CN115433329A - 一种双pH响应型药物载体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种双pH响应型药物载体及其制备方法，属于药物载体技术领域。本发明设计了一种能够负载阿霉素(Dox)的双pH响应型药物载体，所述双pH响应型药物载体以生物相容性良好的丙烯酰吗啉作为亲水性链段，聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯作为疏水性链段，通过两步可逆加成‑裂解链转移聚合(RAFT)制备得到载体聚合物。该载体聚合物与疏水性药物阿霉素通过腙键连接得到具有良好生物相容性的双pH敏感的聚合物前药，所述聚合物前药在水中自组装形成核壳结构的纳米胶束。在肿瘤细胞的微酸性环境刺激下，所负载的药物阿霉素(Dox)在短时间内快速释放提高药物浓度，载药率高且对人体无害。本发明的双pH响应型药物载体，无毒，免疫原性低，安全可靠。

Description

一种双pH响应型药物载体及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种双pH响应型药物载体及其制备方法，属于药物载体领域。
背景技术
目前肿瘤的治疗手段主要有手术、放疗、化疗等方法，其中化疗主要以低分子量药物为主，其治疗方式简单适用范围大。然而化疗在杀死癌细胞的同时，也会对正常组织和细胞造成一定程度的损害，并且传统的抗肿瘤小分子药物选择性差，到达肿瘤组织时药物浓度降低，减弱了治疗效率。药物载体成功将药物分子递送至肿瘤细胞是肿瘤治疗的一个重要保障，有研究表明将化疗药物装载于一定形式的载体中，可有效提高肿瘤治疗效果、降低毒副作用。因此，寻找理想的药物载体成为肿瘤化疗药物研制的重点。
药物载体由于人体环境的复杂性而面临着巨大的挑战，目前面临的主要问题包括药物载体不能通过有效的内吞作用进入肿瘤细胞，在肿瘤细胞中释放药物的速度过慢，致使肿瘤细胞内药物浓度很低，药效低，不足以彻底杀死肿瘤细胞。针对药物释放缓慢问题，一些刺激响应型药物载体应用而生，如pH敏感，光敏感，酶响应型药物载体。在这些刺激响应型药物载体中，pH敏感型药物载体利用载体对肿瘤与正常组织及血液间pH差异的响应，实现药物在肿瘤组织的特异性释放，pH响应的药物载体不需要外部信号刺激，能够利用对体内pH变化的响应自动调节药物的释放，简单方便，条件温和，因而被广为应用。例如：中国专利CN110538149公开了一种pH响应型药物载体的制备方法，以聚天冬氨酸接枝酪氨酸形成自组装纳米胶束，并用透明质酸进行靶向修饰，可实现对两种药物的同时负载，载药量高，但是该药物载体制备工艺复杂，pH敏感性不强。中国专利CN110317335A公开了一种pH响应型药物载体的制备方法，以物质A和乙烯基二乙二醇醚作为原料，其中物质A为蓖麻油或蓖麻油酸，整个反应在以二氯甲烷作为溶剂的反应体系中进行反应，制备工艺简单，绿色环保，生物相容性好，但是该药物载体载药率低。
目前现有的pH响应型药物载体普遍存在生物相容性较差，载药率低，易受到机体体排斥，容易产生副作用等问题，大大限制了pH响应型药物载体的实际应用，因此，一种性能优良的pH响应型药物载体及其制备方法亟待开发。
发明内容
为了克服上述问题，本发明设计了一种能够负载阿霉素(Dox)的双pH响应型药物载体，以生物相容性良好的丙烯酰吗啉作为亲水性链段，聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯作为疏水性链段，通过两步可逆加成-裂解链转移聚合制备得到载体聚合物。疏水性药物阿霉素通过腙键与载体聚合物连接得到具有良好生物相容性的双pH敏感的聚合物前药，载药率高且对人体无害。
本发明的技术方案如下：一种双pH响应型药物载体，以丙烯酰吗啉、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯和氨基乙酸甲酯甲基丙烯酰胺为共聚单体，通过可逆加成-裂解链转移聚合制得，其分子结构如下式(I)所示：
Figure BDA0003851868190000021
式(I)中，m、x为结构单元的单元数目，m为30～100，x为0.5～0.7m，甲基丙烯酸二甲氨基乙酯结构单元与氨基乙酸甲酯甲基丙烯酰胺结构单元摩尔比符合：1.3～2：1，两种结构单元无规交替。
作为抗肿瘤药物载体，该载体聚合物与疏水性药物阿霉素通过腙键连接得到具有良好生物相容性的双pH敏感的聚合物前药，所述聚合物前药在水中自组装形成核壳结构的纳米胶束，在肿瘤细胞的微酸性环境刺激下，负载的药物阿霉素(Dox)可以在短时间内快速释放提高药物的浓度，使其发挥疗效，载药率高且对人体无害。
根据本发明，上述双pH响应型药物载体的制备方法，包括以下步骤：
将丙烯酰吗啉(ACMO)与链转移剂引发聚合，得到以聚丙烯酰吗啉为主体的大分子链转移剂；然后再以甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEMA)、氨基乙酸甲酯甲基丙烯酰胺(MGAA)为反应单体，引发聚合，得到双pH响应型药物载体。
根据本发明，所述的链转移剂为2-(三硫代十二烷酰)硫烷基丙酸，其结构如下式(II)所示：
Figure BDA0003851868190000022
根据本发明，所述的链转移剂2-(三硫代十二烷酰)硫烷基丙酸的制备方法如下：将十二硫醇溶于丙酮中，加入氢氧化钠水溶液搅拌均匀，然后加入二硫化碳，继续搅拌均匀，冰浴下加入2-甲基-2-溴丙酸，保持反应溶液温度始终低于30℃，得到黄色沉淀；加入氢氧化钠水溶液将沉淀溶解，室温反应15-20h；反应结束后加水稀释，使用正己烷洗涤，将水相冷至0℃，逐滴加入盐酸溶液使产物析出，抽滤，冷水洗涤，得到产物链转移剂2-(三硫代十二烷酰)硫烷基丙酸。
优选的，所述链转移剂2-(三硫代十二烷酰)硫烷基丙酸的制备方法中十二硫醇、二硫化碳与2-甲基-2-溴丙酸的摩尔比为1：1：1～1.5。
根据本发明，所述的氨基乙酸甲酯甲基丙烯酰胺单体的制备方法如下：称取一定量的氨基乙酸甲酯盐酸盐配置成水溶液加入到三口瓶中，逐滴加入溶解在无水二氯甲烷的甲基丙烯酰氯溶液和NaOH水溶液，用恒压滴液漏斗同时逐滴滴加至三口瓶中，滴加完毕后，调节反应温度至室温，继续反应4～8h，终止反应。用少量去离子水溶解粗产品，之后加入无水二氯甲烷分液萃取，抽滤、旋蒸后，25℃条件下真空干燥24h得到纯净的氨基乙酸甲酯甲基丙烯酰胺单体。其反应方程如下式(III)所示：
Figure BDA0003851868190000031
优选的，所述氨基乙酸甲酯甲基丙烯酰胺单体的制备方法中氨基乙酸甲酯盐酸盐、甲基丙烯酰氯与氢氧化钠的摩尔比为1：1：1.5～2。
根据本发明优选的，所述双pH响应型药物载体的制备方法包括以下步骤：
S1、采用第一步RAFT聚合方法制备大分子链转移剂
在反应管中加入一定量的亲水性单体丙烯酰吗啉、链转移剂、溶剂，在氮气保护下，加入引发剂反应聚合，于60～70℃下反应12～18h后，液氮淬冷终止反应，得到黄色反应液。用乙醚沉淀产物，反复溶解三次以后，抽滤得到淡黄色粉末状固体，25℃条件下真空干燥至恒重，得到大分子链转移剂。
S2、采用第二步RAFT聚合方法制备双pH响应型药物载体
在反应管中加入一定量的大分子链转移剂、单体甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、单体氨基乙酸甲酯甲基丙烯酰胺以及溶剂，在氮气保护下，加入引发剂反应聚合，于60～70℃下反应12～18h，反应结束后，用液氮淬冷反应装置终止反应，反应液为淡黄色液体，然后用选择性溶剂乙醚沉淀产物，反复溶解沉淀三次，抽滤得到淡黄色粉末状固体，25℃条件下真空干燥至恒重，得到pH响应型聚合物，其结构如下式(IV)所示：
Figure BDA0003851868190000041
在室温和磁力搅拌状态下，将上述pH响应型聚合物溶解在一定比例的无水甲醇和THF的混合溶剂中，而后加入一定量的水合肼，在25℃下反应20-50h，得到的混合物用水透析48h，冷冻干燥，得到双pH响应型药物载体。
根据本发明，步骤S1中所述链转移剂与所述丙烯酰吗啉单体的摩尔比为1：10～100，优选为1：35～65；
优选的，步骤S1中所述溶剂为1,4-二氧六环，溶剂用量是反应单体总质量的400～600％；
优选的，步骤S1中所述引发剂具体选自过硫酸铵、过硫酸铵-亚硫酸氢钠、偶氮二异丁基脒盐酸盐和偶氮二异丁腈中至少一种，引发剂用量是反应单体总质量的1～3％；
优选的，步骤S2中所述大分子链转移剂与所述甲基丙烯酸二甲氨基乙酯单体、氨基乙酸甲酯甲基丙烯酰胺单体的摩尔比为1：(10～40)：(5～30)；
优选的，步骤S2中所述聚合反应采用的溶剂为1,4-二氧六环，溶剂用量是反应单体总质量的400～600％；
优选的，步骤S2中所述引发剂具体选自过硫酸铵、过硫酸铵-亚硫酸氢钠、偶氮二异丁基脒盐酸盐和偶氮二异丁腈中至少一种，引发剂用量是反应单体总质量的1～3％；
优选的，步骤S2所述溶解在无水甲醇和THF中的双pH响应型药物载体的摩尔浓度范围为0.01～0.1mol·L-1；水合肼、甲醇和THF的体积比范围为1：(5～30)：(5～20)。
本发明的有益效果
(1)本发明的双pH响应型药物载体，采用聚丙烯酰吗啉作为亲水性链段，利用其良好的亲水性、生物相容性，无毒，免疫原性低，安全可靠，对蛋白质吸附、细胞粘附有排斥性能，用于修饰纳米药物载体，使其赋予纳米粒长循环的性能。
(2)本发明的双pH响应型药物载体，以pH敏感的聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯作为疏水性链段，利用其在肿瘤组织和微环境弱酸条件下可以发生疏水性到亲水性的转变的性质，可有效提高药物载体中抗癌药物的生物利用度。
(3)本发明的双pH响应型药物载体，共聚单体中具有氨基乙酸甲酯甲基丙烯酰胺，因此，形成的聚合物进行水合肼处理后，能够生成酰肼，负载药物阿霉素(Dox)后，与负载药物上的羰基反应生成pH敏感的腙键，与pH敏感的甲基丙烯酸二甲氨基乙酯协同作用，形成双pH响应型药物载体。
(4)本发明的双pH响应型药物载及其制备方法，以丙烯酰吗啉，甲基丙烯酸二甲氨基乙酯，氨基乙酸甲酯甲基丙烯酰胺为共聚单体，通过两步RAFT聚合制备两亲性双pH响应型药物载体，药物载体分子结构为嵌段共聚物，该药物载体具有双pH响应性，良好的生物相容性，无毒、无害、能够响应肿瘤细胞酸性环境，使负载药物阿霉素(Dox)在短时间内快速释放提高药物的浓度。
附图说明
图1为实施例1中制备的双pH响应型药物载体负载阿霉素(DOX)后在不同环境中的药物释放曲线图。
图2是实施例1中制备的双pH响应型药物载体对HepG-2细胞和HeLa细胞的细胞毒性图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例，实施例不应视作对本发明保护范围的限定。
本发明中链转移剂，其具体制备方法包括：将2.02g十二硫醇溶于丙酮中，加入10mL浓度为7mol/L的氢氧化钠水溶液搅拌均匀，然后加入0.76g二硫化碳，继续搅拌均匀，冰浴下加入1.67g的2-甲基-2-溴丙酸，保持反应溶液温度始终低于30℃，得到黄色沉淀；加入氢氧化钠水溶液将沉淀溶解，室温反应15-20h；反应结束后加水稀释，使用正己烷洗涤，将水相冷至0℃，逐滴加入盐酸溶液使产物析出，抽滤，冷水洗涤，得到产物链转移剂。
本发明中氨基乙酸甲酯甲基丙烯酰胺单体，其具体制备方法包括：称取10g的氨基乙酸甲酯盐酸盐配置成水溶液加入到的三口瓶中，将7.56g溶解在无水二氯甲烷的甲基丙烯酰氯溶液和20mL浓度为7mol/L的NaOH水溶液，用恒压滴液漏斗同时逐滴滴加至三口瓶中，滴加完毕后，调节反应温度至室温，继续反应4～8h，终止反应。用少量去离子水溶解粗产品，之后加入无水二氯甲烷分液萃取，抽滤、旋蒸后，25℃条件下真空干燥24h得到纯净的单体。
实施例1：
1、采用第一步RAFT聚合方法制备大分子链转移剂
在反应管中加入4.26g亲水性单体丙烯酰吗啉、0.36g链转移剂、17g溶剂1,4-二氧六环，在氮气保护下，加入0.04g偶氮二异丁基脒盐酸盐反应聚合，于60℃下反应12h后，液氮淬冷终止反应，得到黄色反应液。用乙醚沉淀产物，反复溶解三次以后，抽滤得到淡黄色粉末状固体，25℃条件下真空干燥至恒重，得到聚合度为30的大分子链转移剂。
2、采用第二步RAFT聚合方法制备双pH响应型药物载体
在反应管中加入4.62g大分子链转移剂、1.57g单体甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、0.79g单体氨基乙酸甲酯甲基丙烯酰胺以及9g溶剂1,4-二氧六环，在氮气保护下，加入0.02g偶氮二异丁基脒盐酸盐反应聚合，于60℃下反应12h，反应结束后，用液氮淬冷反应装置终止反应，反应液为淡黄色液体，然后用选择性溶剂乙醚沉淀产物，反复溶解沉淀三次，抽滤得到淡黄色粉末状固体，25℃条件下真空干燥至恒重，得到pH响应型药物载体。
在室温和磁力搅拌状态下，将6.92g上述pH响应型药物载体溶解在5mL无水甲醇和5mL的THF组成的混合溶剂中，而后加入1mL的水合肼，在25℃下反应20h，得到的混合物用水透析两天，冷冻干燥，得到双pH响应型药物载体。
实施例2：
1、采用第一步RAFT聚合方法制备大分子链转移剂
在反应管中加入4.26g亲水性单体丙烯酰吗啉、0.36g链转移剂、17g溶剂1,4-二氧六环，在氮气保护下，加入0.04g偶氮二异丁基脒盐酸盐反应聚合，于60℃下反应12h后，液氮淬冷终止反应，得到黄色反应液。用乙醚沉淀产物，反复溶解三次以后，抽滤得到淡黄色粉末状固体，25℃条件下真空干燥至恒重，得到聚合度为30的大分子链转移剂。
2、采用第二步RAFT聚合方法制备双pH响应型药物载体
在反应管中加入4.62g大分子链转移剂、3.14g单体甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、2.17g单体氨基乙酸甲酯甲基丙烯酰胺以及26g溶剂1,4-二氧六环，在氮气保护下，加入0.1g偶氮二异丁基脒盐酸盐反应聚合，于65℃下反应15h，反应结束后，用液氮淬冷反应装置终止反应，反应液为淡黄色液体，然后用选择性溶剂乙醚沉淀产物，反复溶解沉淀三次，抽滤得到淡黄色粉末状固体，25℃条件下真空干燥至恒重，得到pH响应型药物载体。
在室温和磁力搅拌状态下，将12.43g上述pH响应型药物载体溶解在15mL无水甲醇和10mL的THF组成的混合溶剂中，而后加入1mL的水合肼，在25℃下反应30h，得到的混合物用水透析两天，冷冻干燥，得到双pH响应型药物载体。
实施例3：
1、采用第一步RAFT聚合方法制备大分子链转移剂
在反应管中加入4.26g亲水性单体丙烯酰吗啉、0.36g链转移剂、17g溶剂1,4-二氧六环，在氮气保护下，加入0.04g偶氮二异丁基脒盐酸盐反应聚合，于60℃下反应12h后，液氮淬冷终止反应，得到黄色反应液。用乙醚沉淀产物，反复溶解三次以后，抽滤得到淡黄色粉末状固体，25℃条件下真空干燥至恒重，得到聚合度为30的大分子链转移剂。
2、采用第二步RAFT聚合方法制备双pH响应型药物载体
在反应管中加入4.62g大分子链转移剂、6.28g单体甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、4.35g单体氨基乙酸甲酯甲基丙烯酰胺以及64g溶剂1,4-二氧六环，在氮气保护下，加入0.32g偶氮二异丁基脒盐酸盐反应聚合，于70℃下反应18h，反应结束后，用液氮淬冷反应装置终止反应，反应液为淡黄色液体，然后用选择性溶剂乙醚沉淀产物，反复溶解沉淀三次，抽滤得到淡黄色粉末状固体，25℃条件下真空干燥至恒重，得到pH响应型药物载体。
在室温和磁力搅拌状态下，将7.63g上述pH响应型药物载体溶解在30mL无水甲醇和20mL的THF组成的混合溶剂中，而后加入1mL的水合肼，在25℃下反应50h，得到的混合物用水透析两天，冷冻干燥，得到双pH响应型药物载体。
实施例4：
1、采用第一步RAFT聚合方法制备大分子链转移剂
在反应管中加入8.52g亲水性单体丙烯酰吗啉、0.36g链转移剂、42g溶剂1,4-二氧六环，在氮气保护下，加入0.17g偶氮二异丁基脒盐酸盐反应聚合，于65℃下反应15h后，液氮淬冷终止反应，得到黄色反应液。用乙醚沉淀产物，反复溶解三次以后，抽滤得到淡黄色粉末状固体，25℃条件下真空干燥至恒重，得到聚合度为60的大分子链转移剂。
2、采用第二步RAFT聚合方法制备双pH响应型药物载体
在反应管中加入4.62g大分子链转移剂、1.57g单体甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、0.79g单体氨基乙酸甲酯甲基丙烯酰胺以及9g溶剂1,4-二氧六环，在氮气保护下，加入0.02g偶氮二异丁基脒盐酸盐反应聚合，于60℃下反应12h，反应结束后，用液氮淬冷反应装置终止反应，反应液为淡黄色液体，然后用选择性溶剂乙醚沉淀产物，反复溶解沉淀三次，抽滤得到淡黄色粉末状固体，25℃条件下真空干燥至恒重，得到pH响应型药物载体。
在室温和磁力搅拌状态下，将10.82g上述pH响应型药物载体溶解在5mL无水甲醇和5mL的THF组成的混合溶剂中，而后加入1mL的水合肼，在25℃下反应20h，得到的混合物用水透析两天，冷冻干燥，得到双pH响应型药物载体。
实施例5：
1、采用第一步RAFT聚合方法制备大分子链转移剂
在反应管中加入8.52g亲水性单体丙烯酰吗啉、0.36g链转移剂、42g溶剂1,4-二氧六环，在氮气保护下，加入0.17g偶氮二异丁基脒盐酸盐反应聚合，于65℃下反应15h后，液氮淬冷终止反应，得到黄色反应液。用乙醚沉淀产物，反复溶解三次以后，抽滤得到淡黄色粉末状固体，25℃条件下真空干燥至恒重，得到聚合度为60的大分子链转移剂。
2、采用第二步RAFT聚合方法制备双pH响应型药物载体
在反应管中加入4.62g大分子链转移剂、3.14g单体甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、2.17g单体氨基乙酸甲酯甲基丙烯酰胺以及26g溶剂1,4-二氧六环，在氮气保护下，加入0.1g偶氮二异丁基脒盐酸盐反应聚合，于65℃下反应15h，反应结束后，用液氮淬冷反应装置终止反应，反应液为淡黄色液体，然后用选择性溶剂乙醚沉淀产物，反复溶解沉淀三次，抽滤得到淡黄色粉末状固体，25℃条件下真空干燥至恒重，得到pH响应型药物载体。
在室温和磁力搅拌状态下，将17.29g上述pH响应型药物载体溶解在15mL无水甲醇和10mL的THF组成的混合溶剂中，而后加入1mL的水合肼，在25℃下反应30h，得到的混合物用水透析两天，冷冻干燥，得到双pH响应型药物载体。
实施例6：
1、采用第一步RAFT聚合方法制备大分子链转移剂
在反应管中加入8.52g亲水性单体丙烯酰吗啉、0.36g链转移剂、42g溶剂1,4-二氧六环，在氮气保护下，加入0.17g偶氮二异丁基脒盐酸盐反应聚合，于65℃下反应15h后，液氮淬冷终止反应，得到黄色反应液。用乙醚沉淀产物，反复溶解三次以后，抽滤得到淡黄色粉末状固体，25℃条件下真空干燥至恒重，得到聚合度为60的大分子链转移剂。
2、采用第二步RAFT聚合方法制备双pH响应型药物载体
在反应管中加入4.62g大分子链转移剂、6.28g单体甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、4.35g单体氨基乙酸甲酯甲基丙烯酰胺以及64g溶剂1,4-二氧六环，在氮气保护下，加入0.32g偶氮二异丁基脒盐酸盐反应聚合，于70℃下反应18h，反应结束后，用液氮淬冷反应装置终止反应，反应液为淡黄色液体，然后用选择性溶剂乙醚沉淀产物，反复溶解沉淀三次，抽滤得到淡黄色粉末状固体，25℃条件下真空干燥至恒重，得到pH响应型药物载体。
在室温和磁力搅拌状态下，将9.58g上述pH响应型药物载体溶解在30mL无水甲醇和20mL的THF组成的混合溶剂中，而后加入1mL的水合肼，在25℃下反应50h，得到的混合物用水透析两天，冷冻干燥，得到双pH响应型药物载体。
实施例7：
1、采用第一步RAFT聚合方法制备大分子链转移剂
在反应管中加入14.2g亲水性单体丙烯酰吗啉、0.36g链转移剂、85g溶剂1,4-二氧六环，在氮气保护下，加入0.43g偶氮二异丁基脒盐酸盐反应聚合，于70℃下反应18h后，液氮淬冷终止反应，得到黄色反应液。用乙醚沉淀产物，反复溶解三次以后，抽滤得到淡黄色粉末状固体，25℃条件下真空干燥至恒重，得到聚合度为100的大分子链转移剂。
2、采用第二步RAFT聚合方法制备双pH响应型药物载体
在反应管中加入4.62g大分子链转移剂、1.57g单体甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、0.79g单体氨基乙酸甲酯甲基丙烯酰胺以及9g溶剂1,4-二氧六环，在氮气保护下，加入0.02g偶氮二异丁基脒盐酸盐反应聚合，于60℃下反应12h，反应结束后，用液氮淬冷反应装置终止反应，反应液为淡黄色液体，然后用选择性溶剂乙醚沉淀产物，反复溶解沉淀三次，抽滤得到淡黄色粉末状固体，25℃条件下真空干燥至恒重，得到pH响应型药物载体。
在室温和磁力搅拌状态下，将16.80g上述pH响应型药物载体溶解在5mL无水甲醇和5mL的THF组成的混合溶剂中，而后加入1mL的水合肼，在25℃下反应20h，得到的混合物用水透析两天，冷冻干燥，得到双pH响应型药物载体。
实施例8：
1、采用第一步RAFT聚合方法制备大分子链转移剂
在反应管中加入14.2g亲水性单体丙烯酰吗啉、0.36g链转移剂、85g溶剂1,4-二氧六环，在氮气保护下，加入0.43g偶氮二异丁基脒盐酸盐反应聚合，于70℃下反应18h后，液氮淬冷终止反应，得到黄色反应液。用乙醚沉淀产物，反复溶解三次以后，抽滤得到淡黄色粉末状固体，25℃条件下真空干燥至恒重，得到聚合度为100的大分子链转移剂。
2、采用第二步RAFT聚合方法制备双pH响应型药物载体
在反应管中加入4.62g大分子链转移剂、3.14g单体甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、2.17g单体氨基乙酸甲酯甲基丙烯酰胺以及26g溶剂1,4-二氧六环，在氮气保护下，加入0.1g偶氮二异丁基脒盐酸盐反应聚合，于65℃下反应15h，反应结束后，用液氮淬冷反应装置终止反应，反应液为淡黄色液体，然后用选择性溶剂乙醚沉淀产物，反复溶解沉淀三次，抽滤得到淡黄色粉末状固体，25℃条件下真空干燥至恒重，得到pH响应型药物载体。
在室温和磁力搅拌状态下，将24.77g上述pH响应型药物载体溶解在15mL无水甲醇和10mL的THF组成的混合溶剂中，而后加入1mL的水合肼，在25℃下反应30h，得到的混合物用水透析两天，冷冻干燥，得到双pH响应型药物载体。
实施例9：
1、采用第一步RAFT聚合方法制备大分子链转移剂
在反应管中加入14.2g亲水性单体丙烯酰吗啉、0.36g链转移剂、85g溶剂1,4-二氧六环，在氮气保护下，加入0.43g偶氮二异丁基脒盐酸盐反应聚合，于70℃下反应18h后，液氮淬冷终止反应，得到黄色反应液。用乙醚沉淀产物，反复溶解三次以后，抽滤得到淡黄色粉末状固体，25℃条件下真空干燥至恒重，得到聚合度为100的大分子链转移剂。
2、采用第二步RAFT聚合方法制备双pH响应型药物载体
在反应管中加入4.62g大分子链转移剂、6.28g单体甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、4.35g单体氨基乙酸甲酯甲基丙烯酰胺以及64g溶剂1,4-二氧六环，在氮气保护下，加入0.32g偶氮二异丁基脒盐酸盐反应聚合，于70℃下反应18h，反应结束后，用液氮淬冷反应装置终止反应，反应液为淡黄色液体，然后用选择性溶剂乙醚沉淀产物，反复溶解沉淀三次，抽滤得到淡黄色粉末状固体，25℃条件下真空干燥至恒重，得到pH响应型药物载体。
在室温和磁力搅拌状态下，将12.56g上述pH响应型药物载体溶解在30mL无水甲醇和20mL的THF组成的混合溶剂中，而后加入1mL的水合肼，在25℃下反应50h，得到的混合物用水透析两天，冷冻干燥，得到双pH响应型药物载体。
实验表征：
双pH响应型药物载体负载阿霉素(Dox)的前药制备：将12mg盐酸阿霉素加水溶解并定容至20mL，配制成浓度为0.6mg/mL的盐酸阿霉素水溶液，取10mg实施例1制备的pH响应型药物载体粉末，加入到配制好的盐酸阿霉素的水溶液中，超声10min，搅拌24h后离心，倒掉上清液后冷冻干燥得到负载阿霉素(Dox)的前药粉末。对上述制备出的产物进行试验分析：
(1)载药量的测定
为了计算聚合物前药的药物键和率(DLC)，将一定质量的前药冻干粉直接溶解到DMSO中，UV-Vis测定溶液在480nm处的紫外吸收光谱，记录吸光度，根据DOX在DMSO中的紫外标准曲线，计算DOX的含量。载药量(DLC)的计算公式如下所示：
Figure BDA0003851868190000101
将实施例1制备的双pH响应型药物载体负载阿霉素(DOX)后，进行载药量的测定，根据上述测定方法测定载药量为28.40％。
(2)不同pH条件下的体外药物释放
准确称量36mg前药冻干粉分散在pH7.4的PBS缓冲液中，取3mL纳米前药溶液置于每个透析袋内，将透析袋浸没在50mL盛有20mL不同pH缓冲液的密闭玻璃瓶内，平均分为三个平行样。将准备好的试样置于37℃恒媪振荡器中，振动速率为100rpm，在预定的时间间隔取出5.0mL试样用于UV-Vis测试，同时分别添加5.0mL新鲜的缓冲液。前药中DOX在不间pH条件下的累积释放，通过下列公式进行计算，绘制体外累积释放曲线。
Figure BDA0003851868190000102
将实施例1制备的双pH响应型药物载体负载阿霉素(DOX)后，DOX在pH(7.4、6.0、5.0和4.0)缓冲液中的药物释放速度图见说明书附图1。从中可以看出，药物载体装载DOX后在弱酸性pH(6.0、5.0和4.0)缓冲液中的药物释放速度要明显快于在生理条件pH(7.4)缓冲液中的药物释放速度，且DOX的释放量随着酸性的增加而増加。药物载体装载阿霉素(DOX)后在弱酸性环境中药物的释放取决于具有pH响应性的腙键和pH敏感的甲基丙烯酸二甲氨基乙酯链段，腙键会在酸性条件下发生水解断裂释放出游离的阿霉素，甲基丙烯酸二甲氨基乙酯链段在弱酸性环境中会向亲水性转变，因而导致DOX在弱酸性pH(6.0、5.0和4.0)缓冲液中快速释放。
(3)生物相容性实验
药物载体与细胞的生物相容性采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)来评估，以HepG-2细胞和HeLa细胞为肿瘤细胞研究模型。
将不同浓度的实施例1制备的双pH响应型药物载体对HepG-2细胞和HeLa细胞的细胞毒性实验结果见说明书附图2。从中可以看出，当药物载体浓度从0mg/mL变化到1.00mg/mL，两种细胞的细胞存活率均大于96％，说明药物载体对两种肿瘤细胞的毒性很小，具有良好的生物相容性。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明公开的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种双pH响应型药物载体，其特征在于：以丙烯酰吗啉、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯和氨基乙酸甲酯甲基丙烯酰胺为共聚单体，通过可逆加成-裂解链转移聚合制得，其分子结构式如下所示：
Figure FDA0003851868180000011
其中，m、x为结构单元的单元数目，m为30～100，x为0.5～0.7m，甲基丙烯酸二甲氨基乙酯结构单元与氨基乙酸甲酯甲基丙烯酰胺结构单元摩尔比为：1.3～2：1，两种结构单元无规交替。
2.一种制备如权利要求1所述的氨基乙酸甲酯甲基丙烯酰胺的方法，其特征在于包括以下步骤：称取一定量的氨基乙酸甲酯盐酸盐配置成水溶液加入到三口瓶中，将一定量溶解在无水二氯甲烷的甲基丙烯酰氯溶液和NaOH水溶液，用恒压滴液漏斗同时逐滴滴加至三口瓶中，滴加完毕后，调节反应温度至室温，继续反应4～8h，终止反应；用去离子水溶解粗产品，之后加入无水二氯甲烷分液萃取，抽滤、旋蒸后，25℃条件下真空干燥24h得到纯净的氨基乙酸甲酯甲基丙烯酰胺单体。
3.一种制备如权利要求1所述的双pH响应型药物载体的方法，其特征在于包括以下步骤：将丙烯酰吗啉与链转移剂引发聚合，得到以聚丙烯酰吗啉为主体的大分子链转移剂；然后再以甲基丙烯酸二甲氨基乙酯和氨基乙酸甲酯甲基丙烯酰胺为反应单体，引发聚合，得到所述的双pH响应型药物载体。
4.一种如权利要求3所述的双pH响应型药物载体的制备方法，其特征在于：其中所述的链转移剂为2-(三硫代十二烷酰)硫烷基丙酸，其结构式如下所示：
Figure FDA0003851868180000012
其制备方法包括以下步骤：将十二硫醇溶于丙酮中，加入氢氧化钠水溶液搅拌均匀，然后加入二硫化碳，继续搅拌均匀，冰浴下加入2-甲基-2-溴丙酸，保持反应溶液温度始终低于30℃，得到黄色沉淀；加入氢氧化钠水溶液将沉淀溶解，室温反应15-20h；反应结束后加水稀释，使用正己烷洗涤，将水相冷至0℃，逐滴加入盐酸溶液使产物析出，抽滤，冷水洗涤，得到所述链转移剂2-(三硫代十二烷酰)硫烷基丙酸。
5.一种如权利要求3所述的双pH响应型药物载体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
S1、制备大分子链转移剂：在反应管中加入一定量的亲水性单体丙烯酰吗啉、链转移剂、溶剂，在氮气保护下，加入引发剂反应聚合，于60～70℃下反应12～18h后，液氮淬冷终止反应，得到黄色反应液；用乙醚沉淀产物，反复溶解三次以后，抽滤得到淡黄色粉末状固体，25℃条件下真空干燥至恒重，得到所述大分子链转移剂；
S2、制备双pH响应型药物载体：在反应管中加入一定量的步骤S1制备的大分子链转移剂、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯单体、氨基乙酸甲酯甲基丙烯酰胺单体以及溶剂，在氮气保护下，加入引发剂反应聚合，于60～70℃下反应12～18h，反应结束后，用液氮淬冷反应装置终止反应，反应液为淡黄色液体，然后用选择性溶剂乙醚沉淀产物，反复溶解沉淀三次，抽滤得到淡黄色粉末状固体，25℃条件下真空干燥至恒重，得到pH响应型聚合物，其结构式如下；
Figure FDA0003851868180000021
在室温和磁力搅拌状态下，将上述pH响应型聚合物溶解在一定比例的无水甲醇和THF的混合溶剂中，而后加入一定量的水合肼，在25℃下反应20-50h，得到的混合物用水透析48h，冷冻干燥，得到双pH响应型药物载体。
6.一种如权利要求5所述的双pH响应型药物载体的制备方法，其特征在于：步骤S1所述链转移剂与丙烯酰吗啉单体的摩尔比为1：10～100。
7.一种如权利要求5所述的双pH响应型药物载体的制备方法，其特征在于：步骤S2中所述大分子链转移剂与甲基丙烯酸二甲氨基乙酯单体、氨基乙酸甲酯甲基丙烯酰胺单体的摩尔比为1：10～40：5～30。
8.一种如权利要求5～7任意一项所述的双pH响应型药物载体的制备方法，其特征在于：步骤S1、S2中所述溶剂为1,4-二氧六环，所述溶剂用量为反应单体总质量的400～600％。
9.一种如权利要求5～7任意一项所述的双pH响应型药物载体的制备方法，其特征在于：步骤S1、S2中所述所述引发剂具体选自过硫酸铵、过硫酸铵-亚硫酸氢钠、偶氮二异丁基脒盐酸盐和偶氮二异丁腈中至少一种，引发剂用量为反应单体总质量的1～3％。
10.一种如权利要求5所述的双pH响应型药物载体的制备方法，其特征在于：步骤S2所述溶解在无水甲醇和THF中的双pH响应型药物载体的摩尔浓度范围为0.01～0.1mol·L-1；水合肼、甲醇和THF的体积比范围为1：5～30：5～20。
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