CN110563587B - 一种具有抗炎活性的芦荟大黄素琥珀酰酯类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种具有抗炎活性的芦荟大黄素琥珀酰酯类化合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有抗炎活性的芦荟大黄素琥珀酰酯类化合物及其制备方法和应用。本发明所述的芦荟大黄素琥珀酰酯类化合物结构式如式I所示。研究表明本发明的化合物能够抑制急性、亚急性和免疫性炎症的发生，且治疗效果安全有效。因此，本发明的一种具有抗炎作用的芦荟大黄素琥珀酰酯类化合物将在抗炎药物的研发上发挥重要的应用价值。

Description

一种具有抗炎活性的芦荟大黄素琥珀酰酯类化合物及其制备 方法和应用
技术领域
本发明涉及一种化合物及其制备方法和应用。特别涉及一种具有抗炎活性的芦荟大黄素琥珀酰酯类化合物及其制备方法和应用，本发明属于生物制药技术领域。
背景技术
炎症是十分常见且重要的基本病理过程，是机体免疫系统与外源性或内源性损伤因子对抗而产生的局部或全身性的保护性反应，其基本病理变化包括变质、渗出和增生。炎症常见于多种疾病的病理过程，根据持续时间不同可分为急性炎症和慢性炎症。急性炎症早期主要以血管系统的反应为主，表现红、肿、热、痛等症状，急性炎症后期的病理与慢性炎症的病理过程相似，主要是细胞修复。其实质就是多种免疫细胞和炎症细胞的功能紊乱，其合成和释放的细胞因子和炎症介质交互作用，反过来又促进免疫细胞和炎症细胞功能紊乱，造成淋巴细胞、巨噬细胞、滑膜细胞和中性粒细胞分泌的细胞因子、趋化因子和蛋白水解酶等含量升高。其中由单核巨噬细胞产生的白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和主要由活化的单核细胞和巨噬细胞产生的TNF-α是炎症反应中的主要细胞因子。对炎症细胞有趋化和粘附作用，可促进活化细胞进入炎性部位，促进炎症细胞附壁增殖，从而诱导炎症并促进炎症反应发生；同时还能增加血管通透性、刺激内皮细胞释放血小板活性因子及前列环素等。适当的炎症反应可帮助机体清除有害物质，将损伤局限化，启动愈合过程对组织进行修复，从而发挥保护作用。但炎症反应若未及时充分消退或过度强烈，则因释放大量炎症细胞因子和炎症介质，使抗炎和促炎反应失衡，导致炎症反应持续性进行，从而加重组织和细胞损伤，引起慢性炎症、慢性疾病和肿瘤转化等各种疾病的发生，严重威胁生命安全。
因此，抗炎药物的介入至关重要。但是目前应用的甾体抗炎药(steroidal anti-inflammatory drugs，SAIDs)和非甾体抗炎药(non-steroidal anti-inflammatorydrugs，NSAIDs)这两类药物都有比较明显的不良反应，包括胃肠功能紊乱、皮肤反应、肾脏、中枢神经系统及心血管系统的损伤，尤其一旦长期和高剂量使用，就会引起人体物质代谢和水盐代谢紊乱、诱发加重消化性溃疡、引起骨质疏松等，甚至诱发严重的并发症。所以，开发安全有效的抗炎药物具有重要的临床价值。
芦荟大黄素(1，8-二羟基-3-羟甲基-9，10-蒽醌)，广泛存在于大黄、虎杖、决明子等中药中，现代科学研究显示，芦荟大黄素不但具有良好的致泻作用，而且还具有很好的抗菌、抗炎、抗氧化、抗病毒和抗传染性原虫等多方面药理活性。但芦荟大黄素本身具有毒性高，机体吸收不好等缺点，芦荟大黄素目前还没有直接用于临床方面的报道。经过化学修饰的芦荟大黄素琥珀酰酯类化合物能表现出比芦荟大黄素更好的抗炎抗菌活性。因此对芦荟大黄素进行修饰改造是非常必要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有抗炎活性的芦荟大黄素琥珀酰酯类化合物，并通过建立急性、亚急性和免疫性炎症模型，观察该化合物对各种炎症模型的影响以及其药理作用从而阐明该化合物的抗炎作用，为炎症相关性疾病的治疗提供新的有效低毒的药物。
为了实现本发明的目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明的一种具有抗炎活性的芦荟大黄素琥珀酰酯类化合物，其具有式I所示的结构，其中，R分别为-C1-5烷基或芳环；
Figure BDA0002182756910000021
其中，优选的，R为乙基，当R为乙基时，所述的芦荟大黄素琥珀酰酯类化合物为芦荟大黄素琥珀酰乙酯，化学名：1,8-二羟基-3-(羟甲基)-蒽醌丁二酸乙酯，分子式：C21H18O8，分子量：398。
进一步的，本发明还提出了一种具有抗炎活性的芦荟大黄素琥珀酰酯类化合物的制备方法，包含以下步骤：
1)琥珀酸单乙酯的合成：在圆底烧瓶中加入琥珀酸酐，无水乙醇，90℃条件下加热回流，回收过量乙醇得淡黄色油状物即琥珀酸单乙酯，该产物不分离直接进行下一步反应；
2)芦荟大黄素琥珀酰酯类化合物的合成：芦荟大黄素及步骤1)得到的琥珀酸单乙酯混合后缓慢滴加浓硫酸，用加热套在100℃条件下反应；产物溶于二氯甲烷中，抽滤去除不溶物；依次碳酸氢钠溶液萃取，纯水萃取，最后回收二氯甲烷得芦荟大黄素琥珀酰酯类化合物粗品；
3)芦荟大黄素琥珀酰酯类化合物的柱层析分离：以二氯甲烷和乙酸乙酯为洗脱剂进行硅胶柱层析分离，石油醚清洗后抽滤，得到所述的芦荟大黄素琥珀酰酯类化合物纯品。
其中，优选的，所述的制备方法包含以下步骤：
1)琥珀酸单乙酯的合成：在圆底烧瓶中加入琥珀酸酐5g，无水乙醇8ml，用加热套在90℃条件下加热回流3h，回收过量乙醇得淡黄色油状物即琥珀酸单乙酯，该产物不分离直接进行下一步反应；
2)芦荟大黄素琥珀酰酯类化合物的合成：在圆底烧瓶中加入芦荟大黄素1g及步骤1)得到的琥珀酸单乙酯6g后缓慢滴加0.1ml硫酸，用加热套在100℃条件下反应2h；产物溶于15ml二氯甲烷中超声5min后，抽滤去除不溶物；二氯溶液用60ml的2.5％碳酸氢钠溶液萃取4次，纯水30mL萃取2次，取二氯甲烷层，后回收二氯甲烷得芦荟大黄素琥珀酰酯类化合物粗品；
3)芦荟大黄素琥珀酰酯类化合物的柱层析分离：以二氯甲烷：乙酸乙酯＝6:1为洗脱剂进行硅胶柱层析分离，取第一大色带，后回收溶剂，产物中加入五倍体积的石油醚清洗后抽滤，滤饼用石油醚清洗两次得所述的芦荟大黄素琥珀酰酯类化合物纯品。
二甲苯致小鼠耳肿胀模型通过模拟机体急性炎症的病理状态，常被用于评价中药创新药物研发中药物的抗炎作用。二甲苯因操作简便常被选择为药理实验抗炎作用的造模致炎剂。它可诱导组胺、激肽及纤维蛋白溶解酶等炎症介质释放，进而引起局部毛细血管通透性的增加、炎症细胞的浸润和急性渗出性炎性水肿等。本发明通过观察芦荟大黄素琥珀酰酯类化合物对耳廓肿胀的抑制作用，从而评价本发明对急性炎症抗炎作用。结果表明，与模型组比较，本发明化合物的高剂量组(100mg/kg)、中剂量组(50mg/kg)、低剂量组(25mg/kg)和醋酸地塞米松组各组均有一定抑制小鼠耳廓急性炎症的作用，其肿胀抑制率分别为50.7％、46.6％、37.7和71.7％。可发现低剂量组对二甲苯所致耳肿胀的抑制率作用最强，仅略低于阳性药醋酸地塞米松组。
醋酸地塞米松，为肾上腺皮质激素类药。其主要用于过敏性与自身免疫性炎症性疾病，是临床和市场上最常用的抗炎药物之一。因此在本发明中的二甲苯致小鼠耳肿胀模型、棉球肉芽肿模型和内毒素炎症模型，均采用醋酸地塞米松作为阳性药，以此来考察本化合物对炎症抑制作用的程度。
棉球肉芽肿模型作为一种亚急性炎症模型，常用于筛选药物对炎症增生期的影响。肉芽肿是被不能消化的异物长时间刺激局部而导致巨噬细胞及其演化的细胞局限性浸润和增生所形成的境界清楚的结节状病灶。本发明通过观察芦荟大黄素琥珀酰酯类化合物对棉球肉芽肿增生的抑制作用，从而阐明该化合物对慢性炎症抗炎作用。结果表明，本发明化合物的高、中、低剂量均可显著抑制棉球肉芽肿的形成，表现为肉芽的湿重、干重显著降低(P＜0.001或P＜0.01)，具有统计学差异。并且中剂量组(50mg/kg)和低剂量组(25mg/kg)对肉芽肿湿重的抑制程度与阳性药醋酸地塞米松组相近，对干肉芽肿的抑制率分别为35.3％、33.3％、17.8％。
内毒素炎症模型会在炎症的发生、发展过程中涉及到众多的器官和炎症因子,是较理想的抗炎药物免疫性炎症筛选模型。内毒素是革兰阴性细菌细胞壁的组成成分，其化学成份是脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)。LPS是重要的致炎因子，大量和持续释放会导致炎症发生，其主要是通过直接作用于细胞膜，刺激免疫系统和炎症细胞释放炎症因子(如TNF-α、IL-1β和IL-6)，放大炎症反应,出现血管通透性增强、炎症细胞浸润以及全身炎症反应。本发明通过观察芦荟大黄素琥珀酰酯类化合物对内毒素炎症模型诱导的炎症反应的抑制作用，从而证实本发明的化合物在体内和体外上的抗炎作用。
结果表明，在体内水平上，不同浓度的芦荟大黄素琥珀酰酯类化合物(6.25mg/kg、12.5mg/kg、25mg/kg、50mg/kg)处理后均可以降低LPS所诱导小鼠的肺湿干重比的升高，而且6.25mg/kg、12.5mg/kg、25mg/kg三个剂量组呈现浓度依赖趋势，随着浓度增加，下降越明显；同时不同浓度的芦荟大黄素琥珀酰酯类化合物还可以明显缓解LPS诱导引起的小鼠的肺和肝组织病理性损伤。此外，对LPS诱导所引起的血糖的降低以及IL-6炎症细胞因子的升高也具有明显的抑制作用。同时在各项结果中，我们还可以发现芦荟大黄素琥珀酰酯类化合物25mg/kg组与阳性药醋酸地塞米松组相比，其对炎症抑制的作用程度相近，无明显差异。
在体外水平上，LPS+25μM芦荟大黄素琥珀酰酯类化合物组、LPS+50μM芦荟大黄素琥珀酰酯类化合物组处理均可降低LPS所诱导的细胞炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1βmRNA的表达,尤以IL-6mRNA的表达最为明显(下降至LPS组的300倍)，且对PMA诱导分化的THP-1巨噬细胞活性没有影响。
因此，更进一步的，本发明还提出了所述的具有抗炎活性的芦荟大黄素琥珀酰酯类化合物在制备抗炎药物中的用途。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明经过化学修饰制备得到了一种芦荟大黄素衍生物，即芦荟大黄素琥珀酰酯类化合物，实验证明，本发明的化合物能够抑制急性、亚急性和免疫性炎症的发生，且该化合物能表现出比芦荟大黄素更好的抗炎抗菌活性，此外相较于芦荟大黄素具有毒性低、机体易吸收的特点。因此，本发明的一种具有抗炎作用的芦荟大黄素琥珀酰酯类化合物将在抗炎药物研发上发挥重要的应用价值。
附图说明
图1为芦荟大黄素琥珀酰乙酯结构鉴定；
图2a为鼠右耳涂抹二甲苯后，与自身未涂抹二甲苯左耳比较，迅速变红肿大；图2b为各组剪下耳片，n＝7；
图3为芦荟大黄素琥珀酰乙酯对二甲苯致炎模型的评价；
与空白组比较，###P<0.001；与模型组比较，***P<0.001，**P<0.01，n＝7；
图4为芦荟大黄素琥珀酰乙酯对二甲苯致炎模型的评价；
与空白组比较，###P<0.001；与模型组比较，***P<0.001，*P<0.05，n＝7；
图5为芦荟大黄素琥珀酰乙酯对肉芽肿致炎模型的评价；
与模型组比较，***P<0.001，**P<0.01，n＝6；
图6为芦荟大黄素琥珀酰乙酯对肉芽肿致炎模型的评价；
与模型组比较，***P<0.001，**P<0.01，n＝6；
图7为芦荟大黄素琥珀酰乙酯对LPS诱导的免疫炎症模型中小鼠肺湿干重的影响；与空白组比较，**P<0.01，与模型组比较，#P<0.05，n＝5。
图8为芦荟大黄素琥珀酰乙酯对LPS诱导的免疫炎症模型中小鼠肺组织病理学的影响；
图9为芦荟大黄素琥珀酰乙酯对LPS诱导的免疫炎症模型中肝组织病理学的影响；
图10为芦荟大黄素琥珀酰乙酯对LPS诱导的免疫炎症模型血糖的影响；
与空白组比较，*P<0.01，与模型组比较，###P<0.001，##P<0.01,#P<0.05,n＝8；
图11为芦荟大黄素琥珀酰乙酯对LPS诱导的免疫炎症模型血清中炎症细胞因子的影响；
与空白组比较，***P<0.001，与模型组比较，###P<0.001，n＝8；
图12为芦荟大黄素琥珀酰乙酯对LPS诱导的PMA分化的THP-1细胞中促炎因子的影响；
与空白组比较，##P<0.01，与模型组比较，***P<0.001，n＝3；
图13为芦荟大黄素琥珀酰乙酯对LPS诱导的PMA分化的THP-1细胞中促炎因子的影响；
与空白组比较，#P<0.05，与模型组比较，**P<0.01，n＝3；
图14为芦荟大黄素琥珀酰乙酯对LPS诱导的PMA分化的THP-1细胞中促炎因子的影响；
与空白组比较，##P<0.01，与模型组比较，***P<0.001，n＝3；
图15为用cck-8(细胞增殖-毒性检测试剂盒)检测不同浓度芦荟大黄素琥珀酰乙酯对细胞活力的影响；
与空白组比较，各组均P>0.05，无显著性差异，n＝8。
具体实施方法
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1芦荟大黄素琥珀酰乙酯制备和结构鉴定
1.1芦荟大黄素琥珀酰乙酯的制备例1
在圆底烧瓶中加入琥珀酸酐5g，无水乙醇8ml，用加热套在90℃条件下加热回流3h，回收过量乙醇得淡黄色油状物即琥珀酸单乙酯(6.5g,89％)，该产物不分离直接进行下一步反应。在圆底儿烧瓶中加入芦荟大黄素1g及上述琥珀酸单乙酯6g后缓慢滴加0.1ml硫酸，用加热套在100℃条件下反应2h。产物溶于15ml二氯甲烷中超声5min后，抽滤去除不溶物。二氯溶液用60ml的2.5％碳酸氢钠溶液萃取4次，纯水30mL萃取2次，取二氯甲烷层。后回收二氯甲烷得芦荟大黄素琥珀酰乙酯粗品。柱层析分离，以二氯甲烷：乙酸乙酯＝6:1为洗脱剂进行硅胶柱层析分离，取第一大色带(可以用薄层板分析)，后回收溶剂。石油醚清洗：上述产物中加入五倍体积的石油醚清洗后抽滤，滤饼用石油醚清洗两次得芦荟大黄素琥珀酰乙酯纯品，黄色粉末(0.5922g，42.3％)。
1.2芦荟大黄素琥珀酰乙酯的制备例2
在圆底烧瓶中加入琥珀酸酐500g，无水乙醇80ml，用加热套在90℃条件下加热回流3h，回收过量乙醇得淡黄色油状物即琥珀酸单乙酯(640g,88％)，该产物不分离直接进行下一步反应。在圆底儿烧瓶中加入芦荟大黄素40g及上述琥珀酸单乙酯240g后缓慢滴加1ml硫酸，用加热套在100℃条件下反应2h。产物溶于600ml二氯甲烷中超声5min后，抽滤去除不溶物。二氯溶液用2400ml的2.5％碳酸氢钠溶液萃取4次，纯水1200mL萃取2次，取二氯甲烷层。后回收二氯甲烷得芦荟大黄素琥珀酰乙酯粗品。柱层析分离，以二氯甲烷：乙酸乙酯＝6:1为洗脱剂进行硅胶柱层析分离，取第一大色带(可以用薄层板分析)，后回收溶剂。石油醚清洗：上述产物中加入五倍体积的石油醚清洗后抽滤，滤饼用石油醚清洗两次得芦荟大黄素琥珀酰乙酯纯品，黄色粉末(10g，16.9％)。
1.3芦荟大黄素琥珀酰乙酯结构鉴定
将上述制备得到的芦荟大黄素琥珀酰乙酯纯品粉末，溶于甲醇。进行结构鉴定：1H-NMR中δ7.32(1H,d,J＝1.1Hz)、7.67(1H,d,J＝1.1Hz)为苯环上处于间位偶合的质子信号，δ7.80(1H,dd,J＝8.3,1.0Hz)、7.71(1H,dd,J＝7.4,1.0Hz)、7.38(1H,dd,J＝8.3,7.4Hz)为芳香邻位质子信号，δ2.61(2H,dd,J＝7.9，5.8)、2.71(2H,dd,J＝7.9,5.8Hz)、4.07(2H,q,J＝7.1Hz)、5.24(2H,s)为4个亚甲基质子信号，δ1.70(3H,t,J＝7.1Hz)为甲基质子信号。碳谱给出21个碳信号，其中δ192.1、181.7为酮羰基碳信号，δ172.2、172.3为酯羰基碳信号，δ161.9、161.8为苯环上连氧碳信号，δ60.7、64.8为连氧亚加基碳信号。在1H-1HCOSY谱中，δ2.61、2.71有相关信号，δ4.07、1.70有相关信号。根据该化合物的DEPT谱可知，结构中含有5个sp2杂化的次甲基碳信号、11个sp2杂化的季碳信号，4个sp3杂化的亚甲基碳信号，1个甲基碳信号。通过HMQC谱对其碳氢信号进行了归属，如表1所示。在HMBC谱中，δ7.80质子与化学位移为δ133.7、118.2的碳信号有远程相关，δ7.71质子与δ124.9、116.4的碳信号有远程相关，δ7.38的质子与δ116.4、161.8、119.8的碳信号有远程相关，δ7.32的质子与δ161.9、115.8、64.8的碳信号有远程相关，δ5.24的质子与δ172.2、122.5、118.2、146.9的碳信号有远程相关。δ2.71的质子与δ172.2的碳信号有远程相关，δ2.61的质子与δ172.3的碳信号有远程相关，δ4.07的质子与δ172.3、14.5的碳信号有远程相关，δ1.70的质子与δ60.7的碳信号有远程相关。综合上述信息确定该化合物结构如图1所示。
表1 NMR data(600MHz,DMSO-d6)
Figure BDA0002182756910000081
Figure BDA0002182756910000091
实施例2芦荟大黄素琥珀酰乙酯对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响
2.1实验材料
实验动物：昆明系小鼠，SPF级，体质量(20±2)g，全雄，购自哈尔滨医科大学第二附属医院动物实验中心。
二甲苯(批号：20171210，天津市富宇精细化工有限公司)；醋酸地塞米松片(批号：H33020822，浙江仙琚制药股份有限公司)，8mm耳肿打耳器、移液枪、12号灌胃器。芦荟大黄素琥珀酰乙酯由实施例1制备得到。
2.2实验分组与方法
2.2.1实验分组
将42只昆明系小鼠，按随机数字表法随机分为6组，每组7只。分别为空白对照组、模型组、芦荟大黄素琥珀酰乙酯高剂量组(100mg/kg)、中剂量组(50mg/kg)、低剂量组(25mg/kg)、醋酸地塞米松组(5mg/kg)。
2.2.2二甲苯致小鼠耳肿胀模型建造
各组适应性喂养3d后灌胃给药，空白对照组和模型组给予等量生理盐水，连续灌胃10d。末次给药1h后,立即右耳前后两面涂二甲苯30μl/只致炎，左耳为对照，间隔30min后将小鼠颈椎脱臼致死,沿耳廓基线剪下两耳，用直径为8mm的打耳器分别在左、右耳同一位置打下圆耳片，用电子天平称耳片重量，记录数据。
2.2.3观察指标
以肿胀度、肿胀率(％)和肿胀抑制率(％)表示:
肿胀度＝致炎后右耳片质量－未致炎左耳片质量
肿胀率＝(致炎后右耳片质量－未致炎左耳片质量)/未致炎左耳片质量×100％
肿胀抑制率＝(用药组平均肿胀度－对照组平均肿胀度)/对照组平均肿胀度×100％
2.3数据统计与分析
本实验中计量数据以均值±标准误(mean±SEM)表示。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)方法进行判别。P<0.05有统计学差异。利用Graphpad Prism 5.0进行数据分析和作图。
2.4实验结果
由图2a可见，小鼠右耳涂抹二甲苯后，与左耳相比明显发现右耳变红、充血、肿大；图2b为各组用8mm打耳器打下的耳片，形状相似、大小均一。对二甲苯致小鼠耳肿胀的抑制作用以耳肿胀度、耳肿胀率、肿胀抑制率进行评价,结果如图3、图4和表2所示,表明与模型组比较，芦荟大黄素琥珀酰乙酯高剂量组(100mg/kg)、中剂量组(50mg/kg)、低剂量组(25mg/kg)和醋酸地塞米松组各组均有一定抑制小鼠耳廓急性炎症的作用，其肿胀抑制率分别为50.7％、46.6％、37.7和71.7％。可发现低剂量组对二甲苯所致耳肿胀的抑制率作用最强，略低于阳性药醋酸地塞米松组。
表2芦荟大黄素琥珀酰乙酯对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀模型的影响(x±s，n＝6)
Figure BDA0002182756910000101
实施例3芦荟大黄素琥珀酰乙酯对棉球致大鼠肉芽肿形成的影响
3.1实验材料
实验动物：SD大鼠，SPF级，体质量(150±2)g，全雄，购自哈尔滨医科大学第二附属医院动物实验中心。
醋酸地塞米松片(批号：H33020822，浙江仙琚制药股份有限公司)，戊巴比妥钠(SIGMA-P3761)。
3.2实验分组与方法
3.2.1实验分组
将36只SD大鼠，按随机数字表法随机分为5组，每组6只。分别为模型组、芦荟大黄素琥珀酰乙酯高剂量组(100mg/kg)、中剂量组(50mg/kg)、低剂量组(25mg/kg)、醋酸地塞米松组(5mg/kg)。
3.2.2棉球致大鼠肉芽肿模型建造
戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，剪掉胸部毛，碘伏常规消毒。于每只大鼠的腹中线切开腹壁，每个切口约0.5-1cm，用镊子将2粒灭菌棉球(每粒20±1mg)分别植入两侧腹股沟皮下，缝合皮肤切口。术后第2天各组小鼠灌胃给药(空白对照组、模型组灌胃给予等量生理盐水)，连续10d。末次给药1h后取出大鼠两侧腹股沟皮下棉球，仔细将棉球连同周围结缔组织取出，剔除棉球周围脂肪组织，称定质量，60℃烘干24h，再称定质量。
3.2.3观察指标
以肉芽肿净量和肿胀抑制率(％)表示:
肉芽肿湿重(g)＝棉球肉芽肿重量－原棉球重量肿胀度
肉芽肿干重(g)＝干燥后棉球肉芽肿重量－原棉球重量肿胀度
肿胀抑制率＝(用药组平均肿胀度－对照组平均肿胀度)/对照组平均肿胀度×100％
3.3数据统计与分析
本实验中计量数据以均值±标准误(mean±SEM)表示。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)方法进行判别。P<0.05有统计学差异。利用Graphpad Prism5.0进行数据分析和作图。
3.4实验结果
与模型组相比，芦荟大黄素琥珀酰乙酯高剂量组(100mg/kg)、中剂量组(50mg/kg)、低剂量组(25mg/kg)和醋酸地塞米松组均可显著抑制棉球肉芽肿形成，表现为肉芽的湿重、干重显著降低(P＜0.001或P＜0.01)，具有统计学意义，结果见图5和图6。并且中剂量组(50mg/kg)和低剂量组(25mg/kg)对肉芽肿湿重的抑制程度与阳性药醋酸地塞米松组相近。芦荟大黄素琥珀酰乙酯的高、中、低剂量均可显著抑制棉球肉芽肿的形成，对干肉芽肿的抑制率分别为35.3％、33.3％、17.8％，结果见表3。
表3芦荟大黄素琥珀酰乙酯对棉球肉芽肿模型的影响(x±s，n＝12)
Figure BDA0002182756910000111
Figure BDA0002182756910000121
实施例4芦荟大黄素琥珀酰乙酯在体内对LPS诱导的免疫炎症模型的影响
4.1实验材料
实验动物：C57BL/6小鼠，SPF级，体质量(20±2)g，全雄，购自哈尔滨医科大学第二附属医院动物实验中心。
脂多糖(LPS)Sigma公司，L2880
醋酸地塞米松片(批号：H33020822，浙江仙琚制药股份有限公司)
Elisa试剂盒(MB-5737A,江苏酶标生物科技有限公司)
血糖仪(三诺安稳血糖仪)
HE染色试剂盒(碧云天)
4.2实验分组与方法
4.2.1实验分组
将56只C57BL/6小鼠，按随机数字表法随机分为7组，每组8只。分别为空白对照组、模型组、芦荟大黄素琥珀酰乙酯组(6.25mg/kg、12.5mg/kg、25mg/kg、50mg/kg，共4组)、醋酸地塞米松组(5mg/kg)。
4.2.2LPS体内免疫炎症模型的建立
各组适应性喂养后灌胃给药，空白对照组和模型组给予等量生理盐水，连续灌胃6d。第7d末次给药1h后，除空白对照组外，其他组通过腹腔注射LPS(12mg/kg)200μL建造体内免疫炎症模型。
4.2.3肺组织湿干重变化
LPS诱导6h后，取各组(n＝6)小鼠全肺，用滤纸擦拭后进行称重，(此时为各组小鼠的肺湿重)，60℃烘干24h，再称定质量(此时为各组小鼠的肺干重)，肺组织湿重/干重比＝肺湿重/肺干重。
4.2.4肝、肺病理组织HE染色
LPS诱导6h后，取各组(n＝3)小鼠左肺及肝右叶，依次进行40g/L多聚甲醛固定，冲水，脱水，用石蜡包埋。4μM切片65℃烘烤过夜，用二甲苯，无水乙醇，90％乙醇，70％乙醇，蒸馏水进行脱蜡，对上述处理好的样品，苏木素染色液染色，浸自来水中吸取多余染色液，伊红染色液染色，随后选择用95％乙醇，二甲苯进行脱水，透明，中性树胶封片。光镜下观察肺和肝组织病理变化。
4.2.5血糖及细胞因子的检测
LPS诱导6h后，小鼠眼眶取血，静置30min后，离心(3000rpm×5min)取上清。取各组适量血清(约2μL)，用血糖仪和试纸测定各组小鼠空腹血糖水平。
其余所有上清液分装后置-80℃保存，待用ELISA法检测各组炎症细胞因子IL-6的变化。
(1)加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步骤操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μL,待测样品孔中先加样品稀释液40μL，然后再加待测样品10μL(样品最终稀释浓度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动摇匀。
(2)温育：用封板模封板后置37℃温育30分钟。
(3)配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用
(4)洗涤：小心揭掉封板模，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
(5)加酶：每孔加入酶标试剂50μL，空白孔除外。
(6)温育：同上；洗涤：同上。
(7)显色：每孔先加入显色剂A50μL，再加入显色剂B50μL，轻轻振荡混匀，37℃避光显色10分钟。
(8)终止：每孔加终止液50μL，终止反应(此时蓝色立转黄色)。
(9)测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量个空的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。
4.3数据统计与分析
本实验中计量数据以均值±标准误(mean±SEM)表示。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)方法进行判别。P<0.05有统计学差异。利用Graphpad Prism 5.0进行数据分析和作图。
4.4实验结果
4.4.1芦荟大黄素琥珀酰乙酯对LPS诱导的免疫炎症模型中小鼠肺湿干重的影响
通过测定小鼠肺湿干重比可以发现(图7)，对照组小鼠肺湿干重比为3.576，LPS模型组小鼠肺湿干重比为4.731。与空白对照组比，有非常明显的统计学差异(n＝5，P<0.01),说明LPS组小鼠产生了明显的肺水肿情况。与模型组相比，我们还可以发现，给与芦荟大黄素琥珀酰乙酯不同浓度(6.25mg/kg、12.5mg/kg、25mg/kg、50mg/kg)和醋酸地塞米松处理后的肺湿干重比明显下降，具有统计学意义。而且6.25mg/kg、12.5mg/kg、25mg/kg三个剂量组呈现浓度依赖趋势，随着浓度增加，下降越明显。其中25mg/kg组对肺湿干重比的抑制程度与阳性药醋酸地塞米松组抑制程度相近，说明芦荟大黄素琥珀酰乙酯对LPS诱导的体内免疫炎症模型所引起的肺水肿损伤具有明显的抑制作用。
4.4.2芦荟大黄素琥珀酰乙酯对LPS诱导的免疫炎症模型中小鼠肺、肝组织病理学的影响
在光学显微镜下观察小鼠肺组织的病理切片可以发现(图8)，与空白组比较，模型组肺泡壁毛细血管扩张充血，肺泡间隔明显增宽，并同时伴有炎症细胞浸润；与模型组比较，给与芦荟大黄素琥珀酰乙酯不同浓度(6.25mg/kg、12.5mg/kg、25mg/kg、50mg/kg)和醋酸地塞米松处理后的上诉症状均得到明显改善。说明芦荟大黄素琥珀酰乙酯对LPS诱导的体内免疫炎症模型所引起的肺组织损伤具有明显的抑制作用。
在光学显微镜下观察小鼠肝组织的病理切片可以发现(图9)，与空白组比较，模型组肝细胞肿胀，中性粒细胞浸润，伴有肝细胞凋亡；与模型组比较，给与芦荟大黄素琥珀酰乙酯不同浓度(6.25mg/kg、12.5mg/kg、25mg/kg、50mg/kg)和醋酸地塞米松处理后的上诉症状均得到明显改善。说明芦荟大黄素琥珀酰乙酯对LPS诱导的体内免疫炎症模型所引起的肝组织损伤具有明显的抑制作用。
4.4.3芦荟大黄素琥珀酰乙酯对LPS诱导的免疫炎症模型中小鼠空腹血糖及炎症细胞因子的影响
血糖结果显示(图10)，当小鼠感染6h后，与空白组比较各组小鼠空腹血糖出现下降趋势，然而给与芦荟大黄素琥珀酰乙酯不同浓度(6.25mg/kg、12.5mg/kg、25mg/kg、50mg/kg)和醋酸地塞米松处理后，各组趋于正常血糖值，有利于维持机体的稳定。其中12.5mg/kg组和25mg/kg组恢复血糖值正常的能力与阳性药醋酸地塞米松组相近。
IL-6试剂盒测定显示(图11),空白对照组小鼠体内血清IL-6含量为150.75pg/ml,LPS组小鼠体内血清IL-6含量为589.08pg/ml。与空白对照组比，LPS组有非常明显的统计学差异(n＝8，P<0.001)，说明模型组炎症细胞因子明显增高。与模型组相比，我们还可以发现，给与芦荟大黄素琥珀酰乙酯不同浓度(6.25mg/kg、12.5mg/kg、25mg/kg、50mg/kg)和醋酸地塞米松处理后的IL-6表达明显下降，具有统计学意义，并且不同浓度的本化合物对炎症细胞因子的抑制作用与阳性药醋酸地塞米松组相比，无明显差异。同时6.25mg/kg、12.5mg/kg、25mg/kg三个剂量组呈现浓度依赖趋势，随着浓度增加，下降越明显。说明芦荟大黄素琥珀酰乙酯对LPS诱导的体内免疫炎症模型所引起的炎症细胞因子的升高具有明显的抑制作用。
实施例5芦荟大黄素琥珀酰乙酯在体外对LPS诱导的免疫炎症模型的影响
5.1实验材料
THP-1细胞 人单核细胞性白血病细胞系
佛波酯(PMA) Sigma公司，L1585
脂多糖(LPS) Sigma公司，L2880
Cell Counting Kit-8(CCK-8)东仁化学科技(上海)有限公司细胞增殖-毒性检测试剂盒，CK04
Transriptor First Strand cDNA Synthesis kit逆转录试剂盒瑞士罗氏制药有限公司，26925820
5.2实验分组与方法
5.2.1实验分组
PMA诱导空白组、LPS处理模型组、LPS+25μM芦荟大黄素琥珀酰乙酯组、LPS+50μM芦荟大黄素琥珀酰乙酯组。
5.2.2LPS体外免疫炎症模型的建立
THP-1细胞在37℃、5％CO2培养条件下悬浮生长于RPMI-1640(HyCLoneLabaratories)培基，培养基中含10％胎牛血清(FCS，Gibco BRL公司)、100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素和2mmol/l L-谷氨酰胺(碧云天有限公司)。根据细胞的生长状态，每2～3天换液1次，采用半量换液或者离心重悬的方法，维持细胞生长浓度在1～10x105/ml。
离心收集对数期生长的THP-1细胞，用含10％胎牛血清的RPMI-1640混悬，以5x105/ml种于细胞培养瓶、96孔或6孔板。加入100ng/ml PMA(佛波酯)诱导其分化，24h后去除培养上清，以37℃温育的RPMI-1640培养基洗涤3次，洗掉未贴壁的THP-1细胞，最后加入无血清培养基RPMI-1640，分别加入1ug/ml LPS培养24h和1ug/ml LPS与芦荟大黄素琥珀酰乙酯(25μM、50μM)共刺激培养24h。
5.2.3总RNA抽提及逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)
收集细胞，按照TRIzol(TRIzol Reagent，美国Invitrogen生命技术公司)说明书进行总RNA的提取。按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录获得cDNA，以cDNA为模板进行PCR，扩增IL-6、TNF-α、IL-1β与β-actin的基因片段,以检测芦荟大黄素琥珀酰乙酯对LPS诱导的PMA分化的THP-1细胞分泌炎性细胞因子IL-6、TNF-α、IL-1β的影响。Real-time PCR反应条件如下:95℃ 10min变性,之后95℃ 15s,60℃ 30s，72℃ 30s共40个循环。
5.2.4CCK-8法检测芦荟大黄素琥珀酰乙酯对细胞活性的影响
在96孔板中接种细胞悬液(100μL/孔)，将培养板放在培养箱预培养(在37℃、5％CO2的条件下)。按照分组处理好细胞后，每孔加入10μL的CCK-8溶液，并将培养板在培养箱内孵育4h，最后用酶标仪测定在450nm处的吸光度，以检测芦荟大黄素琥珀酰乙酯对LPS诱导的PMA分化的THP-1细胞活性的影响。
5.3数据统计与分析
本实验中计量数据以均值±标准误(mean±SEM)表示。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)方法进行判别。P<0.05有统计学差异。利用Graphpad Prism 5.0进行数据分析和作图。
5.4实验结果
5.4.1芦荟大黄素琥珀酰乙酯对PMA诱导分化的THP-1炎性细胞因子分泌的调节作用
通过检测IL-6、TNF-α、IL-1βmRNA的表达可发现，LPS诱导后可显著增加细胞炎症因子的表达,其中IL-6的表达最明显，增至300倍。LPS+25μM芦荟大黄素琥珀酰乙酯组、LPS+50μM芦荟大黄素琥珀酰乙酯组处理后均可降低LPS所诱导的细胞炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1βmRNA的高表达,尤以IL-6mRNA的下降最为明显(下降至LPS组的300倍)。见图12、图13和图14。说明芦荟大黄素琥珀酰乙酯对LPS诱导的体外免疫炎症模型具有明显的抑制作用。
5.4.2芦荟大黄素琥珀酰乙酯对LPS诱导的PMA分化的THP-1细胞活性的影响
为准确测定芦荟大黄素衍生物的细胞毒性作用，将PMA诱导分化的THP-1巨噬细胞与不同浓度芦荟大黄素孵育24小时，观察细胞增殖情况。如图15结果显示，与ctrl组比较，处理24h的1μM、5μM、10μM、25μM和50μM芦荟大黄素琥珀酰乙酯组无统计学意义(P均＞0.05)，说明芦荟大黄素琥珀酰乙酯对PMA诱导分化的THP-1巨噬细胞活性没有影响。

Claims (4)

1.一种具有抗炎活性的芦荟大黄素琥珀酰酯类化合物，其特征在于，所述的芦荟大黄素琥珀酰酯类化合物具有式I所示的结构，其中，R为乙基，所述的芦荟大黄素琥珀酰酯类化合物为芦荟大黄素琥珀酰乙酯，化学名：1,8-二羟基-3-(羟甲基)-蒽醌丁二酸乙酯，分子式：C21H18O8，分子量：398；
Figure FDA0003270529250000011
2.权利要求1所述的具有抗炎活性的芦荟大黄素琥珀酰酯类化合物的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
1)琥珀酸单乙酯的合成：在圆底烧瓶中加入琥珀酸酐，无水乙醇，90℃条件下加热回流，回收过量乙醇得淡黄色油状物即琥珀酸单乙酯，该产物不分离直接进行下一步反应；
2)芦荟大黄素琥珀酰酯类化合物的合成：芦荟大黄素及步骤1)得到的琥珀酸单乙酯混合后缓慢滴加浓硫酸，用加热套在100℃条件下反应；产物溶于二氯甲烷中，抽滤去除不溶物；依次碳酸氢钠溶液萃取，纯水萃取，最后回收二氯甲烷得芦荟大黄素琥珀酰酯类化合物粗品；
3)芦荟大黄素琥珀酰酯类化合物的柱层析分离：以二氯甲烷和乙酸乙酯为洗脱剂进行硅胶柱层析分离，石油醚清洗后抽滤，得到所述的芦荟大黄素琥珀酰酯类化合物纯品。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
1)琥珀酸单乙酯的合成：在圆底烧瓶中加入琥珀酸酐5g，无水乙醇8ml，用加热套在90℃条件下加热回流3h，回收过量乙醇得淡黄色油状物即琥珀酸单乙酯，该产物不分离直接进行下一步反应；
2)芦荟大黄素琥珀酰酯类化合物的合成：在圆底烧瓶中加入芦荟大黄素1g及步骤1)得到的琥珀酸单乙酯6g后缓慢滴加0.1ml硫酸，用加热套在100℃条件下反应2h；产物溶于15ml二氯甲烷中超声5min后，抽滤去除不溶物；二氯溶液用60ml的2.5％碳酸氢钠溶液萃取4次，纯水30mL萃取2次，取二氯甲烷层，后回收二氯甲烷得芦荟大黄素琥珀酰酯类化合物粗品；
3)芦荟大黄素琥珀酰酯类化合物的柱层析分离：以二氯甲烷：乙酸乙酯＝6:1为洗脱剂进行硅胶柱层析分离，取第一大色带，后回收溶剂，产物中加入五倍体积的石油醚清洗后抽滤，滤饼用石油醚清洗两次得所述的芦荟大黄素琥珀酰酯类化合物纯品。
4.权利要求1所述的具有抗炎活性的芦荟大黄素琥珀酰酯类化合物在制备抗炎药物中的用途。
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GR01 Patent grant
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