CN115420716A - 一种检测吊白块含量的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及食品检测技术领域，尤其涉及一种检测吊白块含量的方法及其应用。所述方法包括：包括：混合多巴胺、间苯二酚和待测样品得到混合溶液，充分反应后检测所述混合溶液的荧光强度，将检测结果和吊白块标准曲线对比得到所述待测样品中吊白块含量。本发明基于多巴胺和间苯二酚的反应原理提供了一种检测食品中吊白块含量的方法，其样品处理简单、基质耐受性强、准确性高，对于粉丝、面粉、米粉以及多种其他食品中吊白块的检测具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及食品检测技术领域，尤其涉及一种检测吊白块含量的方法及其应用。
背景技术
吊白块学名为甲醛次硫酸钠，通常被用作工业漂白剂以及有机合成过程中的绿色试剂。吊白块与甲醛和亚硫酸氢钠的化学性质较为相似，具有强还原性，因而被非法用于食品漂白和保鲜。但吊白块是一种强致癌物质，对人体的肺、肝脏和肾脏损害极大，普通人经口摄入量为10g时即可导致中毒死亡。因此，在食品加工中吊白块被严禁使用。然而在利益的驱使下，吊白块被非法用作食品添加剂用于漂白和改善小麦粉、米粉、豆腐、粉丝和其他食品的漂白及保鲜的情况仍然存在，这对消费者的健康造成了严重威胁。因此，如何准确地检测食品中吊白块是保障食品安全的重要举措之一。
吊白块化学性质不稳定，在在酸性溶液和加热条件下会等摩尔分解成甲醛和亚硫酸氢钠。因此，常规的高效液相色谱、高效液相串联质谱等仪器分析方法难以直接测定吊白块。目前，间接法是较为常用的检测吊白块含量的方法，即在酸性条件下将吊白块分解为甲醛、二氧化硫或亚硫酸氢钠，然后通过测定分解产物的含量进而实现吊白块的间接检测。已报道的间接法包括变色酸法、乙酰丙酮法和盐酸苯肼比色法等分析技术。但间接法存在操作复杂、步骤繁琐、准确性低等问题，而且通过间接法无法辨别测得的甲醛是吊白块的分解产物还是本身存在的添加剂，导致检测结果假阳性率高。因此，迫切需要开发一种可靠、快速、灵敏的检测方法并应用于食品样品中吊白块的定量检测。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种检测吊白块的方法及其应用。
第一方面，本发明提供一种检测吊白块含量的方法，包括：
混合多巴胺、间苯二酚和待测样品得到混合溶液，充分反应后检测所述混合溶液的荧光强度，将检测结果和吊白块标准曲线对比得到所述待测样品中吊白块含量。
如图1所示，本发明的检测原理为：多巴胺和间苯二酚在碱性条件下可以生成蓝色荧光分子(azamonardine)；当在多巴胺和间苯二酚的混合溶液中加入吊白块，蓝色荧光分子的生成量降低，即荧光强度降低(图1)。因此，吊白块的浓度与azamonardine荧光强度呈反比，进而实现样品中吊白块的定量检测。
其中，多巴胺和间苯二酚为商用化学试剂，可直接购买获得，作为原位荧光反应的底物。
进一步地，所述吊白块标准曲线的制备方法如下：
将不同浓度吊白块和多巴胺、间苯二酚混合后得到不同浓度的吊白检测溶液，并检测其荧光强度；
后根据所述不同浓度的吊白检测溶液的浓度和所述荧光强度得到所述吊白块标准曲线。
进一步地，所述多巴胺和所述间苯二酚的浓度比为(1～60)：(1～60)，优选为(1～3)：(1～3)。
进一步地，所述多巴胺的浓度为4～6μM；和/或，所述间苯二酚的浓度为8～12μM。
进一步地，所述待测样品在检测前通过如下方法预处理：
将所述待测样品溶解于碳酸盐溶液中，超声提取、离心后过滤。
进一步地，所述碳酸盐溶液的浓度为1～3mM；和/或，所述超声提取为在27℃～35℃条件下提取5～15分钟；和/或，所述离心为在8000～12000rpm转速下离去10～20分钟；和/或，所述过滤为通过0.4～0.5μm的过滤器进行过滤。
进一步地，所述荧光强度为在420nm-465nm范围内的荧光强度。
进一步地，所述充分反应为在碱性条件下反应20分钟以上。
第二方面，本发明提供一种吊白块检测试剂盒，包括：
多巴胺溶液、间苯二酚溶液、吊白块标准品溶液和样品提取液。
其中，多巴胺溶液的浓度为4～6μM，间苯二酚溶液的弄懂度为8～12μM。
本发明进一步提供所述方法在检测食品中的吊白块中的应用。
进一步地，所述食品包括粉丝、面粉、米粉、腐竹或豆腐中的一种或多种。
本发明具备如下有益效果：
本发明提供了一种基于多巴胺和间苯二酚在碱性条件下的反应生产蓝色荧光分子的原理，提供了一种检测吊白块的方法，通过荧光强度即可反应吊白块的含量。本发明提供的方法具有样品前处理简单、基质耐受性强、灵敏度高、准确性高、成本低等特点。本发明提供的方法以粉丝、面粉和米粉等食品为检测样本，方法的检测限为0.28-0.38μg/g，在测定食品中吊白块残留时具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的检测吊白块的原理示意图。
图2为本发明实施例1提供的缓冲体系中荧光强度随吊白块浓度变化对应的变化图。
图3为本发明实施例1提供的缓冲体系中吊白块的标准曲线图。
图4为本发明实施例3提供的荧光检测方法的特异性测定图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本实施例提供一种检测吊白块的方法，其流程如图1所示，其中吊白块标准曲线的建立方法的流程如下：
1、取0.76g多巴胺溶解于超纯水中，并用10mL容量瓶定容，制备获得浓度为500μM的多巴胺溶液。取浓度为50μM的多巴胺溶液稀释100倍，并于100mL容量瓶中定容，即可获得浓度为5.0μM的多巴胺溶液。
2、取1.1g间苯二酚溶解于超纯水中，并用10mL容量瓶定容，制备获得浓度为1mM的间苯二酚溶液。取浓度为1mM的间苯二酚溶液稀释100倍，并于100mL容量瓶中定容，即可获得浓度为10μM的间苯二酚溶液。
3、取吊白块11.8mg溶解于碳酸盐缓冲溶液(2mM，pH 10)中定容至10mL，配置浓度为10mg/mL的吊白块标准品溶液。将吊白块标准品溶液分别稀释为0，0.01，0.03，0.09，0.27，0.81，1.30和2.43μg/mL。
4、取5.0μM多巴胺溶液(30μL/孔)、10μM的间苯二酚溶液(30μL/孔)、不同浓度吊白块标准品溶液(200μL/孔)于不透明96孔酶标板中(每个条件做5个平行)。
5、混合溶液振荡混合均匀，室温条件下反应20min。
6、设定荧光分光光度计或多功能酶标仪的激发和发射波长分别为420nm和465nm，最终测定混合溶液荧光强度。
7、将所测得的数据以-log10(吊白块浓度)值为横坐标，以荧光强度为纵坐标，利用Origin 8.0的四参数方程进行拟合，建立标准曲线获得半数抑制浓度(IC50)值及线性范围。
结果如图2和图3所示，图2中的a显示溶液体系荧光强度呈蓝色荧光，且随着吊白块浓度的增加，蓝色荧光逐渐变浅；经多功能酶标仪扫描获得荧光光谱图，结果如b所示溶液体系的荧光强度逐渐降低；图3为本发明基于吊白块浓度与荧光强度建立标准曲线，通过四参数方程拟合可得方法的IC50为0.22μg/mL，线性范围(IC20-IC80)为0.05-0.9μg/mL，线性相关系数为0.993。
实施例2
本实施例提供吊白块检测试剂盒的制备方法，步骤如下：
1、取5.0μM的多巴胺溶液1mL于1.5mL离心管中标记为A液，避光保存。
2、取10μM的间苯二酚溶液1mL于1.5mL离心管中标记为B液，避光保存。
3、取10mg/mL的吊白块标准品溶液于1.5mL离心管中，避光保存。
4、取100mL碳酸盐缓冲溶液(20mM，pH 10)于塑料试剂瓶中，作为样本提取母液。使用时，将母液稀释10倍后使用。
5、将不透明96孔酶标板用铝箔纸密封保存。
6、上述试剂盒使用说明书包括：概述、原理、组分、储存方法、注意事项、工作液的准备、样品前处理、检测、计算、试剂盒参数、标准曲线参考图、分析限制等。
本发明提供的检测试剂盒的保质期为3个月。
实施例3
本实施例提供粉丝、面粉与米粉等食品样品中吊白块的检测方法，步骤如下：
1、样品前处理方法
粉丝的前处理方法为：取1.0g粉丝磨成粉末并溶解于10mL碳酸盐溶液(2mM，pH10)中，将混合物超声提取10min。以10,000rpm转速离心15min，收集上清液(1.0mL)并用无菌注射器过滤器(0.45μm)过滤。
面粉和米粉的前处理方法为：取1.0g小麦或大米粉溶解于10mL碳酸盐溶液(2mM，pH 10)中，将混合物超声提取10min。以10,000rpm转速离心15min，收集上清液(1.0mL)并用无菌注射器过滤器(0.45μm)过滤。
样本前处理后，取粉丝、面粉与米粉样品提取液进行测定。测定步骤参考实施例1，将实施例1中的标准品溶液替换为制备获得的样品提取液即可，最后对其荧光强度进行测定。
2、原位荧光检测方法及试剂盒检测限的测定
检测限定义为粉丝、面粉、米粉阴性样品荧光强度加3倍标准差对应的浓度(三次平行试验)。
具体操作步骤为：取粉丝、面粉、米粉各20份(经仪器分析方法验证为吊白块阴性样本)，分别进行样品前处理。然后测定阴性样品对应的荧光强度，计算平均值(X)及标准差(SD)。计算X±3SD，并将其带入标准曲线，计算获得原位荧光检测方法及试剂盒的检测限。
经计算可得，粉丝、面粉、米粉的检测线分别为0.38，0.28和0.32μg/g，因此原位荧光检测方法及试剂盒的检测限为0.28-0.38μg/g。
3、原位荧光检测方法特异性的测定
本发明进一步通过探究粉丝、面粉、米粉样品中可能含有的基质化合物及强还原性化合物等对原位荧光检测方法的影响，评估检测方法的特异性。
所涉及的粉丝、面粉、米粉样品中可能含有的基质化合物包括：葡萄糖、蔗糖、谷氨酸、麦醇溶蛋白和Ca2+。强还原性化合物包括：甲醛与亚硫酸氢钠。
具体操作步骤为：分别配置浓度为0、0.25和10μg/mL的上述化合物溶液。分别测定缓冲体系中不同浓度的化合物溶液对检测荧光信号的影响。
检测结果如图4所示，葡萄糖、蔗糖、谷氨酸等样品基质物质对原位荧光检测方法的检测信号几乎无影响。当甲醛和亚硫酸氢钠的浓度为10μg/mL时，会导致荧光强度降低。但荧光信号降低幅度小，尚未达到阴性对照信号的1/2。因此，甲醛和亚硫酸氢钠对原位荧光检测方法的影响可忽略不计。综上，本发明所述基于原位荧光反应的食品中吊白块检测方法及其检测试剂盒的特异性良好。
4、原位荧光检测方法准确性的测定
本实施例通过添加回收率评估原位荧光检测方法的准确性，具体操作步骤如下：
分别取20个粉丝、面粉、米粉阴性样本，并在样本中添加吊白块标准品，至浓度为1、2和4μg/g。采用前述的前处理方法进行前处理，采用实施例1进行检测。检测结果显示，方法的回收率为80.7％-102.1％，变异系数为4.2％-12.6％(表1)。结果表明本发明建立的吊白块的检测方法、开发的检测试剂盒可以高效较准确地测定食品中的吊白块，具有操作简便、安全、高效等优势，具有较好的应用前景。
表1添加回收率(N＝3)
试验例1
本发明进一步对比本发明和现有的化学检测法(DB35/T 638-2005)的检测灵敏度，针对这2种方法，采用实施例3中相同的方法统计吊白块浓度，结果如下(表2)：
表2不同样品中吊白块含量的检测结果
| 样品 | 吊白块添加量 | 实施例1检测结果 | DB35/T 638-2005检测结果 |
| 粉丝1# | 0 | 未检出 | 未检出 |
| 粉丝2# | 0 | 未检出 | 未检出 |
| 粉丝3# | 0 | 未检出 | 未检出 |
| 小麦粉1# | 0 | 未检出 | 未检出 |
| 小麦粉2# | 0 | 未检出 | 未检出 |
| 小麦粉3# | 0 | 未检出 | 未检出 |
| 米粉1# | 0 | 未检出 | 未检出 |
| 米粉2# | 0 | 未检出 | 未检出 |
| 米粉3# | 0 | 未检出 | 未检出 |
| 粉丝1# | 4 | 4.2 | 未检出 |
| 粉丝2# | 4 | 3.9 | 未检出 |
| 粉丝3# | 4 | 3.8 | 未检出 |
| 小麦粉1# | 10 | 9.2 | 未检出 |
| 小麦粉2# | 10 | 9.8 | 未检出 |
| 小麦粉3# | 10 | 9.6 | 未检出 |
| 米粉1# | 20 | 17.9 | 检出 |
| 米粉2# | 20 | 16.4 | 检出 |
| 米粉3# | 20 | 19.2 | 检出 |
注：表中DB35/T 638-2005通过测定甲醛含量然后换算为吊白块浓度。
结果显示，本发明的检测结果与DB35/T 638-2005检测结果一致性较好，且本发明的灵敏度较高，可以对样本中低浓度吊白块进行定量测定。
本发明进一步总结了目前已报道的测定食品中吊白块的检测方法的性质及优缺点(表3)。结果显示：本发明建立的荧光检测方法是一种新型检测方法，且具有样本前处理简单、成本低、适用性好、灵敏度高、检测结果准确等优势。
表3不同吊白块检测方法的效果对比
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种检测吊白块含量的方法，其特征在于，包括：
混合多巴胺、间苯二酚和待测样品得到混合溶液，充分反应后检测所述混合溶液的荧光强度，将检测结果和吊白块标准曲线对比得到所述待测样品中吊白块含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述吊白块标准曲线的制备方法如下：
将不同浓度吊白块和多巴胺、间苯二酚混合后得到不同浓度的吊白检测溶液，并检测其荧光强度；
后根据所述不同浓度的吊白检测溶液的浓度和所述荧光强度得到所述吊白块标准曲线。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述多巴胺和所述间苯二酚的浓度比为(1～60)：(1～60)。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测样品在检测前通过如下方法预处理：
将所述待测样品溶解于碳酸盐溶液中，超声提取、离心后过滤。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述碳酸盐溶液的浓度为1～3mM；和/或，所述超声提取为在27～35℃条件下提取5～15分钟；和/或，所述离心为在8000～12000rpm转速下离去10～20分钟；和/或，所述过滤为通过0.4～0.5μm的过滤器进行过滤。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光强度为在420nm-465nm范围内的荧光强度。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述充分反应为在碱性条件下反应20分钟以上。
8.一种吊白块检测试剂盒，其特征在于，包括：
多巴胺溶液、间苯二酚溶液、吊白块标准品溶液和样品提取液。
9.权利要求1-8任一项所述的方法在检测食品中的吊白块中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述食品包括粉丝、面粉、米粉、腐竹或豆腐中的一种或多种。
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