CN105969676B - 一种调控皮状丝孢酵母b3发酵形态的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种调控皮状丝孢酵母B3发酵形态的方法，属于生物工程领域，所涉及的菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.M 2010076，已在专利ZL201010210264.1中公开。本发明针对所述菌株的特点确定影响其细胞形态转换的关键因子为氮源浓度及培养基pH。将酵母型或菌丝型的细胞接种到发酵培养基中，通过控制氮源浓度及培养基pH，可稳定调控其发酵形态。碱性环境，低氮源浓度；呈菌丝型生长的发酵工艺是：酸性环境，高氮源浓度。本发明的优点在于可使发酵过程中细胞形态均一，为皮状丝孢酵母B3形态代谢工程研究提供理论依据。本发明设计的促使菌体呈酵母型生长的发酵方法工艺简单，能为皮状丝孢酵母B3高密度发酵产微生物油脂降低生产成本。

Description

一种调控皮状丝孢酵母B3发酵形态的方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵形态调控，属于生物工程领域。更具体地，即一株产微生物油脂菌株——皮状丝孢酵母B3的发酵形态调控方法。
背景技术
菌体发酵形态调控作为微生物发酵调控的重要内容，对于提高真菌在工业发酵中的生产水平具有重要作用，受到高度重视。以菌丝型生长的真菌会形成分散菌丝体(Dispersed mycelium)、球状菌丝体(Pellet)和团簇状菌丝体(Clump or Flock)等三种集结形态，不管哪种形态，都会对发酵液的流体学性质、营养物质摄取和氧气传递带来影响。随着细胞菌丝的增多，真菌细胞间更容易发生结团现象，从而使发酵液的粘度不断增加，进一步阻碍细胞对营养物质的摄取和氧气的传递，最终影响菌体的生长和产物的生成。为此，研究人员根据真菌生长的特性，通过优化培养基的成分以及组成来控制丝状真菌形态。如Christiansen等研究了不同葡萄糖糖浓度下黑曲霉(Aspergillus niger)菌丝体的生长情况，发现在不同糖浓度下，菌丝体的分支情况会有所区别。Liao等则全面考察了接种孢子浓度，葡萄糖、尿素、磷酸盐、金属离子的浓度，发酵体系pH以及微粒子添加对米根霉(Rhizopus oryzae)生长形态的影响及其变化规律。
近年来，随着化石燃料的益枯竭和人们环保意识的增强，利用生物技术开发和生产可持续、绿色环保的生物燃料正成为替代能源研究的一个重要方向，利用微生物生产油脂也是近年来的研究重点之一。皮状丝孢酵母具有油脂含量高，生长速度快、可利用木质纤维素等优点，在利用廉价的工农业废弃原料进行发酵生产方面具有优势，越来越受到人们的重视。迄今，皮状丝孢酵母已成为一个重要的微生物油脂生产候选菌种。皮状丝孢酵母归类为二型态真菌，可呈酵母型和菌丝型两种形态，但正常情况下，其在发酵过程中是以丝状生长为主。随着细胞密度的上升，菌丝会发生结团，造成发酵液的流体学性质发生改变(粘度上升)，大大影响了营养物质和氧气的传递，从而进一步对菌体的生长起到阻碍作用，无法进行高密度培养，使得最终油脂产量不高。外界环境条件是影响二型态真菌形态转换的重要因素之一，例如碳氮源、温度、溶氧和pH值等。但有关调控皮状丝孢酵母发酵形态的具体环境因素及工艺却未有报道。本发明所述的皮状丝孢酵母B3发酵形态的调控工艺，可稳定控制其发酵形态，对研究皮状丝孢酵形态代谢具有重要的意义，为其高密度发酵产微生物油脂奠定基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种调控皮状丝孢酵母B3发酵形态的方法，为皮状丝孢酵母B3形态代谢研究和高密度发酵产微生物油脂奠定基础。
本发明提供了皮状丝孢酵母B3发酵形态的调控方法，所述皮状丝孢酵母B3保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.M 2010076；
本发明所述的调控皮状丝孢酵母B3发酵形态的方法，具体步骤如下：
1.皮状丝孢酵母B3所使用的培养基：
(1)固体培养基
葡萄糖：20g/L；酵母提取物：10g/L；琼脂：20g/L；pH自然。
(2)种子培养基
葡萄糖：40g/L；酵母提取物：3.0g/L；KH2PO4：0.75g/L；CaCl2·2H2O：0.4g/L；MgSO4·7H2O：0.4g/L；pH＝6.0。
(3)发酵培养基
葡萄糖：40g/L；KH2PO4:0.75g/L；CaCl2·2H2O:0.4g/L；MgSO4·7H2O:0.4g/L；以酵母提取物、蛋白胨、硫酸铵、尿素作为氮源，用柠磷酸氢二钠-柠檬酸或甘氨酸-氢氧化钠缓冲液进行调配初始pH值。
2.皮状丝孢酵母B3呈酵母型的发酵方法：
(1)将保存在固体培养基上的产微生物油脂皮状丝孢酵母B3的菌种接入种子培养基中培养48-60h，以5％-10％的接种量接入发酵培养基；摇瓶培养的温度为25-30℃，摇床转速为180-200r/min，pH保持在7.0-9.0，氮源浓度保持在0-1.0g/L以下或者0.1～1.0g/L；
(2)将步骤(1)中培养48h的菌体放置显微镜下观察并拍照，所得照片运用图像定量分析(QIA)软件进行分析，计算酵母细胞所占的百分率：[酵母型细胞数/(酵母型细胞数+菌丝型细胞数)]×100％，即：[Y/(Y+M)]×100％。
3.皮状丝孢酵母B3呈菌丝型的发酵方法：
(1)将保存在固体培养基上的产微生物油脂皮状丝孢酵母B3的菌种接入种子培养基中培养48-60h，以体积分数5％-10％的接种量接入发酵培养基；摇瓶培养的温度为25-30℃，摇床转速为180-200r/min，pH保持在4.0-6.0，氮源浓度保持在5.0-10.0g/L。
(2)将步骤(1)中培养48h的菌体放置显微镜下观察并拍照，所得照片运用图像定量分析(QIA)软件进行分析，计算菌丝型细胞所占的百分率：[菌丝型细胞数/(酵母型细胞数+菌丝型细胞数)]×100％，即：[M/(Y+M)]×100％。
有益效果：本发明的调控皮状丝孢酵母B3发酵形态的方法确立了影响皮状丝孢酵母B3形态的关键因素：氮源浓度和培养基的pH。采用本发明所述的方法可稳定控制皮状丝孢酵母B3发酵过程中的细胞形态，这对皮状丝孢酵母的形态代谢工程研究具有重要意义。
另外，采用本发明所设计的促使细胞呈酵母型的发酵方法可使菌体在发酵过程中始终呈酵母型，避免了因菌丝结团造成的发酵液粘度上升，这为皮状丝孢酵母B3高密度发酵产微生物油脂奠定基础。
附图说明
图1是pH为7.0时，不同氮源低浓度条件下细胞的形态；
图2是pH为8.0时，不同氮源低浓度条件下细胞的形态；
图3是pH为9.0时，不同氮源低浓度条件下细胞的形态；
图4是pH为4.0时，不同氮源高浓度条件下细胞的形态；
图5是pH为5.0时，不同氮源高浓度条件下细胞的形态；
图6是pH为6.0时，不同氮源高浓度条件下细胞的形态。
具体实施方式：
以下结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1 pH为7.0时，不同氮源低浓度条件对皮状丝孢酵母B3细胞形态的影响
(1)培养基
a.固体培养基
葡萄糖：20g/L；酵母提取物：10g/L；琼脂：20g/L；pH自然。
b.种子培养基
葡萄糖：40g/L；酵母提取物：3g/L；KH2PO4：0.75g/L；CaCl2·2H2O：0.4g/L；MgSO4·7H2O：0.4g/L；pH＝6.0。
c.发酵培养基
葡萄糖:40g/L；KH2PO4:0.75g/L；CaCl2·2H2O:0.4g/L；MgSO4·7H2O:0.4g/L；以酵母提取物、蛋白胨、硫酸铵、尿素作为氮源，浓度设置如下：1g/L、0.5g/L、0.1g/L；初始pH7.0(通过柠磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液进行调配)。
(2)培养方式
甘油管保藏的菌种转接至固体平板培养基，28℃活化48h。种子培养使用250mL三角瓶，装液量50mL，培养温度为28℃，摇床转速200r/min。种子培养48h以5％的接种量接入发酵培养基，装样量50mL/250mL，培养温度为28℃，摇床转速180r/min。培养48h后进行菌体形态观察。
(3)结果显示
pH＝7.0，氮源浓度在1.0g/L以下时，皮状丝孢酵母B3基本都呈酵母型，酵母型菌体比例均在90％以上，结果见表1，图1。
表1碱性环境，低氮源浓度条件下，酵母型细胞的比例
Figure BDA0001040375130000061
实施例2 pH为8.0时，不同氮源低浓度条件对皮状丝孢酵母B3细胞形态的影响
(1)培养基
a.固体培养基
同实例1
b.种子培养基
同实例1
c.发酵培养基
培养基成分同实例1；初始pH 8.0(通过柠磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液进行调配)
(2)培养方式
同实例1
(3)结果显示：
pH＝8.0，氮源浓度1.0g/L以下时，皮状丝孢酵母B3基本呈酵母型，酵母型菌体比例均在90％以上，结果见表1，图2。
实施例3 pH为9.0时，不同氮源低浓度条件对皮状丝孢酵母B3细胞形态的影响
(1)培养基
a.固体培养基
同实例1
b.种子培养基
同实例1
c.发酵培养基
培养基成分同实例1；初始pH 9.0(通过甘氨酸-氢氧化钠缓冲液进行调配)
(2)培养方式
同实例1
(3)结果显示：
pH＝9.0，氮源浓度在1.0g/L以下时，皮状丝孢酵母B3基本都呈酵母型，酵母型菌体比例均在90％以上，结果见表1，图3。
实施例4 pH为4.0时，不同氮源高浓度条件对皮状丝孢酵母B3菌体形态的影响
(1)培养基
a.固体培养基
同实例1
b.种子培养基
同实例1
c.发酵培养基
葡萄糖：40g/L；KH2PO4:0.75g/L；CaCl2·2H2O:0.4g/L；MgSO4·7H2O:0.4g/L；以酵母提取物、蛋白胨、硫酸铵、尿素作为氮源，浓度设置如下：5.0g/L、7.0g/L、10.0g/L；初始pH 4.0(通过柠磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液进行调配)。
(2)培养方式
同实例1
(3)结果显示：
pH＝4.0，氮源浓度在5.0-10.0g/L时，皮状丝孢酵母B3基本呈菌丝型，且由于培养基环境酸性过强，菌体会产生少量厚垣孢子或形成假菌丝(归为菌丝型)，菌丝型菌体比例可达90％以上，结果见表2，图4。
表2酸性环境，高氮源浓度条件下，菌丝型细胞的比例
Figure BDA0001040375130000091
实施例5 pH为5.0时，不同氮源高浓度条件对皮状丝孢酵母B3菌体形态的影响
(1)培养基
a.固体培养基
同实例1
b.种子培养基
同实例1
c.发酵培养基
同实例4，初始pH 5.0(通过柠磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液进行调配)。(2)培养方式
同实例1
(3)结果显示：
pH＝5.0，氮源浓度在5.0-10.0g/L时，皮状丝孢酵母B3基本呈细长菌丝型，菌丝型菌体比例高达90％以上，结果见表2，图5。
实施例6 pH为6.0时，不同氮源高浓度条件对皮状丝孢酵母B3菌体形态的影响
(1)培养基
a.固体培养基
同实例1
b.种子培养基
同实例1
c.发酵培养基
同实例4，初始pH 6.0(通过柠磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液进行调配)。(2)培养方式
同实例1
(3)结果显示：
pH＝6.0，氮源浓度在5.0-10.0g/L时，皮状丝孢酵母B3也基本呈菌丝型，菌丝型细胞比例要比同等条件下pH为5.0时略低一点，但比例也在90％左右，结果见表2，图6。

Claims (5)

1.一种调控皮状丝孢酵母B3发酵形态的方法，皮状丝孢酵母B3呈酵母型生长的发酵工艺为碱性环境，pH 7.0~9.0，低氮源浓度0.1~1.0 g/L；皮状丝孢酵母B3呈菌丝型生长的发酵工艺为酸性环境，pH 3.0~6.0，高氮源浓度5.0~10.0 g/L；所述菌株皮状丝孢酵母B3保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC NO. M 2010076。
2.按照权利要求1所述的调控皮状丝孢酵母B3发酵形态的方法，其特征在于：所述的氮源为酵母提取物、蛋白胨、尿素或(NH4)2SO4中的一种。
3.按照权利要求1所述的调控皮状丝孢酵母B3发酵形态的方法，其特征在于：通过柠磷酸氢二钠-柠檬酸或甘氨酸-氢氧化钠缓冲液调节培养基的初始pH值。
4.按照权利要求1所述的调控皮状丝孢酵母B3发酵形态的方法，其特征在于：将保存在固体培养基上的皮状丝孢酵母B3的菌种接入种子培养基中培养 48~60 h，以5％~10％的接种量接入发酵培养基；摇瓶培养的温度为25~30℃，摇床转速为180~200 r/min，氮源浓度保持在0.1~1.0 g/L，pH保持在7.0~9.0，细胞呈酵母型生长。
5.按照权利要求1所述的调控皮状丝孢酵母B3发酵形态的方法，其特征在于：将保存在固体培养基上的皮状丝孢酵母B3的菌种接入种子培养基中培养 48~60h，以5％~10％的接种量接入发酵培养基；摇瓶培养的温度为25~30℃，摇床转速为180~200 r/min，氮源浓度保持在5.0 g/L~10.0 g/L，pH保持在3.0~6.0，细胞呈菌丝型生长。
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