，随后进行致病性测定。
2、致病性测定
将上述5个菌株分别在NA培养基上划线，活化培养36hr后，挑取单菌落在NB培养液中培养，置于28℃摇床150rpm振荡培养36hr，制备菌液备用。
2.1直接喷雾接种
选择健康梨花簇，直接喷雾接种，喷至花簇湿润，接种浓度为1×107cfu/mL，每天观察记录发病情况，在接种后5-7天，5个菌株均出现典型梨火疫病症状，其中菌株XJSZ0102侵染后的梨火疫病症状如图4所示。
2.2幼苗针刺接种
选择健康的梨树嫩枝、杜梨苗嫩枝，用灭菌牙签先蘸菌液20微升，再刺接种部位，接种部位离枝条顶端5cm左右，接种浓度为1×107cfu/mL。接种后每天观察记录发病情况，在接种后2-3天，5个菌株均出现典型梨火疫病症状，其中菌株XJSZ0102在杜梨嫩枝上致病性试验症状如图5所示。
3、特异性引物PCR鉴定
3.1PCR引物序列，如表1所示。
表1
3.2PCR反应体系及扩增条件
25μL反应体系：2×PCR反应预混液12.5μL，上游引物(10μmol/L)1μL，下游引物(10μmol/L)1μL，模板2μL，补充超纯水至25μL。
PCR反应程序：95℃3min；94℃30s，52℃30s，72℃1min，35个循环；72℃7min；4℃保存。(引物AMS3/AMS4c)
PCR反应程序：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，35个循环；72℃7min；4℃保存。(引物pEA29A/pEA29B)
3.3琼脂糖凝胶电泳结果
PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳结束后，凝胶成像系统观察、拍照。扩增产物片段大小：引物AMS3/AMS4c的扩增产物为830bp(图6A)；pEA29A/pEA29B为900bp(图6B)，与梨火疫病标准菌株ATCC29850一致。
4、MALDI-TOF质谱鉴定报告如图7所示，经鉴定菌株XJSZ0102为梨火疫病菌(Erwinia amylovora)。
实施例1：丙硫唑和噻唑锌对梨火疫病菌的联合毒力测定
1、供试材料
供试菌株：梨火疫病菌菌株XJSZ0102。
供试药剂：95％噻唑锌原药(浙江新农化工股份有限公司生产)、76.1％丙硫唑原药(贵州道元生物技术有限公司生产)。
2、试验方法
试验方法参照《中华人民共和国农业行业标准NY/T 1156.6-2006》农药室内生物测定试验准则杀菌剂第六部分：混配的联合作用测定，对有效成分丙硫唑：噻唑锌按质量比为1:3、1:5、1:7、1:9、1:11的配比进行混配测定。
1)接种菌液制备
蘸取超低温保存的梨火疫病菌XJSZ0102在NA平板培养基划线培养，置于28℃生化培养箱中培养36～48h。在超净工作台中用灭菌接种环挑取单菌落接种到50mL NB培养基中，置于28℃振荡培养箱中150rpm振荡培养至病菌进入对数生长期。
使用分光光度计在600nm波长下用未接种的空白NB培养基调零，调节菌液OD600至0.4左右，梯度稀释100倍，将其作为接种菌液。
2)药剂配制
噻唑锌原药先用适量二甲亚砜溶解，再用0.1％吐温-80进行稀释母液供试。丙硫唑原药用适量冰醋酸溶解，再用0.1％吐温80进行稀释母液供试。将两种药剂按5种比例混配，每个混配比例稀释成5个梯度浓度。药剂母液剂量设置见表2。
表2供试药剂母液剂量设置
3)药剂处理
在无菌条件下，将预先配制好的药剂母液0.5mL加入装有50mL灭菌NB培养基的锥形瓶中，充分摇匀，得到含药培养基(此时母液浓度将稀释100倍得到预设浓度)。每个含药培养基中加100μL步骤1)制备好的接种菌液，每个药剂处理均做3个重复。用含药不含菌的培养基做组内空白对照，用含菌不含药的培养基做阳性对照，用空白NB培养基做阴性对照。于28℃、150rpm培养至阳性对照进入对数生长期后测定各组浑浊度变化。
4)数据处理
根据测量结果，按公式(1)、(2)计算各药剂处理浓度对梨火疫病菌的生长抑制率，单位为百分率(％)，结果保留两位小数。
T＝T1-T2(1)
式中：
T——浑浊度变化值；
T1——培养结束培养液浊度；
T2——初始培养基浊度。
式中：
I——生长抑制率；
T0——阳性对照浑浊度变化值；
Tt——药剂处理组浑浊度变化值。
用孙云沛法测定其对梨火疫病菌的共毒系数。
孙云沛法：根据共毒系数(CTC)来评价药剂混用的增效作用，即CTC≤80为拮抗作用，80＜CTC＜120为相加作用，CTC≥120为增效作用。共毒系数(CTC)按公式(3)、(4)、(5)计算：
式中：
ATI——混剂实测的毒力指数；
S——标准药剂的EC50，单位为mg/L；
M——混剂的EC50，单位为mg/L。
TTI＝TIA×PA+TIB×PB(4)
式中：
TTI——混剂的理论毒力指数；
TIA——A药剂的毒力指数；
PA——A药剂在混剂中的百分含量，单位为百分率(％)；
TIB——B药剂的毒力指数；
PB——B药剂在混剂中的百分含量，单位为百分率(％)。
5)试验结果
试验结果表明：丙硫唑和噻唑锌对梨火疫病菌有很好的抑制效果，EC50分别为0.021mg/L和9.513mg/L，二者混配后表现为很好的协同增效作用，其中丙硫唑：噻唑锌的质量比为1:7时其增效作用最强。
表3丙硫唑与噻唑锌对梨火疫病菌的联合毒力测定结果
实施例2：丙硫唑和噻唑锌对梨腐烂病菌的联合毒力测定
1、供试材料
供试菌株：梨树腐烂病菌菌株AWT003。
供试药剂：95％噻唑锌原药(浙江新农化工股份有限公司生产)、76.1％丙硫唑原药(贵州道元生物技术有限公司生产)。
2、试验方法
试验方法参照《中华人民共和国农业行业标准NY/T 1156.2-2006》农药室内生物测定试验准则杀菌剂第二部分：抑制病原真菌菌丝生长试验平皿法，对有效成分丙硫唑：噻唑锌按质量比为1:3、1:5、1:7、1:9、1:11的配比进行混配。
1)菌饼的准备
取28℃条件下在PDA培养基上培养2d的梨树腐烂病菌菌株AWT003，用直径6mm的灭菌打孔器在菌落边缘打孔制备成菌饼备用。
2)药剂配制
噻唑锌原药先用适量二甲亚砜溶解，再用0.1％吐温-80进行稀释母液供试。丙硫唑原药用适量冰醋酸溶解，再用0.1％吐温80进行稀释母液供试。将两种药剂按5种比例混配，每个混配比例稀释成5个梯度浓度。药剂母液剂量设置见表4。
表4梨树腐烂病菌毒力测定供试药剂母液剂量设置
3)含药培养基制备
病原真菌培养使用PDA培养基，称200g去皮马铃薯切小块加1000mL纯水小火煮沸20min保留滤液，加20g葡萄糖、15g琼脂，加纯水至1000mL，加热溶解后分装到锥形瓶中，121℃高压蒸汽灭菌20min后冷却至50℃备用。吸取1mL药剂母液到直径为90mm的无菌培养皿中，量取14mLPDA培养基加入培养皿与药剂混合均匀。每个药剂浓度制作3块培养基。
4)接种调查
将制备好的菌饼放置在含药平板中央，同时在不含药的平板中央放置菌饼作为阳性。做好标记，封好皿盖，在28℃条件下培养36h。每个菌落采用十字交叉法测量菌落直径。
5)数据统计分析
根据测量结果，按公式(6)、(7)计算各处理浓度对梨树腐烂病菌的菌丝生长抑制率，单位为百分率(％)，结果保留两位小数。
D＝D1-D2(6)
式中：
D——菌落增长直径；
D1——菌落直径；
D2——菌饼直径。
式中：
I——菌丝生长抑制率；
D0——阳性对照菌落增长直径；
Dt——药剂处理菌落增长直径。
用孙云沛法测定其对梨腐烂病菌的共毒系数，计算公式见公式(3)、(4)、(5)。
6)试验结果
结果表明：丙硫唑和噻唑锌均对梨树腐烂病菌菌丝生长有一定的抑制作用，且丙硫唑抑制作用显著优于噻唑锌。将丙硫唑和噻唑锌按质量比1:7～1:9混配时对梨树腐烂病菌菌丝生长抑制有协同增效作用。
表5丙硫唑与噻唑锌对梨腐烂病菌的联合毒力测定结果
实施例3：添加增效助剂对丙硫唑·噻唑锌混配剂的增效作用(一)
1、供试材料
供试菌株：梨火疫病菌菌株XJSZ0102。
供试苗木：试验用梨树为两年生平茬后长出30cm左右新枝的杜梨苗。
供试药剂：95％噻唑锌原药(浙江新农化工股份有限公司生产)、76.1％丙硫唑原药(贵州道元生物技术有限公司生产)、1,3-丙二醇(美国陶氏)、聚乙二醇3350(美国陶氏)。
2、试验方法
1)制备农药制剂
根据丙二醇含量不同：
(a)按质量比将5份丙硫唑、35份噻唑锌、4份脂肪醇聚氧乙烯醚、5份1,3-丙二醇、0.4份黄原胶、1.5份硅酸铝镁、1份有机硅消泡剂、48.1份蒸馏水混匀，投入高速剪切乳化机中均质20分钟，转移至砂磨机中砂磨50min，经过滤获得40％丙硫唑·噻唑锌混剂-5PG。
(b)按质量比将5份丙硫唑、35份噻唑锌、4份脂肪醇聚氧乙烯醚、10份1,3-丙二醇、0.4份黄原胶、1.5份硅酸铝镁、1份有机硅消泡剂、43.1份蒸馏水混匀，投入高速剪切乳化机中均质20分钟，转移至砂磨机中砂磨50min，经过滤获得40％丙硫唑·噻唑锌混剂-10PG。
(c)按质量比将5份丙硫唑、35份噻唑锌、4份脂肪醇聚氧乙烯醚、15份1,3-丙二醇、0.4份黄原胶、1.5份硅酸铝镁、1份有机硅消泡剂、38.1份蒸馏水混匀，投入高速剪切乳化机中均质20分钟，转移至砂磨机中砂磨50min，经过滤获得40％丙硫唑·噻唑锌混剂-15PG。
根据聚乙二醇含量不同：
(d)按质量比将5份丙硫唑、35份噻唑锌、4份脂肪醇聚氧乙烯醚、5份聚乙二醇3350、0.4份黄原胶、1.5份硅酸铝镁、1份有机硅消泡剂、48.1份蒸馏水混匀，投入高速剪切乳化机中均质20分钟，转移至砂磨机中砂磨50min，经过滤获得40％丙硫唑·噻唑锌混剂-5PEG。
(e)按质量比将5份丙硫唑、35份噻唑锌、4份脂肪醇聚氧乙烯醚、10份聚乙二醇3350、0.4份黄原胶、1.5份硅酸铝镁、1份有机硅消泡剂、43.1份蒸馏水混匀，投入高速剪切乳化机中均质20分钟，转移至砂磨机中砂磨50min，经过滤获得40％丙硫唑·噻唑锌混剂-10PEG。
(f)按质量比将5份丙硫唑、35份噻唑锌、4份脂肪醇聚氧乙烯醚、15份聚乙二醇3350、0.4份黄原胶、1.5份硅酸铝镁、1份有机硅消泡剂、38.1份蒸馏水混匀，投入高速剪切乳化机中均质20分钟，转移至砂磨机中砂磨50min，经过滤获得40％丙硫唑·噻唑锌混剂-15PEG。
(g)按质量比将5份丙硫唑、35份噻唑锌、4份脂肪醇聚氧乙烯醚、0.4份黄原胶、1.5份硅酸铝镁、1份有机硅消泡剂、53.1份蒸馏水混匀，投入高速剪切乳化机中均质20分钟，转移至砂磨机中砂磨50min，经过滤获得40％丙硫唑·噻唑锌混剂-CK。
2)试验处理
试验接菌。选择长势基本一致的杜梨苗分成9组：7个药剂处理组(分别使用上述(a)～(g)制备的药剂处理)、1个阳性对照组和1个阴性对照组，每组3个重复，每个重复10盆苗。药剂处理组和阳性对照组使用109cfu/mL梨火疫病菌液喷雾接种，阴性对照使用清水模拟接种。接种后覆膜保湿48h。药剂组使用对应药剂稀释1000倍液喷施，阳性对照和阴性对照使用清水模拟施药。
3)药效调查
定期观察杜梨苗梨火疫病的发病情况，接种病原菌后14天左右对所有处理和对照的病害发生程度进行调查。根据公式(8)和(9)计算病情指数和治疗效果。分析比较不同药剂在杜梨苗上对梨火疫病的治疗效果。
DI＝(Σ(ni×Li))/(N×Lm)×100(8)
式中：
DI——病情指数；
ni——i病级的枝条数；
Li——i病级数；
N——调查总枝条数；
Lm——最大病级数。
RE＝(DI0-DI1)/DI0×100％(9)
式中：
RE——相对防控效果；
DI0——阳性对照组病情指数；
DI1——药剂组病情指数。
表6盆栽杜梨苗梨火疫病分级标准
| 病级 | 标准 |
| 0 | 无病症 |
| 1 | 感病长度占总枝条长度1/3以下 |
| 3 | 感病长度占总枝条长度1/3-2/3 |
| 5 | 感病长度占总枝条长度2/3以上 |
3、试验结果
试验结果如表7和图8所示，结果表明：丙硫唑和噻唑锌混配后对梨火疫病具有较好防效，添加增效助剂后防效显著提升。聚乙二醇的增效作用略优于丙二醇。
表7丙硫唑·噻唑锌混剂中增效助剂对梨火疫病防效影响
| 试验药剂 | 病情指数 | 治疗效果(％) |
| 40％丙硫唑·噻唑锌-5PG | 9.72±0.85 | 72.86c |
| 40％丙硫唑·噻唑锌-10PG | 8.12±0.43 | 77.33b |
| 40％丙硫唑·噻唑锌-15PG | 6.15±0.78 | 82.83ab |
| 40％丙硫唑·噻唑锌-5PEG | 9.11±0.49 | 74.57bc |
| 40％丙硫唑·噻唑锌-10PEG | 8.53±0.77 | 76.19b |
| 40％丙硫唑·噻唑锌-15PEG | 4.98±1.01 | 86.10a |
| 40％丙硫唑·噻唑锌-CK | 12.18±0.92 | 65.58d |
| 阳性对照 | 35.82±1.38 | —— |
| 阴性对照 | 0.00±0.00 |
注：PG为丙二醇，PEG为聚乙二醇
实施例4：添加增效助剂对丙硫唑·噻唑锌混配剂的增效作用(二)
1、供试材料
供试菌株：梨树腐烂病菌菌株AWT003。
供试苗木：试验用梨树为新疆库尔勒市农业局育苗中心三年生的香梨树。
供试药剂：95％噻唑锌原药(浙江新农化工股份有限公司)、76.1％丙硫唑原药(贵州道元生物技术有限公司)、1,3-丙二醇(美国陶氏)、聚乙二醇3350(美国陶氏)。
2、试验方法
1)农药制剂制备同实施例3。
2)试验处理
选取健康且生长状况基本一致的三年生香梨树分成九组：7个药剂处理组(分别使用上述(a)～(g)制备的药剂处理)、1个阳性对照组和1个阴性对照组，每组3个重复。用解剖刀在主干上切开菌饼大小的树皮(直径5mm)，然后将培养36h打孔制备的腐烂病菌饼贴在切口处，用保鲜膜缠绕固定并保湿24h，使病原菌与寄主建立寄生关系。24小时后揭去菌饼和保鲜膜，并在病斑上下各20公分的范围内涂抹1000倍药液。以清水代替药剂涂抹病斑为阳性对照，以空白培养基模拟接种、清水喷施为阴性对照。2个月后调查病情。
3)病情调查
为了准确分析各处理组对梨腐烂病治疗效果差异，我们通过统计病斑长度，计算防治效果评价各药剂对腐烂病治疗效果的差异性，防治效果的计算公式如下：
3、试验结果
试验结果如表8和图9所示，结果表明：丙硫唑和噻唑锌混配后对梨树腐烂病具有较好防效，添加增效助剂后防效显著上升，且均能达到70％以上防效。
表8丙硫唑·噻唑锌混剂中增效助剂对梨树腐烂病的防效影响
注：PG为丙二醇，PEG为聚乙二醇
实施例5：添加增效助剂对丙硫唑·噻唑锌混配剂的增效作用(三)
1、供试药剂
供试菌株：梨火疫病菌菌株XJSZ0102。
供试苗木：试验用梨树为两年生平茬后长出30cm左右嫩枝的杜梨苗。
供试药剂：95％噻唑锌原药(浙江新农化工股份有限公司)、76.1％丙硫唑原药(贵州道元生物技术有限公司)、1,3-丙二醇(美国陶氏)、聚乙二醇3350(美国陶氏)。
2、试验方法
1)农药制剂制备同实施例3。
2)试验处理
共7组药剂，每组药剂4个处理，分别为1000倍液喷药后1d、7d、14d、21d喷菌，每个处理3组重复，每重复10盆苗，每盆苗约10个嫩枝。同一批处理设置1个喷菌不喷药的阳性对照和不喷菌不喷药阴性对照。
3)药效调查
定期观察杜梨苗的发病情况，接种病原菌后14天左右调查病害发生程度。根据公式(8)和(9)计算病情指数和预防效果。
3、试验结果
试验结果表明：添加增效助剂后制剂的预防效果显著增加，最高可达到80％以上；并且药剂持效期显著延长，部分制剂施药21天后预防效果还可达到50％以上。
表9丙硫唑·噻唑锌混剂中增效助剂对药剂持效期影响
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实施例6：组合物在田间对梨火疫病的防效效果
1、供试材料
供试药剂：95％噻唑锌原药(浙江新农化工股份有限公司)、76.1％丙硫唑原药(贵州道元生物技术有限公司)、1,3-丙二醇(美国陶氏)、聚乙二醇3350(美国陶氏)。
供试果园：位于新疆巴音郭楞蒙古自治州阿瓦提农场四分场张宝财果园，果园面积100亩，2021年3月初本底调查果园梨火疫病株发病率13.85％，发病果树分布较均匀。
2、试验方法
1)农药制剂制备：
(a)按质量比将4份丙硫唑、28份噻唑锌、4份脂肪醇聚氧乙烯醚、10份聚乙二醇3350、0.4份黄原胶、1.5份硅酸铝镁、1份有机硅消泡剂、51.1份蒸馏水混匀，投入高速剪切乳化机中均质20分钟，转移至砂磨机中砂磨50min，经过滤获得32％丙硫唑·噻唑锌混剂-10PEG。
(b)按质量比将4份丙硫唑、28份噻唑锌、4份脂肪醇聚氧乙烯醚、10份1,3-丙二醇、0.4份黄原胶、1.5份硅酸铝镁、1份有机硅消泡剂、51.1份蒸馏水混匀，投入高速剪切乳化机中均质20分钟，转移至砂磨机中砂磨50min，经过滤获得32％丙硫唑·噻唑锌混剂-10PG。
(c)按质量比将4份丙硫唑、28份噻唑锌、4份脂肪醇聚氧乙烯醚、0.4份黄原胶、1.5份硅酸铝镁、1份有机硅消泡剂、61.1份蒸馏水混匀，投入高速剪切乳化机中均质20分钟，转移至砂磨机中砂磨50min，经过滤获得32％丙硫唑·噻唑锌混剂-CK。
(d)按质量比将5份丙硫唑、35份噻唑锌、4份脂肪醇聚氧乙烯醚、0.4份黄原胶、1.5份硅酸铝镁、1份有机硅消泡剂、53.1份蒸馏水混匀，投入高速剪切乳化机中均质20分钟，转移至砂磨机中砂磨50min，经过滤获得40％丙硫唑·噻唑锌混剂-CK。
2)药剂处理
试验园清园：砍除重病株，修剪枯梢，刮除病斑，田间病枝和落叶清除出园集中焚烧。2021年3月15日使用46％氢氧化铜1500倍液清园。
药剂防控：将果园平均分成5个大区，在初花期和落花期分别使用上述(a)-(d)4种制剂1000倍液和清水喷施。喷药装置使用狼山牌迷雾机(容积1.2立方米，南通黄海药械有限公司生产)以牵引拖拉机慢三档速度进行喷施(约200L/亩)。于2021年6月10日调查果园发病情况，记录总调查株数、发病株数、花腐数、果腐数、枯梢数和主干流菌脓数，计算株发病率，根据表10的病级标准计算病情指数和防控效果。
表10梨火疫病田间病级判断标准
| 病级值 | 病级标准 |
| 0级 | 无病症 |
| 1级 | 仅枝梢发病，枯梢、花腐、果腐总计不超过10个 |
| 3级 | 枯梢、花腐、果腐总计超过10个，或大枝发病 |
| 5级 | 主干流菌脓或主干新生枝条发病到主干 |
3)试验结果
试验结果表明：不添加增效助剂，有效成分含量减少显著影响制剂对梨火疫病的田间防效；添加增效助剂后不仅减少农药有效成分用量，还具有更好的防控效果。
表11不同含量有效成分的组合物防控梨火疫病效果
| 药剂处理 | 株发病率(％) | 病情指数 | 防控效果(％) |
| 32％丙硫唑·噻唑锌-10PEG | 4.23 | 0.65 | 78.07 |
| 32％丙硫唑·噻唑锌-10PG | 3.58 | 0.92 | 81.44 |
| 32％丙硫唑·噻唑锌-CK | 8.30 | 1.46 | 56.97 |
| 40％丙硫唑·噻唑锌-CK | 6.19 | 1.24 | 67.88 |
| 清水 | 19.29 | 3.86 | 0.00 |
注：PG为丙二醇，PEG为聚乙二醇
实施例7：组合物对梨火疫病和梨腐烂病兼治效果
1、供试材料
供试药剂：20％噻唑锌(浙江新农化工股份有限公司)，10％丙硫唑(贵州道元生物技术有限公司)，32％丙硫唑·噻唑锌-10PEG(制备方法见实施例6)。
供试果园：位于新疆巴音郭楞蒙古自治州阿瓦提农场四分场张宝财果园，面积78亩。该果园腐烂病和梨火疫病混发，2021年3月初调查该果园病情，梨火疫病株发病率为20.13％，梨腐烂病的株发病率为14.92％。
2、试验方法
试验园清园：砍除重病株，修剪枯梢，刮除病斑，清除病枯枝和落叶,集中焚烧。2021年3月15日使用46％氢氧化铜1500倍液清园。
药剂防控：将试验园随机划分为4个区域，分别使用20％噻唑锌600倍液、10％丙硫唑600倍液、32％丙硫唑·噻唑锌-10PEG1000倍液和清水在果园喷施，喷施时期为2021年4月7日(初花期)和4月25日(落花期)。
调查：2021年6月10日调查果园病情，记录调查总株数，梨火疫病发病株数、腐烂病发病株数，计算梨火疫病株发病率和腐烂病株发病率。
3、试验结果
试验结果表明：20％噻唑锌600倍液对梨火疫病有一定防控效果，但对梨树腐烂病防效甚微，10％丙硫唑600倍液对梨树腐烂病和梨火疫病均有一定防效。将二者混配并添加增效助剂制备的32％丙硫唑·噻唑锌-10PEG1000倍液则对两种病害都有比较理想的防治效果。
表12几种药剂对梨火疫病和梨树腐烂病的兼防效果比较
上述实施例为本发明中选取的效果较优的案例，并不代表本发明的全部。凡在本发明精神和原则内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种杀菌组合物及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 587
<212> DNA
<213> 梨黑腐皮壳菌(Valsa ambiens)
<400> 1
ggagggatca ttgctggaag cgccgcaagg tgcacccaga aaccctttgt gaacttatac 60
ctacatcgtt gcctcggcgc tggctgcccc tcccgccctg ggagggggcc cgcctctggt 120
cgtaaaaacc caggggagga cagcaggccc gccggcggcc caattaactc ttgtatttac 180
tgagtaaaat ctgagtaagc ttctaaatga atcaaaactt tcaacaacgg atctcttggt 240
tctggcatcg atgaagaacg cagcgaaatg cgataagtaa tgtgaattgc agaattcagt 300
gaatcatcga atctttgaac gcacattgcg ccctctggta ttccagaggg catgcctgtt 360
cgagcgtcat ttcaaccctc aagccttgct tggtgttggg gcattacctg agaccgcctc 420
cgggcgggcc gggtaagccc tgaaatttag tggcgagctc gccaggactc cgagcgcagt 480
agtaaaaccc tcgctttgga ctgtactggc gcggccctgc cgtaaaaccc ccaacttctg 540
aaaatttgac ctcggatcag gtaggaatac ccgctgaact taagcat 587
Claims (9)
1.一种杀菌组合物，其特征在于，包括活性组分和增效助剂，所述活性组分包括丙硫咪唑和噻唑锌，所述增效助剂为丙二醇或聚乙二醇，所述活性组分占杀菌组合物总质量的10%~40%，所述杀菌组合物应用于防治梨火疫病病原菌或梨树腐烂病病原菌，丙硫咪唑：噻唑锌的质量比为1：3~11；所述增效助剂占杀菌组合物总质量的5%~15%。
2.如权利要求1所述的杀菌组合物，其特征在于，所述增效助剂占杀菌组合物总质量的10%~15%。
3.如权利要求1所述的杀菌组合物，其特征在于，所述增效助剂为1,3-丙二醇或聚乙二醇3350。
4.如权利要求1所述的杀菌组合物，其特征在于，针对梨树腐烂病病原菌，丙硫咪唑：噻唑锌的质量比为1：7~9。
5.如权利要求1所述的杀菌组合物，其特征在于，还包括农药剂型所需要的辅助成分，所述辅助成分为溶剂、助溶剂、乳化剂、湿润剂、分散剂、崩解剂、增稠剂、防冻剂、防腐剂、稳定剂、成膜剂、消泡剂、着色剂、填料渗透剂、pH调节剂中的一种或几种。
6.如权利要求1所述的杀菌组合物，其特征在于，所述杀菌组合物剂型为粉剂、可湿性粉剂、可分散粒剂、悬浮剂、微乳剂、乳油、可溶液剂或糊剂。
7.如权利要求1~6任一项所述的杀菌组合物在防治作物细菌和/或真菌性病害中的应用，其特征在于，所述细菌病害为欧文氏杆菌(Erwinia amylovora)侵染引起的病害；所述真菌病害为梨黑腐皮壳菌(Valsa ambiens)或苹果黑腐皮壳菌(V.mali)侵染引起的病害。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述病害为梨火疫病和/或梨树、苹果树腐烂病。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用包括：分别于初花期、落花期和夏修后向梨树、苹果树地上部分喷施所述杀菌组合物800-1600倍稀释液，喷施量为每亩地150-200升药液。
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