CN115414429A - 抗骨质疏松症的枸杞子活性提取物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有防治骨质疏松症的枸杞子活性提取物及其制备方法与应用，该提取物由枸杞子多糖与枸杞子总黄酮复配而成。枸杞子多糖由枸杞子水提取物经多次醇沉获得，总黄酮通过大孔吸附树脂精制而成。本发明提供的枸杞子活性提取物，通过大量的试验筛选出二者的最佳配比，实验结果表明采用本发明提供的最佳配比的枸杞子多糖和总黄酮对骨质疏松症具有更好的防治作用，可以显著增加骨基质矿化，抑制骨吸收陷窝的形成，促进骨形成。本发明提供的制备方法，整个工艺设计合理，所得提取物总多糖和总黄酮活性成分含量高。

Description

抗骨质疏松症的枸杞子活性提取物及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及天然产物的应用技术领域，具体涉及提供一种具有防治骨质疏松症的枸杞子多糖和枸杞子总黄酮组合物及其制备方法与应用。
背景技术
骨质疏松(OP)是一种以骨量降低、骨脆性增加、骨微结构破坏、易造成骨折为特征的全身性骨病。成骨细胞和破骨细胞活性及耦联机制的破坏与失衡是骨质疏松发病的主要因素。流行病学研究结果显示，随着人口老龄化进程的推进，骨质疏松及骨质疏松性骨折发病率呈逐年递增的趋势，骨质疏松的预防及治疗已经成为我国面临的重大公共健康问题。
双膦酸盐是临床抗骨质疏松的一线用药，但易引起胃肠道反应、低钙血症、超敏反应、肾功能损害。其它药物包括了Teriparatide(甲状旁腺激素类似物)、abaloparatide(甲状旁腺激素相关蛋白类似物)和romosozumab(罗莫佐单抗)，生物类药物价格昂贵，且存在毒副作用大的缺点，其中Teriparatide和abaloparatide由于存在诱发骨肉瘤的潜在风险，使用期不得超过两年；Romosozumab的起效时间只有一年，会增加严重心血管疾病风险。因此应用中药治疗骨质疏松症已经成为国内外的研究热点。
中医药由于长期的用药经验积累，在防治骨质疏松方面有着天然的优势。枸杞子为茄科植物宁夏枸杞Lycium barbarum L.的干燥成熟果实，是常用的药食同源补益类中药，可以长期服用。《神农本草经》记载其“……久服坚筋骨，轻身，不老”。《名医别录》亦记载：“坚筋骨……，久服耐寒暑”，且枸杞子为临床中药复方治疗骨质疏松症的主要药味组成。
现代药理学研究表明，枸杞子中含有多糖、黄酮、酚酸、生物碱、亚精胺、香豆素等多种化学分，但关于枸杞子发挥“坚筋骨”作用的物质基础尚不明确。
发明内容
为了解决本领域存在的上述问题，本发明的目的在于提供一种具有防治骨质疏松的枸杞子活性提取物，本发明的另一目的是提供上述枸杞子活性提取物的制备方法和应用。
技术方案：为了实现以上目的，本发明所述的具有抗骨质疏松症的枸杞子活性提取物采取的技术方案为：
一种抗骨质疏松症的枸杞子活性提取物，其特征在于，它由枸杞子多糖和枸杞子总黄酮成分复配而成。
作为优选方案，所述的具有防治骨质疏松症的枸杞子活性提取物，其重量份数比由1-10份枸杞子多糖，1-5份枸杞子总黄酮组成。
作为特别优选方案，所述的具有防治骨质疏松症的枸杞子活性提取物，枸杞子多糖和枸杞子总黄酮重量比为10:1。
作为优选方案，所述的具有防治骨质疏松症的枸杞子活性提取物，它是由下列方法制备得到：
(1)取干燥的枸杞子，加入5-20倍量的95％乙醇，回流提取1-3次，每次2h，过滤，滤液浓缩至0.3g/mL-1.0g/mL；
(2)取步骤(1)滤渣，加入5-20倍量的纯水，加热回流提取1-3次，每次2h，过滤，滤液浓缩至浸膏；
(3)向步骤(2)中加入20％-50％乙醇，搅拌均匀，静置24h，过滤，取上清液，浓缩至浸膏；
(4)向步骤(3)浸膏中加入70％-85％乙醇，搅拌均匀，过滤，取沉淀，干燥后即为枸杞子多糖；
(5)取步骤(1)中浓缩液，搅拌均匀后，上大孔树脂柱，先分别用水或者10％浓度的乙醇洗脱，再用体积浓度为30％-95％的乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩，得到枸杞子总黄酮；
(6)取步骤(4)枸杞多糖与步骤(5)枸杞总黄酮类成分按1:10-10:1进行复配，混合均匀，即为枸杞子活性提取物。
作为优选方案，所述的具有抗骨质疏松的枸杞子活性提取物，步骤(1)中提取条件为：依次取枸杞子15倍、10倍和6倍量体积浓度为80％的乙醇，加热回流提取2次，每次2h，过滤，合并滤液，浓缩至0.5g/mL。
作为特别优选方案，所述的具有抗骨质疏松的枸杞子活性提取物，步骤(1)中提取条件为：依次取枸杞子6倍量体积浓度为80％的乙醇，加热回流提取2次，每次2h，过滤，合并滤液，浓缩至0.3～0.5g/mL。
作为优选方案，所述的具有抗骨质疏松的枸杞子活性提取物，步骤(2)中所述的枸杞子水提取条件为：取步骤(1)药渣，依次加入10倍、8倍量的纯水，加热回流提取2次，每次2h，过滤，合并滤液，减压浓缩至浸膏状。
作为特别优选方案，所述的具有抗骨质疏松的枸杞子活性提取物，步骤(2)中所述的枸杞子水提取条件为：取步骤(1)药渣，依次加入10倍量的纯水，加热回流提取2次，每次2h，过滤，合并滤液，减压浓缩至浸膏状。
作为优选方案，以上所述的具有抗骨质疏松的枸杞子活性提取物，步骤(3)中制备条件为：向步骤(2)浓缩液中加入体积浓度30％乙醇，搅拌均匀，静置24h，取上清，浓缩至浸膏状。
作为特别优选方案，以上所述的具有抗骨质疏松的枸杞子活性提取物，步骤(4)中制备条件为：向步骤(3)浓缩液中加入体积浓度80％乙醇，搅拌均匀，静置24h，取沉淀用80℃的95％乙醇洗涤，抽滤，所得沉淀即为枸杞多糖。
作为优选方案，所述的具有抗骨质疏松的枸杞子活性提取物，步骤(4)中所述的干燥方式为减压干燥、喷雾干燥或冷冻干燥。
作为特别优选方案，以上所述的具有抗骨质疏松的枸杞子活性提取物，步骤(4)中枸杞多糖制备条件为：向步骤(3)中加入30％乙醇，搅拌均匀，室温静置24h，取上清液浓缩至浸膏状，向步骤(4)中加入80％的乙醇，搅拌均匀，室温静置24h，取沉淀用加热至80℃的95％乙醇洗涤，抽滤，所得沉淀经冷冻干燥后即为枸杞子多糖。
作为优选方案，所述的具有抗骨质疏松的枸杞子活性提取物，步骤(5)中所述的大孔吸附树脂型号为AB-8、HPD-100、ADS-17、S-8、HPD20、HPD-300、D101或者HP-20。特别优选AB-8树脂。
作为特别优选方案，以上所述的具有抗骨质疏松的枸杞子活性提取物，步骤(5)中枸杞子总黄酮制备条件为：先用纯水洗脱5个柱体积，再用30％的乙醇洗脱5个柱体积，再用60％的乙醇洗脱4个柱体积，将60％乙醇洗脱液浓缩，经冷冻干燥后即为枸杞子总黄酮。
本发明对枸杞子提取物中各原料所含成分进行分析：以葡萄糖为对照品采用硫酸-苯酚法，应用紫外-可见光分光光度计在490nm处测定吸光度，采用该方法测得所制备的枸杞子多糖部位中总多糖含量为55.66％；以芦丁为对照品，采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法，在510nm出测定吸光度，测得所制备的枸杞子活性部位中总黄酮含量为45.67％，有效成分含量高。
作为进一步的优选方案，以上所述的枸杞子活性提取物在制备防治骨质疏松药物及保健食品中的应用，其中枸杞子总多糖和枸杞子总黄酮组合物可以和药学上可接受的载体制剂制成胶囊、颗粒剂、片剂、注射剂、微囊等剂型药物。
本发明提供的枸杞子活性提取物在制成片剂时，将枸杞子多糖和枸杞子总黄酮和载体乳糖或玉米淀粉，需要时加入润滑剂硬脂酸镁，混合均匀，然后压片制成片剂。
本发明提供的枸杞子活性提取物在制成胶囊剂时，将枸杞子多糖和枸杞子总黄酮和载体乳糖或玉米淀粉，整粒，然后装胶囊制成胶囊剂。
本发明提供的枸杞子活性提取物在制成颗粒剂时，将枸杞子多糖和枸杞子总黄酮和稀释剂乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，干燥，制成颗粒剂。
有益效果：本发明提供的枸杞子多糖和总黄酮活性提取物在制备抗骨质疏松症的应用中具有以下优点：
本发明前期通过对枸杞子进行系统分离以共获得枸杞子9个化学部位，并对以上部位进行了系统筛选，得到了枸杞子中抗骨质疏松明确的两个化学部位，枸杞子多糖和枸杞子总黄酮，本发明在前期研究的基础上对二者进行了复配，并筛选得到最佳的抗骨质疏松的组合形式。该组合物改善骨质疏松效果显著，且无毒副作用，适用于长期服用。制备工艺可操作性强，自动化程度高，分离得到的枸杞子多糖和总黄酮成分含量高，活性更显著，活性成分转移率高，能很好地保留原料中的有效成分，杂质少，无毒副作用，生产成本低，且对环境友好。
实验结果表明，本发明提供的枸杞子活性提取物能够促进泼尼松龙诱导的斑马鱼幼鱼头骨发育，增加椎骨形成数量，减少泼尼松龙诱导的斑马鱼成鱼鳞片骨吸收陷窝面积，增强其矿化基质的形成，提高鳞片中成骨细胞活性，抑制鳞片中破骨细胞活性，上调骨形成相关基因ALP、Runx2b、OPG、Sp7的表达，下调骨吸收相关基因CTSK、TRACP的表达，显著改善骨质疏松症的各种症状及临床指标。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步地具体说明。
实施例1
枸杞子不同提取物及分离部位抗骨质疏松活性的筛选，其包括以下步骤：
1、药物与试剂：枸杞子(批号：2109099)购自宁夏明德中药饮片有限公司；泼尼松龙(批号：N15J11Q115595，上海源叶生物科技有限公司)；3-乙氧酰基苯胺甲磺酸盐(批号：C12590064，上海麦克林生化科技有限公司)；茜素红S(批号：NO506Q031，北京索莱宝科技有限公司)；仪器：LEICADFC 7000T体式显微镜(Leica)。
2、试验方法
样品的制备：取枸杞子1kg加入8倍量的水回流提取，每次1h，过滤，滤渣重复提取一次，合并滤液，减压浓缩冷冻干燥后得到水提取物(LBW)；取枸杞子5kg加入10倍量80％乙醇回流提取，每次1h，过滤，滤渣重复提取一次，合并滤液，减压浓缩挥去乙醇后干燥得到醇提取物(LBE)，枸杞子醇提取后药渣加入8倍量水回流提取1h，过滤，滤渣重复提取1次，合并滤液，减压浓缩至一定体积得到醇提后水提取物(LBEW)；向LBEW中缓慢加入95％乙醇，4℃冰箱静置24h，分离上清液(LBEW-P)和沉淀粗多糖部位(LBP)，枸杞子醇提取物加水复溶后，通过AB-8大孔树脂，依次用水、30％、60％、70％不同浓度的乙醇洗脱，得到LBEA1、LBEA2、LBEA3、LBEA4，以上样品经减压浓缩干燥后备用。共计9个提取分离部位。
斑马鱼幼鱼分组与处理：将受精24h的斑马鱼胚胎收集于12孔板中，分为空白组、泼尼松龙模型组(15μmoL·L-1)、依替膦酸二钠阳性药组(30μg·mL-1)、LBW(10μg·mL-1、100μg·mL-1)组、LBE(10μg·mL-1、100μg·mL-1)组、LBEW(10μg·mL-1、100μg·mL-1)组、LBP(10μg·mL-1、100μg·mL-1)组、LBEW-P(10μg·mL-1、100μg·mL-1)组、LBEA1(10μg·mL-1)组、LBEA2(1μg·mL-1、100μg·mL-1)组、LBEA3(1μg·mL-1、100μg·mL-1)组、LBEA4(1μg·mL-1、100μg·mL-1)组，每孔10枚，每个剂量3个副孔，以上药物采用水和DMSO作为溶剂，自受精第三天开始，模型组及各给药组开始给予15μmol·L-1的泼尼松龙(DMSO终浓度为0.1％)，空白组给予0.1％的DMSO，至受精第5天开始给予以上不同浓度的提取物干预(DMSO终浓度为0.1％)，每天半数换液，至第九天结束实验，实验重复三次。
斑马鱼幼鱼骨骼茜素红染色，实验结束后，加入30μg·mL-1的3-乙氧酰基苯胺甲磺酸盐麻醉斑马鱼幼鱼，加入4％的多聚甲醛固定20min，吸去多聚甲醛加入3％H2O2和2％KOH的混合溶液漂白斑马鱼幼鱼躯体黑色素，在体视显微镜下观色漂色情况，直至幼鱼头部及躯体呈透明状，然后向各孔板中加入0.005％的茜素红过夜染色，采用1％KOH-甘油溶液(3:1，1:1，1:3)梯度过渡去除非特异性结合染色。体视显微镜下将斑马鱼幼鱼固定于3％的羧甲基纤维素钠溶液中，采集腹面图片，统计第一椎骨形成面积及染色光密度值。
3、实验结果
枸杞子不同提取分离部位对斑马鱼幼鱼骨骼矿化的影响
与空白组比较，15μmmol·L-1的泼尼松龙会显著抑制斑马鱼幼鱼第一椎骨的形成，表现为茜素红染色面积减小，染色光密度值下降，表明斑马鱼幼鱼骨质疏松模型的成功建立。阳性药依替膦酸二钠能够显著改善斑马鱼幼鱼第一椎骨矿化面积及光密度值(P＜0.05，P＜0.001)，枸杞子各提取分离样品组中LBE高剂量、LBW低剂量和高剂量组、LBEA1高剂量组、LBEA2高剂量组能够显著提高斑马鱼第一椎骨染色光密度值，LBP低剂量和高剂量组、LBEA3低剂量和高剂量组能够显著提高斑马鱼幼鱼第一椎骨形成面积及染色光密度值(P＜0.001，P＜0.001)，以上结果显示枸杞子能够改善泼尼松龙对斑马鱼幼鱼骨骼发育的抑制，具有促进骨形成，增加骨密度的作用，其中LBP和LBEA3是其发挥抗骨质疏松的主要活性部位。
Figure BDA0003746172840000051
Figure BDA0003746172840000061
实施例2
具有防治骨质疏松的枸杞子活性提取物的制备方法，其包括以下步骤：
(1)取干燥枸杞子1kg，加入6倍量的95％乙醇，加热回流1次，每次1h，过滤，上清液浓缩至1g/mL；
(2)向步骤(1)的枸杞子滤渣中加入6倍量的纯水，加热回流1次，每次1h，过滤，上清液浓缩至浸膏状；
(3)向(2)中浸膏中加入20％乙醇，静置24h，取上清浓缩至浸膏状；
(4)向(3)中浸膏中加入70％乙醇，静置24h，取沉淀，抽滤，减压干燥得枸杞多糖(LBP)；
(5)将(1)浓缩液，上样于极性S-8大孔吸附树脂，先用10％乙醇洗脱4个柱体积，再用50％乙醇洗脱4个柱体积，收集50％乙醇洗脱液减压浓缩并干燥，得到枸杞子总黄酮提取物(LBEA3)；
(6)取步骤(4)枸杞子多糖与步骤(5)枸杞总黄酮类成分按1:1进行复配，混合均匀，即为枸杞子活性提取物。
以葡萄糖为对照品采用硫酸-苯酚法，应用紫外-可见光分光光度计在490nm处测定吸光度，采用该方法可知所制备的枸杞子多糖部位中总多糖含量为41.2％；以芦丁为对照品，采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法，在510nm出测定吸光度，测得所制备的枸杞子活性部位中总黄酮含量为30.2％。
实施例3
具有防治骨质疏松的枸杞子活性提取物的制备方法，其包括以下步骤：
(1)取枸杞子1kg，加入6倍量的70％乙醇，加热回流2次，每次1h，过滤，上清液浓缩至0.5g/mL；
(2)向(1)中滤渣加入15倍量的纯水，加热回流2次，每次1h，过滤，上清液浓缩至浸膏状；
(3)向(2)中浸膏中加入25％乙醇，静置24h，取上清浓缩至浸膏状；
(4)向(3)中浸膏中加入70％乙醇，静置24h，取沉淀，抽滤，减压干燥得枸杞多糖(LBP)。
(5)将(1)浓缩液，上样于非极性D101大孔吸附树脂，先用纯水洗脱3个柱体积，再用50％乙醇洗脱5个柱体积，收集50％乙醇洗脱液减压浓缩并干燥，得到枸杞子总黄酮提取物(LBEA3)；
(6)取步骤(4)枸杞子多糖与步骤(5)枸杞总黄酮类成分按5:2进行复配，混合均匀，即为枸杞子活性提取物。
以葡萄糖为对照品采用硫酸-苯酚法，应用紫外-可见光分光光度计在490nm处测定吸光度，采用该方法可知所制备的枸杞子多糖部位中总多糖含量为48.1％；以芦丁为对照品，采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法，在510nm出测定吸光度，测得所制备的枸杞子活性部位中总黄酮含量为37.2％。
实施例4
具有防治骨质疏松的枸杞子活性提取物的制备方法，其包括以下步骤：
(1)取干燥枸杞子1kg，加入6倍量的80％乙醇，加热回流2次，每次2h，过滤，上清液浓缩至0.3g/mL，
(2)向(1)中滤渣加入10倍量的纯水，加热回流2次，每次2h，过滤，上清液浓缩至浸膏状；
(3)向(2)中浸膏中加入30％乙醇，静置24h，取上清浓缩至浸膏状；
(4)向(3)中浸膏中加入80％乙醇，静置24h，取沉淀用加热至80℃的95％乙醇洗涤，抽滤，减压干燥得枸杞子多糖(LBP)；
(5)将步骤(1)浓缩液，上样于弱极性AB-8大孔吸附树脂，先用纯水和30％乙醇洗脱各洗脱5个柱体积，再用60％乙醇洗脱，收集60％乙醇洗脱液减压浓缩并干燥，得到枸杞子总黄酮提取物(LBEA3)；
(6)取步骤(4)枸杞子多糖与步骤(5)枸杞总黄酮类成分按10:1进行复配，混合均匀，即为枸杞子活性提取物。
以葡萄糖为对照品采用硫酸-苯酚法，应用紫外-可见光分光光度计在490nm处测定吸光度，采用该方法可知所制备的枸杞子多糖部位中总多糖含量为55.6％；以芦丁为对照品，采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法，在510nm出测定吸光度，测得所制备的枸杞子活性部位中总黄酮含量为45.7％。
实施例5
具有防治骨质疏松的枸杞子活性提取物的制备方法，其包括以下步骤：
(1)取干燥枸杞子1kg，加入6倍量的95％乙醇，加热回流2次，每次1h，过滤，上清液浓缩至0.3g/mL；
(2)向(1)中滤渣加入10倍量的纯水，加热回流2次，每次1h，过滤，上清液浓缩至浸膏状；
(3)向(2)中浸膏中加入20％乙醇，静置24h，取上清浓缩至浸膏状；
(4)向(3)中浸膏中加入85％乙醇，静置24h，取沉淀，抽滤，减压干燥得枸杞多糖(LBP)；
(5)将(1)浓缩液，上样于中等极性HP-400大孔吸附树脂，先用10％乙醇洗脱，再用50％乙醇洗脱，收集50％乙醇洗脱液减压浓缩并干燥，得到枸杞子总黄酮提取物(LBEA3)；
(6)取步骤(4)枸杞多糖与步骤(5)枸杞总黄酮类成分按3:2进行复配，混合均匀，即为枸杞子活性提取物。
以葡萄糖为对照品采用硫酸-苯酚法，应用紫外-可见光分光光度计在490nm处测定吸光度，采用该方法可知所制备的枸杞子多糖部位中总多糖含量为50.3％；以芦丁为对照品，采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法，在510nm出测定吸光度，测得所制备的枸杞子活性部位中总黄酮含量为38.7％。
实施例6枸杞子活性提取物对斑马鱼幼鱼骨骼发育的影响
1、药物与试剂：枸杞子(批号：2109099)购自宁夏明德中药饮片有限公司；泼尼松龙(批号：N15J11Q115595，上海源叶生物科技有限公司)；3-乙氧酰基苯胺甲磺酸盐(批号：C12590064，上海麦克林生化科技有限公司)；茜素红S(批号：NO506Q031，北京索莱宝科技有限公司)；
仪器：LEICADFC 7000T体式显微镜(Leica)。
3、试验方法
斑马鱼幼鱼分组与处理：将受精24h的斑马鱼胚胎收集于12孔板中，分为空白组、泼尼松龙模型组(15μmoL·L-1)、实施例1组、实施例2组、实施例3组、实施例4组，实施例2-5活性提取物给药浓度均为100μg/mL，每孔10枚，每个剂量3个副孔，自受精第三天开始，除空白组外其余各组开始给予15μmol·L-1的泼尼松龙，含0.1％的DMSO，空白组给予0.1％的DMSO，至受精第5天开始给予以上不同浓度的药物干预，每天半数换液，至第九天结束实验。实验重复三次。
实验结束后，加入30μg·mL-1的3-乙氧酰基苯胺甲磺酸盐麻醉斑马鱼幼鱼，加入4％的多聚甲醛固定20min，吸去多聚甲醛加入3％H2O2和2％KOH的混合溶液漂白斑马鱼幼鱼躯体黑色素，在体视显微镜下观色漂色情况，直至鱼体头部及躯体呈透明状，然后向各孔板中加入0.005％的茜素红过夜染色，采用1％KOH-甘油溶液(3:1，1:1，1:3)梯度过渡去除非特异性结合染色。于体视显微镜下固定于3％的羧甲基纤维素钠溶液中，采集腹面图片，统计斑马鱼幼鱼第一椎骨形成面积及染色光密度值，采集侧面图片，统计椎骨骨节形成数量。
3、实验结果
3.1枸杞子活性提取物对斑马鱼幼鱼头骨发育的影响
斑马鱼幼鱼在第九天时茜素红染色结果显示：与空白组比较，15μmmol·L-1的泼尼松龙会显著抑制斑马鱼幼鱼第一椎骨的形成，表现为茜素红染色面积减小，染色光密度值下降，表明斑马鱼幼鱼骨质疏松模型的成功建立。如表1所示，实施例2-5均能够显著改善斑马鱼幼鱼第一椎骨矿化面积及光密度值，其中实施例4效果最显著。
表1各组斑马鱼幼鱼头骨发育面积
组别 头骨发育面积(μm×10<sup>4</sup>)
空白组 1.34±0.12
模型组 0.95±0.23<sup>###</sup>
实施例2 1.15±0.09<sup>**</sup>
实施例3 1.16±0.10<sup>**</sup>
实施例4 1.28±0.12<sup>***</sup>
实施例5 1.09±0.16<sup>**</sup>
注：n＝20-30，与空白组比较，###P＜0.001，和模型组比较，**P＜0.01，***P＜0.001
3.2枸杞子提取物对斑马鱼幼鱼椎骨形成的影响
15μmmol·L-1的泼尼松龙会显著抑制斑马鱼幼鱼椎骨的形成，阳性药依替膦酸二钠对泼尼松龙诱导的斑马鱼椎骨形成无明显改善作用。如表2所示，实施例2-5均能够显著促进斑马鱼幼鱼椎骨骨节形成，其中实施例4效果最显著。
表2各组斑马鱼幼鱼椎骨骨节形成数量如表
组别 椎骨形成数量(节)
空白组 0.60±1.25
模型组 0.00±0.00
实施例2 1.03±0.24<sup>*</sup>
实施例3 1.47±0.38<sup>*</sup>
实施例4 4.16±2.72<sup>***</sup>
实施例5 2.17±1.72<sup>***</sup>
注：n＝20-30，和模型组比较，*P＜0.05；***P＜0.001。
实施例7枸杞子活性提取物对斑马鱼成鱼骨骼发育的影响
1、药物与试剂：枸杞子(批号：2109099)购自宁夏明德中药饮片有限公司；泼尼松龙(批号：N15J11Q115595，上海源叶生物科技有限公司)；3-乙氧酰基苯胺甲磺酸盐(批号：C12590064，上海麦克林生化科技有限公司)；茜素红S(批号：NO506Q031，北京索莱宝科技有限公司)；碱性磷酸酶染色液(偶氮偶联法)(批号：A20220321，北京索莱宝科技有限公司)；抗酒石酸酸性磷酸酶染液(批号：20220223，南京建成生物工程研究所)；总RNA快速提取试剂盒(货号YFXMOO11P，南京翼飞雪生物科技有限公司)；TransScript一步法gDNA去除及cDNA合成试剂盒(批号：P30923，北京全式金生物)；PerfectStart Green qPCR SuperMix(批号：N41217，北京全式金生物)；Runt家族转录因子2b(Runt family transcription onfactor2b，Runx2b)、sp7转录因子(sp7 transcription factor，sp7)、骨保护素(osteoprotegerin，OPG)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、抗酒酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRACP)、组织蛋白酶K(cathepsin K，CTSK)基因特异性引物由Thermo Fisher Scientific合成。
仪器：LEICADFC 7000T体式显微镜(Leica)，ABI 7500实时定量PCR仪(USAAB)，Tissuelyer-48全自动样品快速研磨仪(上海净信科技)，22R离心机(南京百瑞达生物科技有限公司)，MV-100涡旋混匀仪(武汉塞维尔生物科技有限公司)，TS100恒温混匀仪(杭州瑞诚仪器有限公司)，ST60-4微孔板恒温振荡器(杭州米欧仪器有限公司)，DS-11超微量紫外分光光度计(DeNovix)。
2、实验方法
将60尾斑马鱼成鱼分为空白组(0.1％DMSO)、泼尼松龙组(100μmol·L-1)、空白组、泼尼松龙模型组(15μmoL·L-1)、实施例2-5均1μg/mL，每组各10条。在造模的同时给予药物干预，每2天更换一次培养用水，实验持续30天。
实验结束后，加入200μg·mL-1的MS-222将斑马鱼麻醉致死，用显微镊将斑马鱼躯体自头部至尾部分为3个区域摘取一侧躯体鳞片30～50片，加入0.005％的茜素红溶液，过夜染色。将鳞片置于体式显微镜下拍照观察，通过Image J软件统计鳞片染色的平均光密度值及鳞片吸收陷窝面积。
ALP和TRAP染色所需的鳞片数量及获取方式同茜素红染色一致。采用偶氮偶联法检测ALP活性，其基本原理为在碱性条件下，细胞内ALP可以使萘酚AS-BI磷酸盐水解，释放出磷酸和萘酚，后者与偶联重氮盐生成有色产物，定位于胞浆，ALP活性部位呈蓝色。
采用偶氮偶联法检测TRAP活性，其基本原理是在酸性缓冲液中，细胞内酸性磷酸酶催化底物水解，生成物进而与一种稳定的重氮盐偶联，生成不溶性的偶氮染料沉淀，当底物中存在酒石酸时，TRAP活性部位呈鲜红色或深红色，定位胞浆。
完成以上染色后，将鳞片置于体式显微镜下拍照观察，通过Image J软件统计鳞片染色的平均光密度值及染色面积占整体鳞片面积的百分比。
用显微镊摘取斑马鱼另一侧全部鳞片固定于RNA提取液中，通过反转录法获得cDNA。通过StepOne试剂盒进行实时聚合酶链式反应定量检测ALP、TRACP、OPG、Runx2b、CTSK、sp7。扩增条件为，95℃下3min初始变性，95℃，30s变性和60℃，40s退火，40个循环数。以β-actin作为内参，采用2-△△CT计算各基因mRNA的相对量。
Figure BDA0003746172840000111
Figure BDA0003746172840000121
3、实验结果
3.1枸杞子活性提取物对斑马鱼成鱼鳞片骨吸收陷窝的影响
骨吸收陷窝的形成是由成骨细胞与破骨细胞活性失衡所致。与空白组相比，100μmol·L-1泼尼松龙能够明显诱导斑马鱼成鱼鳞片吸收陷窝的形成，表现为鳞片边缘钙基质缺损，单位面积茜素红染色光密度值下降。如表4和表5，实施例2-5均能够显著抑制鳞片边缘骨吸收陷窝的形成，提高单位面积鳞片茜素红染色光密度值，其中实施例4效果最好。
表4各组斑马鱼成鱼鳞片缺损面积
组别 鳞片缺损面积(×10<sup>3</sup>μm<sup>2</sup>)
空白组 0.00±0.00
模型组 8.96±8.73<sup>###</sup>
实施例2 0.13±0.44<sup>***</sup>
实施例3 0.26±0.43<sup>***</sup>
实施例4 0.09±0.20<sup>***</sup>
实施例5 0.18±0.23<sup>***</sup>
注：n＝10，与空白组比较，###P＜0.001，和模型组比较，***P＜0.001.
表5各组斑马鱼成鱼鳞片染色光密度值
Figure BDA0003746172840000122
Figure BDA0003746172840000131
注：n＝10，与空白组比较，###P＜0.001，和模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001
3.2枸杞子活性提取物对斑马鱼成鱼鳞片中ALP的影响
ALP活性的高表达是成骨细胞分化成熟的早期标志。与空白组相比，100μmol·L-1泼尼松龙能够显著抑制斑马鱼成鱼鳞片ALP活性及活动面积，表现为鳞片ALP着色面积减少，单位面积ALP染色光密度值下降。如表6和表7，实施例2-5均能够提高鳞片中ALP染色面积和单位面积ALP染色光密度值，其中以实施例4效果最好。
表6各组斑马鱼成鱼鳞片ALP染色光密度值
组别 ALP染色光密度值(OD)
空白组 168.79±21.21
模型组组 87.30±16.04<sup>###</sup>
实施例2 133.03±18.71<sup>***</sup>
实施例3 140.01±16.24<sup>***</sup>
实施例4 157.38±17.18<sup>***</sup>
实施例5 149.31±19.43<sup>***</sup>
注：n＝10，与空白组比较，###P＜0.001，和模型组比较，***P＜0.001.
表7各组斑马鱼成鱼鳞片ALP染色面积
组别 ALP染色面积(μm<sup>2</sup>)
空白组 70.90±11.21
模型组 26.76±5.56<sup>###</sup>
实施例2 67.60±7.72<sup>***</sup>
实施例3 68.63±4.86<sup>***</sup>
实施例4 70.20±4.56<sup>***</sup>
实施例5 63.82±5.69<sup>***</sup>
注：n＝10，与空白组比较，###P＜0.001，和模型组比较，***P＜0.001.
3.3枸杞子活性提取物对斑马鱼成鱼鳞片中TRAP的影响
骨组织TRAP染色可以反应破骨细胞活性。与空白组相比，100μmol·L-1泼尼松龙能够增强斑马鱼成鱼鳞片中TRAP活性及活动面积，表现为鳞片TRAP着色面积增大，单位面积TRAP染色光密度值上升。如表8和表9，实施例2-5能够抑制鳞片中TRAP染色阳性面积和单位面积光密度值，抑制破骨细胞激活，其中以实施例4效果最显著。
表8各组斑马鱼成鱼鳞片TRAP染色光密度值
组别 TRAP染色光密度值(OD)
空白组 13.25±6.11
模型组 60.02±21.69<sup>###</sup>
实施例2 37.98±8.20
实施例3 20.47±6.36<sup>***</sup>
实施例4 11.54±7.32<sup>***</sup>
实施例5 27.54±5.26<sup>***</sup>
注：n＝10，与空白组比较，###P＜0.001，和模型组比较，***P＜0.001.
表9各组斑马鱼成鱼鳞片TRAP染色面积
组别 TRAP染色面积(μm<sup>2</sup>)
空白组 0.23±0.23
模型组 4.54±1.90<sup>###</sup>
实施例2 3.03±1.58
实施例3 2.02±1.32<sup>**</sup>
实施例4 0.87±0.52<sup>***</sup>
实施例5 1.55±0.79<sup>***</sup>
注：n＝10，与空白组比较，###P＜0.001，和模型组比较，***P＜0.001.
3.4枸杞子活性提取物对斑马鱼成鱼鳞片中骨形成基因表达的影响
泼尼松龙能够显著提高CTSK、TRACP mRNA表达量，下调Runx2b、ALP、sp7、OPG mRNA表达量。如表10，实施例2-5提取物能够显著恢复泼尼松龙诱导的以上基因的异常表达，其中以实施例4效果最好。
表10各组斑马鱼成鱼鳞片骨形成相关基因的表达
组别 ALP sp7 Runx2b OPG CTSK TRACP
空白组 1.45±0.48 1.41±0.51 1.14±0.24 1.71±0.68 0.53±0.13 0.56±0.20
模型组 0.37±0.14<sup>###</sup> 0.06±0.03<sup>###</sup> 0.21±0.12<sup>###</sup> 0.39±0.18<sup>##</sup> 1.97±0.63<sup>###</sup> 1.46±0.38<sup>###</sup>
实施例2 1.22±0.25<sup>***</sup> 0.83±0.60<sup>*</sup> 0.75±0.11<sup>***</sup> 1.17±0.40<sup>**</sup> 0.54±0.14<sup>***</sup> 0.67±0.26<sup>**</sup>
实施例3 2.57±0.82<sup>***</sup> 0.13±0.08 3.17±0.97<sup>***</sup> 2.55±1.31<sup>**</sup> 0.47±0.24<sup>***</sup> 0.40±0.21<sup>***</sup>
实施例4 3.01±0.76<sup>***</sup> 0.98±0.21<sup>***</sup> 3.78±0.75<sup>***</sup> 3.02±0.86<sup>***</sup> 0.32±0.13<sup>***</sup> 0.21±0.12<sup>***</sup>
实施例5 2.50±0.85 0.18±0.02<sup>***</sup> 2.02±0.83<sup>**</sup> 1.65±1.21<sup>*</sup> 0.48±0.32<sup>***</sup> 0.42±0.23<sup>***</sup>
注：n＝10，与空白组比较，###P＜0.001，和模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001.
以上实验结果表明，本实施例中的制备所得的枸杞子活性提取物能够增强成骨细胞数量及活性，抑制破骨细胞数量及活性，调节骨形成及骨吸收过程相关基因的表达，促进骨骼形成，骨矿化基质的形成，从而发挥抗骨质疏松的作用。
本发明通过不同的制备工艺获得的枸杞子活性提取物的有效成分种类和含量不同，活性也不同，通过本发明比较可知，实施例4制备得到的枸杞子活性提取物提取物活性最强，取得了非常好的预料之外的技术效果。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种抗骨质疏松症的枸杞子活性提取物，其特征在于，该组合物由下列重量份数的原料制成：
枸杞子多糖 1-10份，枸杞子总黄酮1-5份。
2.根据权利要求1所述的抗骨质疏松症的枸杞子活性提取物，其特征在于，该组合物由下列重量份数的原料制成：
枸杞子多糖 5-10份，枸杞子总黄酮1-3份。
3.根据权利要求1所述的抗骨质疏松症的枸杞子活性提取物，其特征在于，该组合物由下列重量份数的原料制成：
枸杞子多糖 10份，枸杞子总黄酮1份。
4.根据权利要求1~3任一项所述的一种抗骨质疏松症的枸杞子活性提取物，其特征在于，所述枸杞子多糖的制备方法为：枸杞子加入6~10倍量的乙醇回流提取1~3次，每次1~2h；取乙醇提取后的枸杞药渣，加入10~16倍量水回流提取1~3次，每次1~2h，将水提取液减压浓缩至浸膏，加至30~40%浓度的乙醇，室温沉淀以除去大分子果胶，上清液减压浓缩至浸膏，加至70~80%浓度的乙醇室温沉淀24~48h，沉淀冷冻干燥后即为枸杞子多糖。
5.根据权利要求1~3任一项所述的一种抗骨质疏松症的枸杞子活性提取物，其特征在于，所述枸杞子总黄酮的制备方法为：枸杞子加入6~15倍量的乙醇回流提取1~3次，每次1~2h，将醇提取液减压浓缩后，加至大孔吸附树脂，静态吸附，依次用纯水、30~50%乙醇各洗脱，然后用60~70%乙醇洗脱，将60~70%乙醇洗脱液减压浓缩，干燥，得枸杞子总黄酮。
6.权利要求1~3任一项所述的一种抗骨质疏松症的枸杞子活性提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取干燥的枸杞子，加入5-20倍量的乙醇，回流提取1-3次，每次1~3h，过滤，滤液浓缩至0.3g/mL-1.0g/mL；
（2）取步骤（1）枸杞子滤渣，加入5-20倍量的纯水，加热回流提取1-3次，每次1~3h，过滤，滤液浓缩至浸膏；
（3）向步骤（2）中加入20%-50%乙醇，搅拌均匀，静置24~48h，过滤，取上清液，浓缩至浸膏；
（4）向步骤（3）浸膏中加入70%-85%乙醇，搅拌均匀，过滤，取沉淀，干燥后即为枸杞子多糖；
（5）取步骤（1）中浓缩液，搅拌均匀后，上大孔树脂柱，先分别用水或者体积浓度10~20%浓度的乙醇洗脱，再用体积浓度为30%-95%的乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩，得到枸杞子总黄酮；
（6）取步骤（4）枸杞多糖与步骤（5）枸杞总黄酮类成分按重量比混合均匀，即得。
7.根据权利要求6所述的一种抗骨质疏松症的枸杞子活性提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤（1）中提取条件为：依次取枸杞子15倍、10倍和6倍量体积浓度为80%的乙醇，加热回流提取2次，每次2h，过滤，合并滤液，浓缩至0.5g/mL。
8.根据权利要求6所述的一种抗骨质疏松症的枸杞子活性提取物的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述的枸杞子水提取条件为：取步骤（1）枸杞子药渣，依次加入10倍量的纯水，加热回流提取2次，每次2h，过滤，合并滤液，减压浓缩至浸膏状；
步骤（3）中制备条件为：向步骤（2）浓缩液中加入30%乙醇，搅拌均匀，静置24h，取上清，浓缩至浸膏状；
步骤（4）中制备条件为：向步骤（3）浓缩液中加入80%乙醇，搅拌均匀，静置24h，取沉淀用80℃的95%乙醇洗涤，抽滤，所得沉淀即为枸杞多糖；
步骤（5）中枸杞子总黄酮制备条件为：先用纯水洗脱5个柱体积，再用30%的乙醇洗脱5个柱体积，再用60%的乙醇洗脱4个柱体积，将60%乙醇洗脱液浓缩，经冷冻干燥后即为枸杞子总黄酮。
9.权利要求1~3任一项所述的枸杞子活性提取物在制备抗骨质疏松症的药物、保健食品及特殊功能膳食中的应用。
10.权利要求1~3任一项所述的枸杞子活性提取物在制备抗糖皮质激素性骨质疏松症的药物、保健食品及特殊功能的膳食中的应用。
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