CN115300499A - 短序蒲桃多酚类化合物在制备减少巨噬细胞脂质蓄积的药物中的应用 - Google Patents
短序蒲桃多酚类化合物在制备减少巨噬细胞脂质蓄积的药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及有机化合物的药物应用领域，具体涉及短序蒲桃多酚类化合物在制备减少巨噬细胞脂质蓄积的药物中的应用。本发明通过氧化低密度脂蛋白诱导的RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞模型，发现短序蒲桃酚B和没食子酸乙酯通过抑制RAW264.7巨噬细胞摄取氧化低密度脂蛋白，从而抑制泡沫细胞的形成；通过减少RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞对脂质摄取、提高泡沫细胞内胆固醇外排率以及维持泡沫细胞内胆固醇稳态，从而减少泡沫细胞内脂质蓄积。因此，短序蒲桃酚B和没食子酸乙酯可用于制备减少巨噬细胞脂质蓄积的药物、预防和/或治疗动脉粥样硬化的药物以及降脂药物。
Description
技术领域
本发明涉及有机化合物的药物应用领域，具体涉及短序蒲桃多酚类化合物在制备减少巨噬细胞脂质蓄积的药物中的应用。
背景技术
动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)，是一种慢性炎症、免疫和表观遗传疾病，其特征是血管壁上的低密度脂蛋白滞留和血管炎症。主动脉内膜下巨噬细胞逐步泡沫化是动脉粥样硬化发病的早期标志。动脉粥样硬化病变部位下的巨噬细胞摄取过量的氧化低密度脂蛋白(Oxidized low-density lipoproteins，ox-LDL)后形成充满脂滴的泡沫细胞。泡沫细胞的迁移能力降低，最终困在动脉壁内并加速动脉粥样硬化的进展。同时，泡沫细胞通过分泌多种细胞因子和趋化因子，以及产生活性氧，从而加速AS进程。在晚期斑块中，巨噬细胞的死亡驱动了坏死核心的扩大形成。最终斑块破裂导致血管闭塞、动脉血栓形成和急性心血管事件的发生。抑制泡沫化进程可以防治AS发展的观点已得到学界广泛共识。到目前为止，他汀类药物是降低血清低密度脂蛋白水平和降低心血管事件发生率最广泛使用的药物之一，但是长期服用他汀类药物会对肝脏产生较大毒性和其他不良反应。因此寻找有效的药物成分来干预泡沫细胞的形成对预防和治疗动脉粥样硬化有重要意义。
短序蒲桃(Syzygium brachythyrsum Merr.et Perry)为桃金娘科(Myrtaceae)蒲桃属(Syzygium)常绿小乔木，是中国岭南和西南地区历史悠久且非常重要的功能性草药茶和民间药材，其果及叶以野冬青果之名入药(详见《云南中草药》)。短序蒲桃叶中含有大量化合物，包括黄酮类、单宁类、酚酸类、花色苷类等。流行病学研究表明，普通人群和有心血管疾病风险的患者从饮食中摄取富含多酚的天然产品可以减少心血管事件。目前对于短序蒲桃的化学成分及药理作用的研究还尚未涉及，因此短序蒲桃的药理作用有待进一步开发。
发明内容
本发明的目的在于提供短序蒲桃多酚类化合物的新用途，即用于制备减少巨噬细胞脂质蓄积的药物。
本发明通过以下技术方案实现：
根据本发明的第一个方面，提供了短序蒲桃多酚类化合物的新用途，即短序蒲桃多酚类化合物在制备减少巨噬细胞脂质蓄积的药物中的应用，其中，短序蒲桃多酚类化合物选自短序蒲桃酚B或者没食子酸乙酯中的任意一种，短序蒲桃酚B的结构式为：
在一些实施方式中，减少巨噬细胞脂质蓄积的药物还包括药学上可接受的辅料。
在一些实施方式中，辅料包括药学上使用的载体、赋形剂、稀释剂中的任意一种或几种。
在一些实施方式中，减少巨噬细胞脂质蓄积的药物的剂型为胶囊剂、颗粒剂、片剂或口服液。
根据本发明的第二个方面，提供了短序蒲桃多酚类化合物的新用途，即短序蒲桃多酚类化合物作为减少巨噬细胞脂质蓄积的药物在制备预防和/或治疗动脉粥样硬化的药物中的应用，其中，短序蒲桃多酚类化合物选自短序蒲桃酚B或者没食子酸乙酯中的任意一种，短序蒲桃酚B的结构式为：
在一些实施方式中，预防和/或治疗动脉粥样硬化的药物还包括药学上可接受的辅料。
在一些实施方式中，辅料包括药学上使用的载体、赋形剂、稀释剂中的任意一种或几种。
在一些实施方式中，预防和/或治疗动脉粥样硬化的药物的剂型为胶囊剂、颗粒剂、片剂或口服液。
根据本发明的第三个方面，提供了短序蒲桃多酚类化合物的新用途，即短序蒲桃多酚类化合物作为减少巨噬细胞脂质蓄积的药物在制备降脂药物中的应用，其中，短序蒲桃多酚类化合物选自短序蒲桃酚B或者没食子酸乙酯中的任意一种，短序蒲桃酚B的结构式为：
在一些实施方式中，降脂药物还包括药学上可接受的辅料。
在一些实施方式中，辅料包括药学上使用的载体、赋形剂、稀释剂中的任意一种或几种。
在一些实施方式中，降脂药物的剂型为胶囊剂、颗粒剂、片剂或口服液。
本发明的有益效果包括：
本发明通过氧化低密度脂蛋白(oxidized-LDL,ox-LDL)诱导的RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞模型，发现从短序蒲桃叶中提取出来的短序蒲桃酚B和没食子酸乙酯通过抑制RAW264.7巨噬细胞摄取ox-LDL，从而抑制泡沫细胞的形成；通过减少RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞对脂质摄取、提高泡沫细胞内胆固醇外排率以及维持泡沫细胞内胆固醇稳态，从而减少泡沫细胞内脂质蓄积。因此，短序蒲桃酚B和没食子酸乙酯可用于制备减少巨噬细胞脂质蓄积的药物、预防和/或治疗动脉粥样硬化的药物以及降脂药物。本发明可为短序蒲桃酚B和没食子酸乙酯未来的开发应用提供新的方向和策略。
附图说明
图1为细胞实验中MTT实验检测细胞存活率结果图。
图2为细胞实验中油红O染色法测定不同浓度短序蒲桃酚B和没食子酸乙酯对抑制泡沫细胞形成以及脂质堆积的结果。
图3为细胞实验中荧光标记的Dil-ox-LDL实验测定不同浓度短序蒲桃酚B和没食子酸乙酯减少RAW264.7细胞摄取ox-LDL的荧光显微镜拍照结果和流式细胞术结果图。
图4为细胞实验中胆固醇外排实验测定短序蒲桃酚B和没食子酸乙酯促进泡沫细胞胆固醇外排率的结果图。
图5为细胞实验中PCR和Western bolt实验测定短序蒲桃酚B和没食子酸乙酯对泡沫细胞中SRA1,CD36,SRB1,ABCG1表达的影响的结果图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步详细的说明。若无特殊说明，以下试验所用试剂均为市购，未做特殊说明的实验方法都是采用本领域已知的常规方法。
泡沫细胞的形成是动脉粥样硬化发生的标志。巨噬细胞中胆固醇酯过度积累，是导致泡沫细胞形成的根本原因。泡沫细胞的形成取决于三个主要的相互关联的生物过程的平衡效应，包括脂质摄取、胆固醇酯化和胆固醇流出。
短序蒲桃多酚类化合物的种类有很多，其中包括短序蒲桃酚B(Brachythol B，简称BB)和没食子酸乙酯(Ethyl gallate，简称EG)，短序蒲桃酚B和没食子酸乙酯的提取方法参见发明人前期公开的论文(Jiaqi Qiu,Xuelian Chen,Pulin Liang,et al.Integratingapproach to discover novel bergenin derivatives and phenolics withantioxidant and anti-inflammatory activities from bio-active fraction ofSyzygium brachythyrsum[J].Arabian Journal of Chemistry,2021,15,103507)。
为验证短序蒲桃酚B和没食子酸乙酯在减少巨噬细胞脂质蓄积中的作用，将短序蒲桃酚B(BB)和没食子酸乙酯(EG)进行以下细胞实验。
1、短序蒲桃酚B和没食子酸乙酯对RAW264.7巨噬细胞的活性实验
短序蒲桃酚B和没食子酸乙酯分别在培养基中稀释至各工作浓度。将密度为1.8×104个/孔的RAW264.7细胞接种于96孔板中，24h后弃去培养基，加入各浓度短序蒲桃酚B或没食子酸乙酯共同孵育24h，然后进行MTT实验检测细胞存活率。
结果如图1所示，根据MTT实验结果最终选择没食子酸乙酯的25，12.5和6.25μM浓度进行后续实验，选择短序蒲桃酚B的50，25和12.5μM浓度进行后续实验。
2、短序蒲桃酚B和没食子酸乙酯对泡沫细胞形成的影响实验
按照1×105个/孔的细胞密度将RAW264.7细胞接种于24孔板中，37℃培养24h后加入不同浓度的短序蒲桃酚B或没食子酸乙酯与80μg/mL ox-LDL共同孵育24小时，模型组加入含80μg/mL ox-LDL的完全培养基，空白组加入等量的细胞完全培养基，孵育24h后，弃上清后用磷酸盐缓冲盐水洗细胞3遍，加入4％多聚甲醛固定30min，然后用油红O染色30min，PBS清洗3遍后在电子显微镜下观察红色脂滴积累情况并拍照。
结果如图2所示，经ox-LDL诱导RAW264.7巨噬细胞泡沫化后，细胞内充满戒环状红色脂滴，细胞体积变大。短序蒲桃酚B和没食子酸乙酯处理后，红色脂滴显著减少，说明短序蒲桃酚B和没食子酸乙酯抑制了RAW264.7巨噬细胞源性的泡沫细胞形成。
3、短序蒲桃酚B和没食子酸乙酯对泡沫细胞脂质蓄积的影响实验
将RAW264.7细胞按1×105个/孔的细胞密度接种于24孔板中，24h后给药组加入含有不同浓度的短序蒲桃酚B或没食子酸乙酯与20μg/mL Dil-ox-LDL共同孵育24h，模型组加入20μg/mL Dil-ox-LDL，空白组加入等量新鲜的细胞完全培养基，培养3h后弃去培养液，PBS洗三遍，然后于荧光显微镜下观察。同样操作步骤，PBS洗三遍后避光收集细胞，在流式细胞仪下检测Dil-ox-LDL的荧光强度。
结果如图3所示，荧光显微镜下观察到短序蒲桃酚B和没食子酸乙酯显著减少RAW264.7细胞摄取荧光标记的ox-LDL，流式细胞术结果也说明了这点。因此，短序蒲桃酚B和没食子酸乙酯可以通过减少RAW264.7巨噬细胞对脂质摄取，从而减少泡沫细胞内脂质蓄积。
4、短序蒲桃酚B和没食子酸乙酯对泡沫细胞胆固醇外排的影响实验
将RAW264.7细胞按5×105个/孔的细胞密度接种于12孔板中，24小时后加入80μg/mL ox-LDL和5μg/mL的25-NBD荧光标记的胆固醇孵育24h，然后按各给药组加入含有不同浓度的短序蒲桃酚B或没食子酸乙酯与50μg/mL HDL的无酚红培养基共同培养24小时。收集上清液，用PBS冲洗细胞三遍，再用RIPA裂解细胞，收集细胞裂解液，于激发波长469nm，发射波长538nm处检测上清液和裂解液荧光强度，NBD-胆固醇外流率＝FI上清液/(FI上清液+FI细胞裂解液)×100％。
结果如图4所示，短序蒲桃酚B和没食子酸乙酯可以提高泡沫细胞内胆固醇外排率，从而减少泡沫细胞内的脂质蓄积。
5、短序蒲桃酚B和没食子酸乙酯对泡沫细胞中相关受体表达的影响实验
脂质进入巨噬细胞主要是通过清道夫受体A(Scavenger Receptor A1,SRA1)和脂肪转运蛋白36(Cluster of Differentiation 36,CD36)一起介导的吞噬及胞饮作用。研究表明，巨噬细胞对ox-LDL的内化中SRA1和CD36的作用占75％-90％。同时，胆固醇主要通过ATP结合盒转运蛋白ABCG1和SRB1从巨噬细胞中流出。
按照1×106个/孔的细胞密度将对数生长期的RAW264.7细胞接种于6孔板中，于37℃细胞培养箱中培养24h后，按分组给药。24h后使用Trizol试剂从RAW264.7细胞中提取总RNA，测定完RNA纯度及浓度后使用Roche Transcriptor First Strand cDNA SynthesisKit合成cDNA，然后使用Roche FastStart Universal SYBR Green Master在real-timePCR System7500(Applied Biosystems)中进行PCR实验(引物序列见表1)。检测各组细胞中SRA1,CD36,SRB1和ABCG1的表达。
表1目的基因的引物序列
按照1×106个/孔的细胞密度将对数生长期的RAW264.7细胞接种于6孔板中，于37℃细胞培养箱中培养24h后，各给药组加入含有不同浓度的短序蒲桃酚B或没食子酸乙酯与80μg/mL ox-LDL共同孵育24h，模型组加入含80μg/mL ox-LDL等量新鲜的细胞完全培养基。孵育24h后弃上清液，用PBS洗3遍，然后加入RIPA裂解30min，得到细胞蛋白样品。采用BCA法测定蛋白浓度，按照40μg的蛋白上样量在8％SDS-PAGE凝胶上分离，然后将蛋白转移至PVDF膜上(250mA,90min)，用5％牛血清蛋白封闭1.5h，然后与相应的抗体4℃孵育过夜。再用二抗孵育条带1h，使用ECL检测系统对条带进行可视化，利用Image J软件分析条带密度和计算。检测各组细胞中SRA1,CD36,SRB1和ABCG1的表达。
结果如图5所示，短序蒲桃酚B和没食子酸乙酯可以减少ox-LDL诱导的SRA1和CD36的表达，促进SRB1和ABCG1的表达。因此，短序蒲桃酚B和没食子酸乙酯通过抑制SRA1和CD36表达，以及增加ABCG1和SRB1的表达，从而维持泡沫细胞内胆固醇稳态，减少泡沫细胞的脂质蓄积。
综上，本发明通过氧化低密度脂蛋白(oxidized-LDL,ox-LDL)诱导的RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞模型，发现短序蒲桃酚B和没食子酸乙酯通过抑制RAW264.7巨噬细胞摄取ox-LDL，从而抑制泡沫细胞的形成；通过减少RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞对脂质摄取、提高泡沫细胞内胆固醇外排率以及维持泡沫细胞内胆固醇稳态，从而减少泡沫细胞内脂质蓄积。分子机制研究表明，这与抑制SRA1和CD36表达以及增加ABCG1和SRB1表达有关。因此，短序蒲桃酚B和没食子酸乙酯可用于制备减少巨噬细胞脂质蓄积的药物、预防和/或治疗动脉粥样硬化的药物以及降脂药物。本发明可为短序蒲桃酚B和没食子酸乙酯未来的开发应用提供新的方向和策略。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.短序蒲桃多酚类化合物在制备减少巨噬细胞脂质蓄积的药物中的应用，其中，所述短序蒲桃多酚类化合物选自短序蒲桃酚B或者没食子酸乙酯中的任意一种，所述短序蒲桃酚B的结构式为：
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述减少巨噬细胞脂质蓄积的药物还包括药学上可接受的辅料。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述辅料包括药学上使用的载体、赋形剂、稀释剂中的任意一种或几种。
4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述减少巨噬细胞脂质蓄积的药物的剂型为胶囊剂、颗粒剂、片剂或口服液。
5.短序蒲桃多酚类化合物作为减少巨噬细胞脂质蓄积的药物在制备预防和/或治疗动脉粥样硬化的药物中的应用，其中，所述短序蒲桃多酚类化合物选自短序蒲桃酚B或者没食子酸乙酯中的任意一种，所述短序蒲桃酚B的结构式为：
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述预防和/或治疗动脉粥样硬化的药物还包括药学上可接受的辅料。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述辅料包括药学上使用的载体、赋形剂、稀释剂中的任意一种或几种。
8.根据权利要求5-7任一项所述的应用，其特征在于，所述预防和/或治疗动脉粥样硬化的药物的剂型为胶囊剂、颗粒剂、片剂或口服液。
9.短序蒲桃多酚类化合物作为减少巨噬细胞脂质蓄积的药物在制备降脂药物中的应用，其中，所述短序蒲桃多酚类化合物选自短序蒲桃酚B或者没食子酸乙酯中的任意一种，所述短序蒲桃酚B的结构式为：
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述降脂药物还包括药学上可接受的辅料。
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