CN104974546A - 一类近红外氟硼二吡咯荧光染料及其合成方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种近红外氟硼二吡咯荧光染料及其合成方法与应用，属于功能性荧光染料、有机合成和精细化学品领域。该发明荧光染料包括以下两种：

Description

一类近红外氟硼二吡咯荧光染料及其合成方法与应用

技术领域

本发明涉及两种近红外氟硼二吡咯荧光染料及其合成方法，属于功能性荧光染料、有机合成和精细化学品领域。

背景技术

荧光分析技术作为目前应用极其广泛的一种有效检测方法，利用带有识别基团的荧光化合物分子作为检测试剂，再与靶标物结合的前后荧光的强度或者波长的变化来判定靶标的种类和浓度等等相关参数。大多数生物分子本身没有荧光或荧光较弱,检测灵敏度较低。为了使其高灵敏地检出,人们常用荧光染料或荧光探针与待测物进行标记或反应,生成具有强荧光的共价或非共价结合的物质进行生物标记、荧光成像等,使检出限大大降低，是研究在活体组织的细胞和亚细胞的一个十分重要的手段.。作为荧光响应信号的传递者，有机染料应不影响生物自身的功能，并且具有良好的性质。目前，许多种类的荧光染料被应用于生物检测领域中，然而不同的荧光染料即便是应用在同种物质分析过程中他们的表现却有着较大的差异，这说明并不是所有的荧光染料都适合设计成相应的荧光探针而应用在生物体内活性靶标的检测领域。一般认为适宜生物用的荧光染料应该同时具备长波吸收和发射、高的荧光量子产率、较高的光化学稳定性、较好的细胞穿透能力和细胞内的溶解能力、对生物体没有或者仅有极小的毒害等。

近红外荧光染料(600-1000nm)，使用低能激光分子，可以降低生物体内物质的自吸收和自发荧光的干扰,提高检测的灵敏度和选择性,有利于提高荧光穿透深度、提高荧光成像效率，可以深入的用于探索生物体内部奥秘。目前已经广泛应用于生物分析众多领域，如DNA杂交测试，免疫检测，肿瘤细胞早期诊断，基因变异检测等。

氟硼二吡咯类(BODIPY)荧光染料是近二三十年发展起来的一类光物理化学性能优异的荧光分子。在其结构中，硼桥键和甲川桥键把两个吡咯环固定在一个平面上,具有刚性平面结构。该类分子大多具有非常优异的光物理性能：1)较高的刚性，较高的荧光量子产率；2)较高的摩尔消光系数,吸光效率高；3)较窄的荧光发射光谱；4)较好的光热及化学稳定性，受环境、溶液pH影响较小；5)较小的分子质量和较低的细胞毒性；6)多个修饰位点等。因此可用于设计高灵敏度的荧光探针来进入细胞检测各种阳离子、阴离子、自由基以及蛋白质等，还能应用于合成DNA探针等。与其他染料一样，短波长的BODIPY荧光染料应用于生物领域检测的结果受到生物自吸收和自身荧光的干扰，降低了检测灵敏度。因此对其进行结构修饰，开发利用具有高度刚性、高荧光量子产率和光化学稳定性的新型长波近红外及功能化BODIPY荧光染料分子具有重大的意义。

目前，在近红外染料BODIPY的合成方面人们已经做了大量的工作，并且得到了一系列近红外荧光染料：Donal F.O’Sheal组(J.Am.Chem.Soc.2004,126,10619-10631)和Erica M.Carreira(Angew.Chem.Int.Ed.2005,44,1677-1679)课题组报道的一系列BODIPY染料，但是这种染料的量子产率都低于0.36。Haugland和Kang课题组(U.S.Patent 6005113，1999；WO93/09185,13May 1993)报道的BODIPY类荧光染料的衍生物，在BODIPY母体的引入芳基、五元杂环、苯乙烯基、萘乙烯基等多达110多种衍生物。但专利中所给出的合成比较繁琐.近年来，市场上的近红外BODIPY荧光染料主要为lifetechnology公司产品，比如BODIPY650/665，BODIPY 630/650等，但是其价格昂贵(前者4280元/mg，后者4419元/5mg)，限制正常的应用。因此合成一种量子产率高，成本低廉的新型的近红外荧光染料具有重大理论意义和应用价值

发明内容

本发明的目的是提供一种量子产率高、稳定性好的近红外氟硼二吡咯荧光染料及其制备方法。

本发明的另一目的是提供该荧光染料的一种交联聚苯乙烯微球的应用方式。

一类近红外氟硼二吡咯荧光染料，其特征在于：所述染料结构通式如下：

其包括化合物1，结构如下：

化合物2，结构如下：

一种制备上述荧光染料的方法，包括如下步骤：

1)将4-溴邻苯二甲酰亚胺、锡粉在酸性条件下过夜进行还原反应后，经回流、萃取、旋干，得到淡黄色固体；

2)将淡黄色固体和等摩尔比例的Vilsmeier-Haack试剂(维尔斯迈尔-哈克试剂)混合，经过夜回流反应，调节PH＝7，萃取，旋干，得到棕色固体；

3)将得到的棕色固体和NaOH水溶液在乙醇中回流反应三小时，用稀盐酸调PH至出现白色晶体，萃取、旋干，得到褐色固体；

4)将得到的褐色固体和吡咯类衍生物，以1：10的摩尔比，有机溶剂、室温、催化剂条件下反应半小时后，冰浴中加入路易斯碱，室温下搅拌后，冰浴中加入三氟化硼乙醚，室温下反应，经旋干后用硅胶柱和高效液相纯化得到产品。

所述酸性条件中酸为浓盐酸和冰醋酸混合液，其体积比为1：1；

所述回流反应的有机溶剂为二氯甲烷和/或三氯甲烷；

所述NaOH溶液浓度为4mol/L；

所述吡咯类衍生物为2，4-二甲基吡咯和2，4-二甲基-三乙基吡咯，其中为前者时，染料为化合物1，为后者时，染料为化合物2；

所述第四步反应催化剂为三氯氧磷，三氟乙酸；

所述路易斯碱为三乙胺。

一种上述荧光染料的应用，其特征在于所述荧光染料和聚苯乙烯微球相互交联形成聚苯乙烯荧光微球。

所述聚苯乙烯荧光微球制备方法如下：

1)聚苯乙烯微球的制备

A.单分散聚苯乙烯种子微球的制备：

装有磁力搅拌、回流冷凝装置的100mL两口圆底烧瓶，抽真空充氩气三次，依次加入一定量乙醇、蒸馏水以及分散剂聚乙烯吡咯烷酮，室温下充分搅拌使分散剂溶解，向体系中加入一定量引发剂偶氮二异丁晴的苯乙烯单体，充分搅拌使体系均勾，油浴加热至聚介，体系逐渐变白，恒温反应，得白色乳状液，反应液高速离心后弃去上层淸液，将下层白色固体依次用去离子水、乙醇洗涤，产物于真空干燥箱中干燥，得白色固体粉末；

B.交联聚苯乙烯微球的制备：

配制0.25wt％的十二烷基硫酸钠(SDS)水溶液备用；

称取一定量聚苯乙烯种子微球加入上述SDS水溶液中，取适量溶胀剂加入SDS溶液中，分别超声乳化后将两份乳液混合，油浴中搅拌溶胀，使乳化后的溶胀剂被种子微球吸收；

分别取一定量单体苯乙烯、交联剂二乙烯基苯，加入适量引发剂过氧化二苯甲酰，搅拌溶解后，加入SDS溶液并超声乳化，将含有单体和引发剂的乳液加入到种子微球的溶胀液中，使单体被种子微球充分吸收；

最后向体系中加入质量分数10％的稳定剂水溶液，搅拌均勾后通氩气保护，70℃条件下恒温聚合，反应液冷却后高速离心分离，下层白色固体依次用乙醇、去离子水洗涤，产物于真空干燥箱中干燥，所得白色固体粉末即交联后的聚苯乙烯微球；

2)荧光染料和聚苯乙烯微球交联：

H₂O-THF体系项微球中负载染料：将一定量交联聚苯乙烯微球分散在适量的去离子水中，权利要求1所述的荧光染料配成不同浓度的THF溶液，按H₂O、THF体积比5：1加入微球分散液中搅拌吸附，然后离心分离并用无水乙醇洗涤数次，微球在真空干燥箱中干燥，获得一系列染料含量不同的荧光微球。

所述的聚苯乙烯荧光微球制备方法，其特征在于：

1)在单分散聚苯乙烯种子微球制备过程中，溶剂中蒸馏水和无水乙醇体积比不小于1：5，苯乙烯单体用量是溶剂质量的10％-15％，分散剂聚乙烯吡咯烷酮用量为苯乙烯单体质量的10％-15％，引发剂偶氮二异丁晴质量为苯乙烯单体质量的1％-2％时，能够生成性能比较完备的微球；优选的，当蒸馏水：无水乙醇＝1：5，单体用量为溶剂质量的15％，分散剂用量为单体质量的10％，引发剂用量为单体质量的1.5％时，微球各指标达到最优状态；

2)在种子微球溶胀制备聚苯乙烯微球过程中，稳定剂选择聚乙烯吡咯烷酮，溶胀剂选择邻苯二甲酸二丁酯，溶胀温度在35-40℃之间，苯乙烯单体用量是种子微球用量的7-12倍，交联剂用量在单体用量的20％以内，聚苯乙烯微球制备效果较佳；优选的，溶胀温度为40℃，单体用量为种子微球的12倍，交联剂为单体用量的20％，制备的微球效果达到最佳；

3)在荧光染料和微球交联过程中，当THF中染料浓度在1×10^-2mol/L以内时，微球中染料负载值随染料浓度增加而增加，最优的，当染料浓度为1×10^-2mol/L，微球中染料负载值达到最大。

本发明的荧光染料激发和发射光谱在近红外光区，半峰宽很窄，stokes位移(斯托克斯位移)大于20，荧光量子产率大于0.65，对极性溶剂不敏感，具有优良的化学稳定性和光学稳定性，该类染料可适用于制备荧光微球，特别是聚苯乙烯荧光微球的制备，该微球分散性好，粒径均一，稳定性强，在计量，标准，生物化学，免疫医学，分析化学，化学工业，微电子工业和生命科学领域具有重大试剂应用价值。

附图说明

图1为不同溶剂体系所获得的聚苯乙烯微球扫描电镜图，其中，a为V(水):V(醇)＝5:1；b为V(水):V(醇)＝1:1；c为V(水):V(醇)＝1:5；d为乙醇做溶剂。

图2为不同单体用量所获得的聚苯乙烯微球扫描电镜图，其中，a为10％；b为15％；c为20％；d为25％(溶剂质量分数)。

图3为不同溶胀温度对聚苯乙烯微球影响的扫描电镜图，其中，a为35℃；b为40℃；c为45℃；d为50℃。

图4为不同单体用量对聚苯乙烯微球溶胀影响的扫描电镜图，其中，a为3倍；b为7倍；c为12倍；d为16倍(单体用量/种球质量)

具体实例方式

下面结合实施案例对本发明作进一步说明。

实施案例1：化合物1的合成

a.在100ml圆底烧瓶中加入5.0g 4-溴邻苯二甲酰亚胺，10.0g锡粉，再分别加入15ml冰醋酸和15ml浓盐酸(HCl)，加热回流，过夜反应，经减压蒸馏除去大部分溶剂以后，用二氯甲烷(CH₂Cl₂)萃取三次后，旋干溶剂，得油状物加入乙酸乙酯析出淡黄色固体；

b.在通氮气的情况下，冰浴中，向100mL圆底烧瓶中加入7mL CH₂Cl₂再加入2.31ml二甲基甲酰胺(DMF)，搅拌5min后慢慢滴2.79mL三氯氧磷(POCl₃)，室温反应半小时后，在冰浴中加入上述淡黄色固体的CH₂Cl₂溶液,加热回流过夜反应。用氢氧化钠(NaOH)溶液调节反应后PH＝7，萃取，旋干后得到黄棕色固体；

c.在100ml圆底烧瓶中,加入80ml乙醇和4M NaOH 6ml,回流反应3h后，用稀HCl调节PH至白色晶体出现为止，萃取旋干后得到褐色固体；

d.在50ml圆底烧瓶中加入20ml CH₂Cl₂，0.5ml 2，4－二甲基吡咯和0.47ml POCl3，室温反应半小时后，在冰浴中加入1ml三乙胺，室温反应10分钟后，加入1.2ml三氟化硼乙醚，室温反应2h，利用正己烷作为流动相，硅胶柱纯化，旋干得到蓝黑色固体即为化合物1。

实施案例2：化合物2的合成

a.在100ml圆底烧瓶中加入称取5.0g 4-溴邻苯二甲酰亚胺，10.0g锡粉，再分别加入15ml冰醋酸和15ml浓HCl，加热回流，过夜反应，经减压蒸馏出去大部分溶剂以后，用CH₂Cl₂萃取三次后，旋干溶剂，得油状物加入乙酸乙酯析出淡黄色固体；

b.在通氮气的情况下，冰浴中，向100mL圆底烧瓶中加入7mLCH₂Cl₂再加入2.31ml DMF，搅拌5min后慢慢滴2.79mL POCl₃，室温反应半小时后，在冰浴中加入上述淡黄色固体的CH₂Cl₂溶液，加热回流，过夜反应。用NaOH溶液调节反应后PH＝7，萃取，旋干后得到黄棕色固体；

c.在100ml圆底烧瓶中，加入80mL乙醇和4M NaOH 6ml，回流反应3h后，用稀HCl调节PH至白色晶体出现为止，萃取旋干后得到褐色固体；

d.在50ml圆底烧瓶中加入20ml CH₂Cl₂，0.5ml 2，4－二甲基三乙基吡咯和0.47mlPOCl3，室温反应半小时后，在冰浴中加入1ml三乙胺，室温反应10分钟后，加入1.2ml三氟化硼乙醚，室温反应2h，利用正己烷作为流动相，硅胶柱纯化，旋干得到蓝黑色固体即为化合物2。

实施例3：聚苯乙烯荧光微球的合成

(1)聚苯乙烯微球的制备

A.单分散聚苯乙烯种子微球的制备：

装有磁力搅拌、回流冷凝装置的100mL两口圆底烧瓶，油泵抽真空充氩气三次使体系充满氩气。分别以蒸馏水：无水乙醇为5:1,1:1,1:5和纯乙醇的体积比以及为苯乙烯单体质量10％，12.5％，15％的分散剂聚乙烯吡咯烷酮加入体系中，室温下充分搅拌使分散剂溶解。分别以苯乙烯单体质量的1％，1.5％，2％的引发剂偶氮二异丁晴的苯乙烯(质量分别为溶剂质量的10％，15％，20％，25％)单体，充分搅拌使体系均勾。将搅拌转速调至200r/min，油浴加热至70℃开始聚介，恒温反应24h，得白色乳状液。反应液高速离心后弃去上层淸液，将下层白色固体依次用去离子水、乙醇洗涤三次，产物于真空干燥箱中50℃干燥24h，得白色固体粉末。

B.聚苯乙烯微球的制备：

配制0.25wt％的十二烷基硫酸钠(SDS)水溶液备用；

称取一定量聚苯乙稀种子微球加入6.5mL上述SDS水溶液中，取适量溶胀剂加入11mLSDS溶液中，分别超声乳化后将两份乳液混合，在35-40℃油浴中以400r/min的速度搅拌溶胀24h，使乳化后的溶胀剂被种子微球吸收；

分别取种子微球质量3，7，12，16倍的单体苯乙稀，单体质量20％以内的交联剂二乙稀基苯，加入适量引发剂过氧化二苯甲酰，搅拌溶解后，加入40mLSDS溶液并超声乳化。将含有单体和引发剂的乳液加入到种子微球的溶胀液中，35-40℃继续溶胀24h，使单体被种子微球充分吸收；

最后向体系中加入5mLPVP质量分数10％的稳定剂水溶液，搅拌均勾后通氩气保护，将搅拌速度调至150r/min，于70℃条件下恒温聚合24h。反应液冷却后高速离心分离，下层白色固体依次用乙醇、去离子水洗涤3次，产物于真空干燥箱中50℃干燥24h，所得白色固体粉末即交联后的聚苯乙烯微球。

2)荧光染料和聚苯乙烯微球交联：

A.H₂O-THF体系向微球中负载染料：将一定量交联聚苯乙烯微球分散在适量的去离子水中，权利要求1所述的荧光染料配成不同浓度的THF溶液，H₂O、THF以一定体积比加入微球分散液中搅拌吸附，离心分离并用无水乙醇洗涤数次，微球在真空干燥箱中40℃干燥10h，获得一系列染料含量不同的荧光微球。

实施例4：聚苯乙烯微球合成中的影响因素分析

(1)反应溶剂体系对单分散微球的影响

合成过程中，分别以蒸馏水：无水乙醇为5:1,1:1,1:5和纯乙醇作为反应中的溶剂，考察了溶剂配比对微球粒径、形貌和单分散性的影响，不同溶剂体系所获得的聚苯乙烯微球扫描电镜图片如图1所示(图中a:V(水):V(醇)＝5:1；b：V(水):V(醇)＝1:1；c：V(水):V(醇)＝1:5；d：乙醇做溶剂)，从图1看出，在一定范围内，随着醇水体系中醇的比例增大，微球粒径增大，且保持均匀和单分散性，但仅以醇为溶剂时，微球粒径并不均一。

通过对不同溶剂体系制备的微球粒径、均匀度、分散性的分析，当体系中水醇比例不小于1:5时，醇越多，粒径越大，最优选择水：醇＝1:5。

(2)单体用量对单分散微球的影响

为考察单体用量对微球粒径大小的影响，固定水醇比例为1:5，单体质量从溶剂质量的10％逐渐增加至25％，其他条件不变，所获微球的扫描电镜图如图2所示(其中a：10％；b：15％；c：20％；d：25％)。

如图2所示，随着单体质量增加，微球粒径逐渐变大，单体质量为10％和15％时，所得微球粒径均匀呈分散，单体质量增值20％时，部分微球略微不均匀，单分散性变差；再增加值25％时，微球中大小粒径同时存在，分散性较差。其中，单体质量为15％时，所得微球粒径、均匀度和分散性表现最优。

(3)分散剂、引发剂的影响

在制备微球环境中，当分散剂质量为单体质量的15％，引发剂质量为单体质量的1.5％时，所得微球的粒径、均匀度和分散度表现最优。

(4)溶胀温度对聚苯乙烯微球溶胀的影响

为获得溶胀种球的最佳温度，以邻苯二甲酸二丁酯为溶胀剂，固定溶胀剂及种子微球、聚合单体的质量，分别以35℃、40℃、45℃、50℃作为溶胀温度，获得的产品经离心分离后测定的形貌如图3所示(其中a:35℃；b:40℃；c:45℃；d:50℃)。

从图4中可以看出，在35-40℃范围内，随着溶胀温度的升高，微球吸收溶胀剂和单体的能力增加，聚合微球的粒径也增加，且形貌良好；而当温度高于45℃时，单体和溶胀剂会对种球造成影响使其破损甚至聚集，因此选择40℃作为溶胀温度，可获得粒径更大，溶胀效率更好的微球，同时保持良好的分散性。

(5)单体用量对聚苯乙烯微球的影响

当种球质量一定时，单体用量的多少直接决定了溶胀后微球的粒径大小，分别取单体质量为种球质量的3、7、12、16倍，溶胀结束后扫描电镜照片如图4所示(其中a:3倍；b:7倍；c:12倍；d:16倍)。

如图4所示，单体质量为种子微球3倍时，粒径大小较均匀，但表面有小的凹陷结构；当为7和12倍时，粒径均匀，且表面光滑，分散性良好；当为16倍时，粒径变大，但是粒径表面破坏严重。因此，随着单体质量的逐渐增加，粒径的大小也逐渐增加，但是当单体的量超过微球单体吸收能力上限时，对微球表面造成影响，所以在12倍种球质量下，微球质量最好。

Claims (6)

1.一类近红外氟硼二吡咯荧光染料，其特征在于：所述染料结构通式如下：

其包括化合物1，结构如下：

化合物2，结构如下：

2.一种制备权利要求1所述的荧光染料的方法，其特征在于包括如下步骤：

1)将4-溴邻苯二甲酰亚胺、锡粉在酸性条件下过夜进行还原反应后，经回流、萃取、旋干，得到淡黄色固体；

2)将淡黄色固体和等摩尔比例的Vilsmeier-Haack试剂(维尔斯迈尔-哈克试剂)混合，经过夜回流反应，调节PH＝7，萃取，旋干，得到棕色固体；

3)将得到的棕色固体和NaOH水溶液在乙醇中回流反应三小时，用稀盐酸调PH至出现白色晶体，萃取、旋干，得到褐色固体；

4)将得到的褐色固体和吡咯类衍生物，以1：10的摩尔比，有机溶剂、室温、催化剂条件下反应半小时后，冰浴中加入路易斯碱，室温下搅拌后，冰浴中加入三氟化硼乙醚，室温下反应，经旋干后用硅胶柱和高效液相纯化得到产品。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述酸性条件中酸为浓盐酸和冰醋酸混合液，其体积比为1：1；所述回流反应的有机溶剂为二氯甲烷和/或三氯甲烷；所述NaOH溶液浓度为4mol/L；所述吡咯类衍生物为2，4-二甲基吡咯和2，4-二甲基-三乙基吡咯，其中为前者时，染料为化合物1，为后者时，染料为化合物2；所述第四步反应催化剂为三氯氧磷，三氟乙酸；所述路易斯碱为三乙胺。

4.一种权利要求1所述荧光染料的应用，其特征在于所述荧光染料和聚苯乙烯微球相互交联形成聚苯乙烯荧光微球。

5.根据权利要求4所述的荧光微球的应用，其特征在于所述聚苯乙烯荧光微球制备方法如下：

1)聚苯乙烯微球的制备

A.单分散聚苯乙烯种子微球的制备：

装有磁力搅拌、回流冷凝装置的100mL两口圆底烧瓶，抽真空充氩气三次，依次加入一定量乙醇、蒸馏水以及分散剂聚乙烯吡咯烷酮，室温下充分搅拌使分散剂溶解，向体系中加入一定量引发剂偶氮二异丁晴的苯乙烯单体，充分搅拌使体系均勾，油浴加热至聚介，体系逐渐变白，恒温反应，得白色乳状液，反应液高速离心后弃去上层淸液，将下层白色固体依次用去离子水、乙醇洗涤，产物于真空干燥箱中干燥，得白色固体粉末；

B.交联聚苯乙烯微球的制备：

配制0.25wt％的十二烷基硫酸钠(SDS)水溶液备用；

称取一定量聚苯乙烯种子微球加入上述SDS水溶液中，取适量溶胀剂加入SDS溶液中，分别超声乳化后将两份乳液混合，油浴中搅拌溶胀，使乳化后的溶胀剂被种子微球吸收；

分别取一定量单体苯乙烯、交联剂二乙烯基苯，加入适量引发剂过氧化二苯甲酰，搅拌溶解后，加入SDS溶液并超声乳化，将含有单体和引发剂的乳液加入到种子微球的溶胀液中，使单体被种子微球充分吸收；

最后向体系中加入质量分数10％的稳定剂水溶液，搅拌均勾后通氩气保护，70℃条件下恒温聚合，反应液冷却后高速离心分离，下层白色固体依次用乙醇、去离子水洗涤，产物于真空干燥箱中干燥，所得白色固体粉末即交联后的聚苯乙烯微球；

2)荧光染料和聚苯乙烯微球交联：

H₂O-THF体系项微球中负载染料：将一定量交联聚苯乙烯微球分散在适量的去离子水中，权利要求1所述的荧光染料配成不同浓度的THF溶液，按H₂O、THF体积比5：1加入微球分散液中搅拌吸附，然后离心分离并用无水乙醇洗涤数次，微球在真空干燥箱中干燥，获得一系列染料含量不同的荧光微球。

6.根据权利要求5所述的荧光微球制备方法，其特征在于：

1)在单分散聚苯乙烯种子微球制备过程中，溶剂中蒸馏水和无水乙醇体积比不小于1：5，苯乙烯单体用量是溶剂质量的10％-15％，分散剂聚乙烯吡咯烷酮用量为苯乙烯单体质量的10％-15％，引发剂偶氮二异丁晴质量为苯乙烯单体质量的1％-2％时，能够生成性能比较完备的微球；优选的，当蒸馏水：无水乙醇＝1：5，单体用量为溶剂质量的15％，分散剂用量为单体质量的10％，引发剂用量为单体质量的1.5％时，微球各指标达到最优状态；

2)在种子微球溶胀制备聚苯乙烯微球过程中，稳定剂选择聚乙烯吡咯烷酮，溶胀剂选择邻苯二甲酸二丁酯，溶胀温度在35-40℃之间，苯乙烯单体用量是种子微球用量的7-12倍，交联剂用量在单体用量的20％以内，聚苯乙烯微球制备效果较佳；优选的，溶胀温度为40℃，单体用量为种子微球的12倍，交联剂为单体用量的20％，制备的微球效果达到最佳；

3)在荧光染料和微球交联过程中，当THF中染料浓度在1×10^-2mol/L以内时，微球中染料负载值随染料浓度增加而增加，最优的，当染料浓度为1×10^-2mol/L，微球中染料负载值达到最大。