CN115322907A - 一种具有防控烟草根腐病功能的微生物菌剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有防控烟草根腐病功能的微生物菌剂及其应用，包括以下三株功能菌株复配而成：一株保藏号为CGMCCNO.18270的具有抑制群结腐霉病原真菌生长繁殖的木霉菌(Trichoderma spp.)WSWFJ‑17、一株保藏号为CGMCC NO.18265的具有抑制异丝腐霉病原真菌生长繁殖的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)WSWFJ‑20、一株保藏号为CGMCC NO.18261的具有促生长、促植物抗性提升作用的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)WSWFJ‑19。本发明产品能有效降低烟草根腐病的发病率，同时能促进烟草根系恢复和再生长，提高烟草抗性和生长活力。

Description

一种具有防控烟草根腐病功能的微生物菌剂及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种具有防控烟草根腐病功能的微生物菌剂及其应用。
背景技术
根腐病是烟草主要的病害之一，常于烟苗小十字期出现、大十字期扩展、猫耳期爆发，导致幼苗胚根、幼根，甚至茎基部造成腐烂，病苗根部先变褐色、腐烂，病苗上部叶片发黄、萎蔫。发病后，随着病情发展，泛黄的烟苗和发育不良的烟苗会逐步扩展，在漂盘上形成不同规则的黄化异常区域。发病严重时，会发生腐烂至幼苗死亡。
烟草种植期间，由于田间管理不当或者排水不畅，引起土壤中氧气含量下降，根系正常呼吸受到抑制，易造成烟草烂根，同时爆发根腐病；单一使用化肥或者过多使用氮肥，施肥时间不合理，肥料距离根系较近或施入过多未腐熟的农家肥，导致烟草根系附近浓度过高，容易造成烧根，同时爆发烟草根腐病；另外不合理施肥，造成土壤板结，透气性差，根系正常的新陈代谢受阻，发育不良，也极易爆发烟草根腐病。根腐病在大田发生时，主要侵染烟草根部，发病初期根尖变褐、腐烂，中后期根系全部腐烂，导致整株死亡，减产严重，移栽初期低温多雨，经常带来根腐病的爆发和蔓延，从而导致烟草的巨大损失。
预防根腐病的发生，首先在于科学管理，合理施肥，避免由于育苗期及大田期管理不当引起的烂根及病菌感染。同时，针对根腐病发病的特点，研究得到一组适用于烟草根腐病防控的微生物菌剂及其配套使用方法，用于烟草种植的绿色防控，是我们当前亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足而提供一种对群结腐霉菌、异丝腐霉菌具有防控功能的微生物菌剂及其应用，本发明产品能有效降低烟草根腐病的发病率，同时能促进烟草根系恢复和再生长，提高烟草抗性和生长活力。
为达到上述目的，本发明通过以下技术方案来实现。
一种具有防控烟草根腐病功能的微生物菌剂，包括以下三株功能菌株复配而成：
一株保藏号为CGMCC NO.18270的具有抑制群结腐霉病原真菌生长繁殖的木霉菌(Trichoderma spp.)WSWFJ-17、一株保藏号为CGMCC NO.18265的具有抑制异丝腐霉病原真菌生长繁殖的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WSWFJ-20、一株保藏号为CGMCCNO.18261的具有促生长、促植物抗性提升作用的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)WSWFJ-19。
所述的具有防控烟草根腐病功能的微生物菌剂，
两种芽孢杆菌菌粉中有效活菌数均为1×1011cfu/g，木霉菌菌粉中有效活菌数为5×105cfu/g。所述的具有防控烟草根腐病功能的微生物菌剂，将三种菌分别发酵后制备菌粉混合制备菌剂；
进一步的，枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和木霉菌的菌粉混合比例为质量比0.5-3:0.5-3:1.3-3.8。
所述的具有防控烟草根腐病功能的微生物菌剂，枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌菌粉的制备：
将活化培养的种子液按照1‰-5‰的比例接种到发酵罐中的发酵培养液中，在温度为35℃-38℃，转速为100-150rpm/min条件下培养48h-60h，得到发酵液；所述发酵液的有效活菌数大于2.0×107cfu/mL；将发酵液导入离心机中，离心后排除上层菌悬液，得到菌种浓缩液，并使菌种浓缩液中的芽孢杆菌有效活菌数不小于1×1010cfu/mL；加入辅料，喷雾干燥；
进一步地，将菌种浓缩液加入搅拌罐中，加入占菌种浓缩液10％～13％的辅料，通过0.8-1.0Pa的压力将所述菌种浓缩液压至旋转喷头，并使喷头保持在转速为18000-22000r/min下喷雾，同时在干燥塔中通入140-160℃、3800-4200m3/h的热风进行干燥，经过喷雾干燥后制得芽孢杆菌有效活菌数不小于1×1011cfu/g的芽孢杆菌微生物菌粉；
进一步地，所述发酵培养液的组成成分及其重量份数比为：黄豆粉2-4份、蔗糖0.5-1份、牛肉膏1-3份、玉米粉2-3份、碳酸钙0.8-1.5份、鱼粉1-2份、磷酸二氢钾0.05-0.1份、磷酸氢二钾0.05-0.1份、氯化钠1-5份、消泡剂(花生油或者菜籽油)0.1-0.3份，水1000份。采用盐酸、氢氧化钠调节pH至6.8-7.5。
进一步地，所述喷雾阶段的辅料包括如下重量份的组分：硅藻土55～65份，碳酸钙15～25份，淀粉15～25份。
优选：枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌菌粉的制备
从-80℃条件下取出用甘油保存的菌株保存液按体积1％-3％的比例接种到LB培养基中，在温度为35℃-38℃、转速为160rpm条件下活化培养24h-48h，得到种子液；再将种子液按照1‰-5‰的比例接种到发酵罐中的发酵培养液中，在温度为35℃-38℃，转速为120rpm/min条件下培养48h-60h，得到发酵液。所述发酵液的有效活菌数大于2.0×107cfu/mL。将发酵液导入碟式离心机中，在转速6000r/min下离心15min，离心后排除上层菌悬液，得到菌种浓缩液，并使菌种浓缩液中的芽孢杆菌有效活菌数不小于1×1010cfu/mL。将浓缩离心后得到的菌种浓缩液进行喷雾干燥，将菌种浓缩液加入搅拌罐中，加入10％～13％的辅料，通过0.9Pa的压力将所述菌种浓缩液压至旋转喷头，并使喷头保持在转速为20000r/min下喷雾，同时在干燥塔中通入150℃、4000m3/h的热风进行干燥，经过喷雾干燥后制得芽孢杆菌有效活菌数不小于1×1011cfu/g的芽孢杆菌微生物菌粉。
所述的具有防控烟草根腐病功能的微生物菌剂，木霉菌菌粉的制备：
将活化的菌种体积6‰-7‰的比例接种到液体发酵培养液中，黑暗条件下培养55-75h，温度控制在25-30℃，pH值为6.0-7.0，通气量为200-260m3/h，每小时搅拌1-2次，搅拌时间为10-20min，得到发酵菌液，所述菌液的有效活菌数大于1.0×1010cfu/mL；按照18-22％的比例将菌液接种到固体培养基中，采用浅盘发酵法进行培养，得到木霉菌，再将木霉菌烘干过筛，得到有效活菌数不小于5×105cfu/g菌粉；
进一步的，发酵培养液的组成成分为：蔗糖10-80g/L，黄豆粉1-30g/L，硝酸钠0.1-20g/L，磷酸氢二钾0.05-5g/L，硫酸锌0.03-3g/L，硫酸铁0.01-1g/L；
进一步的，固体培养基的组成成分为：玉米粉1-3份、麸皮1-3份、黄豆粉2-5份、稻壳粉0.5-2份，加入原料重量65％-80％的水；
进一步的，浅盘发酵的具体步骤：1-5d内温度控制在21-23℃，当温度达到26℃以上时，采用通风、冷藏方法使温度下降至21-23℃，共计发酵天数至少15d。
优选木霉菌菌粉的制备：
从-80℃条件下取出用滤纸保存法保存的木霉菌株，接种到PDA液体培养基中，在20℃-28℃条件下振荡培养72h-120h后得到种子液；将活化的菌种体积6‰-7‰的比例接种到液体发酵液中，黑暗条件下培养55-75h，温度控制在25-30℃，pH值为6.0-7.0，通气量为200-260m3/h，每小时搅拌1-2次，搅拌时间为10-20min，得到发酵菌液，所述菌液的有效活菌数大于1.0×1010cfu/mL。按照20％的比例将菌液接种到固体培养基中，采用浅盘发酵法进行培养，得到木霉菌，再将木霉菌用30℃的温度进行温烘干，粉碎后过60目的筛子，得到有效活菌数不小于5×105cfu/g菌粉。
浅盘发酵的具体步骤：1-5d内温度控制在22℃，当温度达到26℃以上时，采用通风、冷藏等方法使温度下降至22℃，共计发酵天数为15d。
所述的具有防控烟草根腐病功能的微生物菌剂的应用，在烟草育苗和移栽时进行灌根、蘸根处理，用于烟草根腐病的防治，进一步，具体将菌剂兑水稀释300-500倍，用于蘸根和灌根，每亩用量1-2kg。
所述的具有防控烟草根腐病功能的微生物菌剂的应用，菌剂与育苗基质混合后用于烟草育苗，在苗期进行功能菌种的定殖，避免根腐病的发生，进一步，具体为基质和复合菌剂菌粉按照质量比1000:2-10进行混合，用于育苗。
进一步地，烟草育苗基质的制备：
1、原料准备：采用草炭、蛭石、珍珠岩、稻壳炭作为基质的生产原料，原料要求符合有机农业生产资料的要求，符合GB 38400-2019的相关规定。
2、混料：按照体积份数计，各原料配方比例为草炭：蛭石：珍珠岩：稻壳炭＝5-8:3-5:3-6:1-3，混合后即得到烟草育苗基质。
所述的具有防控烟草根腐病功能的微生物菌剂的应用，菌剂与有机肥料混合制成生物有机肥，用于烟草移栽时底肥的施用，在烟苗进入大田时进行功能菌种的定殖，避免根腐病的发生，进一步，具体为有机肥料和复合菌剂菌粉按照质量比1000:1-5进行混合制成生物有机肥，生物有机肥每亩施用量50-200kg，包括采用穴施、塘施、条施、撒施的方法进行施用。
有机肥料优选烟草专用全油枯有机肥，其制备优选：
1、原料准备：采用压榨菜籽枯(片枯)和浸提菜籽枯(粉枯)作为有机肥的生产原料，原料要求符合环保生态肥料、有机农业生产资料的要求，符合GB 38400-2019和NY/T525-2021的相关规定。
2、全油枯有机肥发酵：按照重量份数计，称取片枯300-600份、粉枯400-700份、腐熟剂2-5份均匀混合(腐熟剂具体为专利201810749560.5中描述的腐熟剂，由胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilagin osus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、胶冻样芽孢杆菌(Bacillus jelly)组成)，调节物料水份为50％-70％，投入全自动好氧发酵槽进行发酵腐熟，发酵温度至55℃开始翻抛，控制发酵温度为50-65℃，发酵时间为15-22天，温度下降至室温时发酵结束。
3、肥料后熟：将发酵完成的有机肥料堆放到后熟槽中静置后熟，使有机肥料各项指标趋于稳定，肥料充分腐熟完成，后熟时间为10-15天，之后得到全油枯有机肥成品。
本发明还提供了一株保藏号为CGMCC NO.18270的具有抑制群结腐霉病原真菌生长繁殖的木霉菌(Trichoderma spp.)WSWFJ-17；保藏日期：2019年7月22日，分类命名：木霉Trichoderma spp.。
本发明还提供了一株保藏号为CGMCC NO.18265的具有抑制异丝腐霉病原真菌生长繁殖的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WSWFJ-20；保藏日期：2019年7月22日，分类命名：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。
本发明还提供了一株保藏号为CGMCC NO.18261的具有促生长、促植物抗性提升作用的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)WSWFJ-19；保藏日期：2019年7月22日，分类命名：解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens。
上述菌株均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：中国北京朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明的有益效果为
本发明中采用的木霉菌(Trichoderma spp.)WSWFJ-17能抑制群结腐霉病原真菌的繁殖和生长，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WSWFJ-20能抑制异丝腐霉病原真菌的繁殖和生长，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)WSWFJ-19可以促进烟株生长，从而增强烟株生长势和抗逆性，减少患病几率。采用以上三个菌种进行组配，可以减少根腐病病原真菌的滋长，减少土壤中的病原菌含量，同时增强烟株自身抗逆性，达到有效减少烟草根腐病发生的目的。
本发明可在育苗阶段和大田阶段进行病害防控，对烟草整个生育期进行全程防控，促使功能菌株定殖在烟草根系周围，持续发挥防控作用，可以有效减少病原菌的感染几率，同时功能菌种可以成为烟草内生菌，长期发挥作用。
烟草一旦发生病害，本发明中的复合菌剂在进行杀灭病原菌，抑制病原菌生长的同时，可以刺激烟草根系的重新生长，以保证烟草快速恢复养分和水分吸收功能，促进烟草愈后正常生长，避免减产损失。
当前针对群结腐霉、异丝腐霉进行针对性防控的微生物菌剂还未有研究，本发明填补了这一方面的技术空白，可进行根腐病的特异性防控。
附图说明
图1：木霉菌与群结腐霉菌对峙试验照片。
图2：枯草芽孢杆菌与异丝腐霉菌对峙试验照片。
图3：实施例2中试验小区排布图。
图4：实施例4中试验小区排布图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但不局限于说明书上的内容。
实施例1
1、功能菌株对根腐病病原真菌(群结腐霉、异丝腐霉)的抑菌效果验证
通过从发病的烟苗中筛选出的群结腐霉、异丝腐霉与木霉菌和枯草芽孢杆菌进行拮抗试验，检测两种功能菌株对群结腐霉、异丝腐霉的抑制效果。
1材料与方法
1.1试验时间和地点
试验时间为2021年1月9日，安排在云南省昆明市安宁市青龙镇云南省微生物发酵工程研究中心有限公司实验室进行。
1.2试验材料
供试菌种：实验室筛选出的木霉菌和枯草芽孢杆菌；群结腐霉和异丝腐霉真菌。
供试培养基：PDA培养基、LB培养基。
1.3试验设计
分别以群结腐霉、异丝腐霉作为指示菌，采用木霉菌进行群结腐霉的平板抑菌试验，采用枯草芽孢杆菌进行异丝腐霉的平板抑菌试验，具体试验处理如下表1：
表1
Figure BDA0003644622690000101
1.4检测方法
记录菌株生长的直径，计算抑菌率。
抑菌率(％)＝(对照组菌落直径-处理组对照直径)/对照组菌落直径×100
2试验结果
从表2和图1、图2可知，木霉真菌对群结腐霉的抑菌率为64.17％，枯草芽孢杆菌对异丝腐霉的抑菌率为59.73％。结果表明，产品中所使用微生物菌种对根腐病病原真菌具有较好的抑制效果。
表2功能菌株对根腐病病原真菌抑菌率
处理 抑菌率(％)
1 —
2 64.17
3 —
4 59.73
3结论
综上所述，本发明产品中所使用的木霉真菌对群结腐霉菌具有较好的抑制效果，枯草芽孢杆菌对异丝腐霉菌具有较好的抑制效果，两株菌株能够作为防治烟草根腐病的功能菌株。
2、功能菌株对烟苗促生长效果验证
研究解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)WSWFJ-19对烟草的促生长效果，采用功能菌剂、灭活功能菌剂和空白对照开展烟草盆栽试验，通过对比烟草的生育期和农艺性状，判断其促生长效果。
1.1试验材料与方法
1.1.1试验地点
云南省微生物发酵工程研究中心有限公司试验大棚。
1.1.2试验材料
试验作物：K326
菌剂：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)WSWFJ-19菌粉、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)WSWFJ-19灭活菌粉。
1.1.3试验方法
本试验采取随机区组设计，试验设计3个处理，各处理均设3次重复，每个重复5个盆栽，共计9个小区，各处理如下：
表3各处理内容
Figure BDA0003644622690000111
Figure BDA0003644622690000121
菌剂与底土拌匀，进行烟苗移栽。选择同个生育期素质相当的烟苗作为试验作物，各处理田间管理措施一致，培养至旺长期进行数据采集。
1.2测定的项目及方法
1.2.1主要生育期记载
记录各处理的到达团棵期、旺长期的时间。
1.2.2农艺性状调查
分别在团棵期和旺长期进行农艺性状的测定，按照YC/T 142-2010烟草农艺性状调查测量方法调查，观察测定株高、茎围、叶片数、叶长和叶宽等。
1.3结果与分析
1.3.1微生物菌剂施用技术对烤烟生育期进展的影响
生育期进展情况见下表，从表4中可以看出各处理的生育期时间基本一致，但处理3在团棵期后生育期略有提前，说明菌剂的施用可以促进烤烟生育期的缩短。
表4生育期进展调查表
处理 移栽期日期 摆盘期日期 团棵期日期 旺长期日期
1 4.5 5.11 6.3 6.15
2 4.5 5.11 6.2 6.14
3 4.5 5.11 6.2 6.13
1.3.2微生物菌剂施用技术对烤烟农艺性状的影响
1.3.2.1团棵期农艺性状
团棵期农艺性状调查见下表，其中株高处理3优于处理1和处理2；茎围处理2略优于处理1和处理3；节距处理3最高，单株叶片数处理3最高，各部分叶片的长宽总体上处理3表现最好，综合各项数据可以看出处理3整体较好。
表5团棵期农艺性状调查表
Figure BDA0003644622690000131
1.3.2.2旺长期农艺性状
旺长期农艺性状见下表，从表中可以看出株高处理3较高，处理2次之，处理1最低；茎围处理3稍粗，其余各处理水平差异不大；节距处理3较高，各处理差异不大；单株叶数处理3最多；叶片长、宽处理3整体较为优秀，总个各项数据标明微生物菌剂施用对烟株中期生长有明显促进作用。
表6旺长期农艺性状调查表
Figure BDA0003644622690000132
实施例2
本发明所用的木霉菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌其编号分别为(Trichoderma spp.)WSWFJ-17、(Bacillus amyloliquefaciens)WSWFJ-19、(Bacillussubtilis)WSWFJ-20，保藏登记号分别为CGMCC NO.18270、CGMCC NO.18261、CGMCCNO.18265。
一种具有防控烟草根腐病功能的微生物菌剂及其制备和应用，它包括以下步骤：
第一步，枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌菌粉的制备
从-80℃条件下取出用甘油保存的菌株保存液按体积2％的比例接种到LB培养基中，在温度为35℃、转速为160rpm条件下活化培养24h，得到种子液；再将种子液按照3‰的比例接种到发酵罐中的发酵培养液中，在温度为35℃，转速为120rpm/min条件下培养60h，得到发酵液。所述发酵液的有效活菌数大于2.0×107cfu/mL。将发酵液导入碟式离心机中，在转速6000r/min下离心15min，离心后排除上层菌悬液，得到菌种浓缩液，并使菌种浓缩液中的芽孢杆菌有效活菌数不小于1×1010cfu/mL。将浓缩离心后得到的菌种浓缩液进行喷雾干燥，将菌种浓缩液加入搅拌罐中，加入13％的辅料，通过0.9Pa的压力将所述菌种浓缩液压至旋转喷头，并使喷头保持在转速为20000r/min下喷雾，同时在干燥塔中通入150℃、4000m3/h的热风进行干燥，经过喷雾干燥后制得芽孢杆菌有效活菌数不小于1×1011cfu/g的芽孢杆菌微生物菌粉。
发酵培养液的组成成分及其重量份数比为：黄豆粉3份、蔗糖1份、牛肉膏2份、玉米粉2份、碳酸钙1份、鱼粉1份、磷酸二氢钾0.1份、磷酸氢二钾0.1份、氯化钠3份、消泡剂0.2份，采用盐酸、氢氧化钠调节pH至7.2。水重量份1000份。
所述喷雾阶段的辅料包括如下重量份的组分：硅藻土60份，碳酸钙20份，淀粉20份。
第二步，木霉菌菌粉的制备
从-80℃条件下取出用滤纸保存法保存的木霉菌株，接种到PDA液体培养基中，在28℃条件下振荡培养120h后得到种子液；将活化的菌种体积70％的比例接种到液体发酵液中，黑暗条件下培养75h，温度控制在28℃，pH值为6.5，通气量为250m3/h，每小时搅拌2次，搅拌时间为10min，得到发酵菌液，所述菌液的有效活菌数大于1.0×1010cfu/mL。按照20％的比例将菌液接种到固体培养基中，采用浅盘发酵法进行培养，得到木霉菌，再将木霉菌用30℃的温度进行温烘干，粉碎后过60目的筛子，得到有效活菌数不小于5×105cfu/g菌粉。
发酵培养液的组成成分为：蔗糖50g/L，黄豆粉20g/L，硝酸钠13g/L，磷酸氢二钾4g/L，硫酸锌2g/L，硫酸铁0.5g/L。
固体培养基的组成成分为：玉米粉2份、麸皮1份、黄豆粉3份、稻壳粉1份，加入原料重量75％的水。
浅盘发酵的具体步骤：3d内温度控制在22℃，当温度达到26℃以上时，采用通风、冷藏等方法使温度下降至20℃，共计发酵天数为15d。
第三步，具有防控烟草根腐病功能的微生物菌剂的制备
将枯草芽孢杆菌菌粉、解淀粉芽孢杆菌菌粉、木霉菌菌粉按照一定的比例混合均匀，得到具有防控烟草根腐病功能的微生物菌剂。
枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、木霉菌菌粉的混合比例为质量比2:2:3.8。
本实施例菌剂可以在烟草育苗和移栽时进行灌根、蘸根处理，直接用于烟草根腐病的防治，使用方法为将本菌剂兑水稀释500倍，用于蘸根和灌根，每亩用量2kg。
采用本实施例产品对根腐病病原菌防治效果进行验证
1试验材料及方法
1.1试验时间及地点
2020年3月至12月，试验安排在昭阳守望烟区内进行。选择有代表性的因为连作导致“根腐病”频发的烟地。
1.2试验地土壤、地势等基本情况
1.2.1试验地情况
试验安排在昭通昭阳守望回族乡，海拔1978.6米，土地平整，土壤肥力中等、均匀；长年连作导致“根腐病”频发的烟区。
1.2.2试验品种：云烟116
1.3试验处理方案
表7试验处理
Figure BDA0003644622690000161
(注：所有生物菌剂禁止与杀虫、杀菌剂同时使用)
1.4试验设计
本试验采取小区试验，设计如图3：
1.5整地播种及田间管理措施
按昭通市烤烟栽培技术标准进行。
1.6数据调查与方法
1.6.1主要生育期统计
记录各处理的移栽期、团棵期、旺长期、现蕾期、封顶期、初烤时间和结束采烤时间以及全生育期。
1.6.2农艺性状调查
在采烤前，每个小区选择5株有代表性的烟株测量其株高、茎围、节距、叶片数、叶长和宽等。
1.6.3主要病害调查
按照GB/T 23222—2008烟草病虫害分级及调查方法进行调查。
1.6.4经济性状调查
调查统计各处理产量、产值、均价、上等烟比例、中上等烟比例等经济性状。
1.7数据处理
数据采用SPSS、Excel进行处理。
2结果与分析
2.1不同处理对烤烟生育期的影响
由表8可知，各处理的生育期皆为155天，不同施肥处理对烤烟的生育期无明显影响。
表8不同处理对烤烟生育期的影响
单位：月、日、天
Figure BDA0003644622690000181
2.2不同处理对烤烟农艺性状的影响
由表9可知，处理2、3株高优于处理1，其中处理3＞处理2＞处理1；处理3茎围表现优于处理1和处理2；处理3节距大于处理1和处理2；处理2叶片数表现较优；叶面积大小方面，处理1上部叶较优，处理3中部叶较优，处理2下部叶较优。综上所述，处理3对烤烟农艺性状表现较优，处理2次之。
表9不同处理对烤烟农艺性状的影响
Figure BDA0003644622690000182
2.3不同处理对烤烟常见病害发病率的影响
由表10可以看出，处理2、3对烤烟根腐病防治效果表现优于处理1，其中处理3＞处理2＞处理1；处理2对烤烟花叶病防治效果优于处理1和处理3，处理2、3烟株的烤烟番茄班委病毒病发病率低于处理1。综上所属，处理3对烤烟根腐病防治效果较优，处理2次之。
表10不同处理对烤烟常见病害发病率的影响
Figure BDA0003644622690000191
2.4不同处理对烤烟经济现状的影响
通过对比不同处理的经济性状，由表11可知，处理3的亩产量最高，其次为处理2；均价指标处理3最高，其次为处理2；亩产值处理3最好，处理2次之；上等烟比例处理3达65％，处理2达63％。综合对比处理3的经济效益最好，其次为处理2。
表11不同处理对烤烟经济现状的影响
Figure BDA0003644622690000192
小区试验结果表明，在生育期方面，各防治方法对烟草生育期没有影响；处理3(商品有机肥60kg/亩+摆盘期本实施例防控菌剂兑水稀释500倍灌根，2kg/亩)在农艺性状方面较优，本施肥方法具有促进烟株生长的效果；在病害方面，摆盘期施用本实施例防控菌剂2kg/亩灌根的处理，能有效提高烟叶的经济效益。
对比试验结果表明，采用本发明防控菌剂灌根替代常规防治措施，在农艺性状方面，能有效促进烟株生长，促使烟叶开片；在病害方面，对烟草根腐病具有一定防控效果；在经济性状方面，能够提高烟叶经济效益。
实施例3
本发明所用的木霉菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌其编号分别为(Trichoderma spp.)WSWFJ-17、(Bacillus amyloliquefaciens)WSWFJ-19、(Bacillussubtilis)WSWFJ-20，保藏登记号分别为CGMCC NO.18270、CGMCC NO.18261、CGMCCNO.18265。
一种具有防控烟草根腐病功能的微生物菌剂及其制备和应用，它包括以下步骤：
从-80℃条件下取出用甘油保存的菌株保存液按体积1％的比例接种到LB培养基中，在温度为38℃、转速为160rpm条件下活化培养24h，得到种子液；再将种子液按照5‰的比例接种到发酵罐中的发酵培养液中，在温度为35℃，转速为120rpm/min条件下培养60h，得到发酵液。所述发酵液的有效活菌数大于2.0×107cfu/mL。将发酵液导入碟式离心机中，在转速6000r/min下离心15min，离心后排除上层菌悬液，得到菌种浓缩液，并使菌种浓缩液中的芽孢杆菌有效活菌数不小于1×1010cfu/mL。将浓缩离心后得到的菌种浓缩液进行喷雾干燥，将菌种浓缩液加入搅拌罐中，加入10％的辅料，通过0.9Pa的压力将所述菌种浓缩液压至旋转喷头，并使喷头保持在转速为20000r/min下喷雾，同时在干燥塔中通入150℃、4000m3/h的热风进行干燥，经过喷雾干燥后制得芽孢杆菌有效活菌数不小于1×1011cfu/g的芽孢杆菌微生物菌粉。
所述发酵培养液的组成成分及其重量份数比为：黄豆粉2份、蔗糖1份、牛肉膏1份、玉米粉3份、碳酸钙0.8份、鱼粉2份、磷酸二氢钾0.05份、磷酸氢二钾0.1份、氯化钠1份、消泡剂0.3份，采用盐酸、氢氧化钠调节pH至6.8。水重量1000份。
所述喷雾阶段的辅料包括如下重量份的组分：硅藻土55份，碳酸钙25份，淀粉15份。
第二步，木霉菌菌粉的制备
从-80℃条件下取出用滤纸保存法保存的木霉菌株，接种到PDA液体培养基中，在20℃条件下振荡培养120h后得到种子液；将活化的菌种体积60％的比例接种到液体发酵液中，黑暗条件下培养75h，温度控制在25℃，pH值为7.0，通气量为200m3/h，每小时搅拌2次，搅拌时间为10min，得到发酵菌液，所述菌液的有效活菌数大于1.0×1010cfu/mL。按照20％的比例将菌液接种到固体培养基中，采用浅盘发酵法进行培养，得到木霉菌，再将木霉菌用30℃的温度进行温烘干，粉碎后过60目的筛子，得到有效活菌数不小于5×105cfu/g菌粉。
发酵培养液的组成成分为：蔗糖10g/L，黄豆粉30g/L，硝酸钠0.1g/L，磷酸氢二钾5g/L，硫酸锌0.03g/L，硫酸铁1g/L。
固体培养基的组成成分为：玉米粉1份、麸皮3份、黄豆粉2份、稻壳粉2份，加入原料重量65％的水。
浅盘发酵的具体步骤：1-5d内温度控制在22℃，当温度达到26℃以上时，采用通风、冷藏等方法使温度下降至20℃，共计发酵天数为15d。
第三步，具有防控烟草根腐病功能的微生物菌剂的制备
将枯草芽孢杆菌菌粉、解淀粉芽孢杆菌菌粉、木霉菌菌粉按照一定的比例混合均匀，得到具有防控烟草根腐病功能的微生物菌剂。
枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、木霉菌菌粉的混合比例为质量比0.5:3:1.3。
第四步，烟草育苗基质的制备
1、原料准备：采用草炭、蛭石、珍珠岩、稻壳炭作为基质的生产原料，原料要求符合有机农业生产资料的要求，符合GB 38400-2019的相关规定。
2、混料：按照体积份数计，各原料配方比例为草炭：蛭石：珍珠岩：稻壳炭＝6:4:5:2，根据用途进行调整。混合后即得到烟草育苗基质。
本菌剂可以与育苗基质混合后直接用于烟草育苗，在苗期进行功能菌种的定殖，避免根腐病的发生，使用方法为基质和复合菌剂按照质量比1000:8进行混合，直接用于育苗。
采用本实施例产品对根腐病病原菌防治效果进行验证
1材料与方法
1.1试验时间和地点
试验时间为2021年3月13日，安排在隆阳区西邑乡下坝村育苗点进行。
1.2试验材料
供试品种：云烟87。
供试基质：常规育苗基质、本实施例制备防控根腐病育苗基质。
供试菌液：群结腐霉菌液、异丝腐霉菌液。
1.3试验设计
分别将群结腐霉菌、异丝腐霉菌至PDB培养基中25℃下恒温培养5d，再将群结腐霉菌菌液、异丝腐霉菌菌液分别按照有效活菌数1×105cfu/mL体积的20％接种在常规基质中，作为染病基质使用。本试验3个处理，每个处理重复3次，具体处理如下：
表12处理设计
Figure BDA0003644622690000231
1.4调查方法
分别在烟苗出苗期、十字期、猫耳期、成苗期统计漂盘上根腐病发病率，并计算病情指数和防治效果。病情分级如下：
0级为植株无病害症状；
1级为植株基部叶片出现轻微枯黄症状，根系出现轻微褐变；
2级为植株中下部出现枯黄症状，根系出现褐变，但顶芽良好；
3级为全株出现枯黄症状，根系褐变腐烂；
4级为植株枯萎死亡，根系严重褐变腐烂。
发病率(％)＝发病株数/调查总株数×100
病情指数＝Σ(各级发病数×该级代表数)/(总数×最高级代表值)×100
防效(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100
2结果与分析
由表13可知，整体来看，处理4的根腐病发病率最低，病情指数最低，处理4对处理1在幼苗各生育期的防效分别为83.33％、54.29％、61.55％、64.46％，处理4对于处理2在幼苗各生育期的防效为89.20％、78.87％、79.78％、78.20％。表明防控根腐病育苗基质能有效控制烟草的根腐病的发病率，防治效果较好。
表13各处理对烟苗根腐病的防治效果
Figure BDA0003644622690000241
Figure BDA0003644622690000251
3结论与讨论
从本次试验可知，防控根腐病育苗基质对根腐病原真菌具有较好的防治效果，整个育苗期中根腐病发病率为11.89％，病情指数为7.78。以常规基质作为对照组，防效达64.46％；以染病基质作为对照组，防效达78.2％。
实施例4
本发明所用的木霉菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌其编号分别为(Trichoderma spp.)WSWFJ-17、(Bacillus amyloliquefaciens)WSWFJ-19、(Bacillussubtilis)WSWFJ-20，保藏登记号分别为CGMCC NO.18270、CGMCC NO.18261、CGMCCNO.18265。
一种具有防控烟草根腐病功能的微生物菌剂及其制备和应用，它包括以下步骤：
从-80℃条件下取出用甘油保存的菌株保存液按体积3％的比例接种到LB培养基中，在温度为35℃、转速为160rpm条件下活化培养48h，得到种子液；再将种子液按照1‰的比例接种到发酵罐中的发酵培养液中，在温度为38℃，转速为120rpm/min条件下培养48h，得到发酵液。所述发酵液的有效活菌数大于2.0×107cfu/mL。将发酵液导入碟式离心机中，在转速6000r/min下离心15min，离心后排除上层菌悬液，得到菌种浓缩液，并使菌种浓缩液中的芽孢杆菌有效活菌数不小于1×1010cfu/mL。将浓缩离心后得到的菌种浓缩液进行喷雾干燥，将菌种浓缩液加入搅拌罐中，加入13％的辅料，通过0.9Pa的压力将所述菌种浓缩液压至旋转喷头，并使喷头保持在转速为20000r/min下喷雾，同时在干燥塔中通入150℃、4000m3/h的热风进行干燥，经过喷雾干燥后制得芽孢杆菌有效活菌数不小于1×1011cfu/g的芽孢杆菌微生物菌粉。
所述发酵培养液的组成成分及其重量份数比为：黄豆粉4份、蔗糖0.5份、牛肉膏3份、玉米粉2份、碳酸钙1.5份、鱼粉1份、磷酸二氢钾0.1份、磷酸氢二钾0.05份、氯化钠5份、消泡剂0.1份，采用盐酸、氢氧化钠调节pH至7.5。水的重量份1000份。
所述喷雾阶段的辅料包括如下重量份的组分：硅藻土65份，碳酸钙15份，淀粉25份。
第二步，木霉菌菌粉的制备
从-80℃条件下取出用滤纸保存法保存的木霉菌株，接种到PDA液体培养基中，在28℃条件下振荡培养72h后得到种子液；将活化的菌种体积70％的比例接种到液体发酵液中，黑暗条件下培养55h，温度控制在30℃，pH值为6.0，通气量为260m3/h，每小时搅拌1次，搅拌时间为20min，得到发酵菌液，所述菌液的有效活菌数大于1.0×1010cfu/mL。按照20％的比例将菌液接种到固体培养基中，采用浅盘发酵法进行培养，得到木霉菌，再将木霉菌用30℃的温度进行温烘干，粉碎后过60目的筛子，得到有效活菌数不小于5×105cfu/g菌粉。
发酵培养液的组成成分为：蔗糖80g/L，黄豆粉1g/L，硝酸钠0.1-20g/L，磷酸氢二钾5g/L，硫酸锌0.03g/L，硫酸铁1g/L。
固体培养基的组成成分为：玉米粉3份、麸皮1份、黄豆粉5份、稻壳粉0.5份，加入原料重量80％的水。
浅盘发酵的具体步骤：1-5d内温度控制在22℃，当温度达到26℃以上时，采用通风、冷藏等方法使温度下降至20℃，共计发酵天数为15d。
第三步，具有防控烟草根腐病功能的微生物菌剂的制备
将枯草芽孢杆菌菌粉、解淀粉芽孢杆菌菌粉、木霉菌菌粉按照一定的比例混合均匀，得到具有防控烟草根腐病功能的微生物菌剂。
进一步的，枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、木霉菌菌粉的混合比例为质量比3:0.5:3.8。
第四步，烟草专用全油枯有机肥的制备
1、原料准备：采用压榨菜籽枯(片枯)和浸提菜籽枯(粉枯)作为有机肥的生产原料，原料要求符合环保生态肥料、有机农业生产资料的要求，符合GB 38400-2019和NY/T525-2021的相关规定。
2、全油枯有机肥发酵：按照重量份数计，称取片枯300份、粉枯700份、腐熟剂2份均匀混合，调节物料水份为70％，投入全自动好氧发酵槽进行发酵腐熟，发酵温度至55℃开始翻抛，控制发酵温度为50-65℃，发酵时间为15天，温度下降至室温时发酵结束。
3、肥料后熟：将发酵完成的有机肥料堆放到后熟槽中静置后熟，使有机肥料各项指标趋于稳定，肥料充分腐熟完成，后熟时间为15天，之后得到全油枯有机肥成品。
本实施例菌剂可以与有机肥料混合制成生物有机肥，用于烟草移栽时底肥的施用，在烟苗进入大田时进行功能菌种的定殖，避免根腐病的发生，使用方法为有机肥料和复合菌剂按照质量比1000:3进行混合制成生物有机肥，生物有机肥每亩施用量50-200kg，可采用穴施、塘施、条施、撒施等方法进行施用，肥料不直接接触作物根系，深施覆土。
采用本实施例产品对烟草进行抗病促生长效果验证
在大理弥渡选择1亩左右的植烟地块，要求远离工矿产业区和污染源，排灌方便，土地平整，土壤肥力中等、均匀，通过施用具有防控烟草根腐病功能的生物有机肥作为基肥，研究其对烟叶产质量的影响，并对其病害防控功能进行验证。
1材料与方法
1.1试验时间
2021年4月28日至2021年10月9日。
1.2试验地点
云南大理州弥渡县密祉乡，海拔1987.9m,25.173341°N、100.382348°E。前作为油菜，播种前2d施用15-6-20复合肥料30kg/亩及有机肥料20kg/亩，播种后17d施用22-8-12复合肥料10kg/亩，播种后23d施用16-8-22复合肥料10kg/亩。试验烟田常年种植烤烟，烤烟与油菜轮作。
1.3试验材料
供试烟苗：选择云烟87为试验品种，每年3月初育苗，育苗方法为漂浮育苗，共剪叶2次。苗龄45天。
供试肥料：复合肥料(N-P2O5-K2O＝10-10-24)、全油枯有机肥、防控烟草根腐病生物有机肥，由云南云叶化肥股份有限公司提供。
1.4试验设计
采用小区试验的模式进行研究，试验设三个处理，每个处理三次重复，小区采用随机区组排列，每个小区面积约66㎡，共计约0.9亩。D1为常规施肥，D2和D3在常规施肥的基础上增施有机肥和生物有机肥，肥料用量一致。基肥施用复合肥料(N-P2O5-K2O＝10-10-24)20kg/hm2，追肥施用复合肥料(N-P2O5-K2O＝10-10-24)30kg/hm2，有机肥和生物有机肥150kg/hm2。试验除肥料施用不同外，其他生产管理措施等都按照当地优质烟叶生产标准执行。具体试验处理如下表14：
表14试验各处理肥料施用量
Figure BDA0003644622690000291
试验小区排布图4所示
1.5调查的项目及方法
1.5.1田间管理措施调查
对烤烟大田生育期间的田间管理措施进行调查统计。
1.5.2移栽成活率调查
移栽后7天，对示范和对照的移栽成活率进行调查统计。
1.5.3生育期调查
试验区观察记录50％烟株达到团棵、旺长、现蕾、封顶等生育期时间进展，探讨施用有机肥和生物有机肥对烤烟生育期的影响。
1.5.4田间长势长相调查
在摆盘期、团棵期、旺长期、现蕾期和采收期分别对试验区烟株的长势长相进行调查，调查内容包括：大田长势、整齐度、腋芽生长势和株型，探讨施用有机肥和生物有机肥对烤烟大田长势长相的影响。
1.5.5农艺性状调查
在试验区按照“S”型布点，随机选取有代表性烟株5株，通过平均值比较，观察记录烟株团棵、旺长、现蕾、封顶各时期田间农艺性状。
1.5.6病害调查
对试验区主要病害发生情况进行调查，了解各处理对烟株的抗
1.5.7经济性状统计
烟叶采烤结束后，按试验各个处理调查统计其亩产量、亩产值、均价、上等烟比例、中上等烟比例等经济性状。
2调查与记录
2.1育苗
2021年3月8日育苗，育苗方法为漂浮育苗，共剪叶2次。苗龄50天。
2.2整地移栽
试验地在2021年4月26日整地理墒，行距为110cm；在4月28日移栽，移栽规格为110cm×50cm。移栽方式膜下小苗移栽。
2.3农事操作
4月23日整地理墒，D1处理施用复合肥料(N-P2O5-K2O＝10-10-24)20Kg/亩，混匀条施在烟墒上；D2处理施用复合肥料(N-P2O5-K2O＝10-10-24)20Kg/亩+有机肥150kg/hm2，混匀条施在烟墒上；D3处理施用复合肥料(N-P2O5-K2O＝10-10-24)20Kg/亩+生物有机肥150kg/hm2，混匀条施在烟墒上。
2.4追肥
第一次追肥5月5日，以复合肥料(N-P2O5-K2O＝10-10-24)10Kg/亩兑水浇施；第二次追肥5月21日，以复合肥料(N-P2O5-K2O＝10-10-24)10Kg/亩兑水浇施；第三次追肥6月1日，以复合肥料(N-P2O5-K2O＝10-10-24)10Kg/亩+硫酸钾15Kg/亩兑水浇施。
2.5接膜中耕培土、除草
5月22日小培土第一次人工除草，把少量部分泥土陪在烟株基部；6月12日接膜进行中耕培土，在烟株根部10厘米内线耕深3-5厘米，根部10厘米外深10厘米左右。把垄沟泥土陪到烟株基部和垄面上，使垄体表面平整饱满，第二次人工除草。接膜前和接膜后分别抽水灌溉各一次。
2.6农药施用情况：具体农药施用情况如下表
表15农药使用情况
Figure BDA0003644622690000321
2.7封顶打叉：7月8日第一次打顶并进行淋药，盛花打顶；7月15日第二次打顶并进行淋药；7月19日进行第三次打顶进行淋药。
2.8采收
8月5日第一次采收；9月22日采收结束。
3结果与分析
3.1成活率的影响
由表16可以看出各处理成活率无明显差异。
表16各处理烟苗移栽成活率
处理 移栽后7天烟苗成活率(％)
D1 100
D2 100
D3 100
3.2大田生育期
从表17各处理的大田生育期统计可以看出，常规施肥的生育期在旺长和现蕾期相对落后，反映出施肥可以促进烟株早生快发。
表17各处理大田生育期统计
Figure BDA0003644622690000331
3.3田间长势长相
各处理烤烟主要生育期烟株的长势长相调查结果见表18。从表中可以看出在整个大田生长期间，D1长势较弱，整齐度不高，D2和D3处理烟株的长势长相基本一致，表明施用有机肥料和生物有机肥对烟株长势长相均有促进作用。
表18各处理田间表现
Figure BDA0003644622690000332
3.4农艺性状
从表19各时期的农艺性状可以看出团棵期D2、D3处理农艺性状比较优异，而D1农艺性状较另外两个处理差异较大。
表19各处理各个时期的农艺性状
Figure BDA0003644622690000341
3.5病虫害发生情况
2019年-2021年各处理病害发生情况和发病率见表20。从表中可以看出主要的病害为根腐病、黑胫病、赤星病和气候斑点病，且发病率较高，D2和D3处理病害的发病率低于D1，这是因为施用有机肥可以提高作物抗性，D2与D3相比，D3发病率相对较低，表明功能微生物对于烟株抗病性的整体提升具有促进作用，同时，D3处理根腐病的发生远远低于D1和D2，这表明防控烟草根腐病生物有机肥具有良好的田间防效。
表20各处理病害发生情况统计
Figure BDA0003644622690000342
3.6经济指标统计分析
由表21可以看出，D2和D3处理的亩产值、亩产量、均价、上等烟比例等各方面经济性状都高于D1处理，说明增施有机肥料可以提高烟草的经济价值，同时D2与D3相比，D3的亩产值和上中等烟比例等指标更优，标明施用生物有机肥可以改善烤烟的产量和品质，增加经济价值。
表21不同处理烤烟经济性状
Figure BDA0003644622690000351
4结论与讨论
从烟草生育期、农艺性状、田间表现来看，D2和D3差距很小，但是D3处理在田间病虫害更少，烟株抗逆性较好，且田间长势较为整齐。
从经济性状来看，施用生物有机肥的D3处理较D2处理产值明显提升，说明在大理弥渡自然气候条件下施用生物有机肥能提升烟叶的经济价值。
从病害发生情况来看，增施有机肥能够提高烟株抗性，功能微生物对于烟株整体抗病性的增强有促进作用，同时，经过田间试验可知，防控烟草根腐病生物有机肥能够有效降低烟草根腐病的发生，具有良好的田间防效。
实施例5功能菌剂对烟草抗性提升效果验证
过氧化氢酶,是催化过氧化氢分解成氧和水的酶,存在于细胞的过氧化物体内。逆境胁迫下,细胞内易产生H2O2破坏膜系统的稳定,而过氧化氢酶(CAT)能把H2O2分解为H2O和O2,从而清除H2O2，维护膜的稳定性。经多年科学研究表明,抗逆性强的品种有较高的过氧化氢酶活性,作物体内过氧化氢酶的含量和合成速度与作物抗逆性呈显著性相关。因此，检测作物样本中的过氧化氢酶含量和合成速度，可以作为作物抗逆性评判的技术指标。
一、试验时间和地点
试验时间：2021年2月26日-2021年4月9日。
试点地点：云南省微生物发酵工程研究中心有限公司安宁试验室。
二、材料与方法
1、供试品种：红花大金元。
2、供试材料：市售育苗基质、本发明实施例2制备的防控烟草根腐病微生物菌剂。
3、试验设计
采用育苗基质和微生物菌剂按照重量比1000:5进行混配，得到具有防控烟草根腐病功能的生物育苗基质，将生物育苗基质与普通育苗基质分别装入504阙漂盘，播种红花大金元烟草种子，放置到不同育苗池，进行育苗。通过成苗后检测烟苗根部和茎部的过氧化氢酶含量及合成速度，判断基质对烟苗抗病促生长效果的影响。
各处理漂盘设计为3盘，试验处理与常规同时移栽，一段式育苗。除育苗基质不同外，其他管理措施一致。
三、试验结果
经过42天的培育，每个平行处理漂盘中均选取3株长势适中的烟苗，三个漂盘中选取9株烟苗作为本处理的综合样品，进行过氧化氢酶含量和合成速度的检测，结果如下：
表22酶活检测统计表
Figure BDA0003644622690000371
通过检测可以得知，采用防控根腐病功能生物育苗基质进行烟草育苗，可以有效提高烟草中的过氧化氢酶活性和合成速度，在很大程度上提高了烟草的抗逆性，对于烟草根腐病和其他病害的防控具有促进作用。
显然，本发明的上述实施方式仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (11)

1.一种具有防控烟草根腐病功能的微生物菌剂，其特征在于，包括以下三株功能菌株复配而成：
一株保藏号为CGMCC NO.18270的具有抑制群结腐霉病原真菌生长繁殖的木霉菌(Trichoderma spp.)WSWFJ-17、一株保藏号为CGMCCNO.18265的具有抑制异丝腐霉病原真菌生长繁殖的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WSWFJ-20、一株保藏号为CGMCCNO.18261的具有促生长、促植物抗性提升作用的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)WSWFJ-19。
2.根据权利要求1所述的具有防控烟草根腐病功能的微生物菌剂，其特征在于，两种芽孢杆菌菌粉中有效活菌数均为1×1011cfu/g，木霉菌菌粉中有效活菌数为5×105cfu/g。
3.根据权利要求1所述的具有防控烟草根腐病功能的微生物菌剂，其特征在于，将三种菌分别发酵后制备菌粉混合制备菌剂；
进一步的，枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和木霉菌的菌粉混合比例为质量比0.5-3:0.5-3:1.3-3.8。
4.根据权利要求1所述的具有防控烟草根腐病功能的微生物菌剂，其特征在于，枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌菌粉的制备：
将活化培养的种子液按照1‰-5‰的比例接种到发酵罐中的发酵培养液中，在温度为35℃-38℃，转速为100-150rpm/min条件下培养48h-60h，得到发酵液；所述发酵液的有效活菌数大于2.0×107cfu/mL；将发酵液导入离心机中，离心后排除上层菌悬液，得到菌种浓缩液，并使菌种浓缩液中的芽孢杆菌有效活菌数不小于1×1010cfu/mL；加入辅料，喷雾干燥；
进一步地，将菌种浓缩液加入搅拌罐中，加入占菌种浓缩液10％～13％的辅料，通过0.8-1.0Pa的压力将所述菌种浓缩液压至旋转喷头，并使喷头保持在转速为18000-22000r/min下喷雾，同时在干燥塔中通入140-160℃、3800-4200m3/h的热风进行干燥，经过喷雾干燥后制得芽孢杆菌有效活菌数不小于1×1011cfu/g的芽孢杆菌微生物菌粉；
进一步地，所述发酵培养液的组成成分及其重量份数比为：黄豆粉2-4份、蔗糖0.5-1份、牛肉膏1-3份、玉米粉2-3份、碳酸钙0.8-1.5份、鱼粉1-2份、磷酸二氢钾0.05-0.1份、磷酸氢二钾0.05-0.1份、氯化钠1-5份、消泡剂0.1-0.3份，水1000份。采用盐酸、氢氧化钠调节pH至6.8-7.5。
进一步地，所述喷雾阶段的辅料包括如下重量份的组分：硅藻土55～65份，碳酸钙15～25份，淀粉15～25份。
5.根据权利要求1所述的具有防控烟草根腐病功能的微生物菌剂，其特征在于，木霉菌菌粉的制备
将活化的菌种体积6‰-7‰的比例接种到液体发酵培养液中，黑暗条件下培养55-75h，温度控制在25-30℃，pH值为6.0-7.0，通气量为200-260m3/h，每小时搅拌1-2次，搅拌时间为10-20min，得到发酵菌液，所述菌液的有效活菌数大于1.0×1010cfu/mL；按照18-22％的比例将菌液接种到固体培养基中，采用浅盘发酵法进行培养，得到木霉菌，再将木霉菌烘干过筛，得到有效活菌数不小于5×105cfu/g菌粉；
进一步的，发酵培养液的组成成分为：蔗糖10-80g/L，黄豆粉1-30g/L，硝酸钠0.1-20g/L，磷酸氢二钾0.05-5g/L，硫酸锌0.03-3g/L，硫酸铁0.01-1g/L；
进一步的，固体培养基的组成成分为：玉米粉1-3份、麸皮1-3份、黄豆粉2-5份、稻壳粉0.5-2份，加入原料重量65％-80％的水；
进一步的，浅盘发酵的具体步骤：1-5d内温度控制在21-23℃，当温度达到26℃以上时，采用通风、冷藏方法使温度下降至21-23℃，共计发酵天数至少15d。
6.权利要求1-5任一项所述的具有防控烟草根腐病功能的微生物菌剂的应用，其特征在于，在烟草育苗和移栽时进行灌根、蘸根处理，用于烟草根腐病的防治，进一步，具体将菌剂兑水稀释300-500倍，用于蘸根和灌根，每亩用量1-2kg。
7.权利要求1-5任一项所述的具有防控烟草根腐病功能的微生物菌剂的应用，其特征在于，
菌剂与育苗基质混合后用于烟草育苗，在苗期进行功能菌种的定殖，避免根腐病的发生，进一步，具体为基质和复合菌剂菌粉按照质量比1000:2-10进行混合，用于育苗。
8.权利要求1-5任一项所述的具有防控烟草根腐病功能的微生物菌剂的应用，其特征在于，菌剂与有机肥料混合制成生物有机肥，用于烟草移栽时底肥的施用，在烟苗进入大田时进行功能菌种的定殖，避免根腐病的发生，进一步，具体为有机肥料和复合菌剂菌粉按照质量比1000:1-5进行混合制成生物有机肥，生物有机肥每亩施用量50-200kg，包括采用穴施、塘施、条施、撒施的方法进行施用。
9.一株保藏号为CGMCC NO.18270的具有抑制群结腐霉病原真菌生长繁殖的木霉菌(Trichoderma spp.)WSWFJ-17。
10.一株保藏号为CGMCC NO.18265的具有抑制异丝腐霉病原真菌生长繁殖的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WSWFJ-20。
11.一株保藏号为CGMCC NO.18261的具有促生长、促植物抗性提升作用的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)WSWFJ-19。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050096225A1 (en) * 2001-02-02 2005-05-05 Johnson Thomas D. Controlling plant pathogens with bacterial/fungal antagonist combinations
CN109402012A (zh) * 2018-11-19 2019-03-01 四川省烟草公司凉山州公司 一种防治烟草真菌土传病的抗病微生物复合菌剂、生物有机肥及其制备方法
CN109971680A (zh) * 2019-03-29 2019-07-05 云南省微生物发酵工程研究中心有限公司 一种具有抗病促生长功能的复合微生物菌剂的制备及应用
CN114395397A (zh) * 2022-01-27 2022-04-26 云南农业大学 一种防治烟草疫病的微生物土壤改良菌剂及其制备方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050096225A1 (en) * 2001-02-02 2005-05-05 Johnson Thomas D. Controlling plant pathogens with bacterial/fungal antagonist combinations
CN109402012A (zh) * 2018-11-19 2019-03-01 四川省烟草公司凉山州公司 一种防治烟草真菌土传病的抗病微生物复合菌剂、生物有机肥及其制备方法
CN109971680A (zh) * 2019-03-29 2019-07-05 云南省微生物发酵工程研究中心有限公司 一种具有抗病促生长功能的复合微生物菌剂的制备及应用
CN114395397A (zh) * 2022-01-27 2022-04-26 云南农业大学 一种防治烟草疫病的微生物土壤改良菌剂及其制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
何沛;苏代发;杨俊誉;肖炜;刘志华;崔晓龙;: "微生物在烟草中的研究、开发与利用进展" *

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