CN115353875B - 荧光编码微球、制备方法和应用、诊断试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种荧光编码微球、制备方法和应用、诊断试剂盒。该荧光编码微球包括:聚苯乙烯微球;具有不同的最大发射波长的第一荧光染料和第二荧光染料,包覆在所述聚苯乙烯微球的内部;所述第一荧光染料和所述第二荧光染料各自独立地具有如下结构式I所示的结构,其中的R选自取代或未取代的具有5至10个环原子的芳香基团;所述荧光染料的最大发射波长为650~850nm。由于荧光染料的最大发射波长为650~850nm,将荧光编码微球与流式细胞仪联用时,荧光编码微球发射的荧光并不能被流式细胞仪的FITC通道和PE通道捕捉,从而荧光编码微球发射的荧光并不会影响FITC通道和PE通道的后续测定,提高了测定结果的准确度。
Description
技术领域
本发明涉及化合物合成技术领域,特别是涉及一种荧光编码微球、制备方法和应用、诊断试剂盒。
背景技术
基于荧光编码微球的液相芯片技术是近年热点之一,可进行多因子细胞联检,同时鉴定和定量分析多种待测目标靶分子,例如核酸、蛋白、小分子化合物等。液相芯片技术是将微米尺度的微球进行染色编码,其中最常用的是采用一种或一种以上的荧光染料,通过控制染料的浓度,使得每种微球携带一种可被仪器识别的编码信息以鉴别固定在其表面的探针种类,在特异性地与相应靶分子反应后,所得复合物带有可被仪器读取的检测信号,即可进行检测结果分析。
通常将流式细胞仪和荧光编码微球联用进行目标靶分子测定。流式细胞仪常用的四个通道,分别为FITC通道、PE通道、APC通道和APC-Cy7通道。进行测定时,APC通道和APC-Cy7通道用于捕捉荧光编码微球与相应靶分子特异性反应后得到的复合物所携带的检测信号,即APC通道和APC-Cy7通道用于捕捉荧光编码微球发射的荧光;FITC通道、PE通道用捕捉后续测定中抗体所携带的荧光物质发射的荧光。相关技术中,流式细胞仪和荧光编码微球联用测定目标靶分子时,通常存在荧光编码微球发射的荧光影响FITC通道和PE通道的后续测定的问题,从而能降低了测定结果的准确性。
发明内容
基于此,有必要提供一种能够提高流式细胞仪FITC通道和PE通道检测准确度的荧光染料、荧光编码微球、制备方法和应用、诊断试剂盒。
本发明第一方面提供了一种荧光染料,所述荧光染料具有如下结构式I所示的结构:
其中,R选自取代或未取代的具有5至10个环原子的芳香基团;所述荧光染料的最大发射波长为650~850nm。
在一些实施例中,所述R选自取代或未取代的苯基以及取代或未取代的噻吩基团中的一个。
在一些实施例中,所述R选自苯基、5-(2-苯基噻吩)-基、5-(2-(4-甲苯基)噻吩)-基、5-(2-(4-甲氧基苯基)噻吩)-基和2-联二噻吩基中的一种。
本发明第二方面提供了一种荧光染料的制备方法,包括如下步骤:
(2)反应温度为110~120℃;
(3)反应时间为10~12h;
(4)反应溶剂包括甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、叔丁醇和正丁醇中的一种或多种。
在一些实施例中,制备所述化合物IV时包括如下条件中的至少一项:
(2)所述催化剂包括醋酸钯、醋酸铅中的一种或多种;
(3)反应温度为25~30℃;
(4)反应时间为2~4h;
(5)反应溶剂选自四氢呋喃。
(2)反应温度为25~30℃;
(3)反应时间为20~24h。
在一些实施例中,制备所述化合物I时包括如下条件中的至少一项:
(2)反应温度为25~30℃;
(3)反应时间为10~16h。
所述化合物VI具有如下所示的结构通式:
其中,R1选自苯基、4-甲苯基、4-甲氧基苯基和2-噻吩基中的一种或多种。
在一些实施例中,所述化合物与氢化钠及二氧化碳发生反应的步骤,具体包括:将化合物与氢化钠于25~30℃反应3~5h,回流30~60min,然后于-78~-70℃加入二氧化碳继续反应0.5~1h;其中,所述化合物VI与所述氢化钠及所述二氧化碳的摩尔比为1:(1~2):(5~10)。
(2)反应温度为80~90℃;
(3)反应时间为3~4h。
(2)反应温度为-30~-25℃;
(3)反应时间为0.5~1h。
本发明的第三方面提供了一种荧光染料在制备荧光编码微球中的应用。
本发明的第四方面提供了一种荧光编码微球,包括:
聚苯乙烯微球;
具有不同的最大发射波长的第一荧光染料和第二荧光染料,包覆在所述聚苯乙烯微球的内部;所述第一荧光染料和所述第二荧光染料各自独立地选自如第一方面所述的荧光染料或如第二方面所述的方法制备的荧光染料。
在一些实施例中,所述聚苯乙烯微球满足下述条件中的至少一项:
(1)所述聚苯乙烯微球的表面携带羧基,所述聚苯乙烯微球表面的羧基的含量为6~10μmol/g;
(2)所述聚苯乙烯微球的交联度为1~20%;
(3)所述聚苯乙烯微球的粒径为5.3μm。
在一些实施例中,所述第一荧光染料的最大发射波长为674~686nm,所述第二荧光染料的最大发射波长为800~850nm。
本发明的第五方面提供了一种荧光编码微球的制备方法,包括如下步骤:
将聚苯乙烯微球分散在溶胀剂中,对所述聚苯乙烯微球进行预溶胀处理,制得溶液A;
将第一荧光染料和第二荧光染料溶解在有机溶剂中,制得溶液B;
将所述溶液B与所述溶液A混合,对预溶胀后的聚苯乙烯微球进行染色处理;
将染色处理后的产物进行清洗,制得荧光编码微球。
在一些实施例中,对所述聚苯乙烯微球进行预溶胀处理时包括如下条件中的至少一项:
(1)所述溶胀剂为良溶剂和醇类物质的混合物,所述良溶剂和所述醇类物质的体积比为(1~5):(5~9);
所述良溶剂包括二氯甲烷、四氢呋喃、甲苯和正己烷中的一种或多种;
所述醇类物质包括甲醇、乙醇、正丙醇和正丁醇中的一种或多种;
(2)对所述聚苯乙烯微球进行预溶胀处理时的温度为30~35℃;
(3)对所述聚苯乙烯微球进行预溶胀处理时的时间为4~6h。
在一些实施例中,所述第一荧光染料和所述第二荧光染料的质量比为8:(1~8);
所述有机溶剂包括二氯甲烷、四氢呋喃和甲苯中的一种或多种。
在一些实施例中,将染色处理后的产物进行清洗的步骤具体包括:
依次采用清洗液和去离子水分别对染色处理后的产物进行清洗;
其中,所述清洗液为体积比为(5~9):(1~5)的乙醇和去离子水的混合液。
本发明的第六方面提供了一种荧光编码微球在制备诊断试剂盒中的应用。
本发明的第七方面提供了一种诊断试剂盒,包括如第四方面所述的荧光编码微球或如第五方面所述的方法制备的荧光编码微球。
上述提供的荧光染料、荧光编码微球、制备方法和应用、诊断试剂盒,由于荧光染料的最大发射波长在650~850nm之间,则将该荧光染料用于制备荧光编码微球后,在将荧光编码微球与流式细胞仪联用时,荧光编码微球发射的荧光并不能被流式细胞仪的FITC通道和PE通道捕捉,从而荧光编码微球发射的荧光并不会影响FITC通道和PE通道的后续测定,提高了测定结果的准确度。
附图说明
图1为一实施方式提供的荧光染料的制备流程示意图;
图3为实施例6制得的荧光编码微球的测试结果示意图;
图4为对比例1制得的荧光编码微球的测试结果示意图;
图5为对比例2制得的荧光编码微球的测试结果示意图。
具体实施方式
为了便于理解本发明,下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是,本发明可以以许多不同的形式来实现,并不限于本文所描述的实施例。相反地,提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本发明。
本文中,以开放式描述的技术特征中,包括所列举特征组成的封闭式技术方案,也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本文中,涉及到数值区间,如无特别说明,上述数值区间内视为连续,且包括该范围的最小值及最大值,以及这种最小值与最大值之间的每一个值。进一步地,当范围是指整数时,包括该范围的最小值与最大值之间的每一个整数。此外,当提供多个范围描述特征或特性时,可以合并该范围。换言之,除非另有指明,否则本文中所公开之所有范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
在本文中,涉及数据范围的单位,如果仅在右端点后带有单位,则表示左端点和右端点的单位是相同的。比如,800~850nm表示左端点“800”和右端点“850”的单位都是nm(纳米)。
本文仅具体地公开了一些数值范围。然而,任意下限可以与任意上限组合形成未明确记载的范围;以及任意下限可以与其它下限组合形成未明确记载的范围,同样任意上限可以与任意其它上限组合形成未明确记载的范围。此外,每个单独公开的点或单个数值自身可以作为下限或上限与任意其它点或单个数值组合或与其它下限或上限组合形成未明确记载的范围。
本文中的温度参数,如无特别限定,既允许为恒温处理,也允许在一定温度区间内进行处理。所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。
本文中,术语“第一”、“第二”仅用于描述目的,而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此,限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在发明的描述中,“多种”的含义是至少两种,例如两种,三种等,除非另有明确具体的限定。在本申请的描述中,“若干”的含义是至少一个,例如一个,两个等,除非另有明确具体的限定。
如果没有特别的说明,本发明的所有实施方式以及可选实施方式可以相互组合形成新的技术方案。
如果没有特别的说明,本发明的所有步骤可以顺序进行,也可以随机进行,优选是顺序进行的。例如,所述方法包括步骤(a)和(b),表示所述方法可包括顺序进行的步骤(a)和(b),也可以包括顺序进行的步骤(b)和(a)。例如,所述提到所述方法还可包括步骤(c),表示步骤(c)可以任意顺序加入到所述方法,例如,所述方法可以包括步骤(a)、(b)和(c),也可包括步骤(a)、(c)和(b),也可以包括步骤(c)、(a)和(b)等。
基于荧光编码微球的液相芯片技术是近年热点之一,可进行多因子细胞联检,同时鉴定和定量分析多种待测目标靶分子,例如核酸、蛋白、小分子化合物等。液相芯片技术是将微米尺度的微球进行染色编码,其中最常用的是采用一种或一种以上的荧光染料,通过控制染料的浓度,使得每种微球携带一种可被仪器识别的编码信息以鉴别固定在其表面的探针种类,在特异性地与相应靶分子反应后,所得复合物带有可被仪器读取的检测信号,即可进行检测结果分析。
通常将流式细胞仪和荧光编码微球联用进行目标靶分子测定。流式细胞仪常用的四个通道,分别为FITC通道、PE通道、APC通道和APC-Cy7通道。进行测定时,APC通道和APC-Cy7通道用于捕捉荧光编码微球与相应靶分子特异性反应后得到的复合物所携带的检测信号,即APC通道和APC-Cy7通道用于捕捉荧光编码微球发射的荧光;FITC通道、PE通道用捕捉后续测定中抗体所携带的荧光物质发射的荧光。相关技术中,流式细胞仪和荧光编码微球联用测定目标靶分子时,通常存在荧光编码微球发射的荧光影响FITC通道和PE通道的后续测定的问题,从而能降低了测定结果的准确性。
本发明技术人员分析其原因发现,FITC通道、PE通道可接受的荧光发射波长范围分别为525±25nm和575±13nm。相关技术中采用的荧光染料的最大发射波长在450nm~610nm之间,油溶性的量子点的波长范围在505~625nm之间,则将流式细胞仪和荧光编码微球联用时,荧光染料发射的荧光及油溶性量子点发射的荧光将会被FITC通道、PE通道捕捉到,从而影响FITC通道和PE通道后续测定的准确性。
此外,制备编码微球时大多采用荧光量子点作为染色荧光物质,通过溶胀法制备量子点的荧光编码微球,但是采用此方法制备的编码微球量子点基本上是吸附在微球的表面上,会导致量子点很容易从微球的表面上脱落,从而造成编码微球的荧光强度的不稳定性。
相关技术中,制备编码微球时还采用通过共价结合荧光物质的方法,不管是共价结合量子点还是带有官能团的荧光物质,以共价结合的方式稳定在微球的表面,均存在下列不足:一方面共价结合的操作比较繁琐,而且对微球表面改性,增加难度,另一方面,共价的荧光物质会在微球表面造成非特异性吸附,导致微球的荧光强度不稳定;此外量子点是通过改变量子点晶体的尺寸来改变其发光的颜色,若共价结合量子点将会导致合成量子点的要求非常高且不可避免的会出现批件差,则量子点的荧光强度就会不稳定。
为了解决上述问题,本发明的实施例提供了一种荧光染料,具有如下结构式I所示的结构:
其中,R选自取代或未取代的具有5至10个环原子的芳香基团;荧光染料的最大发射波长为650~850nm。
需要说明的是,“取代或未取代”表示具有5至10个环原子的芳香基团可以被取代,也可以不被取代。当具有5至10个环原子的芳香基团被取代时,应理解为任选被本领域可接受的基团所取代,包括但不限于:烷基、环烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、芳氧基、杂芳基、杂烷基、杂环基、氨基、卤素、亚烷基、亚烯基、亚炔基、烷基氨基或芳基烷基,且上述基团也可以进一步被本领域可接受取代基取代。
荧光染料的最大发射波长可以为680~850nm、700~850nm、730~850nm、750~850nm、770~850nm、800~850nm、820~850nm、840~850nm或650~700nm等,具体不做限定。进一步地,荧光染料的最大发射波长可以为650nm、680nm、700nm、750nm、800nm、820nm、840nm等,具体不做限定。
可理解地,由于荧光染料的最大发射波长在650~850nm之间,则将该荧光染料用于制备荧光编码微球后,在将荧光编码微球与流式细胞仪联用时,荧光编码微球发射的荧光并不能被流式细胞仪的FITC通道和PE通道捕捉,从而荧光编码微球发射的荧光并不会影响FITC通道和PE通道的后续测定,提高了测定结果的准确度。
在其中的一些实施方式中,R选自取代或未取代的苯基以及取代或未取代的噻吩基团中的一个。噻吩基团是p型的给电子基团,与芳环连接可增加整体的Π共轭,从而使荧光染料的最大发射波长红移。
在其中的一些实施方式中,R选自苯基、5-(2-苯基噻吩)-基、5-(2-(4-甲苯基)噻吩)-基、5-(2-(4-甲氧基苯基)噻吩)-基和2-联二噻吩基中的一种。当R为苯基时,荧光染料的最大发射波长为680nm;当R为5-(2-苯基噻吩)-基时,荧光染料的最大发射波长为800nm;当R为5-(2-(4-甲苯基)噻吩)-基时,荧光染料的最大发射波长为800nm;当R为5-(2-(4-甲氧基苯基)噻吩)-基时,荧光染料的最大发射波长为820nm;当R为2-联二噻吩基时,荧光染料的最大发射波长为840nm。
本发明的实施例还提供了一种荧光染料的制备方法,如图1所示,包括如下步骤:化合物与邻羟基苯乙酮发生反应,制备化合物;化合物在催化剂的作用下发生反应,制备化合物;化合物与乙酸及氨水发生反应,制备化合物;化合物与三氟化硼乙醚及三乙胺发生反应,制备化合物;
制备如结构式I所示的化合物I时,以化合物和邻羟基苯乙酮为原料进行制备。在其中的一些实施方式中,制备化合物时,化合物与邻羟基苯乙酮的摩尔比为1:(2~3);例如,可以为1:(2.3~3)、1:(2.5~3)、1:(2.7~3)或1:(2~2.5)等,具体不做限定。
在其中的一些实施方式中,制备化合物时,反应温度为110~120℃;例如,可以为113~120℃、115~120℃、117~120℃、110~115℃或112~118℃等,具体不做限定。反应时间为10~12h;例如,可以为11.5~12h、11~12h、11.5~12h、10~10.7h、10.3~11.3h等,具体不做限定。
制得化合物后,将其在催化剂的作用下制备化合物。在其中的一些实施方式中,制备所述化合物IV时,化合物与催化剂的摩尔比为1:(1.2~2);例如,可以为1:(1.4~2)、1:(1.6~2)、1:(1.8~2)、1:(1.2~1.5)或1:(1.3~1.7)等,具体不做限定。
在其中的一些实施方式中,制备化合物IV时,催化剂可以包括醋酸钯、醋酸铅中的一种或多种。
在其中的一些实施方式中,制备化合物IV时,反应温度为25~30℃;例如,可以为26~30℃、27~30℃、28~30℃、29~30℃或25~28℃等,具体不做限定。反应时间为2~4h;例如,可以为2.3~4h、2.5~4h、2.8~4h、3~4h、3.2~4h、3.5~4h、3.8~4h、2~3h或2.2~3.5h等,具体不做限定。
在其中的一些实施方式中,制备所述化合物IV时,反应溶剂可以选自四氢呋喃。
作为示例,制备化合物IV时可采用如下方法:将1moL的化合物IV与1.2~2moL的催化剂加入50~100mL的四氢呋喃中,于25~30℃反应2~4h。
制得化合物IV,继续以其为底物制备化合物。在其中的一些实施方式中,制备化合物时,化合物与乙酸及氨水的摩尔比为1:(20~55):(20~40);例如,可以为1:20:20、1:55:40、1:35:30或1:40:25等,具体不做限定。
在其中的一些实施方式中,制备化合物时,反应温度为25~30℃;例如,可以为26~30℃、27~30℃、28~30℃、29~30℃或25~28℃等,具体不做限定。反应时间为20~24h;例如,可以为20.5~24h、21~24h、21.5~24h、22~24h、22.5~24h、23~24h、23.5~24h、或20~23h等,具体不做限定。
制得化合物V后,继续以化合物V作为底物制备化合物I。在其中的一些实施方式中,制备化合物I时,化合物与三氟化硼乙醚及三乙胺的摩尔比为1:(9~10):(9~10);例如,可以为1:9:10、1:10:9、1:9.5:10或1:9:9.5等,具体不做限定。
在其中的一些实施方式中,制备化合物I时,反应温度为25~30℃;例如,可以为26~30℃、27~30℃、28~30℃、29~30℃或25~28℃等,具体不做限定。反应时间为10~16h;例如,可以为11~16h、12~16h、13~16h、14~16h、15~16h、10~14h或10.5~13.5h等,具体不做限定。
作为示例,制备化合物I时可采用如下方法:将1moL的化合物V与9~10moL的三氟硼乙醚及9~10moL的三乙胺在25~30℃下反应10~16h。
化合物可以市售购买,也可以自行合成。在一些实施方式中,当R为取代或未取代的噻吩基团时,还包括制备化合物的步骤,如图2所示,具体包括如下步骤:化合物与氢化钠及二氧化碳发生反应,制备化合物;化合物与氯化亚砜发生反应,制备化合物;化合物与无水肼发生反应,制备化合物;
化合物VI具有如下所示的结构通式:
其中,R1选自苯基、4-甲苯基、4-甲氧基苯基和2-噻吩基中的一种或多种。
制得化合物后,继续以化合物为底物制备化合物。在其中的一些实施方式中,制备化合物时,化合物与氯化亚砜的摩尔比为1:(2~3);例如,可以为1:(2.2~3)、1:(2.5~3)、1:(2.8~3)或1:(2~2.5)等,具体不做限定。
在其中的一些实施方式中,制备化合物时,反应温度为80~90℃;例如,可以为82~90℃、85~90℃、88~90℃、80~85℃或81~87℃等,具体不做限定。反应时间为3~4h;例如,可以为3.2~4h、3.5~4h、3.7~4h或3~3.5h等,具体不做限定。
制得化合物后,继续以其作为底物制备化合物。在其中的一些实施方式中,制备化合物时,化合物与无水肼的摩尔比为1:(1.5~2);例如,可以为1:(1.6~2)、1:(1.7~2)、1:(1.8~2)、1:(1.9~2)或1:(1.5~1.8) 等,具体不做限定。
在其中的一些实施方式中,制备化合物时,反应温度为-30~-25℃;例如可以为-29~-25℃、-28~-25℃、-27~-25℃、-26~-25℃或-30~-27℃等,具体不做限定。反应时间为0.5~1h;例如,可以为0.6~1h、0.7~1h、0.8~1h、0.9~1h或0.5~0.7h等,具体不做限定。
本发明的实施例还提供了一种荧光染料在制备荧光编码微球中的应用。
本发明的实施例还提供了一种荧光编码微球,包括:
聚苯乙烯微球;
具有不同的最大发射波长的第一荧光染料和第二荧光染料,包覆在聚苯乙烯微球的内部;第一荧光染料和第二荧光染料各自独立地选自上述的荧光染料或采用如上述的方法制备的荧光染料。
在聚苯乙烯微球内部包覆具有不同最大发射波长的荧光染料,可通过调整不同荧光染料的质量比实现更多的编码组数。
可理解地,荧光染料包覆在聚苯乙烯微球的内部,可提高荧光染料与聚苯乙烯微球结合的稳定性,进而提升荧光强度的稳定性。
在其中的一些实施方式中,聚苯乙烯微球的表面携带羧基,聚苯乙烯微球表面的羧基的含量为6~10μmol/g;例如,可以为7~10μmol/g、8~10μmol/g、9~10μmol/g或6~8μmol/g等,具体不做限定。当聚苯乙烯微球表面的羧基的含量低于上述范围时,将导致后续应用中可偶联的抗体量减少;当聚苯乙烯微球表面的羧基的含量高于高范围时,将会增加最后制得的磁性微球的非特异性吸附。
在其中的一些实施方式中,聚苯乙烯微球的交联度为1~20%;例如,可以为5~20%、10~20%、15~20%或1~10%等,具体不做限定。当聚苯乙烯微球的交联度低于上述范围时,聚苯乙烯微球在溶胀会将会出现变形和溶解;当聚苯乙烯微球的交联度高于上述范围时,聚苯乙烯微球不易发生溶胀。
在其中的一些实施方式中,聚苯乙烯微球的粒径为5.3μm。
在一些实施方式中,第一荧光染料的最大发射波长为674~686nm;例如,可以为674nm、680nm或686nm等,具体不做限定。第二荧光染料的最大发射波长为800~850nm;例如,可以为810~850nm、820~850nm、830~850nm、840~850nm、800~830nm或805~8350nm等,具体不做限定。
本发明的实施例还提供了一种荧光编码微球的制备方法,包括如下步骤:将聚苯乙烯微球分散在溶胀剂中,对聚苯乙烯微球进行预溶胀处理,制得溶液A;
将第一荧光染料和第二荧光染料溶解在有机溶剂中,制得溶液B;将溶液B与溶液A混合,对预溶胀后的聚苯乙烯微球进行染色处理;将染色处理后的产物进行清洗,制得荧光编码微球。
可理解地,该荧光编码微球的制备方法,仅需要一步溶胀染色便可实现双编码微球的制备,操作简单方便,工艺周期短,且荧光染料本身稳定性好,大大降低了生产成本。
在一些实施方式中,在对聚苯乙烯微球进行预溶胀处理时,先采用醇溶剂对其进行清洗处理,以去除醇聚苯乙烯微球表面的水;醇溶剂可以为甲醇、乙醇、正丁醇中的一种或多种。
在一些实施例方式中,对聚苯乙烯微球进行预溶胀处理时,溶胀剂为良溶剂和醇类物质的混合物,良溶剂和醇类物质的体积比为(1~5):(5~9);例如,可以为1:9、5:5、2:8、3:7或4:6等,具体不做限定。可选地,良溶剂包括二氯甲烷、四氢呋喃、甲苯和正己烷中的一种或多种;可选地,醇类物质包括甲醇、乙醇、正丙醇和正丁醇中的一种或多种。
在一些实施方式中,对聚苯乙烯微球进行预溶胀处理时的温度为30~35℃;例如,可以为31~35℃、32~35℃、33~35℃、34~35℃或30~33℃等,具体不做限定。
在一些实施方式中,对聚苯乙烯微球进行预溶胀处理时的时间为4~6h;例如,可以为4h、4.5h、5h、5.5h或6h等,具体不做限定。
在一些实施方式中,第一荧光染料和第二荧光染料的质量比为8:(1~8);例如,可以为8:(2~8)、8:(3~8)、8:(4~8)、8:(5~8)、8:(6~8)、8:(7~8)或8:(1~5)等,具体不做限定。当第一荧光染料和第二荧光染料的质量比低于上述范围时,则无法在流式细胞仪中检测到荧光信号;当第一荧光染料和第二荧光染料的质量比高于上述范围时,则会溢出流式细胞仪的检测上限。
在其中的一些实施方式中,有机溶剂包括二氯甲烷、四氢呋喃和甲苯中的一种或多种。
在一些实施方式中,在将溶液B与溶液A混合时,可以采用蠕动泵将溶液B缓慢加入溶液A中,泵速为2mL/h。
在一些实施方式中,将染色处理后的产物进行清洗的步骤具体包括:依次采用清洗液和去离子水分别对染色处理后的产物进行清洗;其中,清洗液为体积比为(5~9):(1~5)的乙醇和去离子水的混合液。
本发明的实施例还提供了一种荧光编码微球在制备诊断试剂盒中的应用。
本发明的实施例还提供了一种诊断试剂盒,包括上述的荧光编码微球或采用如上述的方法制备的荧光编码微球。
下述结合具体实施例对技术方案进行详细说明。
需要说明的是下述各实施例和对比例中使用的苯甲酰肼购自阿拉丁,批号为B104697;其他原料或试剂均为市售购买。
一、荧光染料的制备
实施例1
称取1.5mmoL的苯甲酰肼(作为化合物)和3mmoL的邻羟基苯乙酮,加入80mL的正丙醇中,于115℃的条件下反应12小时,反应结束后将反应液降温至室温,过滤,滤饼采用正丙醇清洗,于100℃下真空干燥,得到1.35mmoL的化合物;
将1.35mmoL的化合物溶于100mL干燥的四氢呋喃中,然后加入2.7mmoL的醋酸钯,于25℃下反应2.5h,反应结束后过滤反应液,将滤饼采用50mL的四氢呋喃冲洗3次,收集滤液,减压蒸馏,得到1.3mmoL的化合物;
取0.2mmoL的化合物V溶于20mL二氯甲烷中,加入含有2mmoL三乙胺和2mmoL三氟化硼的乙醚溶液,25℃下反应12h,反应结束后,采用20mL的去离子水萃取反应液2次,收集有机相,减压蒸馏,进行硅胶层析法提纯,得到0.12mmoL的化合物,即为荧光染料1。
在氯仿溶液中,将荧光染料1以10-5moL/L的浓度进行荧光光谱图测试,测得荧光染料1的最大发射波长为680nm。
荧光染料1的核磁共振谱为:1H NMR (500 MHz,CDCl3) δ 8.92 (dd, J = 7.8,1.4 Hz, 1H), 8.60 (ddd, J = 15.3, 7.7, 1.5 Hz, 2H), 7.79 – 7.72 (m, 2H), 7.68– 7.62 (m, 2H), 7.57 – 7.47 (m, 4H), 7.43 (td, J = 7.8, 1.3 Hz, 1H), 7.39 –7.26 (m, 6H), 6.89 (s, 1H);高分辨质谱HRMS为: ESI-MS (m/z). C29H19BF2N2 (M+)计算结果:445.16. 测试结果:445.16。
实施例2
取3mmoL氢化钠加入50mL干燥的乙醚溶液中,将1.5mmoL的2-苯基噻吩(作为化合物)溶于20mL的乙醚溶液中,然后将化合物乙醚溶液缓慢滴加到氢化钠的乙醚溶液中,在氮气保护下,于25℃反应3h,回流30min。将反应液降温至-78℃,向反应液中通入15mmoL干燥的二氧化碳,反应40min,将反应液升温至室温,搅拌16h;用二氯甲烷萃取,用1%的盐酸溶液和去离子水进行萃取,收集有机相,采用无水硫酸钠除去有机相中的水,减压蒸馏有机相,得到1.8mmoL的化合物;
将1.8mmoL的化合物加入到1mL干燥的DMF中,然后将化合物和DMF加入到30mL的甲苯中,然后缓慢加入3.6mmoL的氯化亚砜,加热至80℃,反应3h,反应结束后将反应液降温至室温,减压除去未反应的氯化亚砜,制得化合物;将化合物加入50mL的四氢呋喃中,然后缓慢滴1.5mmoL的无水肼,于-30℃反应30min,反应结束后将反应液升温至室温,用100mL水清洗反应液,再采用100mL的二氯甲烷萃取3次,取下层有机相,采用无水硫酸钠去除下层有机相中的水,减压蒸馏有机相,制得1.5mmoL的化合物。
在氯仿溶液中,将荧光染料2以10-5moL/L的浓度进行荧光光谱图测试,测得荧光染料2的最大发射波长为800nm。
荧光染料2的核磁共振谱为:1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.84 – 7.77 (m,2H), 7.76 – 7.71 (m, 2H), 7.59 – 7.49 (m, 7H), 7.49 – 7.37 (m, 11H), 6.92 (s,1H);高分辨质谱HRMS为: ESI-MS (m/z). C37H23BF2N2S2 (M+)计算结果:609.14. 测试结果: 609.14。
实施例3
实施例3和实施例2的区别在于,采用2-(4-甲苯基)噻吩替代2-苯基噻吩,其他均相同;制得荧光染料3。
在氯仿溶液中,将荧光染料3以10-5moL/L的浓度进行荧光光谱图测试,测得荧光染料3的最大发射波长为800nm。
荧光染料3的核磁共振谱为:1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.56 – 7.36 (m,16H), 7.26 (dd, J = 8.5, 0.7 Hz, 2H), 7.20 (dd, J = 8.5, 0.7 Hz, 2H), 6.92(s, 1H), 2.37 (d, J = 0.8 Hz, 6H);高分辨质谱HRMS为: ESI-MS (m/z).C39H27BF2N2S2 (M+)计算结果:637.17. 测试结果: 637.17。
实施例4
实施例4和实施例2的区别在于,采用2-(4-甲氧基苯基)噻吩替代2-苯基噻吩,其他均相同;制得荧光染料4。
在氯仿溶液中,将荧光染料4以10-5moL/L的浓度进行荧光光谱图测试,测得荧光染料4的最大发射波长为820nm。
荧光染料4的核磁共振谱为:1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.68 (d, J = 1.4Hz, 1H), 7.66 (d, J = 1.2 Hz, 1H), 7.65 (d, J = 1.2 Hz, 1H), 7.63 (d, J = 1.4Hz, 1H), 7.56 – 7.36 (m, 12H), 7.08 – 7.01 (m, 4H), 6.91 (s, 1H), 3.78 (s,6H);高分辨质谱HRMS为: ESI-MS (m/z). C39H27O2BF2N2S2 (M+)计算结果:669.16. 测试结果: 669.16。
实施例5
实施例5和实施例2的区别在于,采用2-(4-甲氧基苯基)噻吩替代2-苯基噻吩,其他均相同;制得荧光染料5。
在氯仿溶液中,将荧光染料5以10-5moL/L的浓度进行荧光光谱图测试,测得荧光染料5的最大发射波长为840nm。
荧光染料5的核磁共振谱为:1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.77 (s, 1H), 8.57– 8.55 (m, 1H), 8.53 – 8.50 (m, 1H), 7.51 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.45 – 7.39(m, 2H), 7.39 – 7.24 (m, 7H), 7.23 – 7.20 (m, 2H), 7.11 – 7.04 (m, 4H);高分辨质谱HRMS为: ESI-MS (m/z). C33H19BF2N2S4 (M+)计算结果:621.05. 测试结果: 621.05。
由上述实施例1和实施例2~5的荧光光谱图测试结果可知,荧光染料2和荧光染料3在荧光染料1的基础上增加了噻吩结构,从而增加了荧光染料2和荧光染料3的Π共轭,进而使其的最大发射波长发生了红移。与荧光染料2和荧光染料3相比,荧光染料4的最大发射波长发生了进一步红移;本发明技术人员分析其原因,可能是由于与荧光染料1相比,荧光染料4中不仅仅增加了噻吩基团,还在苯环上增加了甲氧基,甲氧基为给电子基团,故而可使其最大发射包场进一步红移。与荧光染料1相比,荧光染料5增加了两个噻吩基团,故而其最大发射波长可更进一步地红移。
二、荧光编码微球的制备
需要说明的是,下述各实施例和对比例中采用的聚苯乙烯微球为苏州纳微科技股份有限公司生产,批号为:PolymStar LB500-Carboxyl。
实施例6
取0.5g聚苯乙烯微球,其表面羧基含量为8.5μmol/g,交联度为5%,将聚苯乙烯微球加入50mL的离心管中,向离心管中加入30mL的乙醇,于2000rpm下离心清洗3次;
配制体积百分比浓度为10%的二氯甲烷的乙醇溶液作为溶胀剂,取50mL的溶胀剂置于100mL的三口烧瓶中,于30℃下预溶胀4h,制得溶液A;
将荧光染料1和荧光染料2加入5mL的二氯甲烷中,制得溶液B;
采用蠕动泵以2mL/h的速度将溶液B加入溶液A中,继续于30℃下搅拌18h;
向三口烧瓶中加入25mL90%的乙醇溶液,将液体移至离心瓶中,采用90%的乙醇溶液离心清洗10次,最后采用去离子水离心清洗三次,制得荧光编码微球。
需要说明的是,制备溶液B时,首先分别配制浓度为1mg/mL的荧光染料1溶液和荧光染料2溶液,分别取不同体积的荧光染料1溶液和荧光染料2溶液配制不同荧光染料浓度的溶液B,荧光染料1溶液和荧光染料2溶液的体积分别如下表1所示:
表1
序号 | 荧光染料1 | 荧光染料2 | 序号 | 荧光染料1 | 荧光染料2 | 序号 | 荧光染料1 | 荧光染料2 |
1 | 1000μL | 1000μL | 13 | 250μL | 500μL | 25 | 62.5μL | 62.5μL |
2 | 1000μL | 500μL | 14 | 250μL | 125μL | 26 | 31.25μL | 1000μL |
3 | 1000μL | 250μL | 15 | 250μL | 62.5μL | 27 | 31.25μL | 500μL |
4 | 1000μL | 125μL | 16 | 250μL | 31.25μL | 28 | 31.25μL | 250μL |
5 | 1000μL | 62.5μL | 17 | 125μL | 1000μL | 29 | 15.6μL | 1000μL |
6 | 1000μL | 31.25μL | 18 | 125μL | 500μL | 30 | 15.6μL | 500μL |
7 | 500μL | 1000μL | 19 | 125μL | 125μL | 31 | 15.6μL | 250μL |
8 | 500μL | 500μL | 20 | 125μL | 62.5μL | 32 | 7.8μL | 1000μL |
9 | 500μL | 125μL | 21 | 125μL | 31.25μL | 33 | 7.8μL | 500μL |
10 | 500μL | 62.5μL | 22 | 62.5μL | 1000μL | 34 | 7.8μL | 250μL |
11 | 500μL | 31.25μL | 23 | 62.5μL | 500μL | 35 | 7.8μL | 1250μL |
12 | 250μL | 1000μL | 24 | 62.5μL | 125μL |
实施例7
取0.5g聚苯乙烯微球,其表面羧基含量为7.6μmol/g,交联度为10%,将聚苯乙烯微球加入50mL的离心管中,向离心管中加入30mL的乙醇,于2000rpm下离心清洗3次;
配制体积百分比浓度为20%的二氯甲烷的乙醇溶液作为溶胀剂,取50mL的溶胀剂置于100mL的三口烧瓶中,于30℃下预溶胀4h,制得溶液A;
将5mg荧光染料1和5mg荧光染料3加入5mL的二氯甲烷中,制得溶液B;
采用蠕动泵以2mL/h的速度将溶液B加入溶液A中,继续于30℃下搅拌18h;
向三口烧瓶中加入25mL90%的乙醇溶液,将液体移至离心瓶中,采用90%的乙醇溶液离心清洗10次,最后采用去离子水离心清洗三次,制得荧光编码微球。
实施例8
取0.5g聚苯乙烯微球,其表面羧基含量为8.5μmol/g,交联度为5%,将聚苯乙烯微球加入50mL的离心管中,向离心管中加入30mL的乙醇,于2000rpm下离心清洗3次;
配制体积百分比浓度为20%的二氯甲烷的乙醇溶液作为溶胀剂,取50mL的溶胀剂置于100mL的三口烧瓶中,于30℃下预溶胀4h,制得溶液A;
将5mg荧光染料1和5mg荧光染料4加入5mL的二氯甲烷中,制得溶液B;
采用蠕动泵以2mL/h的速度将溶液B加入溶液A中,继续于30℃下搅拌18h;
向三口烧瓶中加入25mL90%的乙醇溶液,将液体移至离心瓶中,采用90%的乙醇溶液离心清洗10次,最后采用去离子水离心清洗三次,制得荧光编码微球。
实施例9
取0.5g聚苯乙烯微球,其表面羧基含量为7.6μmol/g,交联度为15%,将聚苯乙烯微球加入50mL的离心管中,向离心管中加入30mL的乙醇,于2000rpm下离心清洗3次;
配制体积百分比浓度为20%的二氯甲烷的乙醇溶液作为溶胀剂,取50mL的溶胀剂置于100mL的三口烧瓶中,于30℃下预溶胀4h,制得溶液A;
将5mg荧光染料1和5mg荧光染料5加入5mL的二氯甲烷中,制得溶液B;
采用蠕动泵以2mL/h的速度将溶液B加入溶液A中,继续于30℃下搅拌18h;
向三口烧瓶中加入25mL90%的乙醇溶液,将液体移至离心瓶中,采用90%的乙醇溶液离心清洗10次,最后采用去离子水离心清洗三次,制得荧光编码微球。
对比例1
对比例1和实施例6的区别在于溶液B的配制,其他均相同。溶液B的配制为:仅采用荧光染料1配制溶液B,配制溶液B时首先采用二氯甲烷配制溶度为1mg/mL的荧光染料1的溶液,然后分别取1000μL、500μL、250μL、125μL、62.5μL、31.25μL、15.6μL、7.8μL的荧光染料1的溶液,配制不同浓度的溶液B。
对比例2
对比例2和实施例6的区别在于溶液B的配制,其他均相同。溶液B的配制为:仅采用荧光染料2配制溶液B,配制溶液B时首先采用二氯甲烷配制溶度为1mg/mL的荧光染料2的溶液,然后分别取1000μL、500μL、250μL、125μL、62.5μL、31.25μL、15.6μL的荧光染料2的溶液,配制不同浓度的溶液B。
三、性能测试试验
采用流式细胞仪分别检测实施例6和对比例1~2中的荧光编码微球,具体方法如下:取1mg的微球,稀释到1mL的去离子水中,从中取200μL的量放入流式管中,上机检测。
实施例6的测试结果如图3所示,对比例1的测试结果如图4所示,对比例2的测试结果如图5所示。
由实施例6、对比例1和对比例2的结果可知,通过调整荧光染料1溶液和/或荧光染料2溶液的加入体积,以配制荧光染料浓度不同的多个溶液B,采用多个溶液B分别制备不同的荧光编码微球,可得到具有不同荧光强度的荧光编码微球;在将制备的各荧光编码微球用于流式细胞仪检测时,仅在APC通道和APC-Cy7通道具有荧光信号,在FITC通道和PE通道上无荧光信号;并且不同荧光编码微球对应的图谱之间无相互重叠,达到了双编码的效果。表明通过采用最大发射波长红移至680nm和/或800~850nm的荧光染料制备荧光编码微球,在将制备的荧光编码微球用于流式细胞仪时可降低荧光编码微球对FITC通道和PE通道的影响,提高检测的准确度。
由实施例6和对比例1~2的结果可知,采用单一的荧光染料对微球进行染色时具有局限性,不能够获得更多的编码组数,采用二维荧光编码,将二种荧光染料通过不同比例来进行染色可得到更多的编码组数。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (17)
11.如权利要求1~3任一项所述的荧光编码微球,其特征在于,所述聚苯乙烯微球满足下述条件中的至少一项:
(1)所述聚苯乙烯微球的表面携带羧基,所述聚苯乙烯微球表面的羧基的含量为6~10μmol/g;
(2)所述聚苯乙烯微球的交联度为1~20%;
(3)所述聚苯乙烯微球的粒径为5.3μm。
12.一种如权利要求1~11中任一项所述的荧光编码微球的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
将聚苯乙烯微球分散在溶胀剂中,对所述聚苯乙烯微球进行预溶胀处理,制得溶液A;
将第一荧光染料和第二荧光染料溶解在有机溶剂中,制得溶液B;
将所述溶液B与所述溶液A混合,对预溶胀后的聚苯乙烯微球进行染色处理;
将染色处理后的产物进行清洗,制得荧光编码微球。
13.如权利要求12所述的荧光编码微球的制备方法,其特征在于,对所述聚苯乙烯微球进行预溶胀处理时包括如下条件中的至少一项:
(1)所述溶胀剂为良溶剂和醇类物质的混合物,所述良溶剂和所述醇类物质的体积比为(1~5):(5~9);
所述良溶剂包括二氯甲烷、四氢呋喃、甲苯和正己烷中的一种或多种;
所述醇类物质包括甲醇、乙醇、正丙醇和正丁醇中的一种或多种;
(2)对所述聚苯乙烯微球进行预溶胀处理时的温度为30~35℃;
(3)对所述聚苯乙烯微球进行预溶胀处理时的时间为4~6h。
14.如权利要求12所述的荧光编码微球的制备方法,其特征在于,所述第一荧光染料和所述第二荧光染料的质量比为8:(1~8);
所述有机溶剂包括二氯甲烷、四氢呋喃和甲苯中的一种或多种。
15.如权利要求12~14中任一项所述的荧光编码微球的制备方法,其特征在于,将染色处理后的产物进行清洗的步骤具体包括:
依次采用清洗液和去离子水分别对染色处理后的产物进行清洗;
其中,所述清洗液为体积比为(5~9):(1~5)的乙醇和去离子水的混合液。
16.一种如权利要求1~11中任一项所述的荧光编码微球在制备诊断试剂盒中的应用。
17.一种诊断试剂盒,其特征在于,包括如权利要求1~11中任一项所述的荧光编码微球或如权利要求12~15中任一项所述的方法制备的荧光编码微球。
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