CN115381811B - Cyclomorusin制备抗骨质疏松药物的应用 - Google Patents
Cyclomorusin制备抗骨质疏松药物的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了Cyclomorusin在制备抗骨质疏松药物中的应用。本发明中的实验证明Cyclomorusin在无毒浓度下抑制了破骨细胞的分化及破骨细胞的骨吸收活性；下调RANKL/RANK/TRAF6通路中TRAF6、NFATc1、c‑fos、CTSK、TRAP mRNA水平；下调RANKL/RANK/TRAF6通路中TRAF6、NFATc1、CTSK、TRAP蛋白水平，表现出了显著的抗骨质疏松活性。因此，Cyclomorusin具有制备抗骨质疏松药物的应用前景。
Description
发明领域：
本发明属于生物医药领域，具体涉及Cyclomorusin在制备抗骨质疏松药物中的应用。
背景技术：
随着人类社会逐渐进入老龄化，骨质疏松症的患病率逐年增加。骨质疏松症是一种全身性疾病，其特征在于单位体积骨量减少，骨强度受损，骨的脆性增加使骨易发生骨折。老年人是世界上增长最快的人口，随着人们年龄的增长，骨量下降，骨折的风险增加。骨质疏松症的主要特征是疼痛、骨折和畸形，不仅严重威胁着人们的健康，也给人们带来了沉重的经济负担。
骨骼是一个动态活性组织，它通过持续的重塑来维持其矿化平衡及自身的结构完整。骨重塑是一个复杂的生物学过程，在这一过程中，破骨细胞完成骨的吸收功能，成骨细胞主导骨的形成功能，健康骨骼处于骨形成与骨吸收的动态平衡状态。在病理状态下，若破骨细胞过度活跃，这种平衡就会被打破，骨吸收增加使骨密度降低，从而导致骨质疏松的发生。因此，骨质疏松症的防治可以通过抑制破骨细胞从而减少人体骨质流失。
目前，临床上治疗骨质疏松症的药物种类有限，且部分品种如雌激素长期使用毒副作用较大。越来越多的研究表明，传统中药里有许多活性物质具有抗骨质疏松作用，如黄酮类、皂苷类、生物碱类、香豆素类、苯丙酸类化合物等，因此从传统中药里寻找具有抗骨质疏松活性的有效物质，是开发抗骨质疏松药物的重要途径。Cyclomorusin是一种天然黄酮类化合物，关于Cyclomorusin的药理研究很少，目前尚未见其抗骨质疏松方面的研究报道。
发明内容
申请人采用高糖环境下RAW264.7和MC3T3-E1共培养的破骨细胞模型，来研究Cyclomorusin的抗骨质疏松作用。采用MTT法排除Cyclomorusin对RAW264.7和MC3T3-E1细胞毒性的干扰，通过TRAP染色和骨吸收活性实验，发现Cyclomorusin能抑制破骨细胞的分化及骨吸收活性。
RT-PCR和Western Blot研究发现，Cyclomorusin可以下调RANKL/RANK/TRAF6通路中TRAF6、c-fos、NFATc1、CTSK、TRAP mRNA水平和TRAF6、NFATc1、CTSK、TRAP蛋白水平。
本发明发现Cyclomorusin对破骨细胞的形成以及破骨细胞的骨吸收功能均有抑制作用，而破骨细胞的过度活跃会导致骨质疏松症的发生。破骨细胞的成熟分化，与RANK/RANKL/TRAF6信号通路的激活密切相关。Cyclomorusin能够降低RANKL/RANK/TRAF6通路中TRAF6、c-fos、NFATc1、CTSK、TRAP的基因和蛋白表达。
一方面，本申请提供了Cyclomorusin在制备抗骨质疏松药物中的应用。
进一步地，Cyclomorusin抑制破骨细胞生成。
进一步地，Cyclomorusin抑制破骨细胞骨吸收活性。
进一步地，Cyclomorusin抑制RANKL/RANK/TRAF6通路。
进一步地，Cyclomorusin降低了RANKL/RANK/TRAF6通路中TRAP、CTSK、TRAF6和NFATC1的基因和蛋白表达。
进一步地，所述药物中Cyclomorusin的浓度为3.75-15μM，或者施用药物后局部药物浓度为3.75-15μM，优选15μM。
进一步地，所述药物剂型选自片剂、胶囊剂、颗粒剂、滴丸、散剂、微丸、栓剂、灌肠剂、软膏剂、凝胶剂、糊剂、乳剂、膜剂、贴剂。
进一步地，所述药物中包含药学上可接受的辅料。
进一步地，所述药物中包含非Cyclomorusin的抗骨质疏松药物。
本申请中Cyclomorusin，又被称为环桑色烯，环桑黄酮，环桑白皮素，环桑根皮素等，其CAS编号为62596-34-3，分子式为C25H22O6，分子量为418.44，该化合物具体结构如下式：
本领域技术人员可以根据来源、提取/合成工艺、质量要求的区别在使用不同纯度的Cyclomorusin。
除了上述剂型外，本领域技术人员可以根据药剂学领域常识和治疗需要选择其他剂型；并选用适合的辅料，辅料包括但不限于溶剂、助溶剂、缓冲剂、渗透压调节剂、稳定剂、分散剂、抗氧化剂、防腐剂、包衣、胶囊壳、丸芯、填充剂、粘合剂、缓释剂、矫味剂等。
Cyclomorusin中可以作为药物中的唯一抗骨质疏松成分，也可以与其他已知抗骨质疏松活性成分制备入同一药物组合物中或者与其他抗骨质疏松活性成分联合使用。
有益效果：
本发明首次发现了Cyclomorusin在防治骨质疏松症方面的新用途，为制备抗骨质疏松药物和扩展Cyclomorusin的用途提供了新选择，在制药行业具有重要的应用价值。
附图说明
图1：化合物结构图；
图2：Cyclomorusin(CYM)对RAW264.7和MC3T3-E1细胞存活率的影响；
图3：Cyclomorusin(CYM)抑制破骨细胞的生成；
图4：Cyclomorusin(CYM)抑制破骨细胞的骨吸收活性；
图5：Cyclomorusin(CYM)对RANKL/RANK/TRAF6通路中TRAP、CTSK、TRAF6、C-FOS和NFATC1 mRNA表达的抑制作用；
图6：Cyclomorusin(CYM)对RANKL/RANK/TRAF6通路中TRAP、CTSK、TRAF6和NFATC1蛋白表达的抑制作用。
具体实施方式
实施例1：Cyclomorusin对RAW264.7和MC3T3-E1细胞存活率的影响
将RAW264.7或MC3T3-E1细胞接种于96孔板，接种密度1.8×104个/cm2。细胞随机分为对照组和实验组，分别设置三组复孔。实验组细胞接种24h后加入不同浓度的Cyclomorusin(RAW264.7细胞：3.1、6.2、12.5、25、50、100、200和400μM；MC3T3-E1细胞：2.3、4.6、9.3、18.7、37.5、75、150和300μM)，对照组只更换培养基，继续培养48h。48h后，加入10μL 5mg/mL的MTT，于培养箱4h后，弃上清，每孔再加入150μL的DMSO，振荡器振荡10min后于490nm测定吸光值。
结果如图2所示，与对照组相比，Cyclomorusin对RAW264.7细胞在3.1μM-25μM时细胞存活率无显著性差异(P>0.05)，50μM-400μM时细胞存活率明显下降(P<0.01)；与对照组相比，Cyclomorusin对MC3T3-E1细胞在2.3μM-18.7μM时细胞存活率无显著性差异(P>0.05)，37.5μM-300μM时细胞存活率明显下降(P<0.01)。综合考虑，选择对RAW264.7和MC3T3-E1细胞无毒性的Cyclomorusin浓度(3.75、7.5和15μM)用于后续实验。
实施例2：Cyclomorusin对破骨细胞生成的抑制作用
将处于对数生长期的RAW264.7和MC3T3-E1细胞按照1:2的比例接种于24孔板，接种密度1.8×104个/cm2，每组设置3组重复。培养24h后换液，对照组换用15mM葡萄糖浓度的培养基；模型组换用45mM葡萄糖浓度的培养基；阳性对照组用45mM葡萄糖浓度的培养基，并添加10-2μM的雌二醇；Cyclomorusin给药组用45mM葡萄糖浓度的培养基，并添加不同浓度的Cyclomorusin(3.75、7.5和15μM)。此后每隔2d换液，Cyclomorusin和雌二醇作用5d后处理细胞。细胞诱导完成后，按照leukdcyte acid phosphatase(trap)kit对细胞进行染色，在显微镜下对TRAP阳性细胞进行计数，并拍照。
结果如图3所示，与对照组相比，模型组破骨细胞数量具有显著性差异(P<0.01)，表明高糖环境可以促进破骨细胞生成。与模型组相比较，Cyclomorusin给药组破骨细胞数量逐渐减少，呈现出一定的浓度依赖性，表明Cyclomorusin对破骨细胞形成具有抑制作用。
实施例3：Cyclomorusin对破骨细胞骨吸收活性的抑制作用
牛股骨骨磨片剪成适当的大小，放入24孔板中，将RAW264.7和MC3T3-E1细胞按照1:2的比例接种其中，接种密度1.8×104个/cm2，每组设置3组重复。实验分组、细胞换液操作同上。7d后，处理骨磨片。培养板弃培养基后，用PBS轻洗一遍，加入300μL10％的甲醛固定5min，弃甲醛后ddH2O清洗一遍，再用300μL0.25M的氨水超声3min，然后用80％、85％、90％、100％的乙醇进行梯度脱水，最后用300μL 0.1％的甲苯胺蓝染色3min，ddH2O洗净后使用倒置荧光显微镜拍照并积分计算面积。
RAW264.7和MC3T3-E1细胞在共培养条件下，RAW264.7细胞受到细胞因子的作用形成破骨细胞并吸附在骨磨片上行使骨吸收功能。通过甲苯胺蓝染色，在显微镜下可以看到形状和大小不规则的蓝紫色吸收陷窝。在机体内，破骨细胞是唯一行使骨吸收功能的细胞，而骨陷窝的面积大小可以反映和评价破骨细胞的骨吸收能力。实验结果如图4所示，与对照组相比，模型组骨吸收面积增加，差异具有显著性(P<0.01)，表明高糖环境可以增强破骨细胞骨吸收能力；与模型组相比，Cyclomorusin组骨吸收面积随着给药浓度增加而逐渐减小，差异具有显著性(P<0.01)，表明Cyclomorusin对破骨细胞骨吸收活性具有抑制效果。
实施例4：Cyclomorusin对RANKL/RANK/TRAF6通路中TRAP、CTSK、TRAF6、C-FOS和NFATC1 mRNA表达的抑制作用
将处于对数生长期的RAW264.7和MC3T3-E1细胞按照1:2的比例接种于6孔板，接种密度1.8×104个/cm2。实验分组、细胞换液操作同上。5d后按照Total RNA Kit I试剂盒的说明书进行总RNA提取，采用RT EasyTM II kit将其逆转录为单链cDNA，通过RT-PCR法检测相关炎症因子mRNA表达水平。PCR扩增反应采用三步法，预变性：95℃3min，共设40个循环，循环中模板变性：95℃，10s；退火：56℃，20s；延伸：72℃，10s。采用β-actin为内参，以2-ΔΔct法计算相关基因mRNA表达水平。引物序列见下表：
表1目的基因引物序列
结果如图5所示，高糖处理RAW264.7和MC3T3-E1细胞共培养环境后，与对照组相比，TRAP、CTSK、TRAF6、C-FOS和NFATC1mRNA表达水平显著上升(P<0.01)。与模型组相比，Cyclomorusin给药组TRAP、CTSK、TRAF6、C-FOS和NFATC1 mRNA表达水平逐渐降低，差异具有显著性(P<0.05或P<0.01)。结果表明Cyclomorusin可以抑制破骨细胞相关mRNA的表达水平。
实施例5：Cyclomorusin对RANKL/RANK/TRAF6通路中TRAP、CTSK、TRAF6和NFATC1蛋白表达的抑制作用
将处于对数生长期的RAW264.7和MC3T3-E1细胞按照1:2的比例接种于6孔板，接种密度1.8×104个/cm2。实验分组、细胞换液操作同上。5d后提取蛋白，然后按照BCA蛋白定量试剂盒说明书进行操作，测定各样品中蛋白浓度。蛋白质(30-40μg)在10％SDS-PAGE电泳分离后，转移到PVDF膜上。用5％脱脂牛奶封闭1h后，用一抗在4℃下孵育过夜，TBST洗涤3次，然后暴露于HRP标记的二抗室温孵育1h。TBST洗涤3次后，加入ECL化学发光显影液(避光)，然后置于Bio-Rad显影仪上显影曝光。通过Image Lab6.0(Bio-Rad,CA,USA)分析蛋白质条带的强度。
结果如图6所示，高糖处理RAW264.7和MC3T3-E1共培养细胞后，与对照组相比，TRAP、CTSK、TRAF6和NFATC1蛋白表达水平显著上升(P<0.01)；与模型组相比，Cyclomorusin给药组TRAP、CTSK、TRAF6和NFATC1蛋白表达水平逐渐降低，差异具有显著性(P<0.05或P<0.01)。结果表明Cyclomorusin可以抑制RANKL/RANK/TRAF6的破骨细胞信号通路。
综合以上实例，Cyclomorusin在无毒浓度下抑制了破骨细胞的分化及破骨细胞的骨吸收活性；Cyclomorusin可下调RANKL/RANK/TRAF6通路中TRAF6、c-fos、NFATc1、CTSK、TRAP mRNA水平；Cyclomorusin可下调RANKL/RANK/TRAF6通路中TRAF6、NFATc1、CTSK、TRAP蛋白水平，表现出了显著的抗骨质疏松活性。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 贵州大学
<120> Cyclomorusin制备抗骨质疏松药物的应用
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
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Claims (7)
1. Cyclomorusin在制备抗骨质疏松药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其中Cyclomorusin抑制破骨细胞生成。
3.根据权利要求1所述的应用，其中Cyclomorusin抑制破骨细胞骨吸收活性。
4.根据权利要求1所述的应用，其中Cyclomorusin抑制RANKL/RANK/TRAF6通路。
5.根据权利要求4所述的应用，其中Cyclomorusin降低RANKL/RANK/TRAF6通路中TRAP、CTSK、TRAF6和NFATC1的基因和蛋白表达。
6.根据权利要求1所述的应用，其中所述药物剂型选自片剂、胶囊剂、颗粒剂、滴丸、散剂、微丸、栓剂、灌肠剂、软膏剂、凝胶剂、糊剂、乳剂、膜剂、贴剂。
7.根据权利要求6所述的应用，其中所述药物中包含药学上可接受的辅料。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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