CN115436523A - 咪达唑仑血药浓度检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种咪达唑仑血药浓度检测方法，采用二维液相色谱仪系统，包括以下步骤：S1制备溶液，溶液包括空白血清溶液、标准溶液、系统适用性溶液和供试品溶液；S2设置色谱参数，一维柱色谱条件的参数为：填充剂为亲水性的固相萃取柱；一维洗脱液包括甲醇和水，一维洗脱方式为梯度洗脱；二维柱色谱条件的参数为：二维柱是色谱柱，二维洗脱液包括乙腈和水，二维洗脱方式为等度洗脱；S3实施检测，将标准溶液和供试品溶液注入二维液相色谱仪系统并记录典型谱图；S4定量分析，绘制咪达唑仑的标准曲线，计算得到供试品溶液中咪达唑仑的含量。本发明具有操作简单、专属性强、灵敏度高、线性范围宽、准确度高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及医疗血液检测技术领域，特别涉及一种咪达唑仑血药浓度检测方法。
背景技术
咪达唑仑又称速眠安，属苯二氮类镇静催眠药。咪达唑仑为亲脂性物质，能直接抑制脑干网状结构上行激活系统，具有强大的镇静催眠作用，其在PH＜4的酸性溶液中形成稳定的水溶性盐，临床制剂为盐酸盐或马来酸盐，在临床上被广泛用于抑郁症、焦虑等疾病，亦可用于外科手术或诊断检查时作诱导睡眠用，被列为第二类精神药品管控，测定咪达唑仑血药浓度,而对研究患者体内咪达唑仑药物浓度与药效之间的作用关系,指导临产合理用药具有重要意义。目前已报道的咪达唑仑血药浓度测定方法，存在流动相制备比较复杂，检测效率低下，血浆样品处理操作比较繁琐，成本较高等缺陷，因此提出一种针对性极强的咪达唑仑血药浓度检测方法很有必要。
发明内容
基于现有技术中存在的上述缺陷，本申请提出了一种针对性极强的咪达唑仑血药浓度检测方法，能够快速、准确且高效地检测人体血液样品中的咪达唑仑含量。
发明采用的技术方案是：一种咪达唑仑血药浓度检测方法，采用二维液相色谱仪系统，包括以下步骤：S1、制备溶液，所述溶液包括由正常人空白血清制得的空白血清溶液、含有咪达唑仑的标准溶液、混合有咪达唑仑和正常人空白血清的系统适用性溶液、由正在进行咪达唑仑治疗的患者的血清制得的供试品溶液；
S2、设置色谱参数，在所述二维液相色谱仪系统上设置一维柱色谱条件的参数、二维柱色谱条件的参数、大体积进样条件的参数和阀切换条件的参数，并使用所述空白血清溶液和所述系统适用性溶液确认，其中所述一维柱色谱条件的参数为：一维柱是填充剂为亲水性聚氧乙烯和疏水基的苯基以一定比例键合的固相萃取柱；一维洗脱液包括一维流动相A和一维流动相B，所述一维流动相A为甲醇，所述一维流动相B为水；一维洗脱方式为梯度洗脱；
所述二维柱色谱条件的参数为：二维柱是填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶的色谱柱；二维洗脱液包括二维流动相A和二维流动相B，所述二维流动相A为浓度是0.01mol/L的乙酸铵，所述二维流动相B为乙腈；二维洗脱方式为等度洗脱；
S3、实施检测，将所述供试品溶液和不同质量浓度的所述标准溶液分别注入所述二维液相色谱仪系统，并记录典型谱图；
S4、定量分析，分析得到不同质量浓度的所述标准溶液各自对应的咪达唑仑的峰面积，绘制咪达唑仑的标准曲线，分析得到供试品溶液对应的咪达唑仑的峰面积，计算得到供试品溶液中咪达唑仑的含量。
进一步地，所述一维流动相A甲醇在一维洗脱液中的体积占比不低于10％且不高于80％。
进一步地，所述一维洗脱液以0.2mL/min-1.5mL/min的流速流经温度范围为35℃-45℃的所述一维柱，以富集纯化样品中的咪达唑仑。
进一步地，所述一维洗脱液的梯度洗脱程序为：0min-7min，流速为0.2mL/min，一维流动相A甲醇：一维流动相B水的体积比为1：9；7min-7.5min，流速升高至1.5mL/min，一维流动相A甲醇：一维流动相B水的体积比改变为8：2；7.5min-11.0min，流速维持在1.5mL/min，一维流动相A甲醇：一维流动相B水的体积比维持在8：2；11.0min-11.2min，流速维持在1.5mL/min，一维流动相A甲醇：一维流动相B水的体积比改变为1：9；11.2min-12.0min，流速维持在1.5mL/min，一维流动相A甲醇：一维流动相B水的体积比维持在1：9；12.0min-12.5min，流速下降至0.2mL/min，一维流动相A甲醇：一维流动相B水的体积比改变为1：9；12.5min-15min，流速维持在0.2mL/min，一维流动相A甲醇：一维流动相B水的体积比维持在1：9。
进一步地，在一维洗脱时，为一维洗脱液注入水进行稀释，注水稀释程序为：0min-3min，水的流速为1.2mL/min；3min-3.1min，水的流速下降至0.1mL/min；3.1min-13.5min，水的流速保持在0.1mL/min；13.5min-13.8min，水的流速上升至1.2mL/min；13.8min-15min，水的流速保持在1.2mL/min。
进一步地，所述二维洗脱液以0.8mL/min-1.2mL/min的流速流经温度范围为35℃-45℃的所述二维柱，以分离和定量分析咪达唑仑。
进一步地，所述二维洗脱液中所述二维流动相A乙酸铵：二维流动相B乙腈的体积比为48:52。
进一步地，所述等度洗脱程序为0min-15min，流速为1.0mL/min。
进一步地，所述大体积进样条件的参数为400μL。
进一步地，所述一维柱为MF Ph-1 S-5固定萃取柱，规格为4.0mmL.D.×20mm；所述二维柱为ChromCoreTM 120C18色谱柱，规格为250×4.6mm，5μm。
与现有技术比较，本发明提出的咪达唑仑血药浓度检测方法具有操作简单、专属性强、灵敏度高、线性范围宽、准确度高等优点和重现性高等特点，依靠二维洗脱的方式，在极短的时间能够实现咪达唑仑的富集和定量分析，提高了医院监测患者体内咪达唑仑的血药浓度的效率，缩减了临床诊断时间，极大节约时间和成本，实现精准医疗。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明中二维液相色谱仪系统工作原理示意图；
图2为本发明中第一次进样的标准溶液典型谱图；
图3为本发明中第二次进样的标准溶液典型谱图；
图4为本发明中空白血清溶液典型谱图；
图5为本发明中第一次进样的系统适用性溶液典型谱图；
图6为本发明中第二次进样的系统适用性溶液典型谱图；
图7为本发明中标准溶液的标准曲线图；
图8为本发明中标准曲线典型谱图；
图9为本发明中供试品溶液重复性实验的典型谱图。
具体实施方式
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供了一种咪达唑仑血药浓度检测方法，该检测方法中采用二维液相色谱仪系统进行咪达唑仑的血药浓度检测，其具体的检测步骤包括：
步骤S1、制备溶液
本申请中所需要提前制备的溶液包括空白血清溶液、系统适用性溶液、标准曲线溶液以及供试品溶液，下面将例举上述各溶液的制备方法，需要说明的是，在实际应用中制备溶液的方法比较灵活，因此本发明中仅做例举说明，并不做出具体限定，本领域技术人员应当知道，在溶液的制备方法在现有技术中可以做出适应的选择或者调整。
空白血清溶液的制备：取正常人空白血清2mL，加入蛋白沉淀剂稀释定容至10mL，混合后超声5min，并将上述溶液转移至EP管中，随后置于离心机中以10000r/min离心10min，取其上清液，将取得的上清液通过尼龙滤膜(0.22μm)过滤，过滤得到的滤液即可作为空白血清溶液。
标准溶液的制备：将1mL的咪达唑仑标准品全部转移至10mL的容量瓶中，以甲醇稀释，最终定容至10mL，即得浓度为0.1mg/mL的咪达唑仑标准母液，根据所需将母液进行稀释定容。
系统适用性溶液的制备：取正常人空白血清2mL和浓度为30ug/mL咪达唑仑溶液混匀，使用乙腈将混合溶液定容至10mL，混合后超声5min，并将上述溶液转移至10mL的EP管中，随后置于离心机中以10000r/min离心10min，取其上清液，将取得的上清液通过尼龙滤膜(0.22μm)过滤，过滤得到的滤液即可作为系统适用性溶液。
供试品溶液：取正在进行咪达唑仑治疗的患者的血清2mL至10mL的容量瓶中，加入蛋白沉淀剂混匀并稀释定容，混合后超声5min，将上述溶液转移至EP管中，于离心机中以10000r/min离心10min，取上层清液通过尼龙滤膜(0.22μm)过滤，过滤得到的滤液即为供试品溶液。
步骤S2、设置色谱参数
在二维液相色谱仪系统上设置一维柱色谱条件的参数、二维柱色谱条件的参数和大体积进样条件的参数和阀切换条件的参数，并使用空白血清溶液和系统适用性溶液进行确认，待二维液相色谱仪系统的压力和基线平衡稳定后，注入不少于5针空白血清溶液和系统适用性溶液用来确认。
其中，如图1所示，本实施例中所用到的二维液相色谱仪系统为ThermoUltimate3000SD系统，包括带在线脱气单元的双梯度标准泵DGP-3600SD、辅助泵、自动进样器(WPS-3000SL)、带有一个六通阀的柱温箱(TCC-3000RS)和检测器(型号为DAD-3000)，色谱软件采用Chromeleon Chromatography Data System 7.2；上述双梯度标准泵分别作为一维泵和二维泵，一维泵用于在线固相萃取，二维泵用于色谱分析，吸附在一维柱的咪达唑仑通过六通阀切换到分析流路中，可以将原来用4～5h进行固相萃取前处理的时间缩短至3min左右在线完成，净化和浓缩后的咪达唑仑样品可直接进行定量分析，上述六通阀设置的阀口位置顺序为阀口1、阀口2、阀口3、阀口4、阀口5和阀口6。
进一步地，本申请中的工作原理为：通过多流道切换阀与寄存阀之间阀的切换，可以改变中间色谱柱在流道中所处的位置，实现中间色谱柱的寄存功能。具体为：一维洗脱液在一维泵的驱动下由阀口1进入到系统，二维洗脱液则在二维泵驱动下由阀口6进入系统，待测品溶液由从阀口2进入系统后，从阀口1流经一维柱并从阀口4流入，通过一维柱实现待测物的富集浓缩，实现在线固相萃取，分离后的截留部分暂缓寄存作为第二维液相系统的输入，而多余的一维洗脱液从阀口3排出；之后二维泵通过阀口5输送二维洗脱液，待测物经管线由阀口6进入二维柱进行分离后，经过检测器检测出物质成分及其含量，检测后由管线排出，检测器通过信号传输转化在计算机上显示出相应的典型谱图。
在上述Thermo Ultimate3000SD系统中的自动进样器的最大进样体积设计为400μL，这样可以连续进样富集待测物质，在本实施例中设计了通过大体积进样可提高本方法的灵敏度。
大体积的样品先流经一维柱富集在柱顶端，然后再经过一维洗脱液洗脱血清样品中的大分子蛋白成分和其他杂质，通过反向切阀流入到二维柱中进行分离和定量分析。由于样品溶剂中含有高比例的有机溶剂，所以用了大体积泵进水稀释，确保被测物质在一维柱上富集不流出，由于进样体积较大，容易导致色谱峰扩展及变形，在本实施例中，采用一维柱富集纯化后洗脱液反方向切阀，进行洗脱后再流经至二维柱，并设计了辅助泵在一维柱富集纯化期间注入纯化水，使一维柱中的待测成分充分保留，这样就可实现大体积进样也不会使色谱峰峰型变宽。
进一步地，本申请中对一维柱的填充材料要求具有良好的亲水性，这是因为血清中含有血细胞和大分子的蛋白，这就需要色谱纯化分离有分子排阻和色谱分配两种模式同时存在，并结合咪达唑仑与填充剂材料的相互作用，在本实施例中，一维柱为MF Ph-1 S-5固定萃取柱，其具体规格为4.0mmL.D.×20mm；针对咪达唑仑的化合物结构，对二维柱的填充剂材料基质的表面要求有很好的疏水性，二维柱的双封端技术优良，硅胶表面残存的硅羟基不超过1％，依据咪达唑仑在二维柱中的热力学和动力学特点，使得咪达唑仑具有较好的分离度，可以选择填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶的色谱柱，具体的二维柱为ChromCoreTM 120C18色谱柱，规格为250×4.6mm，5μm，该色谱柱具有优良的稳定性和耐用性，且使用寿命较长。
具体的，二维液相色谱仪系统上设置的色谱参数如表1所示：
表1、色谱参数
在上述参数设置中，一维洗脱液以0.2mL/min-1.5mL/min的流速流经温度范围为35℃-45℃的所述一维柱，经过验证，一维洗脱液在0.2mL/min-1.5mL/min的流速下，且一维柱温度在35℃-45℃内可以很快的富集纯化样品中的咪达唑仑。优选的，本实施例中一维柱的温度为40℃。
上述一维洗脱液的梯度洗脱程序为：0min-7min，流速为0.2mL/min，一维流动相A甲醇：一维流动相B水的体积比为1：9；7min-7.5min，流速升高至1.5mL/min，一维流动相A甲醇：一维流动相B水的体积比改变为8：2；7.5min-11.0min，流速维持在1.5mL/min，一维流动相A甲醇：一维流动相B水的体积比维持在8：2；11.0min-11.2min，流速维持在1.5mL/min，一维流动相A甲醇：一维流动相B水的体积比改变为1：9；11.2min-12.0min，流速维持在1.5mL/min，一维流动相A甲醇：一维流动相B水的体积比维持在1：9；12.0min-12.5min，流速下降至0.2mL/min，一维流动相A甲醇：一维流动相B水的体积比改变为1：9；12.5min-15min，流速维持在0.2mL/min，一维流动相A甲醇：一维流动相B水的体积比维持在1：9。通过上述方式洗脱咪达唑仑，能够在极短的时间内将咪达唑仑进行萃取和富集，可以极大的缩短咪达唑仑的分析周期，改善了咪达唑仑的峰型，增加检测的灵敏度。
进一步地，在进行一维梯度洗脱时，本申请还进一步配合温度的变化来提升咪达唑仑的萃取分离效果，本实施例中进一步提出了一种温度梯度变化与梯度洗脱程序相结合的组合方式来使咪达唑仑的萃取分离效率达到最佳，使得咪达唑仑的检测效率和测试结果得到最佳，其中温度梯度和梯度洗脱程序的具体组合方式为：0min-7min，流速为0.2mL/min，一维流动相A甲醇：一维流动相B水的体积比为1：9，此时一维柱的柱温维持在30±0.5℃；7min-7.5min，流速升高至1.5mL/min，一维流动相A甲醇：一维流动相B水的体积比改变为8：2，且一维柱的柱温上升到35±0.5℃；7.5min-11.0min，流速维持在1.5mL/min，一维流动相A甲醇：一维流动相B水的体积比维持在8：2，且一维柱的柱温维持在35±0.5℃；11.0min-11.2min，流速维持在1.5mL/min，一维流动相A甲醇：一维流动相B水的体积比改变为1：9，且一维柱的柱温上升到40±0.5℃；11.2min-12.0min，流速维持在1.5mL/min，一维流动相A甲醇：一维流动相B水的体积比维持在1：9，此时一维柱的柱温维持在40±0.5℃；12.0min-12.5min，流速下降至0.2mL/min，一维流动相A甲醇：一维流动相B水的体积比改变为1：9，此时一维柱的柱温维持在40±0.5℃；12.5min-15min，流速维持在0.2mL/min，一维流动相A甲醇：一维流动相B水的体积比维持在1：9，一维柱的柱温继续维持在40±0.5℃。而为避免由于一维流动相和一维柱之间由于温差带来的谱带展宽的问题，本实施例中还需要对一维流动相提前进行预热，使一维流动相的温度能够与一维柱的温度相近，从而很好的避免了峰展宽的问题，梯度洗脱程序配合一维柱逐渐上升的温度梯度，使得咪达唑仑的分析时间成倍的缩短，同时还保持了非常好的分析效果，极大提高了咪达唑仑的血药浓度检测效率。
且在一维洗脱时，为一维洗脱液注入水进行稀释，注水稀释程序为：0min-3min，水的流速为1.2mL/min；3min-3.1min，水的流速下降至0.1mL/min；3.1min-13.5min，水的流速保持在0.1mL/min；13.5min-13.8min，水的流速上升至1.2mL/min；13.8min-15min，水的流速保持在1.2mL/min。在此方式下，可很好的确保被测物质在一维柱上富集不流出，使一维柱中的待测成分得以充分保留，这样就可实现大体积进样也不会使色谱峰峰型变宽。
其中，二维洗脱液中二维流动相A浓度为0.01mol/L的乙酸铵：二维流动相B乙腈的体积比为48:52。等度洗脱程序为0min-15min，流速为1.0mL/min。上述二维洗脱中的流动相配比及流速的设定能够实现咪达唑仑的快速分离，提升了咪达唑仑的检测效率。
步骤S3、实施检测
将所述供试品溶液和不同体积的所述标准溶液分别注入所述二维液相色谱仪系统，并记录典型谱图。
步骤S4、定量分析
分析得到不同体积下的咪达唑仑各自对应的咪达唑仑图谱的峰面积，绘制咪达唑仑的标准曲线，分析得到供试品溶液对应的咪达唑仑的峰面积，计算得到供试品溶液中咪达唑仑的含量。
在一个实施例中，步骤S3和步骤S4的操作方式为：在二维液相色谱仪中进样标准溶液，分五次进样不同体积的标准溶液，这五次进样体积分别为100uL、150uL、200uL、250uL、300uL，所注入的咪达唑仑质量分别为1.5ng、2.25ng、3ng、3.75ng和4.5ng，每次进样的标准溶液的体积不同，本申请中每次进样体积设置为400uL，将上述进样体积下的标准溶液稀释后的质量浓度依次为3.75ng/mL、5.625ng/mL、7.5ng/mL、9.375ng/mL和11.25ng/mL，记录典型谱图15min，并以咪达唑仑的质量浓度(横坐标)和色谱峰面积(纵坐标)绘制标准曲线图，得到相关的线性方程，用以计算供试品溶液中咪达唑仑的含量。其所绘制的标准曲线图如图6所示，其中标准曲线的方程为Y＝0.0079X-0.0052，线性相关系数R＝0.9948，血清样品带入标准曲线即可计算相应的色谱峰面积，通过公式：血清样品中咪达唑仑的浓度＝供试品中咪达唑仑的峰面积*咪达唑仑标准品浓度*稀释倍数/咪达唑仑标准品峰面积，即可求出测得的血清样品中咪达唑仑的浓度。
步骤S5、方法学验证
步骤S5.1、验证方法专属性
为需提前进行空白血清溶液的检测、标准溶液的检测、系统适用性溶液的检测，将所测的结果与方法说明中的要求进行比较，如果所测的结果符合，则后续的供试品检测分析则可以进行。如图2至6所示，本申请中第一次进样的标准溶液典型谱图、第二次进样的标准溶液典型谱图、空白血清溶液典型谱图、第一次进样的系统适用性溶液典型谱图及第一次进样的适用性溶液典型谱图；分析典型谱图表明空白血清溶液的典型谱图中没有出现咪达唑仑干扰峰，系统适用性溶液的典型谱图中与咪达唑仑最近的杂质峰的分离度大于1.5，且两次标准溶液的典型谱图中咪达唑仑保留时间一致，验证了二维液相色谱仪系统及参数设置的专属性较强，具有较好的适用性，后续可进行供试品检测分析。
如图7、8所示，为本发明实施例中标准曲线图，结果为本方法的线性范围为：3.75ng/mL-11.25ng/mL，可以满足临床检测的需求。
步骤S5.2、供试品溶液检测精密度的验证
为了证明本实施例中的方法的精密度，进行了重复性实验，即取五份相同体积的系统适用性溶液进行检测，注入五针系统适用性溶液，得到的典型谱图如图9所示，检测结果如表2所示：
表2、重复性实验测试结果表
| 保留时间/min | 峰面积/mAU*min | |
| 第一针 | 10.803 | 0.1056 |
| 第二针 | 10.817 | 0.1005 |
| 第三针 | 10.817 | 0.1006 |
| 第四针 | 10.820 | 0.0960 |
| 第五针 | 10.817 | 0.1063 |
| RSD/％ | 0.06 | 4.14 |
根据上表所示，结果为所得5份供试品溶液的咪达唑仑含量的相对标准偏差为0.06％，且典型谱图中的杂质个数基本一致。
步骤S5.3、验证检测方法的准确度
进行回收率实验，采用步骤S1中的方法，配置低、中、高三个浓度的系统适用性溶液，奥沙西泮的浓度范围在9.375ng/mL-15.625ng/mL之间，例如3.75ng/mL、7.5ng/mL和11.25ng/mL三个浓度的奥沙西泮系统适用性溶液，每个浓度系统适用性溶液取五针进样检测，每针取400uL，检测得出谱图，根据谱图求得峰面积，根据计算公式求出系统适用性溶液中的实测浓度值，并计算回收率；以浓度为3.75ng/mL的系统适用性溶液数据进行说明，浓度为3.75ng/mL的系统适用性溶液具体数据如表3所示：
表3、回收率实验结果表
根据上表可知，本实施例中浓度为3.75ng/mL的系统适用性溶液的平均回收率为106.6％，以上述方法再分别检测浓度为7.5ng/mL和11.25ng/mL的系统适用性溶液并计算平均回收率(由于检测方法均相同，故省略，此处可直接参3.75ng/mL的检测)，经检测本申请的平均回收率范围为95％-108％，因此本申请检测方法符合生物分析方法学验证的要求。
综上所述，本发明所提出的方法具有极强的专属性，十分适用于咪达唑仑的血药浓度检测，且该方法的灵敏度高、准确度高、精密度较高，检测方法十分可靠，且线性范围宽，能够满足临床上监测咪达唑仑的血药浓度，并且检测时间不超过15min，可极大提高咪达唑仑血药浓度的检测效率。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种咪达唑仑血药浓度检测方法，采用二维液相色谱仪系统，其特征在于，包括以下步骤：
S1、制备溶液
所述溶液包括由正常人空白血清制得的空白血清溶液、含有咪达唑仑的标准溶液、混合有咪达唑仑和正常人空白血清的系统适用性溶液、由正在进行咪达唑仑治疗的患者的血清制得的供试品溶液；
S2、设置色谱参数
在所述二维液相色谱仪系统上设置一维柱色谱条件的参数、二维柱色谱条件的参数、大体积进样条件的参数和阀切换条件的参数，并使用所述空白血清溶液和所述系统适用性溶液确认，其中
所述一维柱色谱条件的参数为：
一维柱是填充剂为亲水性聚氧乙烯和疏水基的苯基以一定比例键合的固相萃取柱；
一维洗脱液包括一维流动相A和一维流动相B，所述一维流动相A为甲醇，所述一维流动相B为水；
一维洗脱方式为梯度洗脱；
所述二维柱色谱条件的参数为：
二维柱是填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶的色谱柱；
二维洗脱液包括二维流动相A和二维流动相B，所述二维流动相A为浓度是0.01mol/L的乙酸铵，所述二维流动相B为乙腈；
二维洗脱方式为等度洗脱；
S3、实施检测
将所述供试品溶液和不同质量浓度的所述标准溶液分别注入所述二维液相色谱仪系统，并记录典型谱图；
S4、定量分析
分析得到不同质量浓度的所述标准溶液各自对应的咪达唑仑的峰面积，绘制咪达唑仑的标准曲线，分析得到供试品溶液对应的咪达唑仑的峰面积，计算得到供试品溶液中咪达唑仑的含量。
2.根据权利要求1中所述的咪达唑仑血药浓度检测方法，其特征在于，所述一维流动相A甲醇在一维洗脱液中的体积占比不低于10％且不高于80％。
3.根据权利要求2中所述的咪达唑仑血药浓度检测方法，其特征在于，所述一维洗脱液以0.2mL/min-1.5mL/min的流速流经温度范围为35℃-45℃的所述一维柱，以富集纯化样品中的咪达唑仑。
4.根据权利要求3中所述的咪达唑仑血药浓度检测方法，其特征在于，所述一维洗脱液的梯度洗脱程序为：
0min-7min，流速为0.2mL/min，一维流动相A甲醇：一维流动相B水的体积比为1：9；
7min-7.5min，流速升高至1.5mL/min，一维流动相A甲醇：一维流动相B水的体积比改变为8：2；
7.5min-11.0min，流速维持在1.5mL/min，一维流动相A甲醇：一维流动相B水的体积比维持在8：2；
11.0min-11.2min，流速维持在1.5mL/min，一维流动相A甲醇：一维流动相B水的体积比改变为1：9；
11.2min-12.0min，流速维持在1.5mL/min，一维流动相A甲醇：一维流动相B水的体积比维持在1：9；
12.0min-12.5min，流速下降至0.2mL/min，一维流动相A甲醇：一维流动相B水的体积比改变为1：9；
12.5min-15min，流速维持在0.2mL/min，一维流动相A甲醇：一维流动相B水的体积比维持在1：9。
5.根据权利要求4中所述的咪达唑仑血药浓度检测方法，其特征在于，在一维洗脱时，为一维洗脱液注入水进行稀释，注水稀释程序为：0min-3min，水的流速为1.2mL/min；3min-3.1min，水的流速下降至0.1mL/min；3.1min-13.5min，水的流速保持在0.1mL/min；13.5min-13.8min，水的流速上升至1.2mL/min；13.8min-15min，水的流速保持在1.2mL/min。
6.根据权利要求1中所述的咪达唑仑血药浓度检测方法，其特征在于，所述二维洗脱液以0.8mL/min-1.2mL/min的流速流经温度范围为35℃-45℃的所述二维柱，以分离和定量分析咪达唑仑。
7.根据权利要求6中所述的咪达唑仑血药浓度检测方法，其特征在于，所述二维洗脱液中所述二维流动相A乙酸铵：二维流动相B乙腈的体积比为48:52。
8.根据权利要求7中所述的咪达唑仑血药浓度检测方法，其特征在于，所述等度洗脱程序为0min-15min，流速为1.0mL/min。
9.根据权利要求1中所述的咪达唑仑血药浓度检测方法，其特征在于，所述大体积进样条件的参数为400μL。
10.根据权利要求1中所述的咪达唑仑血药浓度检测方法，其特征在于，所述一维柱为MF Ph-1 S-5固定萃取柱，规格为4.0mmL.D.×20mm；所述二维柱为ChromCoreTM 120C18色谱柱，规格为250×4.6mm，5μm。
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