CN115287304A - 一种利用群体感应促进酿酒酵母提高乙醇产量并降低染菌危害的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物发酵工程领域，公开一种利用群体感应促进酿酒酵母提高乙醇产量并降低染菌危害的方法。该方法是将酿酒酵母菌GIM2.188按照(1～4)×105cells/mL的接种量接种至含有2‑苯乙醇的YPD培养基中，发酵培养9～12h；或者将酿酒酵母菌和植物乳杆菌分别按照(1～4)×105cells/mL和1×(106～108)cells/mL的接种量接种至含有2‑苯乙醇的YPD培养基中，所述2‑苯乙醇的浓度均为30～120mg/L，发酵培养9～30h，实现同时提高乙醇产量并降低染菌危害。本发明方法操作简单，成本低，对酿酒酵母菌生长无影响，具有良好的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵工程技术领域，更具体地，涉及一种利用群体感应促进酿酒酵母提高乙醇产量并降低染菌危害的方法。
背景技术
随着传统化石能源的不断耗竭，对于新能源的开发与利用迫在眉睫。生物乙醇作为可再生的绿色能源，可替代部分化石燃料，对于缓解能源压力、改善环境质量具有重要意义，因此受到各国政府及学术界的广泛关注。
目前，95％燃料乙醇都是利用微生物发酵法产生，生物乙醇已成为全球规模最大的发酵产品。然而，随着社会的发展和人口的增长对于乙醇产量的需求急剧增加，以粮食作物为原料的第一代生物乙醇已满足不了目前人们对乙醇的需求，而以木质纤维素等非粮食作物为原料的第二代生物乙醇在发酵效率和工艺方面还有待加强。在工业生物乙醇发酵生产过程中，还常常受到细菌污染的影响。其中，乳酸菌被认为是工业生物乙醇发酵过程中最主要的污染细菌。乳酸菌通过与酿酒酵母菌争夺营养物质、分泌酸性物质降低发酵体系的pH、竞争生存的空间等形式对乙醇发酵过程进行抑制。因此，寻找一种即可以促进酿酒酵母菌产乙醇又可以降低染菌影响的方法，对于工业生物乙醇发展具有重要意义。
群体感应是微生物之间的一种通讯机制，在微生物生长过程中会向环境分泌群体感应信号分子，当信号分子浓度达到某一阈值后被微生物监测并调控相关基因的表达，如菌体发光、生物膜的形成、毒力因子和抗生素的产生等。2-苯乙醇已被证实为酿酒酵母菌的信号分子之一，在贫氮的条件下能够促进酿酒酵母菌假菌丝生长，但2-苯乙醇对生物乙醇发酵系统影响的研究尚未报道。
发明内容
本发明的目的在于针对上述问题，提供一种利用群体感应促进酿酒酵母提高乙醇产量并降低染菌危害的方法。该方法是将酿酒酵母菌单独培养或者酿酒酵母菌GIM2.188与植物乳杆菌ATCC8014共同培养，模拟工业生物乙醇发酵过程中的染菌问题。通过在培养基中添加酿酒酵母群体感应信号分子2-苯乙醇，可以有效促进酿酒酵母菌发酵过程中的乙醇产量，提升酿酒酵母产生乙醇的能力并且降低植物乳杆菌对乙醇产量的影响。
本发明的目的通过下述技术方案来实现：
一种利用群体感应促进酿酒酵母提高乙醇产量并降低染菌危害的方法，该方法是将酿酒酵母菌GIM2.188(保藏编号为GDMCC 2.188)按照(1～4)×105cells/mL的接种量接种至含有2-苯乙醇的YPD培养基中，在28℃、180rmp/min条件下发酵培养9～12h；或者将酿酒酵母菌和植物乳杆菌分别按照(1～4)×105cells/mL和1×106～1×108cells/mL的接种量接种至含有2-苯乙醇的YPD培养基中，所述2-苯乙醇的浓度均为30～120mg/L，在28℃、180rmp/min条件下发酵培养9～30h，实现促进酿酒酵母菌产生乙醇并降低染菌危害。
优选地，所述酿酒酵母菌的接种量均是将酿酒酵母菌GIM2.188接种至YPD培养基中，在28℃、180rmp/min条件下培养9～12h活化，活化后的菌种再次接种至YPD培养基中培养9～12h，通过血细胞计数板按照(1～4)×105cells/mL确定。
优选地，所述植物乳杆菌的接种量是将植物乳杆菌ATCC8014接种至MRS培养基中，在37℃恒温培养箱中静置活化培养9～12h，活化后的菌种再次接种至MRS培养基中培养9～12h，通过稀释涂布法按照1×106～1×108cells/mL确定。
所述的利用群体感应促进酿酒酵母提高乙醇产量并降低染菌危害的方法，所述染菌危害中的菌类为乳杆菌属。
优选地，所述乳杆菌属为植物乳杆菌ATCC8014(保藏编号为GDMCC 1.140)、植物乳杆菌ACCC 11095(保藏编号为GDMCC 1.191)、嗜酸乳杆菌(保藏编号为GDMCC 1.731)、短乳杆菌(保藏编号为GDMCC 1.773)、植物乳杆菌(保藏编号为GDMCC 1.2868)、干酪乳杆菌(保藏编号为GDMCC 1.2885)、嗜酸乳杆菌(保藏编号为GDMCC 1.1807)。本发明并不限于此，其他属于乳杆菌属，并且作为生物乙醇发酵过程中的主要污染细菌，均能使用本发明降低其对乙醇产量的影响。
与现有的技术对比，本发明有以下的有益效果：
1.本发明将酿酒酵母菌单独培养或者酿酒酵母菌GIM2.188与植物乳杆菌(如植物乳杆菌ATCC8014)共同培养，通过向YPD培养基中添加2-苯乙醇，可以有效促进酿酒酵母菌发酵过程中的乙醇产量，并且外源添加的2-苯乙醇浓度为酿酒酵母菌自身可以产生的浓度水平。因此，不会对酵母细胞生长产生影响。
2.本发明在酿酒酵母菌单独培养或者酿酒酵母菌GIM2.188与植物乳杆菌(如植物乳杆菌ATCC8014)共同培养后，添加2-苯乙醇后可降低植物乳杆菌污染对乙醇产量的影响，对于降低生物乙醇发酵过程中植物乳杆菌污染带来的危害具有重要的应用价值。
附图说明
图1为实施例1中酿酒酵母菌发酵过程中2-苯乙醇浓度和生长曲线；
图2为实施例2中添加不同浓度2-苯乙醇对酿酒酵母菌乙醇产量的影响；
图3为实施例3中添加120mg/L的2-苯乙醇对酿酒酵母菌与植物乳杆菌共发酵产生的乙醇浓度变化曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。除非特别说明，本发明采用的方法和设备为本技术领域常规方法和设备。
本发明使用的酿酒酵母菌GIM2.188(保藏编号为GDMCC 2.188)和植物乳杆菌ATCC8014(保藏编号为GDMCC 1.140)，均购自广东省微生物保藏中心。
实施例1
1.酿酒酵母菌在发酵过程中产生2-苯乙醇的浓度，具体步骤如下：
(1)培养基的准备：配制640mL的液体YPD培养基(葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母浸膏10g，用1L去离子水配制，斜面培养基添加2％琼脂粉)，分装180mL至3个250mL的锥形瓶中，剩余的100mL液体YPD培养基平均分配至2个250mL锥形瓶中作为活化培养基并计算接种量，所有培养基在115℃下灭菌20min。
(2)酿酒酵母菌活化及接种量确定：将酿酒酵母菌GIM2.188从斜面培养基中接种两环至50mLYPD培养基，在28℃、180rmp/min条件下培养活化9～12h，活化后的菌液移取1mL于50mLYPD培养基再次培养9～12h，移取1mL培养后的菌液用无菌水稀释20倍，用滴管吸取少许稀释菌液滴加至盖有盖玻片的血细胞计数板上，在显微镜下对规定的视野进行计数，按1×105cells/mL～4×105cells/mL确定酿酒酵母菌的接种量。
(3)酿酒酵母菌的培养：按照步骤(2)确定的接种量，将酿酒酵母菌接种于180mLYPD培养基中培养，在28℃、180rmp/min条件下培养144h。每隔36h取样，8000rpm/min离心10min后，上清液通过0.22um有机相滤头过滤，用于测定2-苯乙醇的浓度。
2.2-苯乙醇的测定：采用超高效液相色谱串联质联仪来定量酿酒酵母菌发酵过程中2-苯乙醇的浓度(参考Growth Regulation in Amphibian Pathogenic Chytrid Fungiby the Quorum Sensing Metabolite Tryptophol)。图1为实施例1中酿酒酵母菌发酵过程中2-苯乙醇浓度和生长曲线。如图1所示，酿酒酵母菌在发酵至144h，2-苯乙醇的浓度逐渐趋于平稳至118.02mg/L。
实施例2
2-苯乙醇的浓度对酿酒酵母菌单独发酵系统乙醇产量的影响，步骤如下：
(1)培养基的准备：配制2260mL的液体YPD培养基用于酿酒酵母菌单独发酵系统，分装180mL至12个250mL的锥形瓶中，其中9瓶分别加入2-苯乙醇使其终浓度分别为30mg/L、60mg/L、120mg/L，每个浓度三个平行，另外3瓶加入等量的蒸馏水作为对照组。剩余的100mL液体YPD培养基平均分配至2个250mL锥形瓶中作为活化培养基并计算接种量。
(2)酿酒酵母菌活化及接种量确定：将酿酒酵母菌GIM2.188从斜面培养基中接种两环至50mLYPD培养基，在28℃、180rmp/min条件下培养活化9～12h，活化后的菌液移取1mL于50mLYPD培养基再次培养9～12h，移取1mL培养后的菌液用无菌水稀释20倍，用滴管吸取少许稀释菌液滴加至盖有盖玻片的血细胞计数板上，在显微镜下对规定的视野进行计数，按1×105cells/mL～4×105cells/mL确定酿酒酵母菌的接种量。
(3)按照步骤(2)确定好的接种量，将酿酒酵母菌分别接种至步骤(1)中添加了不同浓度的2-苯乙醇的YPD培养基和等量蒸馏水作为对照组的YPD培养基中，在28℃、180rmp/min条件下培养9～30h，取样测定乙醇浓度。表1为不同浓度的2-苯乙醇对酿酒酵母菌单发酵系统乙醇产量的影响。由表1可知，发酵至9h，随着2-苯乙醇浓度的增加，乙醇浓度逐渐增大，分别比对照组提高了59％、55％、45％(P<0.05)，而发酵到第12h，仅添加120mg/L 2-苯乙醇的处理组与对照组的乙醇产量有显著差异，提高了9％(P<0.05)，发酵至24～30h系统中的葡萄糖已消耗完，此时2-苯乙醇对乙醇发酵没有表现出促进作用。
表1不同浓度2-苯乙醇对酿酒酵母菌单发酵系统乙醇产量的影响
图2为实施例2中添加不同浓度2-苯乙醇对酿酒酵母菌乙醇产量的影响；从图2中可知，添加2-苯乙醇后乙醇产量有所提升，其中添加120mg/L的2-苯乙醇提升效果最为明显。
实施例3
2-苯乙醇的浓度对酿酒酵母菌与植物乳杆菌共发酵系统乙醇产量的影响，具体步骤如下：
(1)培养基的准备：配制2260mL的液体YPD培养基用于酿酒酵母菌与植物乳杆菌共发酵系统，分装180mL至12个250mL的锥形瓶中，其中9瓶分别加入2-苯乙醇使其终浓度分别为30mg/L、60mg/L、120mg/L，每个浓度三个平行，另外3瓶加入等量的蒸馏水作为染菌组。剩余的100mL液体YPD培养基平均分配至2个250mL锥形瓶中作为活化培养基并计算接种量。配制300mL的液体MRS培养基(葡萄糖20g，牛肉膏10g，蛋白胨10g，酵母膏5g，乙酸钠5g，柠檬酸氢二铵2g，磷酸氢二钾2g，七水硫酸镁0.58g，一水硫酸锰0.25g，吐温-801mL，用1L去离子水配制，斜面培养基添加2％琼脂粉)，平均分配100mL至2个250mL锥形瓶中作为活化培养基并计算接种量，剩余200mL的液体MRS培养基加入2g琼脂粉，制成固体培养基。所有培养基在115℃下灭菌20min。
(2)酿酒酵母菌活化及接种量确定：将酿酒酵母菌GIM2.188从斜面培养基中接种两环至50mLYPD培养基，在28℃、180rmp/min条件下培养活化9～12h，活化后的菌液移取1mL于50mLYPD培养基再次培养9～12h，移取1mL培养后的菌液用无菌水稀释20倍，用滴管吸取少许稀释菌液滴加至盖有盖玻片的血细胞计数板上，在显微镜下对规定的视野进行计数，按1×105cells/mL～4×105cells/mL确定酿酒酵母菌的接种量。
(3)植物乳杆菌活化及接种量确定：将植物乳杆菌ATCC8014从斜面培养基中接种五环至50mLMRS培养基，在37℃下静置培养9～12h，活化后的菌液移取10mL于50mLMRS培养基再次培养9～12h，将培养后的菌液按107稀释三份，分别用移液枪移取100uL的稀释液加入到3个灭菌的培养皿中，轻轻倒入50℃的MRS固体培养基中并摇匀，待培养基凝固后，置于37℃的恒温条件下培养24h，按照1×108cells/mL确定植物乳杆菌的接种量。
(4)按照步骤(2)和步骤(3)确定好的接种量，将酿酒酵母菌和植物乳杆菌同时接种至步骤(1)中，添加了不同浓度2-苯乙醇的YPD培养基和等量蒸馏水作为染菌组的YPD培养基中，在28℃、180rmp/min条件下培养9～30h，取样测定乙醇浓度。表2为不同浓度2-苯乙醇对酿酒酵母菌与植物乳杆菌共发酵系统乙醇产量的影响。比较表1和表2中的对照组和染菌组可知，植物乳杆菌污染降低了酿酒酵母菌乙醇产量；当发酵至12～30h，与对照组相比，染菌组的乙醇产量降低了5.1～37.7％。然而2-苯乙醇的添加促进了酿酒酵母菌产生乙醇，降低了植物乳杆菌污染带来的影响。发酵至9h，添加2-苯乙醇的处理组比染菌组高了4.3～18.5％，发酵至12h，添加2-苯乙醇的处理组比染菌组高了5.9～14.3％。
表2不同浓度2-苯乙醇对酿酒酵母菌与植物乳杆菌共发酵系统乙醇产量的影响
图3为实施例3中添加120mg/L的2-苯乙醇对酿酒酵母菌与植物乳杆菌共发酵产生的乙醇浓度变化曲线；从图3中可知，在受到植物乳杆菌污染的酿酒酵母菌发酵体系中添加120mg/L2-苯乙醇依然可以提升乙醇产量，在植物乳杆菌快速生长的对数期(发酵至12h)，添加120mg/L 2-苯乙醇的处理组的乙醇浓度甚至可以恢复到与酿酒酵母菌单独发酵的水平相当，比染菌组提升了14.3％。
实施例4
植物乳杆菌在不同接种量的条件下，添加2-苯乙醇对酿酒酵母菌产乙醇的影响。
(1)培养基的准备：配制3340mL的液体YPD培养基，分装180mL至18个250mL的锥形瓶中，其中9瓶加入2-苯乙醇使其终浓度为120mg/L，另外9瓶加入等量的蒸馏水分别作为染菌组。剩余的100mL液体YPD培养基平均分配至2个250mL锥形瓶中作为活化培养基并计算接种量。配制300mL的液体MRS培养基，平均分配100mL至2个250mL锥形瓶中作为活化培养基并计算接种量，剩余200mL的液体MRS培养基加入2g琼脂粉，制成固体培养基。所有培养基在115℃下灭菌20min。
(2)酿酒酵母菌活化及接种量确定：将酿酒酵母菌GIM2.188从斜面培养基中接种两环至50mLYPD培养基，在28℃、180rmp/min条件下培养活化9～12h，活化后的菌液移取1mL于50mLYPD培养基再次培养9～12h，移取1mL培养后的菌液用无菌水稀释20倍，用滴管吸取少许稀释菌液滴加至盖有盖玻片的血细胞计数板上，在显微镜下对规定的视野进行计数，按1×105cells/mL～4×105cells/mL确定酿酒酵母菌的接种量。
(3)植物乳杆菌活化及接种量确定：将植物乳杆菌ATCC8014从斜面培养基中接种五环至50mLMRS培养基，在37℃下静置培养9～12h，活化后的菌液移取10mL于50mLMRS培养基再次培养9～12h，将培养后的菌液按107稀释三份，分别用移液枪移取100uL的稀释液加入到三个灭菌的培养皿中，轻轻倒入50℃的MRS固体培养基中并摇匀，待培养基凝固后，置于37℃的恒温条件下培养24h，分别按照1×106cells/mL、1×107cells/mL、1×108cells/mL确定植物乳杆菌的接种量。
(4)按照步骤(2)-(3)确定的接种量，将酿酒酵母菌和植物乳杆菌同时接种至步骤(1)中添加120mg/L 2-苯乙醇的YPD培养基和等量蒸馏水作为染菌组的YPD培养基中，在28℃、180rmp/min条件下培养12h，取样测定乙醇浓度。表3为2-苯乙醇在不同植物乳杆菌接种量条件下对酿酒酵母菌乙醇产量的影响。从表3中可知，植物乳杆菌接种量越大，酿酒酵母菌乙醇发酵受到的污染越严重，乙醇产量越低。而在不同接种量的情况下，添加120mg/L2-苯乙醇对乙醇产量均有促进作用，植物乳杆菌接种量越低，这种促进作用越明显。
表32-苯乙醇在不同植物乳杆菌接种量条件下对酿酒酵母菌乙醇产量的影响
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合和简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种利用群体感应促进酿酒酵母提高乙醇产量并降低染菌危害的方法，其特征在于，该方法是将酿酒酵母菌GIM2.188按照(1～4)×105cells/mL的接种量接种至含有2-苯乙醇的YPD培养基中，在28℃、180rmp/min条件下发酵培养9～12h；或者将酿酒酵母菌和植物乳杆菌分别按照(1～4)×105cells/mL和1×106～1×108cells/mL的接种量接种至含有2-苯乙醇的YPD培养基中，所述2-苯乙醇的浓度均为30～120mg/L，在28℃、180rmp/min条件下发酵培养9～30h，实现提高乙醇产量并降低染菌危害。
2.根据权利要求1所述的利用群体感应促进酿酒酵母提高乙醇产量并降低染菌危害的方法，其特征在于，所述酿酒酵母菌GIM2.188的接种量是将酿酒酵母菌GIM2.188接种至YPD培养基中，在28℃、180rmp/min条件下培养9～12h活化，活化后的菌种再次接种至YPD培养基中培养9～12h，通过血细胞计数板按照(1～4)×105cells/mL确定。
3.根据权利要求1所述的利用群体感应促进酿酒酵母提高乙醇产量并降低染菌危害的方法，其特征在于，所述植物乳杆菌的接种量是将植物乳杆菌ATCC8014接种至MRS培养基中，在37℃恒温培养箱中静置活化培养9～12h，活化后的菌种再次接种至MRS培养基中培养9～12h，通过稀释涂布法按照1×106～1×108cells/mL确定。
4.根据权利要求1所述的利用群体感应促进酿酒酵母提高乙醇产量并降低染菌特指危害的方法，其特征在于，所述染菌危害中的菌类为乳杆菌属。
5.根据权利要求4所述的利用群体感应促进酿酒酵母提高乙醇产量并降低染菌危害的方法，其特征在于，所述乳杆菌属为植物乳杆菌ACCC 8014、植物乳杆菌ACCC 11095、嗜酸乳杆菌GDMCC 1.731、短乳杆菌GDMCC 1.773、植物乳杆菌GDMCC 1.2868、干酪乳杆菌GDMCC1.2885、嗜酸乳杆菌GDMCC1.1807。
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| CN107022499A (zh) * | 2017-05-04 | 2017-08-08 | 北京化工大学 | 调控酿酒酵母社会行为提高生物乙醇发酵速率效率的方法 |
| CN112646736A (zh) * | 2020-12-15 | 2021-04-13 | 北京化工大学 | 生物乙醇发酵中植物乳杆菌提高酿酒酵母乙醇耐受力的方法 |
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