CN115326956A - 一种索马鲁肽修饰剂中同系物杂质的分离检测方法 - Google Patents
一种索马鲁肽修饰剂中同系物杂质的分离检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种索马鲁肽修饰剂中同系物杂质的分离检测方法，涉及医药中间体分析技术领域。采用高效液相色谱仪对供试品溶液进行检测，利用流动相A和流动相B按不同的比例混合作为流动相进行梯度洗脱，利用面积归一化法计算杂质含量；其中，流动相A是由磷酸盐缓冲液和乙腈混合而得；流动相B是利用磷酸盐缓冲液、乙腈和水混合而得；用于配置流动相A和流动相B的所述磷酸盐缓冲液的pH值为3.5～5.0。利用高效液相色谱方法，通过优化色谱条件和洗脱条件能够在较短的时间内将索马鲁肽修饰剂中同系物杂质进行有效分离，具有较好的专属性和精密度，有利于控制终产品的质量。
Description
技术领域
本发明涉及医药中间体分析技术领域，具体而言，涉及一种索马鲁肽修饰剂中同系物杂质的分离检测方法。
背景技术
索马鲁肽(semaglutide)(别名：索玛鲁肽、司美格鲁肽)是由丹麦诺和诺德公司开发的新一代GLP-1(胰高血糖素样肽-1)类似物，索马鲁肽是基于利拉鲁肽基本结构而开发的长效剂型，其治疗2型糖尿病的效果更好。是继艾塞那肽、利拉鲁肽、阿比鲁肽、度拉糖肽、利司那肽、贝那鲁肽(中国批准)之后，全球第7个上市的GLP-1受体激动剂，也是全球第三款长效GLP-1周制剂。
在索马鲁肽的生产过程中，修饰剂的中的杂质情况尤其是同系物会影响最终产品的品质，若能够在短时间内检测修饰剂中的杂质情况，对于控制终产品的质量至关重要。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种索马鲁肽修饰剂中同系物杂质的分离检测方法，能够在较短时间内检测修饰剂X6的杂质情况，从而控制终产品的质量，具有良好的专属性和精密度。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供一种索马鲁肽修饰剂中同系物杂质的分离检测方法，包括：采用高效液相色谱仪对供试品溶液进行检测，利用流动相A和流动相B按不同的比例混合作为流动相进行梯度洗脱，利用面积归一化法计算杂质含量；
其中，流动相A是由磷酸盐缓冲液和乙腈混合而得；
流动相B是利用磷酸盐缓冲液、乙腈和水混合而得；
用于配置流动相A和流动相B的磷酸盐缓冲液的pH值为3.5～5.0。
在可选的实施方式中，流动相A的制备过程包括：将磷酸盐缓冲液和乙腈混合，过滤，磷酸盐缓冲液和乙腈的体积比为17～21:1。
在可选的实施方式中，流动相B的制备过程包括：将磷酸盐缓冲液、乙腈和水混合，过滤，磷酸盐缓冲液、乙腈和水的体积比为0.8～1.2:7～9:1。
在可选的实施方式中，用于配置流动相A和流动相B的磷酸盐缓冲液的制备过程包括：将磷酸二氢盐和水混合，用磷酸调节pH值为3.5～5.0；
优选地，在制备磷酸盐缓冲液的过程中，磷酸二氢盐为磷酸二氢钾，每1L水对应磷酸二氢钾的用量为4.0g～4.3g。
在可选的实施方式中，洗脱程序如下：
当时间为0.0min时，混合流动相中流动相A的体积分数为50-70％，流动相B的体积分数为30-50％；
当时间为10.0min时，混合流动相中流动相A的体积分数为25-30％，流动相B的体积分数为70-75％；
当时间为20.0min时，混合流动相中流动相A的体积分数为10-20％，流动相B的体积分数为80-90％；
当时间为55.0min时，混合流动相中流动相A的体积分数为10-20％，流动相B的体积分数为80-90％。
在可选的实施方式中，供试品溶液是将待测样品与稀释剂混合，控制待测样品在供试品溶液中的浓度为1mg/mL～3mg/mL；
其中，待测样品中含有索马鲁肽修饰剂X6及同系物，同系物包括C14、C15、C16、C17、C19和C20的衍生物。
在可选的实施方式中，稀释剂为乙腈或甲醇。
在可选的实施方式中，色谱条件：柱温为45℃～55℃，流速为0.9mL/min～1.1mL/min，检测波长为200nm～220nm，进样量为15μL～25μL。
在可选的实施方式中，所采用的色谱柱为Agilent Poroshell 120EC-C18。
在可选的实施方式中，色谱柱的长度为90mm～120mm，内径为4mm～5mm，填料粒径为2μm～3μm，色谱柱的填料是由1.5μm-2.0μm直径的实心核和0.3μm-0.7μm厚的多孔外层构成的小粒径填料；或，所述色谱柱的填料为亚2微米全多孔填料。
本发明具有以下有益效果：利用高效液相色谱方法，通过优化色谱条件和洗脱条件能够在较短的时间内将索马鲁肽修饰剂中同系物杂质进行有效分离，具有较好的专属性和精密度，有利于控制终产品的质量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例1的混合溶液色谱图；
图2为实施例2的重复性色谱图；
图3为对比例1的混合溶液色谱图；
图4为对比例2的混合溶液色谱图；
图5为对比例3的混合溶液色谱图；
图6为对比例4的混合溶液色谱图；
图7为对比例5的混合溶液色谱图；
图8为对比例6的混合溶液色谱图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明实施例提供一种索马鲁肽修饰剂中同系物杂质的分离检测方法，包括以下步骤：
S1、供试品溶液制备
供试品溶液是将待测样品与稀释剂混合，控制待测样品在供试品溶液中的浓度为1mg/mL～3mg/mL；其中，待测样品中含有索马鲁肽修饰剂X6及同系物，同系物包括C14、C15、C16、C17、C19和C20的衍生物。
具体地，供试品溶液中的浓度可以为1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL、2.5mg/mL、3.0mg/mL等。
需要说明的是，索马鲁肽修饰剂[tBuO-Ste-Glu(AEEA-AEEA-OH)-OtBu，简称X6，CAS登记号为1118767-16-0]。索马鲁肽修饰剂X6(又名索玛鲁肽侧链X6、司美格鲁肽侧链X6，其同系物包括C14、C15、C16、C17、C19和C20的衍生物，该同系物杂质是在索马鲁肽修饰剂X6生产过程中存在。本发明实施例的目的在于将索马鲁肽修饰剂X6与杂质分离，且分离度较好。
在一些实施例中，稀释剂采用乙腈或甲醇，有利于进一步提升分离效果。
在实际操作过程中可以采用如下操作步骤配置：
(1)配制系统适用性溶液：分别取主成分对照品、杂质A(3AEEA衍生物)对照品、杂质B(单AEEA衍生物)对照品和杂质C(甲酯衍生物)对照品适量，用稀释剂溶解并制成每1mL中含主成分约1～3mg、杂质A约0.01～0.03mg、杂质B约0.03～0.05mg和杂质C约0.01～0.03mg的混合溶液。
(2)供试品溶液：取供试品适量，用稀释剂溶解并制成每1mL中含1～3mg的溶液。
S2、检测
采用高效液相色谱仪对供试品溶液进行检测，利用流动相A和流动相B按不同的比例混合作为流动相进行梯度洗脱，利用面积归一化法计算杂质含量。
发明人对洗脱条件进行了优化，流动相A是由磷酸盐缓冲液和乙腈混合而得，流动相B是利用磷酸盐缓冲液、乙腈和水混合而得，通过进一步控制流动相A和流动相B的组成和洗脱条件达到更好地分离效果。
在一些实施例中，用于配置流动相A和流动相B的磷酸盐缓冲液的制备过程包括：将磷酸二氢盐和水混合，用磷酸调节pH值为3.5～5.0(如4.0、4.5、5.0等)，磷酸二氢盐可以为磷酸二氢钾或磷酸二氢钠。磷酸二氢盐为磷酸二氢钾时，在制备磷酸盐缓冲液的过程中，每1L水对应磷酸二氢钾的用量为4.0g～4.3g，如4.0g、4.1g、4.2g、4.3g等。
进一步地，流动相A的制备过程包括：将磷酸盐缓冲液和乙腈混合，过滤，磷酸盐缓冲液和乙腈的体积比为17～21:1，如17:1、18:1、19:1、20:1、21:1等。过滤的形式不限，可以采用抽滤的方式。
进一步地，流动相B的制备过程包括：将磷酸盐缓冲液、乙腈和水混合，过滤，磷酸盐缓冲液、乙腈和水的体积比为0.8～1.2:7～9:1，如0.8:7:1、0.9:7:1、1.0:8:1、1.1:8.5:1、1.2:9.0:1等。
进一步地，洗脱程序可以参照表1，当时间为0.0min时，混合流动相中流动相A的体积分数为50-70％，流动相B的体积分数为30-50％；当时间为10.0min时，混合流动相中流动相A的体积分数为25-30％，流动相B的体积分数为70-75％；当时间为20.0min时，混合流动相中流动相A的体积分数为10-20％，流动相B的体积分数为80-90％；当时间为55.0min时，混合流动相中流动相A的体积分数为10-20％，流动相B的体积分数为80-90％。在55.0min后回初始梯度，当时间为57.0min时，混合流动相中流动相A的体积分数为50-70％，流动相B的体积分数为30-50％；当时间为65.0min时，混合流动相中流动相A的体积分数为50-70％，流动相B的体积分数为30-50％。
表1洗脱程序
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 50-70 | 30-50 |
| 10 | 25-30 | 70-75 |
| 20 | 10-20 | 80-90 |
| 55 | 10-20 | 80-90 |
| 57 | 50-70 | 30-50 |
| 65 | 50-70 | 30-50 |
发明人对检测时的色谱条件进行了优化，以进一步提高分离效果，色谱条件：柱温为45℃～55℃，流速为0.9mL/min～1.1mL/min，检测波长为200nm～220nm，进样量为15μL～25μL。柱温、流速、检测波长、进样量控制在上述范围内为宜，如柱温可以为45℃、48℃、50℃、53℃、55℃等，流速为0.9mL/min、1.0mL/min、1.1mL/min等，检测波长为200nm、205nm、210nm、215nm、220nm等，进样量可以为15μL、18μL、20μL、22μL、25μL等。
进一步地，所采用的色谱柱为Agilent Poroshell 120EC-C18，色谱柱的长度为90mm～120mm，内径为4mm～5mm，填料粒径为2μm～3μm，色谱柱的填料是由1.5μm-2.0μm直径的实心核和0.3μm-0.7μm厚的多孔外层构成的小粒径填料；或，所述色谱柱的填料为亚2微米全多孔填料。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
以下实施例中采用的实验仪器：Agilent 1100；检测器：DAD；
色谱柱：Agilent Poroshell EC-C18规格：100×4.6mm,2.7μm。
实施例1
本实施例提供一种索马鲁肽修饰剂中同系物杂质的分离检测方法，包括以下步骤：
(1)溶液配制
磷酸盐缓冲液(PH4.4)：取磷酸二氢钾4.17g，加水使溶解成1000mL，用磷酸调节pH值至4.4。
流动相A：磷酸盐缓冲液(PH4.4)和乙腈按照体积比19:1混合。
流动相B：乙腈、磷酸盐缓冲液(PH4.4)和水按照体积比8:1:1混合。
稀释剂：乙腈。
混合溶液：分别取C14、C15、C16、C17、C19、C20衍生物和X6适量，用稀释剂配制成每1mL中含各杂质约0.002mg，索马鲁肽修饰剂X6(CAS登记号为1118767-16-0，为C18-(OtBu)-Glu(AEEA-AEEA-OH)OtBu，为C18衍生物)约2mg的混合溶液。
需要说明的是，C14、C15、C16、C17、C19、C20衍生物是X6的基础上碳链增加或减少几个碳，比如C15就是C15-(OtBu)-Glu(AEEA-AEEA-OH)OtBu。
(2)检测条件
色谱条件：柱温50℃，检测波长210nm，进样量20μL，流速1.0mL/min；
洗脱程序如表2所示：
表2洗脱程序
检测结果如图1所示，各同系物杂质间的分离度均大于1.5，同系物杂质与相邻色谱峰及X6与相邻色谱峰间的分离度均大于1.0。
实施例2-精密度
取供试品X6适量，用乙腈溶解制成每1mL中约含2mg的溶液。同法配制12份。以面积归一化法计算，前6份检测结果计算重复性结果(见表3和图2所示)，12份结果一起计算中间精密度结果(见表4)。
表3重复性结果(％)
| 名称 | 重复性1 | 重复性2 | 重复性3 | 重复性4 | 重复性5 | 重复性6 | 平均值 | RSD％ |
| 杂质A | 0.1195 | 0.1180 | 0.1181 | 0.1181 | 0.1185 | 0.1178 | 0.1183 | 0.52 |
| 主成分 | 98.4802 | 98.4777 | 98.4806 | 98.4843 | 98.4874 | 98.4899 | 98.4834 | 0.005 |
| 杂质B | 0.1930 | 0.1973 | 0.1936 | 0.1931 | 0.1942 | 0.1927 | 0.1940 | 0.88 |
| 杂质C | 0.9618 | 0.9592 | 0.9600 | 0.9586 | 0.9594 | 0.9603 | 0.9599 | 0.12 |
| 总杂 | 1.5198 | 1.5223 | 1.5194 | 1.5157 | 1.5126 | 1.5101 | 1.5167 | 0.31 |
| 杂质个数 | 14 | 14 | 14 | 14 | 14 | 14 | 14 | / |
表4中间精密度结果(％)
| 名称 | 杂质A | 主成分 | 杂质B | 杂质C | 总杂 | 杂质个数 |
| 重复性1 | 0.1195 | 98.4802 | 0.1930 | 0.9618 | 1.5198 | 14 |
| 重复性2 | 0.1180 | 98.4777 | 0.1973 | 0.9592 | 1.5223 | 14 |
| 重复性3 | 0.1181 | 98.4806 | 0.1936 | 0.9600 | 1.5194 | 14 |
| 重复性4 | 0.1181 | 98.4843 | 0.1931 | 0.9586 | 1.5157 | 14 |
| 重复性5 | 0.1185 | 98.4874 | 0.1942 | 0.9594 | 1.5126 | 14 |
| 重复性6 | 0.1178 | 98.4899 | 0.1927 | 0.9603 | 1.5101 | 14 |
| 中间精密度1 | 0.1213 | 98.5059 | 0.1909 | 0.9302 | 1.4941 | 14 |
| 中间精密度2 | 0.1257 | 98.4993 | 0.1930 | 0.9316 | 1.5007 | 14 |
| 中间精密度3 | 0.1176 | 98.4598 | 0.1972 | 0.9442 | 1.5402 | 14 |
| 中间精密度4 | 0.1233 | 98.4821 | 0.1876 | 0.9407 | 1.5179 | 14 |
| 中间精密度5 | 0.1245 | 98.4754 | 0.1938 | 0.9373 | 1.5246 | 14 |
| 中间精密度6 | 0.1229 | 98.4772 | 0.1925 | 0.9394 | 1.5228 | 14 |
| 平均值 | 0.1204 | 98.4833 | 0.1932 | 0.9486 | 1.5167 | 14 |
| RSD(％) | 2.45 | 0.01 | 1.32 | 1.31 | 0.78 | / |
结论：供试品溶液连续进样6次，杂质A含量RSD值均不过0.52％，杂质B和杂质C含量RSD值均不过0.88％，主成分和总杂含量RSD值均不过0.31％，故该方法的重复性良好。12组数据，杂质A含量RSD值均不过2.45％，杂质B和杂质C含量RSD值均不过1.32％，主成分和总杂含量RSD值均不过0.78％。故该方法的中间精密度良好。
对比例1
与实施例1的区别仅在于：磷酸盐缓冲液的pH值，具体如下：
磷酸盐缓冲液(PH6.0)：取磷酸二氢钾4.17g，加水使溶解成1000mL，用磷酸调节pH值至6.0。
流动相A：磷酸盐缓冲液(PH6.0)和乙腈按照体积比19:1混合。
流动相B：乙腈、磷酸盐缓冲液(PH6.0)和水按照体积比8:1:1混合。
结论：如图3所示，该方法下，主峰前延，同系物杂质与相邻色谱峰及X6与相邻色谱峰间的分离度减小。
对比例2
与实施例1的区别仅在于：磷酸盐缓冲液的pH值，具体如下：
磷酸盐缓冲液(PH3.0)：取磷酸二氢钾4.17g，加水使溶解成1000mL，用磷酸调节pH值至3.0。
流动相A：磷酸盐缓冲液(PH3.0)和乙腈按照体积比19:1混合。
流动相B：乙腈、磷酸盐缓冲液(PH3.0)和水按照体积比8:1:1混合。
结论：如图4所示，同系物杂质与相邻色谱峰及X6与相邻色谱峰间的分离度减小。
对比例3
与实施例1的区别仅在于：改变柱温为40℃，其余不变。
结论：如图5所示，杂质与主峰未分开。
对比例4
与实施例1的区别仅在于：在实施例1上更换色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C184.6*250mm,3μm，其余条件不变。
结论：如图6所示，杂质间及杂质与主峰间未分开。
对比例5
与实施例1的区别仅在于：在实施例1调整流速为1.2mL/min。
结论：如图7所示，主峰与相邻杂质间未分开。
对比例6
与实施例1的区别仅在于：在实施例1调整流速为0.8mL/min。
结论：如图8所示，主峰与相邻杂质间未分开，且主峰变宽，峰有拖尾。
综上，本发明提供一种索马鲁肽修饰剂中同系物杂质的分离检测方法，利用高效液相色谱方法，通过优化色谱条件和洗脱条件能够在较短的时间内将索马鲁肽修饰剂中同系物杂质进行有效分离，具有以下优点：
(1)在本发明的色谱条件下，能有效分离开X6及其同系物(C14、C15、C16、C17、C19、C20衍生物)杂质，分离度达到1.5以上；
(2)方法的精密度良好，检测结果准确可靠；
(3)本发明在较短时间内检测出其他杂质和同系物杂质，节约检测时间和成本，更好地控制产品质量，为企业创造更大收益。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种索马鲁肽修饰剂中同系物杂质的分离检测方法，其特征在于，包括：采用高效液相色谱仪对供试品溶液进行检测，利用流动相A和流动相B按不同的比例混合作为流动相进行梯度洗脱，利用面积归一化法计算杂质含量；
其中，所述流动相A是由磷酸盐缓冲液和乙腈混合而得；
所述流动相B是利用磷酸盐缓冲液、乙腈和水混合而得；
用于配置所述流动相A和所述流动相B的所述磷酸盐缓冲液的pH值为3.5～5.0。
2.根据权利要求1所述的分离检测方法，其特征在于，所述流动相A的制备过程包括：将所述磷酸盐缓冲液和乙腈混合，过滤，所述磷酸盐缓冲液和乙腈的体积比为17～21:1。
3.根据权利要求1所述的分离检测方法，其特征在于，所述流动相B的制备过程包括：将所述磷酸盐缓冲液、乙腈和水混合，过滤，所述磷酸盐缓冲液、乙腈和水的体积比为0.8～1.2:7～9:1。
4.根据权利要求1所述的分离检测方法，其特征在于，用于配置所述流动相A和所述流动相B的所述磷酸盐缓冲液的制备过程包括：将磷酸二氢盐和水混合，用磷酸调节pH值为3.5～5.0；
优选地，在制备所述磷酸盐缓冲液的过程中，所述磷酸二氢盐为磷酸二氢钾，每1L水对应所述磷酸二氢钾的用量为4.0g～4.3g。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的分离检测方法，其特征在于，洗脱程序如下：
当时间为0.0min时，混合流动相中流动相A的体积分数为50-70％，流动相B的体积分数为30-50％；
当时间为10.0min时，混合流动相中流动相A的体积分数为25-30％，流动相B的体积分数为70-75％；
当时间为20.0min时，混合流动相中流动相A的体积分数为10-20％，流动相B的体积分数为80-90％；
当时间为55.0min时，混合流动相中流动相A的体积分数为10-20％，流动相B的体积分数为80-90％。
6.根据权利要求1所述的分离检测方法，其特征在于，所述供试品溶液是将待测样品与稀释剂混合，控制待测样品在所述供试品溶液中的浓度为1mg/mL～3mg/mL；
其中，所述待测样品中含有索马鲁肽修饰剂X6及同系物，所述同系物包括C14、C15、C16、C17、C19和C20衍生物。
7.根据权利要求6所述的分离检测方法，其特征在于，所述稀释剂为乙腈或甲醇。
8.根据权利要求1所述的分离检测方法，其特征在于，色谱条件：柱温为45℃～55℃，流速为0.9mL/min～1.1mL/min，检测波长为200nm～220nm，进样量为15μL～25μL。
9.根据权利要求8所述的分离检测方法，其特征在于，所采用的色谱柱为AgilentPoroshell 120EC-C18。
10.根据权利要求9所述的分离检测方法，其特征在于，色谱柱的长度为90mm～120mm，内径为4mm～5mm，填料粒径为2μm～3μm，所述色谱柱的填料是由1.5μm-2.0μm直径的实心核和0.3μm-0.7μm厚的多孔外层构成的小粒径填料；
或，所述色谱柱的填料为亚2微米全多孔填料。
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