CN115376609B - 一种判别met基因拷贝数扩增类型的方法及装置 - Google Patents

Abstract

本申请涉及一种判别MET基因拷贝数扩增类型的方法及装置，具体涉及一种拷贝数扩增类型判别方法，包含将待测样本与参考样本组比较，预测MET及周边参考基因捕获区间的拷贝数，预测MET拷贝数状态，基于MET基因捕获区间的拷贝数与周边参考基因的拷贝数分布的KL散度判别MET基因拷贝数扩增类型。

Description

一种判别MET基因拷贝数扩增类型的方法及装置

技术领域

本申请涉及生物信息领域，具体涉及一种MET基因拷贝数扩增状态的判别方法及其应用。

背景技术

MET基因，全名间质上皮转化因子(c-Met)，位于人类7号染色体长臂(7q21-q31)。是一种原癌基因，其编码的跨膜受体蛋白具有酪氨酸激酶活性，因此是一种酪氨酸激酶，与多种癌基因产物和调节蛋白有关，参与细胞信息传导、细胞骨架重排的调控，是细胞增殖、分化和运动的重要因素。肝细胞生长因子(HGF)/c-met信号通路在原发性肿瘤的形成及继发转移中起着至关重要的作用。

MET基因拷贝数扩增包括两组类型：1)局部扩增(focal amplification，又称定点扩增)；2)整体染色体重复(polysomy，又称多倍体扩增)。整体染色体重复即肿瘤细胞中出现多条7号染色体短臂和/或长臂，也称为多倍体。多倍体在生物学中不能作为驱动基因，局部扩增可能作为驱动基因，也是EGFR耐药的主要机制之一。多种实体瘤中都发现原发MET扩增，根据肿瘤基因组计划(TCGA)和cBioPortal数据库提供的数据，MET扩增在不同的实体瘤中发生率存在一定的差异。非小细胞肺癌(NSCLC)的检出率约为1～5％，胃癌中约为1～10％，结肠癌中约为2～4％，I型和II型肾乳头状癌约为13％和3％左右，在食管癌和肝细胞癌中检出比例较低。在许多恶性肿瘤中，MET扩增意味着预后不良。研究发现，非小细胞肺癌中MET扩增度越高，肿瘤MET驱动依赖性越强。MET高度扩增(MET/CEP7≥5，FISH)的非小细胞肺癌患者，很少伴发其他致癌基因的驱动突变(如EGFR突变或ALK融合等)，而在MET低度扩增(1.8≤MET/CEP7≤2.2，FISH)和中度扩增(2.2<MET/CEP7<5，FISH)的患者中，更多伴发其他驱动突变。此外，MET高度扩增患者的客观反应率(ORR)和中位生存期(PFS)显著性高于低度扩增和中度扩增患者。

常见的MET扩增检测技术包括荧光原位杂交(FISH)、实时定量PCR(qRT PCR)和二代测序(NGS)。FISH是目前公认为检测MET扩增的金标准，其原理为通过计算MET探针与7号染色体着丝粒(CEP7)探针的信号比(MET/CEP7)或单位细胞中MET的拷贝数(GCN)来判断MET的扩增状态。FISH具有实验周期短，特异性高，定位准确等优点，但是对操作和判读的要求较高，不同实验室/实验者对结果的判读差异较大，而且无法适用于大规模筛查，单次只能判断单基因的扩增状态。目前，临床上对于NGS检测MET扩增的定义没有达到共识。目前大部分平台均基于读短深度(read depth)原理，使用MET基因与7号染色体片段的拷贝数比例，并使用一些生物信息学方法进行计算，然而在敏感性和特异性上有一定的局限性。

发明内容

针对现有技术存在的不足和实际需求，本发明提供一种判别MET拷贝数扩增类型的方法及装置。

本发明提供以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种判别MET拷贝数扩增类型的方法或装置。该方法或装置包括如下步骤，或执行如下步骤的模块：

(1)获取待测样本的测序数据(例如通过：测序模块)：

a)将高通量测序原始数据回帖到人类参考基因组；

b)去除PCR过程中产生的重复序列；

c)计算捕获区间的覆盖深度，具体可以是，计算目标区域上每个碱基的测序深度；

d)对深度进行矫正，包括样本总测序深度矫正，具体可以是，对每个目标区间各个位点上的覆盖深度根据样本总测序深度进行标准化，以消除不同样本之前的测序数据量差异；根据探针铺设特征进行矫正，具体可以是，根据探针设计中不同区间探针铺设乘数差异，例如根据区间上覆盖的探针数，将区间分割，每个目标区间长度可以为约24个碱基对，并计算各个目标区间平均覆盖深度，根据每个目标区间上覆盖的探针数，对目标区间上测序深度进行局部加权回归矫正；根据GC含量进行矫正，具体可以是，将用于覆盖深度计算的目标区间按照侧翼延伸至总长大于200bp长度，计算平均GC占比，根据各区间的GC占比，对测序深度进行局部加权回归矫正，得到GC矫正后的测序深度；

(2)评估MET基因及周边参考基因各捕获区域的拷贝数(例如通过：拷贝数评估模块)：

a)待测样本与背景基线比较，计算MET基因及周边参考基因各捕获区间的拷贝数；

b)所述周边参考基因包括EGFR和BRAF，CDK6和BRAF，EGFR、CDK6和BRAF，三种组合；

(3)评估MET基因的拷贝数状态(例如通过：拷贝数状态评估模块)：

a)评估MET基因的拷贝数，具体可以是，计算待测样本MET基因及周边参考基因的加权平均拷贝数，使用该基因上外线子的长度对区间的拷贝数进行矫正；

b)评估MET基因各个区间发生拷贝数扩增的概率，具体可以是，区间的测序深度与背景基线的分布进行正态性检验，计算显著性p值；

c)评估MET基因显著性比例，具体可以是，计算MET基因发生显著性扩增的区间占MET基因所有区间的比例；

d)评估MET基因整体水平的显著性，具体可以是，对MET基因的所有区间矫正之后的测序深度，与参考基线中MET的所有区间的平均测序深度，进行T检验，判断MET基因在样本与基线中的差异是否显著，计算显著性p值；

e)确定MET基因的拷贝数状态，判断标准为：

各个阈值可通过使用大规模样本训练得到。其中：CN_thA表示拷贝数扩增的阈值，取值可以任选为2.25～4；CN_thD表示拷贝数缺失的阈值，取值可以任选为1.0～1.75；sigRatio_th表示显著性扩增/缺失比例的阈值，取值可以任选为0.3～1；p_th表示显著性T检验的阈值，取值可以任选为0.05～0.00001。

(4)对于MET基因拷贝数扩增的情况，评估MET基因与周边参考基因的离散程度，例如：KL散度(例如通过：离散度评估模块)：

a)将MET基因及周边参考基因各个捕获区间的拷贝数转化为log2Ratio；

log2Ratio＝log2(CN/2)

b)将所有捕获区间的log2Ratio划分为多个区间；

c)分别计算MET基因及周边参考基因的log2Ratio落在每个区间上的概率分布，即为P和Q，其中P表示MET基因各个区间的概率分布，Q表示周边参考基因各个区间的概率分布；

d)计算MET基因及周边参考基因的两个概率分布P和Q的KL散度(Kullback-Leibler Divergence)；

机器学习中常见的散度距离包括：F-散度(F-divergence)，JS散度(Jensen–Shannon divergence)等。

(5)基于KL散度判别MET基因的扩增类型(例如通过：判断模块)：

a)使用拷贝数和KL散度两个指标判别MET基因的扩增类型，具体如下：

i.MET基因的拷贝数高于EGFR和BRAF，且MET与EGFR和BRAF的KL散度均高于KL阈值；

ii.MET基因的拷贝数高于CDK6和BRAF，且MET与EGFR和BRAF的KL散度均高于KL阈值；

iii.只要满足i或ii其中之一，则为MET局部扩增；否则为多倍体扩增。

b)判别公式如下：

其中，CN_met，CN_braf，CN_cdk6，CN_egfr分别表示MET，BRAF，CDK6，EGFR基因的拷贝数；KL_braf，KL_cdk6，KL_egfr分别表示MET与BRAF，CDK6，EGFR基因的KL散度；KL_th表示KL阈值，可以是4，5，6，7，8，9，10，11，12，13或14等，经验上使用7作为KL阈值效果最佳。

第二方面，本发明提供一种判别MET拷贝数扩增类型的装置。该装置包括：

存储器，用于存储程序；

处理器，用于通过执行所述存储器存储的程序以实现如本发明第一方面所述的方法。

第三方面，本发明提供一种计算机可读存储介质，其上存储有程序，所述程序能够被处理器执行以实现如第一方面所述的方法。

本发明具有以下有益效果：

1)本发明基于EGFR，CDK6，BRAF三个基因作为MET拷贝数水平的参考，计算拷贝数距离，用以MET扩增状态判断，显著提高MET基因拷贝数扩增类型预测的灵敏度和特异性；

2)本发明通过计算KL散度，基于KL散度判别MET基因的扩增类型，显著提高MET基因拷贝数扩增类型预测的准确性。

附图说明

图1：MET基因及周边参考基因在基因组上的位置示意图。

图2A-2B：MET扩增类型为局部扩增的示例。每个点表示基因的一个区间，黑色点为MET基因区域。横轴表示基因所在的染色体位置，纵轴表示基于本发明方法计算得到的拷贝数(中间横线表示正常基因的拷贝数)，灰色背景表示基线中各捕获区间的波动范围。图2A表示只有MET扩增，图2B表示MET与CDK6一起扩增。

图3A-3B：MET扩增类型为多倍体扩增的示例。图3A表示7号染色体整体扩增(chr7polysomy)，图3B表示7号染色体长臂扩增(chr7q polysomy)。

图4A-4F：本发明实施例1中判别结果与FISH不一致样本的拷贝数分布图示。

图5A-5D：本发明实施例2中判别结果与FISH不一致样本的拷贝数分布图示。

图6：本发明实施例3中判别结果的MET扩增类型PFS曲线。纵坐标表示无进展生存率，横轴为生存时间，polysomy的曲线表示多倍体扩增，focal的曲线表示局部扩增，mPFS表示中位生存期，HR表示两组间的风险比，p表示两组生存时间显著性差异概率。

图7A-7C：本发明实施例4中判别结果与FISH不一致样本的拷贝数分布图示。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

术语定义

生存分析：是将时间的发生与所经历的时间结合起来的一种统计分析方法，在肿瘤临床实验中十分常见。

无进展生存期：简称PFS。指受试者从随机分组到疾病进展或任何原因死亡的时间。通常PFS越长，意味着患者有质量的生存时间越长。所有受试者在某一时刻仍未发生事件的比例称为无进展生存率。以生存时间为横轴，生存率为纵轴，并连接每个时间点的生存率，即为生存曲线。

中位生存时间：简称mPFS。表示在研究中一半的患者发生疾病进展等特定事件时的生存时间。本研究中，局部扩增的中位生存时间为7.27个月，多倍体扩增的中位生存时间为1.27个月，说明局部扩增的患者的治疗效果更好。

HR：两组受试者之间的风险比(Hazard Ratio)。默认情况下为实验组风险与对照组风险的比值，这个数值与时间无关，是根据整个试验数据得到的结果。即当HR小于1时，说明试验组能降低风险；HR大于1时，试验组提升风险。根据回归方程(常用log-rank)评估显著性p值，p值小于0.05，说明两组受试者之间存在显著性差异。在本例中，HR＝0.21，说明局部扩增风险更低，仅为多倍体扩增的21％；p＝0.0035，说明PFS存在显著性差异。

log-rank检验：是一种检验生存曲线之间是否存在差别的常用方法，主要用于对单一分组因素的分析，例如本研究中的局部扩增和多倍体扩增。该方法基于生存曲线上每个点的数据，取相同权重进行计算。如果p值小于阈值(0.05或0.01)，则两组生存时间有显著差异。

风险人数：又称Number at risk。表示两组受试者在当前时间下，尚存的没有发生终点事件的患者。这些患者有发生终点事件的风险，因此被记录为风险人数。

实施例1：

选择27例NGS及FISH均为MET扩增阳性的癌症组织样本，使用本发明中的双基因判别方法对MET基因的拷贝数类型进行判别。同时使用金标准FISH进行验证。

FISH的评判标准为：

本发明的KL散度阈值为7，首先确定MET基因为拷贝数扩增，继而通过MET与周边的BRAF和EGFR双基因比较，判别MET基因扩增类型，类型判别标准具体如下：

NGS及FISH的结果如表1。

表1:实施例1中金标准FISH和NGS本发明方法中的判别结果

表2:实施例1中NGS本发明检测结果与金标准FISH的一致性

	FISH MET feeal	FISH MET polysomy
			NGS MET focal	16	2
NGS MET polysomy	4	4

结果表明，如表2所示，本发明方法与金标准FISH在MET基因拷贝数扩增类型判别的一致性为77％(20/26)。

其中，不一致的6例样本CNV图谱如图4A-4F所示。

1)4例样本FISH判为局部扩增，本发明判为多倍体扩增。CNV图谱中发现，1例样本MET与周边参考基因拷贝数无差别，1例样本与BRAF共扩增，2例样本与EGFR共扩增。

2)2例样本FISH判为多倍体扩增，本发明方法判为局部扩增。CNV图谱中MET基因的拷贝数显著高于7号染色体上其他基因，MET基因为局部扩增。本发明方法的CNV图谱中可以很明确的看到MET基因为局部扩增。

结果显示，本发明的MET基因扩增类型判别方法结果更加准确。

实施例2:

选择9例NGS及FISH均为MET扩增阳性的癌症组织样本，使用本发明中的三基因判别方法对MET基因的拷贝数类型进行判别。同时使用金标准FISH进行验证。

FISH的评判标准为：

本发明的KL散度阈值为7，首先确定MET基因扩增，继而通过MET与周边的EGFR/CDK6和BRAF三基因比较，判别MET基因扩增类型，类型判别标准具体如下：

NGS及FISH的结果如表3。

表3:实施例2中金标准FISH和NGS本发明方法中的判别结果

表4:实施例2中NGS本发明检测结果与金标准FISH的一致性

	FISH MET focal	FISH MET polysomy
			NGS MET focal	4	4
NGS MET polysomy	0|	1

结果表明，如表4所示，本发明方法与金标准FISH在MET基因拷贝数扩增类型判别的一致性为56％(5/9)。其中，不一致4例样本均为FISH判为多倍体扩增，本发明方法判为局部扩增。本发明方法的CNV图谱中可以很明确的看到MET基因为局部扩增。CNV图谱如图5A-5D所示。表明本发明对于MET基因扩增类型的判别更加准确。

实施例3:

选择20例无进展生存时间(PFS)已知，NGS MET扩增阳性的癌症组织样本，使用本发明中的方法对MET基因的拷贝数类型进行判别。KL散度的阈值为7，具体的判读同实施例2。本发明的MET扩增判别结果如表5。不同MET扩增类型的PFS曲线如图6。

表5：本发明方法的MET基因扩增类型判别结果及样本FPS信息

结果表明，如图6所示，本发明方法判别的MET基因拷贝数扩增类型，局部扩增和多倍体扩增的生存期具有显著差异，局部扩增和多倍体扩增的中位生存期分别为7.27m和1.27m。

实施例4：

选择82例NGS及FISH均为MET扩增阳性的癌症组织样本，使用本发明中的方法对MET基因的拷贝数扩增类型进行判别，同时比较其他几种常见的判别标准与FISH的一致性。FISH评判标准及本发明评判标准如实施例2中所述。其他常见的判别标准如表6所示。NGS及FISH的结果如表7。

表6：实施例中用于比较的常见判别标准

判别方法	方法描述	Focal的标准
			KL.dist	本发明方法	KL≥7
CN.diff	MET与CDK6和BRAF的拷贝数差值	Diff≥0.5
			CN.rate	MET与CDK6和BRAF的拷贝数比值	Rate≥1.2
T.test	MET与7号染色体其他区域的拷贝数进行T检验	Pvalue≤0.05

表7:实施例中金标准FISH和NGS本发明方法中的判别结果

表8:实施例中NGS本发明检测结果与金标准FISH的一致性

表9：不同KL阈值与金标准FISH的一致性

结果表明，如表8所示，本发明方法与金标准FISH在MET基因拷贝数扩增类型判别的一致性最高，一致性为96.34％。其他的评估方法一致性均低于本发明方法。说明本发明判别MET扩增类型的准确性最高。其中，本发明与FISH不一致的3例样本，本发明方法的CNV图谱中可以很明确的看到MET基因为局部扩增。CNV图谱如图7A-7C所示。

不同KL阈值与金标准FISH的一致性如表9，KL阈值为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13时，本方法与FISH的一致性性均高于85％，当KL阈值为7或8时，一致性最高为96.30％，故实施例中均优选KL≥7作为局部扩增的阈值。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (14)

1.一种检测MET基因拷贝数扩增类型的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)获取待测样本的高通量测序数据；

(2)评估MET基因及MET周边参考基因各捕获区域的拷贝数，所述MET周边参考基因包括3种组合类型，所述3种组合类型包括EGFR和BRAF，或者CDK6和BRAF，或者EGFR、CDK6和BRAF；

(3)评估MET基因的拷贝数状态，如果MET基因的拷贝数评估为缺失或正常，则不再进行后续步骤；如果MET基因的拷贝数评估为扩增，则进行以下步骤判别其扩增类型；

(4)评估MET基因与MET周边参考基因的离散程度，所述离散程度包括KL散度、或F-散度、或JS散度；

(5)基于所述MET基因与MET周边参考基因的拷贝数和离散程度，判别MET基因的扩增类型，包括：当MET基因的拷贝数大于任一种组合类型的MET周边参考基因的拷贝数，并且MET基因与该组合类型的MET周边参考基因的离散程度均大于散度阈值，则判别MET基因拷贝数扩增类型为局部扩增；如不能同时满足上述两个条件，则判别MET基因扩增类型为多倍体扩增。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，评估MET基因的拷贝数状态的标准为：

其中：CN_thA表示拷贝数扩增的阈值，取值为2.25～4；CN_thD表示拷贝数缺失的阈值，取值为1.0～1.75；sigRatio_th表示显著性扩增/缺失比例的阈值，取值为0.3～1；p_th表示显著性T检验的阈值，取值为0.05～0.00001。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述评估MET基因及MET周边参考基因各捕获区域的拷贝数，是通过将所述待测样本与基线比较，计算MET基因及周边参考基因各捕获区间的拷贝数。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，评估MET基因与MET周边参考基因的KL散度，包括如下步骤：

a)将MET基因及周边参考基因各个捕获区间的拷贝数转化为log2Ratio；

b)将所有捕获区间的log2Ratio划分为多个区间；

c)分别计算MET基因及周边参考基因的log2Ratio落在每个区间上的概率分布，即为P和Q，其中P表示MET基因各个区间的概率分布，Q表示周边参考基因各个区间的概率分布；

d)计算MET基因及周边参考基因的两个概率分布P和Q的KL散度(Kullback-LeiblerDivergence)。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)具体包括序列比对、去除重复序列、计算捕获区间的覆盖深度、深度矫正的步骤；

步骤(3)具体包括：

a)评估MET基因及周边参考基因的平均拷贝数；

b)评估MET基因中每个捕获区域与背景基线比较，发生显著性扩增的概率，并评估MET基因发生扩增区间占MET所有区间的比例；

c)评估MET基因相对于背景基线整体水平的显著性；

d)确定MET基因的拷贝数状态。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)具体包括如下步骤：

e)对于MET基因拷贝数扩增的情况，使用拷贝数和KL散度两个指标判别MET基因的扩增类型，具体如下：

i.MET基因的拷贝数高于EGFR和BRAF，且MET与EGFR和BRAF的KL散度均高于KL阈值；

ii.MET基因的拷贝数高于CDK6和BRAF，且MET与EGFR和BRAF的KL散度均高于KL阈值；

iii.只要满足i或ii其中之一，则为MET局部扩增；否则为多倍体扩增。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述使用拷贝数和KL散度两个指标判别MET基因的扩增类型的判别公式如下：

其中，CN_met，CN_braf，CN_cdk6，CN_egfr分别表示MET，BRAF，CDK6，EGFR基因的拷贝数；KL_braf，KL_cdk6，KL_egfr分别表示MET与BRAF，CDK6，EGFR基因的KL散度；KL_th表示KL阈值。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述KL阈值选自4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述KL阈值选自4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述KL阈值为7或8。

11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述KL阈值为7或8。

12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测样本包括肿瘤组织样本、正常组织样本和体液样本中的至少一种。

13.一种判别MET拷贝数扩增类型的装置，所述装置包括：

存储器，用于存储程序；

处理器，用于通过执行所述存储器存储的程序以实现如权利要求1-12任一项所述的方法。

14.一种计算机可读存储介质，其特征在于，其上存储有程序，所述程序能够被处理器执行以实现如权利要求1-12任一项所述的方法。

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