CN115299872A

CN115299872A - 结膜杯状细胞的荧光成像设备

Info

Publication number: CN115299872A
Application number: CN202210943813.9A
Authority: CN
Inventors: 袁进; 肖鹏; 段铮昱
Original assignee: Zhongshan Ophthalmic Center
Current assignee: Zhongshan Ophthalmic Center
Priority date: 2022-08-08
Filing date: 2022-08-08
Publication date: 2022-11-08

Abstract

本公开描述一种结膜杯状细胞的荧光成像设备，是对预涂有荧光标记物的结膜杯状细胞成像的设备，包括输出具有第一预设波段的第一光束的照明装置、包括变焦单元、聚焦透镜和相机的成像装置、以及包括控制单元和图像处理单元的处理装置，控制单元用于控制可调焦透镜以调整变焦单元的第一实时焦距，相机用于输出针对结膜杯状细胞的多个目标图像，多个目标图像对应多个不同的第一实时焦距，图像处理单元用于对多个目标图像进行融合处理以获取全焦细胞图像。根据本公开，提供一种能够对结膜杯状细胞进行成像、且成像质量较高的成像设备。

Description

结膜杯状细胞的荧光成像设备

技术领域

本公开涉及生物医学工程产业领域，具体涉及一种结膜杯状细胞的荧光成像设备。

背景技术

结膜杯状细胞是位于眼部的上皮细胞，可以在眼表分泌粘蛋白以对眼球进行保护。对结膜杯状细胞进行检查可以用于判断眼表的内环境的稳定性，对干眼及各种眼表并发症的监控具有重要意义。但是，由于结膜杯状细胞一般呈曲面分布于眼表，且结膜杯状细胞的形态一般相对不规则，因此对结膜杯状细胞进行在体成像一般是比较困难的。

目前对细胞进行成像的装置一般包括照明装置和成像装置，其中照明装置可以发出光束将待观测细胞照亮，并且光束经待观测细胞反射后可以进入成像装置以输出细胞图像。但是由于结膜杯状细胞大体是透明的而且颜色较浅，因此基于结膜杯状细胞反射的光生成的细胞图像的对比度一般不高，成像质量较差。

因此，需要一种能够对结膜杯状细胞进行成像、且成像质量较高的成像设备。

发明内容

本公开是有鉴于上述现有技术的状况而提出的，其目的在于提供一种能够对结膜杯状细胞进行成像、且成像质量较高的荧光成像设备。

为此，本公开提供一种结膜杯状细胞的荧光成像设备，是对预涂有荧光标记物的结膜杯状细胞成像的设备，包括输出具有第一预设波段的第一光束的照明装置、包括变焦单元、聚焦透镜和相机的成像装置、以及包括控制单元和图像处理单元的处理装置，所述变焦单元包括相对设置的可调焦透镜和视物镜，所述变焦单元的第一实时焦距满足公式：

其中，f为所述变焦单元的第一实时焦距，f₁为所述可调焦透镜的第二实时焦距，f₂为所述视物镜的焦距，d为所述可调焦透镜的主平面和所述视物镜的主平面之间的距离，所述控制单元用于控制所述可调焦透镜以调整所述变焦单元的第一实时焦距，所述相机用于输出针对所述结膜杯状细胞的多个目标图像，所述多个目标图像对应多个不同的第一实时焦距，所述图像处理单元用于对所述多个目标图像进行融合处理以获取全焦细胞图像，所述第一光束照射到所述结膜杯状细胞，所述荧光标记物吸收所述第一光束以输出具有第二预设波段的第二光束，所述第二光束依次经由所述视物镜、所述可调焦透镜、以及所述聚焦透镜而聚焦于所述相机的感光平面，所述第一预设波段与所述第二预设波段不同。

在本公开中，使用荧光标记物对结膜杯状细胞进行标记，当荧光标记物在第一光束的照射下能够输出具有第二预设波段且携带有结膜杯状细胞信息的第二光束，由此能够基于第二光束输出对比度高、图像清晰的目标图像。另外，成像装置的变焦单元的第一实时焦距是可调的，由此能够对结膜杯状细胞进行分层扫描获取多个焦距的目标图像，再对多个目标图像进行融合处理能够获得全焦细胞图像。根据本公开的荧光成像设备，能够对结膜杯状细胞进行成像并能够输出对比度高、图像清晰的全焦细胞图像。

另外，在本公开所涉及的荧光成像设备中，可选地，还包括二向色镜，所述二向色镜配置为使所述第一光束反射到所述结膜杯状细胞，并使所述第二光束透过所述二向色镜而进入所述成像装置。在这种情况下，二向色镜能够使第一光束和第二光束的部分传播路径相同，由此能够使荧光成像设备的结构紧凑。另外，二向色镜能够降低第二光束中不期望的杂光被相机采集的可能性。

另外，在本公开所涉及的荧光成像设备中，可选地，所述照明装置包括光源以及基于中心波长和带宽过滤所述光源发出的光的第一滤光元件。在这种情况下，光源发出的光中具有第一预设波段的部分能够经过第一滤光元件输出，由此能够根据荧光标记物的激发光的波段选择不同的第一滤光元件。

另外，在本公开所涉及的荧光成像设备中，可选地，所述照明装置还包括用于获取不同强度的所述第一光束的第二滤光元件。由此，能够控制第一光束的强度，降低第一光束的强度过高对结膜杯状细胞造成伤害的可能性。

另外，在本公开所涉及的荧光成像设备中，可选地，所述处理装置还包括基于梯度算法获取聚焦效果评价值的计算单元。由此，能够有效地提取目标图像不同方向的灰度梯度信息。

另外，在本公开所涉及的荧光成像设备中，可选地，所述处理装置还包括用于确定所述多个不同的第一实时焦距对应的变焦范围的确定单元，在确定所述变焦范围的过程中，令所述变焦单元的第一实时焦距连续变化以获得多个聚焦效果评价值并基于所述多个聚焦效果评价值确定聚焦效果评价函数，基于所述聚焦效果评价函数的极值确定目标焦距，并且基于所述目标焦距获得所述变焦范围，所述变焦范围为第一预设焦距至第二预设焦距，所述第一预设焦距小于所述目标焦距，所述第二预设焦距大于所述目标焦距。在这种情况下，基于聚焦效果评价函数值能够确定整体成像较清晰的目标焦距，进而能够判断出适合于对结膜杯状细胞进行成像的变焦范围。

另外，在本公开所涉及的荧光成像设备中，可选地，所述控制单元获取所述变焦范围并控制所述变焦单元的第一实时焦距在所述变焦范围内变化，以使所述相机输出所述多个目标图像。由此，能够输出针对结膜杯状细胞的不同深度的局部清晰的多个目标图像。

另外，在本公开所涉及的荧光成像设备中，可选地，所述成像装置还包括第三滤光元件，所述第三滤光元件配置为调整照射到所述感光平面的光线的中心波长和带宽。由此，第三滤光元件能够降低第二光束中的不期望的波段的部分照射到感光平面，从而降低成像质量的可能性。

另外，在本公开所涉及的荧光成像设备中，可选地，所述结膜杯状细胞为在体细胞。由此，能够对在体的结膜杯状细胞进行无创的检查诊断。

另外，在本公开所涉及的荧光成像设备中，可选地，所述第一光束为人眼不敏感的光。由此，能够降低第一光束对人眼造成伤害的可能性。

另外，在本公开所涉及的荧光成像设备中，可选地，所述视物镜配置为满足公式：L₁＝f₂，

其中，L₁为所述视物镜的主平面和所述可调焦透镜的主平面的间距，f₁为所述可调焦透镜的第二实时焦距，f₂为所述视物镜的焦距，L₂为聚焦平面和所述视物镜的主平面的间距。由此，能够通过调整可调焦透镜的第一实时焦距控制聚焦平面的位置，进一步能够对观测对象的不同区域进行成像。

另外，在本公开所涉及的荧光成像设备中，可选地，所述照明装置配置为间歇性地输出所述第一光束，所述照明装置输出所述第一光束的频率等于所述相机采集图像的频率或所述第一实时焦距变化的频率。由此，能够控制在体成像激光曝光量，减轻在体成像光毒性。

根据本公开，能够提供一种能够对结膜杯状细胞进行成像、且成像质量较高的荧光成像设备。

附图说明

现在将仅通过参考附图的例子进一步详细地解释本公开，其中：

图1是示出了本公开实施方式所涉及的荧光成像设备的模块图。

图2是示出了本公开实施方式所涉及的荧光成像设备的工作原理图。

图3是示出了本公开实施方式所涉及的荧光成像设备的示意图。

图4是示出了本公开示例所涉及的调节聚焦平面位置的原理图。

图5a是示出了本公开实施方式所涉及的使用被观测对象反射的光束成像的原理图；

图5b是示出了本公开实施方式所涉及的使用观测对象发出的荧光成像的原理图。

图6a是示出了本公开实施方式所涉及的使用观测对象发出的荧光成像时视物镜的视野中所能观察到的图像的示意；

图6b是示出了本公开实施方式所涉及的使用被观测对象反射的光束成像时视物镜的视野中所能观察到的图像的示意。

图7是示出了本公开实施方式所涉及的对观测对象进行分层扫描的示意图。

图8是示出了本公开实施方式所涉及的对观测对象进行分层扫描输出目标图像的示意图。

图9是示出了本公开实施方式所涉及的处理装置的模块图。

图10是示出了本公开实施方式所涉及的对观测对象进行成像的流程图。

附图标记说明

1…荧光成像设备，2…观测对象，3…目标图像，

100…照明装置，200…成像装置，300…处理装置，

110…光源，120…第一滤光元件，130…第二滤光元件，

210…聚焦透镜，220…变焦单元，221…可调焦透镜，222…视物镜，230…相机，240…第三滤光元件，250…观测镜，260…分光元件， 270…二向色镜，

310…控制单元，320…图像处理单元，330…计算单元，340…确定单元。

具体实施方式

以下，参考附图，详细地说明本公开的优选实施方式。在下面的说明中，对于相同的部件赋予相同的符号，省略重复的说明。另外，附图只是示意性的图，部件相互之间的尺寸的比例或者部件的形状等可以与实际的不同。

需要说明的是，本公开中的术语“包括”和“具有”以及它们的任何变形，例如所包括或所具有的一系列步骤或装置的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或装置，而是可以包括或具有没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或装置。

另外，在本公开的下面描述中涉及的小标题等并不是为了限制本公开的内容或范围，其仅仅是作为阅读的提示作用。这样的小标题既不能理解为用于分割文章的内容，也不应将小标题下的内容仅仅限制在小标题的范围内。

本公开大致涉及生物医学工程产业领域，具体涉及一种结膜杯状细胞的荧光成像设备。在一些示例中，结膜杯状细胞的荧光成像设备也可以称为细胞成像装置、荧光成像装置、显微成像装置、显微镜装置等。

图1是示出了本公开实施方式所涉及的荧光成像设备1的模块图。图2是示出了本公开实施方式所涉及的荧光成像设备1的工作原理图。图3是示出了本公开实施方式所涉及的荧光成像设备1的示意图。

参见图1，在一些示例中，荧光成像设备1一般包括照明装置100、成像装置200和处理装置300。在一些示例中，荧光成像设备1可以对观测对象2进行成像。在一些示例中，照明装置100可以发出光束照射到观测对象2。成像装置200可以收集来自观测对象2的光束并输出目标图像3。处理装置300可以对目标图像3进行处理。

在一些示例中，照射到观测对象2的光束可以称为第一光束。在一些示例中，来自于观测对象2的光束可以称为第二光束。在一些示例中，第二光束可以指的是观测对象2反射的光束。在一些示例中，观测对象2中可以预涂有荧光标记物，第二光束可以是由观测对象2 中的荧光标记物发出的。具体而言，预涂于观测对象2的荧光标记物可以在具有第一预设波段的第一光束的照射下发出具有第二预设波段的第二光束。

在本公开中，荧光成像设备1适合于对活体或在体的结膜杯状细胞进行成像，而且尤其适合于对结膜杯状细胞进行成像。也即，在一些示例中，观测对象2可以为活体或在体的结膜杯状细胞。但是可以理解的是，本公开涉及的荧光成像设备1可以对离体或活体的细胞(例如角膜上皮细胞、结膜上皮细胞、呼吸道杯状细胞、消化道杯状细胞、结膜微血管或睑板腺管等)进行成像并且获得等同的技术效果。

参见图2或图3，在一些示例中，照明装置100可以输出具有第一预设波段的第一光束。

在一些示例中，照明装置100可以包括光源110。在一些示例中，光源110可以发光。在一些示例中，照明装置100还可以包括第一滤光元件120。在一些示例中，第一滤光元件120可以基于中心波长和带宽过滤光源110发出的光。在一些示例中，第一滤光元件120可以为边通滤光片或带通滤光片。在这种情况下，光源110发出的光中具有第一预设波段的部分能够经过第一滤光元件120输出，由此能够根据荧光标记物的激发光的波段选择不同的第一滤光元件120。例如，在对眼部细胞进行成像的时候，第一滤光元件120可以配置为使光源110 发出的光线中人眼不敏感或不容易损伤人眼的部分光线通过。由此，能够起到保护眼睛的作用。

在一些示例中，照明装置100还可以包括用于获取不同强度的第一光束的第二滤光元件130。在一些示例中，第二滤光元件130可以为衰减滤光片。由此，能够控制第一光束的强度，降低第一光束的强度过高对结膜杯状细胞造成伤害的可能性。由此，能够起到保护眼睛的作用。

在一些示例中，第一光束可以为人眼不敏感的光。由此，能够降低第一光束对人眼造成伤害的可能性。在一些示例中，优选地，第一光束的中心波长、带宽及强度均符合在体成像激光安全标准。

在一些示例中，照明装置100可以配置为间歇性地输出第一光束。在一些示例中，照明装置100输出第一光束的频率可以等于相机230 采集图像的频率或第一实时焦距变化的频率(稍后描述)。由此，能够控制在体成像激光曝光量，减轻在体成像光毒性。

在一些示例中，照明装置100可以设置有电控快门。在一些示例中，电控快门可以与相机或可调焦透镜的工作频率同步。在这种情况下，照明装置100输出的第一光束可以间歇性的将结膜杯状细胞照亮，由此能够控制入眼光的功率。在一些示例中，光源110可以配置为间歇性工作的。在这种情况下，通过控制光源110的开机时间、曝光时间等参数可以起到等同的效果。

在一些示例中，成像装置200可以包括聚焦透镜210、变焦单元 220和相机230。

在一些示例中，变焦单元220可以包括相对设置的可调焦透镜221 和视物镜222。在一些示例中，变焦单元220的第一实时焦距可以满足公式：

其中，f可以为变焦单元220的第一实时焦距，f₁可以为可调焦透镜221的第二实时焦距，f₂可以为视物镜222的焦距，d可以为可调焦透镜221的主平面和视物镜222的主平面之间的距离。

在一些示例中，视物镜222可以是包括一个或多个透镜。在一些示例中，视物镜222可以为放大镜。在一些示例中，视物镜222可以为可更换或可调节的。由此能够根据观测对象2的大小对放大倍率进行调整。在一些示例中，视物镜222也可以称为物镜。

在一些示例中，相机230可以用于输出针对结膜杯状细胞(观测对象2)的多个目标图像3。当来自结膜杯状细胞的光束照射到相机230 的感光平面后，相机230可以输出目标图像3。在一些示例中，多个目标图像3可以对应多个不同的第一实时焦距。在一些示例中，相机230 可以为面阵相机。

在一些示例中，多个目标图像3可以包括第一图像和第二图像。其中，第一图像对应的第一实时焦距和第二图像对应的第一实时焦距不同。由此，能够获得对应多个不同的第一实时焦距的多个目标图像3。

另外，在一些示例中，多个目标图像3还可以包括第三图像。与第三图像对应的第一实时焦距可以等于第一图像或第二图像的第一实时焦距。也就是说，多个目标图像3中也可以包括对应于同一个第一实时焦距的多个图像。由此，能够增加获得质量较高的目标图像的可能性。

在一些示例中，成像装置200还可以包括第三滤光元件240。在一些示例中，第三滤光元件240可以为边通滤光片。在一些示例中，第三滤光元件240可以配置为调整照射到感光平面的光线的中心波长和带宽。由此，第三滤光元件240能够降低第二光束中的不期望的波段的部分照射到感光平面，从而降低成像质量的可能性。

在一些示例中，第三滤光元件240可以位于可调焦透镜221和聚焦透镜210之间。在一些示例中，可调焦透镜221可以位于聚焦透镜 210和第三滤光元件240之间。也就是说，在一些示例中，各个光学器件(例如滤光片、透镜)的可以按任意的顺序放置。在本公开中，来自观测对象2的光线可以依次经由视物镜222、可调焦透镜221、聚焦透镜210为相机230所接收。其中，对第三滤光元件240的位置不做限制。

在一些示例中，成像装置200还可以包括观测镜250。在一些示例中，观测镜250也可以称为目镜。在一些示例中，观测镜250可以包括一个或多个透镜。在一些示例中，观测镜250可以是放大镜。在一些示例中，观测镜250可以为可更换或可调节的。由此能够根据观测对象2的大小对放大倍率进行调整。在一些示例中，操作人员或医师能够使用肉眼通过观测镜250和视物镜222对观测对象2进行观察。

在一些示例中，成像装置200可以具有分光元件260。在一些示例中，第二光束中的部分光线可以经分光元件260进入观测镜250。在一些示例中，第二光束中的部分光线可以经分光元件260朝向相机230 传播。

在一些示例中，成像装置200可以具有聚焦平面。在一些示例中，聚焦平面可以指的是经过成像装置200的系统焦点且与视物镜222的光轴垂直的平面。观测对象2位于聚焦平面时获取的目标图像3相较于观测对象2位于聚焦平面前或聚焦平面后时获取的目标图像3更清晰。因此，当观测对象2靠近聚焦平面时有利于输出清晰的目标图像3。

可以理解的是，观测对象2并不一定总是位于成像装置200的聚焦平面。在这种情况下，通过观测镜250可以判断观测对象2大致是否位于聚焦平面的附近。当观测对象2明显偏离聚焦平面的位置的时候，可以移动观测对象2以靠近聚焦平面，或者移动成像装置200使观测对象2大致位于聚焦平面附近。

参见图4，在一些示例中，视物镜222可以配置为满足以下公式： L₁＝f₂，

其中，L₁为视物镜222的主平面和可调焦透镜221 的主平面的间距，f₁为可调焦透镜221的第二实时焦距，f₂为视物镜 222的焦距，L₂为聚焦平面和视物镜222的主平面的间距。由此，能够通过调整可调焦透镜221的第一实时焦距控制聚焦平面的位置，进一步能够对观测对象2的不同区域进行成像。

可以理解的是，当可调焦透镜221的第二实时焦距f₁变化时，变焦单元220的第一实时焦距f也会发生变化。也即聚焦平面和视物镜222 的主平面的距离(聚焦深度)也会发生变化。由此，能够通过控制第二实时焦距f₁以使聚焦深度发生变化、聚焦平面的位置发生移动。

在一些示例中，荧光成像设备1还可以包括二向色镜270。在一些示例中，二向色镜270可以配置为使具有第一预定波段的光(第一光束)照射到观测对象2。具体地，二向色镜270可以配置为使第一光束反射到结膜杯状细胞。在一些示例中，来自观测对象2的光束(第二光束)可以朝向二向色镜270传播。具体地，二向色镜270可以配置为使第二光束透过二向色镜270而进入成像装置200。

参见图2和图3，在一些示例中，二向色镜270可以位于视物镜 222和观测对象2之间。也即，照明装置100发出的具有第一预设波段的光(第一光束)可以经二向色镜270反射，并由视物镜222聚焦于观测对象2。观测对象2中的荧光标记物发出的携带有观测对象2的信息且具有第二预设波段的光(第二光束)可以依次经由视物镜222、二向色镜270向第三滤光元件240或可调焦透镜221传播。在这种情况下，二向色镜270可以使第一光束和第二光束的部分传播路径相同，由此能够使荧光成像设备1的结构紧凑。另外，二向色镜270能够降低第二光束中不期望的杂光被相机230采集的可能性。

在另一些示例中，视物镜222也可以位于二向色镜270和观测对象2之间。在一些示例中，荧光成像设备1还可以不包括二向色镜270。也就是说，二向色镜270并不是必须的。

图5a是示出了本公开实施方式所涉及的使用被观测对象2反射的光束成像的原理图；图5b是示出了本公开实施方式所涉及的使用观测对象2发出的荧光成像的原理图。

参见图5a和图5b，在一些示例中，来自观测对象2的光束可以为被观测对象2反射的光束。在这种情况下，成像质量会受到观测对象2 对光的反射能力的影响。因此在这种情况下，荧光成像设备1一般用于对具有颜色的观测对象2或者不透明的观测对象2进行成像。

在一些示例中，来自观测对象2的光束可以为观测对象2发出的荧光。在这种情况下，成像质量对观测对象2的反光能力较不敏感，但是容易受到观测对象2的透光度的影响。因此在这种情况下，荧光成像设备1一般用于对透明的观测对象2或者颜色较浅的观测对象2 进行成像。另外，相较于来自观测对象2的光束为被观测对象2反射的光束，观测对象2发出的荧光用于成像时可以提高成像质量，例如可以显著提高目标图像3的对比度，另外还能够保留更多的图像细节。

图6a是示出了本公开实施方式所涉及的使用观测对象2发出的荧光成像时视物镜222的视野中所能观察到的图像的示意图；图6b是示出了本公开实施方式所涉及的使用被观测对象2反射的光束成像时视物镜222的视野中所能观察到的图像的示意图。

参见图6a和图6b，在一些示例中，使用被观测对象2反射的光束成像的时候，为了获得足够清晰的图像，光束通常会聚集在较小的区域，这也有可能导致成像的区域需要受到光照区域的限制。但是使用观测对象2发出的荧光成像的时候，成像的区域几乎可以等于视物镜 222的视野区域。由此，能够增大视物镜222的视野中可观察到观测对象2的面积。因此在使用被观测对象2反射的光束成像的时候，可能需要在视物镜222的视野范围内反复移动光照区域或移动观测对象2 以完整地对观测对象2进行检查或成像。

在本公开中，观测对象2可以为结膜杯状细胞。考虑到结膜杯状细胞大致透明，因此在本公开中，来自观测对象2的光束可以指的是观测对象2发出的“荧光”。

在本公开中，观测对象2中可以预涂有荧光标记物。在一些示例中，荧光标记物可以在具有第一预设波段的光的照射下形成具有第二预设波段的光。第一预设波段和第二预设波段不同。在一些示例中，具有第二预设波段的光可以称为荧光。换言之，荧光标记物可以将观测对象2“染色”(在第一预设波段的光的照射下)。在这种情况下，荧光标记物发出的具有第二预设波段的光会携带有观测对象2的信息，由此能够增大视物镜222的视野中可观察到观测对象2的面积，并且提高成像的对比度。

在一些示例中，荧光成像设备1可以对来自观测对象2的光束进行处理成像。在一些示例中，来自观测对象2的光束可以包括具有第二预设波段的光。

具体而言，第一光束照射到结膜杯状细胞，荧光标记物吸收第一光束以输出具有第二预设波段的第二光束。第二光束可以依次经由视物镜222、可调焦透镜221、以及聚焦透镜210而聚焦于相机230的感光平面。

图7是示出了本公开实施方式所涉及的对观测对象2进行分层扫描的示意图。图8是示出了本公开实施方式所涉及的对观测对象2进行分层扫描输出目标图像3的示意图。

在一些示例中，结膜杯状细胞可以为活体细胞或在体细胞。在这种情况下，结膜杯状细胞可以整体上沿着不规则的曲面分布。作为对比，离体的细胞一般可以放在载玻片上进行观察，因此用于观察的离体细胞一般在同一平面上。在一些示例中，可以通过调整荧光成像设备1的聚焦深度使荧光成像设备1能够对呈曲面状的结膜杯状细胞进行全面地观察。

在本公开中，分层扫描可以指的是通过调整变焦单元220的第一实时焦距，以使成像装置200的聚焦平面在沿着与视物镜222的光轴D 平行的方向移动并对观测对象2进行扫描成像。

参见图8，当荧光成像设备1可以对观测对象2中不同深度的区域进行扫描，并分别获取对应多个不同的第一实时焦距的目标图像3。在一些示例中，成像装置200的聚焦平面可以按照预定步距移动。

在一些示例中，在分层扫描的过程中，由于观测对象2中的荧光标记物都处于发光的状态，观测对象2中处于聚焦平面外(离焦区域) 的荧光标记物发出的荧光可能会干扰观测对象2中与聚焦平面对应的聚焦区域(成像区域)的荧光标记物发出的荧光。换言之，位于聚焦平面外(离焦区域)的荧光标记物发出的荧光是不期望的光线，有可能会遮掩成像区域的荧光标记物发出的信息，从而导致目标图像3的细节减少、对比度降低。因此，本公开涉及的第三滤光元件240还可以起到抑制离焦区域的荧光的作用。

图9是示出了本公开实施方式所涉及的处理装置300的模块图。

参见图9，在一些示例中，处理装置300可以包括控制单元310 和图像处理单元320。

在一些示例中，图像处理单元320可以用于对多个目标图像3进行融合处理以获取全焦细胞图像。具体而言，图像处理单元320可以将多个目标图像3中不同聚焦区域的图像进行融合以生成全焦细胞图像。在一些示例中，全焦细胞图像可以指的是全部区域清晰的细胞图像。也即，全焦细胞图像中的目标可以是清晰的。

在一些示例中，控制单元310可以用于控制可调焦透镜221以调整变焦单元220的第一实时焦距。

在一些示例中，相机230可以具有预设的采集频率。在一些示例中，控制单元310可以根据相机230的采集频率对可调焦透镜221进行同步控制。具体而言，控制单元310控制可调焦透镜221的变焦频率可以等于相机230的采集频率。在一些示例中，控制单元310控制可调焦透镜221的变焦频率可以等于相机230的采集频率的整数倍。由此，能够通过处理装置300实现变焦单元220的自动变焦。另外，能够快速获取多个目标图像3。

在一些示例中，处理装置300还可以包括用于获取聚焦效果评价值的计算单元330。在一些示例中，计算单元可以基于梯度算法获取聚焦效果评价值。由此，能够有效地提取目标图像3不同方向的灰度梯度信息。

在一些示例中，聚焦效果评价值可以满足公式：

其中，G为聚焦效果评价值，g(x,y)为各个第一实时焦距对应的目标图像3中像素点的灰度值，x为各个第一实时焦距对应的目标图像3 中像素点的横坐标，y为各个第一实时焦距对应的目标图像3中的像素点的纵坐标。在这种情况下，针对结膜杯状细胞呈曲面分布且结膜杯状细胞形态不规则，在传统x、y方向的梯度评价算法的基础上，增加±45度多方向灰度梯度变化评价参数，能够更加全面地提取目标图像 3不同方向的灰度梯度信息。

在一些示例中，处理装置300还可以包括用于确定上述的多个不同的第一实时焦距对应的变焦范围的确定单元340。在一些示例中，变焦范围可以指的是整体上适合用于成像的变焦范围。当变焦单元220 的第一实时焦距在变焦范围内移动的时候，聚焦平面可以整体上在覆盖观测对象2的区域内进行移动。

在一些示例中，在确定变焦范围的过程中，可以令变焦单元220 的第一实时焦距连续变化以获得多个聚焦效果评价值。在一些示例中，基于多个聚焦效果评价值可以确定聚焦效果评价函数。在一些示例中，基于聚焦效果评价函数的极值可以确定目标焦距。具体地，聚焦效果评价函数可以利用聚焦评价函数曲线表示，聚焦评价函数曲线的局部极值对应的第一实时焦距可以作为目标焦距。在一些示例中，目标焦距可以指的是相对较适合用于成像的焦距。在目标焦距下，成像装置 200可以整体上获得相对较清晰、画面细节较多的目标图像3。

在一些示例中，基于目标焦距可以获得变焦范围。在一些示例中，变焦范围可以为第一预设焦距至第二预设焦距。在一些示例中，第一预设焦距可以小于目标焦距，第二预设焦距可以大于目标焦距。在这种情况下，基于聚焦效果评价函数值能够确定整体成像较清晰的目标焦距，进而能够判断出适合于对结膜杯状细胞进行成像的变焦范围。

在一些示例中，控制单元310可以获取变焦范围。在一些示例中，控制单元310可以控制变焦单元220的第一实时焦距在变焦范围内变化，以使相机230输出上述的多个不同的第一实时焦距对应的多个目标图像3。换言之，控制单元310可以控制变焦单元的第一实时焦距在目标焦距的附近变化。由此，能够输出针对结膜杯状细胞的不同深度的局部清晰的多个目标图像3。

在本公开中，使用荧光标记物对结膜杯状细胞进行标记。当荧光标记物在第一光束的照射下可以将观测对象2“染色”，并输出具有第二预设波段且携带有结膜杯状细胞信息的第二光束。由此能够基于第二光束输出对比度高、图像清晰的目标图像3。另外，成像装置200 的变焦单元220的第一实时焦距是可调的，由此能够对结膜杯状细胞进行分层扫描获取多个焦距的目标图像3，再对多个目标图像3进行融合处理能够获得全焦细胞图像。根据本公开的荧光成像设备1，能够对结膜杯状细胞进行成像并能够输出对比度高、图像清晰的全焦细胞图像。

在一些示例中，荧光成像设备1还可以包括支承观测对象2的保持架。在一些示例中，保持架可以配置为使观测对象2对准视物镜222。在本公开中，保持架可以用于承载受试者的头部以使受试者的眼部大致对准视物镜222。由此，能够检查观测对象2的过程中降低观测对象 2晃动导致成像模糊的可能性。

在一些示例中，保持架可以包括下巴托、额托。受试者的头部可以置于下巴托上并为下巴托所支承。受试者的额头可以抵靠于额托。由此，能够降低在图像采集的过程中受试者的头部或眼部晃动从而造成运动伪影的可能性。在一些示例中，保持架可以调节高度和距离。由此，能够用于固定受试者的头部并且使受试者的眼部大致对准视物镜222。在另一些示例中，保持架可以根据观测对象2的形状、尺寸调整成不同的形状。

在一些示例中，荧光成像设备1可以包括支承成像装置200的移动平台。在一些示例中，移动平台可以为二维移动平台或三维移动平台。在一些示例中，移动平台可以包括基座、可移动的设置于基座的第一移动部、可移动的设置于第一移动部的第二移动部、以及可移动的设置于第二移动部的第三移动部。在一些示例中，第一移动部、第二移动部和第三移动部的移动方向彼此垂直。在一些示例中，第一移动部、第二移动部或第三移动部的移动方向可以平行于视物镜222的光轴方向。

在一些示例中，荧光成像设备1可以是基于裂隙灯平台的荧光成像设备。裂隙灯是一种眼科常用的检查设备。在一些示例中，裂隙灯可以包括裂隙光源装置和显微镜装置。需要说明的是，一般而言，裂隙灯本身无法获得对比度高的结膜杯状细胞图像。裂隙灯本身也不适合用于对透明的细胞进行成像。

本公开中的基于裂隙灯平台的荧光成像设备1可以利用裂隙灯的放大光路(也即本公开涉及的视物镜222和观测镜250)。

在一些示例中，可以在裂隙灯的裂隙光源装置加装第一滤光元件 120、第二滤光元件130获得本公开示例涉及的照明装置100。在一些示例中，可以在裂隙灯的显微镜装置上加装变焦单元220、第三滤光元件240获得本公开示例涉及的成像装置200。在一些示例中，还可以在裂隙灯上增加处理装置300。另外，裂隙灯一般包括保持架、移动平台等。

在一些示例中，基于裂隙灯平台的荧光成像设备1可以不具有二向色镜270。也就是说，基于裂隙灯平台的荧光成像设备1的照明装置 100发出的第一光束可以照射到结膜杯状细胞。来自结膜杯状细胞的第二光束可以依次经视物镜222、可调焦透镜221、第三滤光元件240和聚焦透镜210后为感光平面所接受，或者来自结膜杯状细胞的第二光束可以依次经视物镜222、第三滤光元件240、可调焦透镜221和聚焦透镜210后为感光平面所接受。

图10是示出了本公开实施方式所涉及的对观测对象2进行成像的流程图。

参见图10，在一些示例中，对观测对象2进行成像可以包括以下步骤：步骤S10：待测对象2进入成像视野；步骤S20：确定变焦范围；步骤S30：控制变焦单元220焦距在变焦范围内变化；步骤S40：相机 230输出多个目标图像3；步骤S50：对多个目标图像3进行处理以输出结膜杯状细胞图像。

在一些示例中，在步骤S10中，受试者可以将头部置于保持架上。在一些示例中，操作人员可以通过观测镜250观测受试者的眼部是否大致位于视野区域。当受试者的眼部偏离视野区域的时候，可以通过移动平台调整成像装置200的位置，使视物镜222对准受试者的眼部 (观测区域)。

在一些示例中，在步骤S20中，可以包括获取目标焦距。在一些示例中，可以令变焦单元220的第一实时焦距连续变化以获得多张目标图像3。对多张目标图像3的成像效果进行比较以确定目标焦距。在一些示例中，可以通过本公开上述的聚焦效果评价函数对多个目标图像3的成像效果进行评价。

在一些示例中，基于目标焦距可以获得变焦范围。在一些示例中，变焦范围可以为第一预设焦距至第二预设焦距。在一些示例中，第一预设焦距可以小于目标焦距，第二预设焦距可以大于目标焦距。

在一些示例中，在步骤S30中，可以通过控制单元310控制变焦单元220的第一实时焦距在变焦范围内变化。在一些示例中，在控制单元310控制第一实时焦距变化的过程中，成像装置200的聚焦平面可以沿着视物镜222的光轴方向按预定步距移动。

在一些示例中，在步骤S40中，相机230可以为面阵相机。在一些示例中，相机230可以具有预设的采集频率。在一些示例中，相机 230可以按预设的采集频率快速地对输出针对结膜杯状细胞(观测对象2)的多个目标图像3。在一些示例中，多个目标图像3可以对应多个不同的第一实时焦距。

在一些示例中，在步骤S50中，可以对多个目标图像3进行图像融合以获得结膜杯状细胞图像。在一些示例中，结膜杯状细胞图像可以指的是全焦细胞图像。

根据本公开，能够提供一种能够对结膜杯状细胞进行非侵入地检查并输出对比度高的、大视野的目标图像3的荧光成像设备1。

虽然以上结合附图和示例对本公开进行了具体说明，但是可以理解，上述说明不以任何形式限制本公开。本领域技术人员在不偏离本公开的实质精神和范围的情况下可以根据需要对本公开进行变形和变化，这些变形和变化均落入本公开的范围内。

Claims

1.一种结膜杯状细胞的荧光成像设备，是对预涂有荧光标记物的结膜杯状细胞成像的设备，其特征在于，包括输出具有第一预设波段的第一光束的照明装置、包括变焦单元、聚焦透镜和相机的成像装置、以及包括控制单元和图像处理单元的处理装置，所述变焦单元包括相对设置的可调焦透镜和视物镜，所述变焦单元的第一实时焦距满足公式：

2.根据权利要求1所述的荧光成像设备，其特征在于，还包括二向色镜，所述二向色镜配置为使所述第一光束反射到所述结膜杯状细胞，并使所述第二光束透过所述二向色镜而进入所述成像装置。

3.根据权利要求1所述的荧光成像设备，其特征在于，所述照明装置包括光源以及基于中心波长和带宽过滤所述光源发出的光的第一滤光元件。

4.根据权利要求3所述的荧光成像设备，其特征在于，所述照明装置还包括用于获取不同强度的所述第一光束的第二滤光元件。

5.根据权利要求1所述的荧光成像设备，其特征在于，所述处理装置还包括基于梯度算法获取聚焦效果评价值的计算单元。

6.根据权利要求5所述的荧光成像设备，其特征在于，所述处理装置还包括用于确定所述多个不同的第一实时焦距对应的变焦范围的确定单元，在确定所述变焦范围的过程中，令所述变焦单元的第一实时焦距连续变化以获得多个聚焦效果评价值并基于所述多个聚焦效果评价值确定聚焦效果评价函数，基于所述聚焦效果评价函数的极值确定目标焦距，并且基于所述目标焦距获得所述变焦范围，所述变焦范围为第一预设焦距至第二预设焦距，所述第一预设焦距小于所述目标焦距，所述第二预设焦距大于所述目标焦距。

7.根据权利要求6所述的荧光成像设备，其特征在于，所述控制单元获取所述变焦范围并控制所述变焦单元的第一实时焦距在所述变焦范围内变化，以使所述相机输出所述多个目标图像。

8.根据权利要求1所述的荧光成像设备，其特征在于，所述成像装置还包括第三滤光元件，所述第三滤光元件配置为调整照射到所述感光平面的光线的中心波长和带宽。

9.根据权利要求1所述的荧光成像设备，其特征在于，所述结膜杯状细胞为在体细胞。

10.根据权利要求1所述的荧光成像设备，其特征在于，所述第一光束为人眼不敏感的光。

11.根据权利要求1所述的荧光成像设备，其特征在于，所述视物镜配置为满足公式：L₁＝f₂，

其中，L₁为所述视物镜的主平面和所述可调焦透镜的主平面的间距，f₁为所述可调焦透镜的第二实时焦距，f₂为所述视物镜的焦距，L₂为聚焦平面和所述视物镜的主平面的间距。

12.根据权利要求1所述的荧光成像设备，其特征在于，所述照明装置配置为间歇性地输出所述第一光束，所述照明装置输出所述第一光束的频率等于所述相机采集图像的频率或所述第一实时焦距变化的频率。