CN115449544A - 一种人脑胶质瘤的血液检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种人脑胶质瘤的血液检测方法，通过先将外周静脉血经离心分离得到净化的血浆，再从净化的血浆中提取游离DNA并打断为碱基对片段，经末端修复、连接接头处理后，靶向性捕获含有羟甲基化胞嘧啶的DNA片段，经文库扩增、质检后进行上机测序后，基于主成分弹性网状模型进行数据处理，得到检测结果。本发明通过血浆游离DNA羟甲基化特征的低深度检测达到诊断脑胶质瘤的目的，极大拓宽了检测血液中脑胶质瘤特异性标志物的范围，通过较低深度的测序就能够达到较高的敏感性和特异性，成本低。同时通过主成分弹性网状模型建立人工智能诊断系统高效处理检测数据，产生具有直接临床意义的检测结果。

Description

一种人脑胶质瘤的血液检测方法

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种人脑胶质瘤的血液检测方法。

背景技术

脑胶质瘤是最常见的人类中枢神经系统恶性肿瘤。目前胶质瘤的诊断方法主要是核磁共振，需要患者前往大医院预约检查，并且影像的判读也需要经验丰富的医师，因此目前胶质瘤的筛查和诊断过程对于患者依然存在诸多不便。由于胶质瘤早期症状不显著，往往直到肿瘤侵犯功能神经通路或者产生癫痫，造成患者偏瘫、抽搐才能引发患者警觉从而就诊检查。

脑胶质瘤中约半数患者为高度恶性的胶质母细胞瘤，这类患者即使经过手术、放疗、化疗等多学科综合治疗，死亡率居高不下，中位生存时间仅为14-16个月。而另一部分患者为恶性程度较低的异柠檬酸脱氢酶(Isocitrate Dehydrogenases，IDH)基因突变型，经过综合治疗后，5年生存率超过80％。由于这两类胶质瘤缺乏影像特征和临床现的差异，目前临床上只能在手术后对于胶质瘤的IDH分型进行检测，而不能在术前预判，因而胶质瘤的手术治疗只能遵循“一刀切”式的最大范围安全切除，难以因病施治。

通过测序或是PCR检测血液中循环肿瘤DNA的方法目前已经可以实现肝癌、肠癌等多种肿瘤的筛查和诊断。这类方法只需要抽取少量的静脉血，通过标准化检测和分析流程即可产生明确的检测结果，操作简单方便，对于肿瘤的早诊早治和个体化精准诊疗起到了重要的推动作用，这类方法的一般步骤是：(1)将患者静脉血收集到含有EDTA的抗凝采血管；(2)通过低速离心去除血细胞，再通过高速离心去除细胞碎片，得到无细胞血浆；(3)通过游离DNA提取试剂盒提取血浆中的游离DNA；(4)通过超声或者片段化酶将游离DNA分解为200-600碱基对的片段；(5)在此基础上，通过数字PCR检测特定基因组位点上面的特定突变，或者是扩增特定基因组区域的DNA片段，再通过高深度(1000-10000X，即同一位点检测1000-10000条DNA片段)的二代测序检测这些区域上面的突变。

然而，将上述方法用于胶质瘤的诊断，存在以下几个方面的问题：一、对于胶质瘤诊断的敏感性低，常常无法在血液中检测到脑胶质瘤的循环肿瘤DNA；二、对于脑胶质瘤诊断的特异性低，需要事先明确疾病对象的特异性突变标志才能设计相应的检测位点。不同脑胶质瘤患者间突变位点一致性极低，缺乏脑胶质瘤的特异性突变标志，因此，上述方法难以实现对于脑胶质瘤的特异性检测。三、利用上述方法产生的肿瘤循环DNA结果实质是血液游离DNA中存在的可能与肿瘤相关的突变，需要专业医师解读才能得出具有明确的临床诊断；四、上述方法基于的二代测序技术需要极高的测序深度(1000-10000X，即同一位点检测1000-10000条DNA片段)才能检测到频率较低的突变信号，因此检测成本居高不下。同时为了避免高深度测序造成的偏倚，需要在建库过程中采用UMI标签，进一步推高了检测成本。

发明内容

为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种成本低、敏感性好、特异性高的人脑胶质瘤的血液检测方法。本发明通过血浆游离DNA羟甲基化特征的低深度检测达到诊断脑胶质瘤的目的。本发明所采用的方法极大的拓宽了检测血液中脑胶质瘤特异性标志物的范围，同时不需要预设检测目标，因此通过较低深度(数据量仅为现有检测技术的10％)的测序就能够达到较高的敏感性和特异性。通过大规模混样可以摊薄检测所需的试剂和耗材成本。同时通过主成分弹性网状模型建立人工智能诊断系统高效处理检测数据，产生具有直接临床意义的检测结果。

本发明所采用的技术方案为：

一种人脑胶质瘤的血液检测方法，包括如下步骤：

(1)采集检测对象外周静脉血，得到血液样本；

(2)将步骤(1)所述血液样本进行离心分离，得到净化的血浆；

(3)从净化的血浆中提取游离DNA；

(4)将游离DNA打断为碱基对片段；

(5)对所述碱基对片段进行末端修复，连接含样本识别序列的接头，得到DNA连接产物；

(6)对步骤(5)所得DNA连接产物进行处理，靶向性捕获含有羟甲基化胞嘧啶的DNA片段；

(7)对捕获的DNA片段进行文库扩增、质检；

(8)对通过质检的文库进行上机测序；

(9)数据下机后，通过基于主成分弹性网状模型进行数据处理，得到检测结果。

本发明通过血浆游离DNA羟甲基化特征的低深度检测达到诊断脑胶质瘤的目的。这是由于本申请发明人在长期研究中发现不同的脑胶质瘤虽然基因组特变特征千差万别，但是基因组的表观修饰特征可稳定的按照良性和恶性分为两类，并与其他肿瘤具有明显的差别，具有极高的特异性。另外，脑以及神经上皮来源的胶质肿瘤是人体中基因组羟甲基化修饰最丰富的组织，羟甲基化测序一方面可检测脑胶质瘤来源的信号，另一方面可以检测受到肿瘤影像的脑胶质瘤来源的信号，因此羟甲基化测序特别适合用于脑胶质瘤的检测。进一步，本申请发明人经过大量创造性劳动发现，使用主成分弹性网状模型建立人工智能诊断系统，能够有效利用游离DNA羟甲基化信号诊断脑胶质瘤及其良恶性分型。

步骤(1)中，所述血液样本的采集对象包括至少50例IDH突变型脑胶质瘤患者、至少50例IDH野生型脑胶质瘤患者和至少100例健康志愿者或非胶质瘤病患。

步骤(2)中，所述离心分离的具体操作为：

a、将所述血液样本预冷至4℃；

b、在4℃、1600g条件下进行第一次离心10分钟，分离得到血浆层；

c、将步骤b所得血浆层在4℃、16000g条件下进行第二次离心10分钟，分离上层血浆，即得净化的血浆。

当采用EDTA抗凝采血管采集所述血液样本时，2小时内进行所述离心分离；

室温下，当采用Streck采血管采集所述血液样本时，72小时内进行所述离心分离。

步骤(3)中，采用游离DNA提取试剂盒从净化的血浆中提取游离DNA；

步骤(4)中，所述碱基对片段为200-600碱基对片段。

步骤(5)中的具体操作为：

S1、使用Vazyme DNA建库试剂盒，在PCR管里加入10ng打断后的DNA样本溶液、15μL的End-prep预混试剂、5μL lambda噬菌体DNA，再用无核酸酶纯净水将反应体系补齐到50μL，在室温下孵育30分钟，然后在65℃孵育15分钟；

S2、向步骤S1所得反应体系中加入25μL的连接缓冲液，2.5μL的DNA连接酶、1μL的接头，再用无核酸酶纯净水将反应体系补齐到100μL，在20℃孵育15分钟，转移到冰上；

S3、用20μL的无核酸酶纯净水进行洗脱，得到DNA连接产物。

步骤(6)中的具体操作为：

SS1、首先用β-葡萄糖基转移酶和尿苷二磷酸-6-叠氮-葡萄糖处理使5-羟甲基胞嘧啶结合叠氮-葡萄糖基团；具体为：

1uL T4-β-葡萄糖转移酶、0.5uL的10×尿苷二磷酸-6-叠氮-葡萄糖、2.5μL10×Epi缓冲液(T4-β-葡萄糖转移酶配套试剂)和21μL步骤(5)所得DNA连接产物，将混合液在37℃孵育2小时；

SS2、用二硫化-二苯基环辛炔-生物素使叠氮-葡萄糖-5-羟甲基胞嘧啶结合生物素形成生物素-叠氮-葡萄糖-5-羟甲基胞嘧啶；具体为：

向步骤SS1所得反应体系中加入2.5μL的二苯基环辛炔-四聚乙二醇-生物素，在37℃孵育2小时；

之后向反应体系中加入10μg的鲑鱼精子DNA，使用Bio-Rad的Micro Bio-spin 30column净化DNA，得到纯化的标记DNA样本，定容至50μL；

SS3、使用链霉亲和素磁珠捕获携带生物素的DNA片段；具体为：

将步骤SS2所得纯化的标记DNA样本与磁珠悬液混合，旋转混匀30分钟；

其中，所述磁珠悬液采用如下方法制备得到：

取出5μL的链霉素亲和素免疫磁珠吹打均匀后置于磁场，待澄清后吸除上清液，加50μL的2×缓冲液1，移除磁场，在旋转架上孵育3分钟后，置于磁场吸除上清液，再加50μL的2×缓冲液1吹打均匀重悬磁珠，移除磁场；所述缓冲液1的组成为：1M pH7.5 Tris，0.5MEDTA，5M NaCl，0.1％聚山梨醇酯-20。

SS4、缓冲液多次洗涤磁珠，洗脱掉未结合磁珠的不含羟甲基化胞嘧啶的DNA片段，实现含有羟甲基化胞嘧啶的DNA片段的靶向性捕获；具体为：

依次采用100μL的1×稀释的缓冲液1(1M pH7.5 Tris，0.5M EDTA，5M NaCl，0.1％聚山梨醇酯-20)、缓冲液2、缓冲液3、缓冲液4与磁珠旋转混匀5分钟，每种缓冲液洗涤磁珠两次，每次5分钟。缓冲液2、缓冲液3、缓冲液4分别为缓冲液1的1/2、1/10、1/100稀释液。

步骤(7)中，所述文库扩增的具体操作为：

将25μL的VAHTS HiFi Amplication Mix，2μL的PCR Primer Mix 3 for Illumina以及23μL的无核酸酶纯净水加入到上述洗涤的磁珠中，根据以下参数设置PCR扩增：

Ⅰ、98℃，140秒；

Ⅱ、60℃，30秒，72℃，30秒，循环11次；

Ⅲ、72℃，1分钟；

Ⅳ、保持4℃；

Ⅴ、使用AmpureXP beads纯化扩增产物；

所述质检的具体操作为：用Qubit测定产物浓度，用LabChip GX Touch检测DNA片段大小，产物总量不应低于1ng，DNA片段大小峰值应处于160bp左右，并集中分布于100-300bp范围内。

步骤(9)中，所述数据处理的具体操作为：

(A)对于每个样本，将上机测序所得到的DNA片段切除接头序列后，比对到hg19人类基因组序列；

(B)计数比对到基因组上各个基因上的DNA片段数量，通过除以测序的总DNA片段数目和基因的长度得到所述样本各个基因的羟甲基化胞嘧啶修饰水平log₂(每千碱基对每百万片段数)矩阵(logFPKM)；

(C)以检测得到的50例IDH突变型胶质瘤患者的样本、50例IDH野生型脑胶质瘤患者的样本、100例健康志愿者或非胶质瘤病患对照样本的全基因组羟甲基化胞嘧啶修饰水平数据为基准数据，进行以下操作：

i.筛选IDH突变型胶质瘤患者的样本数据与IDH野生型脑胶质瘤患者的样本数据之间、胶质瘤患者的样本数据与健康志愿者或非胶质瘤病患对照样本之间的羟甲基化胞嘧啶修饰水平存在差异的基因；

ii.求各差异基因羟甲基化胞嘧啶修饰水平的基准中值、极值，然后对各基因羟甲基化胞嘧啶修饰水平进行减中值、除以极值差的变换；

iii.对于变换后的矩阵进行主成分分析，取可解释95％样本间差异的主成分，得到基准主成分变换矩阵；

iv.使用主成分变换后的基准数据分别训练区分胶质瘤与非胶质瘤以及IDH突变型胶质瘤与IDH野生型胶质瘤的基准弹性网状模型；训练的参数组合采用：α＝{0,0.01,0.05,0.1,0.2,0.5,0.8,1}，λ＝{0,0.01,0.05,0.1,0.2,0.5}，训练过程采用3次10等分重复交叉验证；

(D)产生检测结果：

对于一个新的待诊断样本，通过上述基准中值、极值、主成分变换得到主成分变换的基因的羟甲基化胞嘧啶修饰水平矩阵数据；

将变换后基因的羟甲基化胞嘧啶修饰水平矩阵数据，代入上述基准模型，即得受检者患脑胶质瘤的概率以及受检者所患胶质瘤为恶性胶质母细胞瘤的概率。

本发明的有益效果为：

本发明所述的人脑胶质瘤的血液检测方法，通过先采集检测对象的外周静脉血，经离心分离得到净化的血浆，再从净化的血浆中提取游离DNA并打断为碱基对片段，经末端修复、连接接头处理后，靶向性捕获含有羟甲基化胞嘧啶的DNA片段，经文库扩增、质检后进行上机测序，数据下机后，基于主成分弹性网状模型进行数据处理，得到检测结果。本发明通过血浆游离DNA羟甲基化特征的低深度检测达到诊断脑胶质瘤的目的。本发明所采用的方法极大的拓宽了检测血液中脑胶质瘤特异性标志物的范围，同时不需要预设检测目标，因此通过较低深度的测序就能够达到较高的敏感性和特异性。通过大规模混样可以摊薄检测所需的试剂和耗材成本。同时通过主成分弹性网状模型建立人工智能诊断系统高效处理检测数据，产生具有直接临床意义的检测结果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明检测方法的示意图；

图2为本发明检测方法的分析流程及检测效果图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

实施例1

本实施例提供一种人脑胶质瘤的血液检测方法，如图1和图2所示，包括如下步骤：

(1)采集检测对象外周静脉血，得到血液样本；具体操作为：

通过肘正中静脉分别采集74例IDH突变型脑胶质瘤患者、69例IDH野生型脑胶质瘤患者、189例健康志愿者或非胶质瘤病患的外周静脉血8-10mL；

(2)室温下，步骤(1)所述血液样本采用EDTA抗凝采血管采集，2小时内进行离心分离，得到净化的血浆；具体操作为：

a、将所述血液样本预冷至4℃；b、在4℃、1600g条件下进行第一次离心10分钟，分离得到血浆层；c、将步骤b所得血浆层在4℃、16000g条件下进行第二次离心10分钟，分离上层血浆，即得净化的血浆；

(3)采用游离DNA提取试剂盒从净化的血浆中提取10ng游离DNA；理论上，可以采用任何提取血浆的cfDNA的方法进行；

(4)使用超声DNA打断仪将游离DNA打断为200-600碱基对片段；

(5)对所述碱基对片段进行末端修复，连接含样本识别序列的接头，得到DNA连接产物；具体操作为：

S1、使用Vazyme DNA建库试剂盒，在PCR管里加入10ng打断为碱基对片段的DNA样本溶液、15μL的End-prep预混试剂、5μL lambda噬菌体DNA，再用无核酸酶纯净水将反应体系补齐到50μL，在室温下孵育30分钟，然后在65℃孵育15分钟；S2、向步骤S1所得反应体系中加入25μL的连接缓冲液，2.5μL的DNA连接酶、1μL的接头，再用无核酸酶纯净水将反应体系补齐到100μL，在20℃孵育15分钟，转移到冰上；S3、用20μL的无核酸酶纯净水进行洗脱，得到DNA连接产物；

(6)对步骤(5)所得DNA连接产物进行处理，靶向性捕获含有羟甲基化胞嘧啶的DNA片段；具体操作为：

SS1、混合1uL T4-β-葡萄糖转移酶、0.5uL的10×尿苷二磷酸-6-叠氮-葡萄糖、2.5μL 10×Epi缓冲液(T4-β-葡萄糖转移酶配套试剂)和21μL步骤(5)所得DNA连接产物，将混合液在37℃孵育2小时；使所述DNA连接产物中的5-羟甲基胞嘧啶结合叠氮-葡萄糖基团；

SS2、向步骤SS1所得反应体系中加入2.5μL的二苯基环辛炔-四聚乙二醇-生物素，在37℃孵育2小时；之后向反应体系中加入10μg的鲑鱼精子DNA，使用Bio-Rad的Micro Bio-spin 30 column净化DNA，形成生物素-叠氮-葡萄糖-5-羟甲基胞嘧啶，即得纯化的标记DNA样本，定容至50μL；

SS3、将步骤SS2所得纯化的标记DNA样本与与链霉亲和素磁珠悬液混合，旋转混匀30分钟，利用链霉亲和素磁珠捕获携带生物素的DNA片段；其中，所述磁珠悬液采用如下方法制备得到：取出5μL的链霉素亲和素免疫磁珠吹打均匀后置于磁场，待澄清后吸除上清液，加50μL的2×缓冲液1(所述缓冲液1的组成为：1M pH7.5 Tris，0.5M EDTA，5M NaCl，吐温20)，移除磁场，在旋转架上孵育3分钟后，置于磁场吸除上清液，再加50μL的2×缓冲液1吹打均匀重悬磁珠，移除磁场；

SS4、依次采用100μL的1×稀释的缓冲液1、缓冲液2、缓冲液3、缓冲液4与磁珠旋转混匀5分钟，每种缓冲液洗涤磁珠两次，每次5分钟，以洗脱掉未结合磁珠的不含羟甲基化胞嘧啶的DNA片段，实现含有羟甲基化胞嘧啶的DNA片段的靶向性捕获；缓冲液2、缓冲液3、缓冲液4分别为缓冲液1的1/2、1/10、1/100稀释液；

(7)对捕获的DNA片段进行文库扩增、质检；

所述文库扩增的具体操作为：将25μL的VAHTS HiFi Amplication Mix，2μL的PCRPrimer Mix 3 for Illumina以及23μL的无核酸酶纯净水加入到上述洗涤的磁珠中，根据以下参数设置PCR扩增：

Ⅰ、98℃，140秒；

Ⅱ、60℃，30秒，72℃，30秒，循环11次；

Ⅲ、72℃，1分钟；

Ⅳ、保持4℃；

Ⅴ、使用AmpureXP beads纯化扩增产物；

所述质检的具体操作为：用Qubit测定产物浓度，用LabChip GX Touch检测DNA片段大小，产物总量不应低于1ng，DNA片段大小峰值应处于160bp左右，并集中分布于100-300bp范围内；

(8)对通过质检的文库进行上机测序，测序数据量为每样本6G碱基对；通过质检的测序文库可用于高通量测序，按相同浓度混样后，根据二代测序的标准方法进行测序；

(9)数据下机后，通过基于主成分弹性网状模型进行数据处理，得到检测结果；具体操作为：

所述数据处理的具体操作为：

(A)对于每个样本，将上机测序所得到的DNA片段切除接头序列后，比对到hg19人类基因组序列；

(B)计数比对到基因组上各个基因上的DNA片段数量，通过除以测序的总DNA片段数目和基因的长度得到所述样本各个基因的羟甲基化胞嘧啶修饰水平log₂(每千碱基对每百万片段数)矩阵(logFPKM)；

(C)以检测得到的74例IDH突变型胶质瘤患者的样本、50例IDH野生型脑胶质瘤患者的样本、69例健康志愿者或非胶质瘤病患对照样本的全基因组羟甲基化胞嘧啶修饰logFPKM数据为基准数据，进行以下操作：

i.筛选IDH突变型胶质瘤患者的样本数据与IDH野生型脑胶质瘤患者的样本数据之间、胶质瘤患者的样本数据与健康志愿者或非胶质瘤病患对照样本之间的羟甲基化胞嘧啶修饰水平存在差异的基因，分别得到652个(基因集2)和7734个基因(基因集1)在两型脑胶质瘤患者样本之间，及脑胶质瘤样本和对照样本之间的存在显著的羟甲基化胞嘧啶修饰水平差异(Benjamini-Hochberg法校正后p值<0.05)；

ii.求各差异基因羟甲基化胞嘧啶修饰水平的基准中值、极值，然后对各基因羟甲基化胞嘧啶修饰水平进行减中值、除以极值差的变换，其中胶质瘤和非胶质瘤对照样本的差异基因的中值组定为中值1，极值差组为极值差1；两型脑胶质瘤差异羟甲基化修饰的基因的中值组定为中值2，极值差组为极值差2；

iii.对于变换后的矩阵进行主成分分析，取可解释95％样本间差异的主成分，得到基准主成分变换矩阵，其中胶质瘤和非胶质瘤对照样本的差异基因可变换为239个主成分(主成分矩阵1)，两型脑胶质瘤差异羟甲基化修饰的基因可变换为66个主成分(主成分矩阵2)；

iv.使用主成分变换后的基准数据分别训练区分胶质瘤与非胶质瘤(模型1)以及IDH突变型胶质瘤与IDH野生型胶质瘤的基准弹性网状模型(模型2)；训练的参数组合采用：α＝{0,0.01,0.05,0.1,0.2,0.5,0.8,1}，λ＝{0,0.01,0.05,0.1,0.2,0.5}，训练过程采用3次10等分重复交叉验证；

(D)产生检测结果：

按照上述实验流程，收集19例IDH突变型脑胶质瘤患者、18例IDH野生型脑胶质瘤患者、47例健康志愿者或非胶质瘤病患的外周静脉血作为检验方法诊断效能的待诊断样本。对于待诊断样本，通过上述检测方法得到所有基因的羟甲基化胞嘧啶修饰水平数据。基准中值、极值、主成分变换得到主成分变换的logFPKM矩阵；

将该矩阵中基因集1的值减去中值组1，除以机制差组1，与主成分矩阵1作叉乘，并代入到模型1，可得到各样本对应患者是否患脑胶质瘤的概率。如图2所示，在本实施例中，本方法对于本组待诊断样本是否患脑胶质瘤进行判断的接受者操作特征曲线下面积为0.962，准确率为0.881，敏感性为0.892，特异性为0.913；

将拟诊断脑胶质瘤的患者的logFPKM矩阵中基因集2的值减去中值组2，除以机制差组2，与主成分矩阵2作叉乘，代入到模型2，可得到各样本对应患者为IDH突变型或野生型脑胶质瘤的概率。如图2所示，在本实施例中，本方法对于本组待诊断样本脑胶质瘤分型进行判断的接受者操作特征曲线下面积为0.816，准确率为0.838，敏感性为0.842，特异性为0.778。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种人脑胶质瘤的血液检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)采集检测对象外周静脉血，得到血液样本；

(2)将步骤(1)所述血液样本进行离心分离，得到净化的血浆；

(3)从净化的血浆中提取游离DNA；

(4)将游离DNA打断为碱基对片段；

(5)对所述碱基对片段进行末端修复，连接含样本识别序列的接头，得到DNA连接产物；

(6)对步骤(5)所得DNA连接产物进行处理，靶向性捕获含有羟甲基化胞嘧啶的DNA片段；

(7)对捕获的DNA片段进行文库扩增、质检；

(8)对通过质检的文库进行上机测序；

(9)数据下机后，通过基于主成分弹性网状模型进行数据处理，得到检测结果。

2.根据权利要求1所述的人脑胶质瘤的血液检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述血液样本的采集对象包括至少50例IDH突变型脑胶质瘤患者、至少50例IDH野生型脑胶质瘤患者和至少100例健康志愿者或非胶质瘤病患。

3.根据权利要求1所述的人脑胶质瘤的血液检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述离心分离的具体操作为：

a、将所述血液样本预冷至4℃；

b、在4℃、1600g条件下进行第一次离心10分钟，分离得到血浆层；

c、将步骤b所得血浆层在4℃、16000g条件下进行第二次离心10分钟，分离上层血浆，即得净化的血浆。

4.根据权利要求1所述的人脑胶质瘤的血液检测方法，其特征在于，室温下，当采用EDTA抗凝采血管采集所述血液样本时，2小时内进行所述离心分离；

室温下，当采用Streck采血管采集所述血液样本时，72小时内进行所述离心分离。

5.根据权利要求1所述的人脑胶质瘤的血液检测方法，其特征在于，步骤(3)中，采用游离DNA提取试剂盒从净化的血浆中提取游离DNA；

步骤(4)中，所述碱基对片段为200-600碱基对片段。

6.根据权利要求1所述的人脑胶质瘤的血液检测方法，其特征在于，步骤(5)中的具体操作为：

S1、使用Vazyme DNA建库试剂盒，在PCR管里加入10ng打断后的DNA样本溶液、15μL的End-prep预混试剂、5μL lambda噬菌体DNA，再用无核酸酶纯净水将反应体系补齐到50μL，在室温下孵育30分钟，然后在65℃孵育15分钟；

S2、向步骤S1所得反应体系中加入25μL的连接缓冲液，2.5μL的DNA连接酶、1μL的接头，再用无核酸酶纯净水将反应体系补齐到100μL，在20℃孵育15分钟，转移到冰上；

S3、用20μL的无核酸酶纯净水进行洗脱，得到DNA连接产物。

7.根据权利要求6所述的人脑胶质瘤的血液检测方法，其特征在于，步骤(6)中的具体操作为：

SS1、向步骤(5)所得DNA连接产物加入β-葡萄糖基转移酶和尿苷二磷酸-6-叠氮-葡萄糖，使所述DNA连接产物中的5-羟甲基胞嘧啶结合叠氮-葡萄糖基团；

SS2、向步骤SS1所得反应体系中加入二苯基环辛炔-四聚乙二醇-生物素，使叠氮-葡萄糖-5-羟甲基胞嘧啶结合生物素，形成生物素-叠氮-葡萄糖-5-羟甲基胞嘧啶，即得纯化的标记DNA样本；

SS3、将步骤SS2所得纯化的标记DNA样本与链霉亲和素磁珠悬液混合，利用链霉亲和素磁珠捕获携带生物素的DNA片段；

SS4、采用缓冲液多次洗涤磁珠，以洗脱掉未结合磁珠的不含羟甲基化胞嘧啶的DNA片段，实现含有羟甲基化胞嘧啶的DNA片段的靶向性捕获。

8.根据权利要求7所述的人脑胶质瘤的血液检测方法，其特征在于，步骤(SS3)中，所述链霉亲和素磁珠悬液采用如下方法制备得到：

取出5μL的链霉素亲和素免疫磁珠吹打均匀后置于磁场，待澄清后吸除上清液，加50μL的2×缓冲液1，移除磁场，在旋转架上孵育3分钟后，置于磁场吸除上清液，再加50μL的2×缓冲液1吹打均匀重悬磁珠，移除磁场；

所述缓冲液1的组成为：1M pH7.5 Tris，0.5M EDTA，5M NaCl，0.1％聚山梨醇酯-20。

9.根据权利要求7或8所述的人脑胶质瘤的血液检测方法，其特征在于，步骤(7)中，所述文库扩增的具体操作为：

将25μL的VAHTS HiFi Amplication Mix，2μL的PCR Primer Mix 3for Illumina以及23μL的无核酸酶纯净水加入到上述洗涤的磁珠中，根据以下参数设置PCR扩增：

Ⅰ、98℃，140秒；

Ⅱ、60℃，30秒，72℃，30秒，循环11次；

Ⅲ、72℃，1分钟；

Ⅳ、保持4℃；

Ⅴ、使用AmpureXP beads纯化扩增产物；

所述质检的具体操作为：用Qubit测定产物浓度，用LabChip GX Touch检测DNA片段大小，产物总量不低于1ng，DNA片段大小峰值应处于160bp左右，并集中分布于100-300bp范围内。

10.根据权利要求1所述的人脑胶质瘤的血液检测方法，其特征在于，步骤(9)中，所述数据处理的具体操作为：

(A)对于每个样本，将上机测序所得到的DNA片段切除接头序列后，比对到hg19人类基因组序列；

(B)计数比对到基因组上各个基因上的DNA片段数量，通过除以测序的总DNA片段数目和基因的长度得到所述样本各个基因的羟甲基化胞嘧啶修饰水平log₂(每千碱基对每百万片段数)矩阵(logFPKM)；

(C)以检测得到的至少50例IDH突变型胶质瘤患者的样本、至少50例IDH野生型脑胶质瘤患者的样本、至少100例健康志愿者或非胶质瘤病患对照样本的全基因组羟甲基化胞嘧啶修饰logFPKM数据为基准数据，进行以下操作：

i.筛选IDH突变型胶质瘤患者的样本数据与IDH野生型脑胶质瘤患者的样本数据之间、胶质瘤患者的样本数据与健康志愿者或非胶质瘤病患对照样本之间的羟甲基化胞嘧啶修饰水平存在差异的基因；

ii.求各差异基因羟甲基化胞嘧啶修饰水平的基准中值、极值，然后对各基因羟甲基化胞嘧啶修饰水平进行减中值、除以极值差的变换；

iii.对于变换后的矩阵进行主成分分析，取可解释95％样本间差异的主成分，得到基准主成分变换矩阵；

iv.使用主成分变换后的基准数据分别训练区分胶质瘤与非胶质瘤以及IDH突变型胶质瘤与IDH野生型胶质瘤的基准弹性网状模型；训练的参数组合采用：α＝{0,0.01,0.05,0.1,0.2,0.5,0.8,1}，λ＝{0,0.01,0.05,0.1,0.2,0.5}，训练过程采用3次10等分重复交叉验证；

(D)产生检测结果：

对于一个新的待诊断样本，通过上述基准中值、极值、主成分变换得到主成分变换的基因的羟甲基化胞嘧啶修饰水平矩阵数据；

将变换后基因的羟甲基化胞嘧啶修饰水平矩阵数据，代入上述基准模型，即得受检者患脑胶质瘤的概率以及受检者所患胶质瘤为恶性胶质母细胞瘤的概率。

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