CN115287299A - 一种重组溶瘤痘苗病毒的构建方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开的是本发明提供了一种重组溶瘤痘苗病毒的构建方法及其应用，首先在分子水平以pCB质粒为载体，通过酶切连接的方法将IL‑7基因、CCL19基因和IL‑7‑F2A‑CCL19基因连接到载体质粒上，然后将重组质粒与野生痘苗病毒在293A细胞内同源重组转染得到表达IL‑7和CCL19的重组溶瘤痘苗病毒药物，在细胞水平上增强了痘苗病毒对肿瘤细胞的杀伤作用，IL‑7和CCL19的表达一定程度上引起了细胞水平一些炎症因子的表达升高，在细胞水平显示出对抗肿瘤免疫的诱导作用。

Description

一种重组溶瘤痘苗病毒的构建方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种重组溶瘤痘苗病毒的构建方法及其应用，更具体一点说，涉及一种表达IL-7和CCL19的重组溶瘤痘苗病毒的构建法及其应用，属于生物技术和基因治疗领域。
背景技术
肝癌是危害人类健康的一大“杀手”。最新发布的《2020全球癌症报告》显示，肝癌的发病率在所有癌症中位居第八位，死亡率更是达到了第四位。现有的癌症治疗方法在治疗肝癌后，容易发生复发和转移，所以急需寻找新的治疗肝癌的方法。溶瘤病毒疗法可以靶向性的选择肿瘤细胞且不会引发癌症患者严重不良反应，在众多溶瘤病毒载体中，溶瘤痘苗病毒具有独特的优势。
溶瘤病毒疗法作为一种新型癌症治疗策略，在肿瘤治疗方面取得一些令人鼓舞的成果，目前已有一些溶瘤病毒正在进行I期和II期临床试验。近年来，溶瘤腺病毒已成为溶瘤病毒疗法中一种有效的抗肿瘤药物，因其在恶性肿瘤中具有选择性复制能力，能靶向裂解肿瘤细胞，而对正常细胞不会引起明显的杀伤作用。痘苗病毒是一种双链的DNA病毒，它能够在细胞中快速复制并裂解细胞，但是在病毒进入细胞到产生子代病毒的整个感染过程中，痘苗病毒始终只存在于细胞质中[1],所以病毒DNA不会整合到宿主细胞基因组中,也就不会诱发肿瘤。痘苗病毒还具有较大的基因组，可以允许插入至少25kb的外源基因，这一特点为构建携带不同功能基因的痘苗病毒提供了便利。
2001年，刘新垣院士首次提出了癌症靶向基因病毒治疗(Cancer targeted gene-virus therapy,CTGVT)策略，在溶瘤腺病毒的DNA上插入抑癌基因，利用溶瘤腺病毒的复制性实现了抑癌基因在癌症治疗中的稳定表达。针对癌症的靶向双基因病毒治疗再次成为有前景的抗肿瘤治疗策略。因此，将双重治疗基因的选择性重组对于实现癌症靶向基因病毒治疗至关重要。
发明内容
本发明的目的在于提供具有能够解决现有的用于治疗肝癌的药物疗效欠佳问题等技术特点的一种重组溶瘤痘苗病毒的构建方法及其应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明一种重组溶瘤痘苗病毒的构建方法，包括如下步骤：
1)构建TK(胸苷激酶)区缺失的pCB质粒；
2)以pCB质粒为载体，通过酶切连接的方法将目的基因连接到载体质粒上以构建pCB-IL-7质粒、pCB-CCL19质粒和pCB-IL-7-F2A-CCL19质粒；目的基因包括IL-7基因、CCL19基因和IL-7-F2A-CCL19基因；
3)通过脂质体转染，将步骤2)所得的pCB-IL-7质粒、pCB-CCL19质粒和pCB-IL-7-F2A-CCL19质粒分别转至293A细胞，获得3种重组溶瘤痘苗病毒。
优选的，1)首先应用高保真PCR方法扩增IL-7基因片段、CCL19基因片段和IL-7-F2A-CCL19基因片段；
2)然后将3种基因片段通过限制酶酶切和连接酶连接的方法连接到pCB载体质粒中，得到pCB-hIL-7质粒、pCB-hCCL19质粒和pCB-IL-7-F2A-CCL19质粒；
3)将3种重组质粒和野生病毒通过脂质体转染的方法在293A细胞内同源重组包装病毒；
4)步骤3)所属野生病毒为经过改造TK缺失的WR株；
5)包装后经过药物筛选(黄嘌呤、次黄嘌呤和霉酚酸进行至少3次药筛，霉酚酸可以阻断野生病毒鸟嘌呤的合成抑制野生病毒的复制，重组病毒在gpt基因、黄嘌呤和次黄嘌呤存在的条件下可以替代鸟嘌呤合成途径)；
6)挑空斑筛选，药筛后的病毒梯度稀释后铺低熔点胶，出现病毒空板后挑取空板提基因组，PCR鉴定是否含有野生病毒基因和目的基因，鉴定正确后扩增病毒，获得3种重组溶瘤痘苗病毒，分别未溶瘤痘苗病毒vv-IL-7、vv-CCL19、vv-IL-7-F2A-CCL19。
优选的，利用EcoRⅠ和BglⅡ双酶切IL-7和pCB质粒，并将酶切后的大小产物利用连接酶连接，得到pCB-IL-7重组质粒；利用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切CCL19和pCB质粒，并将酶切后的大小产物利用连接酶连接，得到pCB-CCL19重组质粒；利用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切IL-7-F2A-CCL19和pCB质粒，并将酶切后的大小产物利用连接酶连接，得到pCB-IL-7-F2A-CCL19重组质粒。
优选的，IL-7的引物如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示；CCL19引物如SEQ IDNO.3或SEQ ID NO.4所示；IL-7-F2A-CCL19引物如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.4所示，IL-7基因序列如SEQ ID NO.5所示；CCL19基因序列如SEQ ID NO.6所示；IL-7-F2A-CCL19基因序列如SEQ ID NO.7所示。
优选的，药物筛选为：
用含有1×黄嘌呤、次黄嘌呤、霉酚酸3种药物的培养基筛选重组病毒，将构建得到的溶瘤痘苗病毒vv-IL-7、vv-CCL19、vv-IL-7-F2A-CCL19感染293A细胞2小时后，用含有1×黄嘌呤、次黄嘌呤、霉酚酸3种药物的培养基培养，带细胞基本病变，收集细胞，-80℃和37℃反复冻融3次，1000rpm离心5mins，此过程重复至少3次。
优选的，鉴定为：对3种重组溶瘤痘苗病毒进行qPCR、westernblot和Elisa检测，检测痘苗病毒感染肿瘤细胞是否表达IL-7基因和CCL19基因。
优选的，具体鉴定方法为：提取病毒液病毒基因组，PCR鉴定是否含有野生病毒基因和目的基因IL-7、CCL19和IL-7-F2A-CCL19，选择鉴定正确的病毒液作为种子病毒。
优选的，还包括重组溶瘤痘苗病毒的扩增、纯化和保存步骤：利用BSC40细胞扩增重组溶瘤痘苗病毒vv-IL-7、vv-CCL19、vv-IL-7-F2A-CCL19；利用蔗糖梯度离心方法纯化重组溶瘤痘苗病毒；利用TCID50法测定重组溶瘤痘苗病毒vv-IL-7、vv-CCL19、vv-IL-7-F2A-CCL19的滴度，最后分装纯化病毒，保存于-80℃冰箱。
本发明一种重组溶瘤痘苗病毒用在制备治疗消化道恶性肿瘤药物中的应用。
本发明一种抑制肝癌细胞增殖的药物，由溶瘤痘苗病毒vv-IL-7、vv-CCL19、vv-IL-7-F2A-CCL19为原料制成。
有益效果：本发明采用肿瘤靶向治疗策略，提高了腺病毒载体的靶向性和安全性；本发明采用痘苗病毒相关基因缺失的方式，确保腺病毒的肿瘤内特异性复制，大大增强溶瘤痘苗病毒消灭肿瘤的效果；本发明将基因治疗和病毒治疗相结合，制备了可高效表达IL-7和CCL19的溶瘤腺病毒，相比于单一的基因疗法或病毒疗法，显著增强了杀瘤效果；本发明成功构建了表达IL-7和CCL19的新型溶瘤腺病毒，实现了其对实体肿瘤的靶向性和抗肿瘤作用；完善了病毒筛选、鉴定、扩增和病毒滴度控制体系，为进一步的产业化奠定基础，使本发明具有良好的产业化前景；利用IL-7和CCL19双重治疗基因改造痘苗病毒，实现了基因治疗和病毒治疗相结合的目的，将显著提高溶瘤痘苗病毒抗肝癌的疗效。
附图说明
图1为新型溶瘤痘苗病毒vv-IL-7的构建图。
图2为新型溶瘤痘苗病毒vv-CCL19的构建图。
图3为新型溶瘤痘苗病毒vv-IL-7-F2A-CCL19的构建图。
图4为qPCR方法检测病毒感染MHCC-97H细胞和Hepa1-6细胞后IL-7的表达图。
图5为qPCR方法检测病毒感染MHCC-97H细胞和Hepa1-6细胞后CCL19的表达图。
图6为Elisa方法检测病毒感染MHCC-97H细胞后细胞上清中IL-7的表达图。
图7为Elisa方法检测病毒感染Hepa1-6细胞后细胞上清中IL-7的表达图。
图8为MTT法检测肝癌细胞MHCC-97H 24h后存活率分析图。
图9为MTT法检测肝癌细胞MHCC-97H 48h后存活率分析图。
图10为MTT法检测肝癌细胞MHCC-97H 72h后存活率分析图。
图11为MTT法检测肝癌细胞MHCC-97H 96h后存活率分析图。
图12为MTT法检测小鼠肝癌细胞Hepa1-6 24h存活率分析图。
图13为MTT法检测小鼠肝癌细胞Hepa1-6 48h存活率分析图。
图14为MTT法检测小鼠肝癌细胞Hepa1-6 72h存活率分析图。
图15为MTT法检测小鼠肝癌细胞Hepa1-6 96h存活率分析图。
具体实施方式
以下结合说明书附图，对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于以下实施例。
本发明中IL-7作为一种趋化因子，在T细胞和B细胞的发育和成熟中发挥关键作用，在体内它可以募集和激活淋巴细胞进而引起免疫反应，CCL19主要作用是招募和影响巨噬细胞、淋巴细胞、树突状细胞等免疫细胞，还可以影响肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和血管生成等活动。值得注意的是，过表达IL-7或CCL19不仅能够直接作用于肿瘤细胞，抑制肿瘤细胞的生长和增殖，而且还可以通过向肿瘤组织招募免疫细胞，增强抗肿瘤免疫作用。因此证实IL-7和CCL19可能是肿瘤靶向病毒治疗和抗肿瘤免疫治疗中合适的双重治疗基因。
IL-7和CCL19属于趋化因子家族成员，可以增强淋巴细胞的增殖和肿瘤浸润，增加记忆性T细胞数量和促进细胞存活，提高抗肿瘤免疫功能。同时表达IL-7和CCL19的嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞能促进免疫细胞在肿瘤内的浸润和CAR-T细胞存活，并且产生了对肿瘤的记忆应答，能有效发挥抗肿瘤活性，表明IL-7和CCL19存在着抗肿瘤的协同效应，具有较好的临床价值。
本发明通过构建新型溶瘤痘苗病毒vv-IL-7、vv-CCL19、vv-IL-7-F2A-CCL19，双基因病毒vv-IL-7-F2A-CCL19相较于单基因病毒治疗效果更加显著。而按照公开发表于《中华肿瘤杂志》的肿瘤靶向双基因-病毒治疗策略所述，并不是同时表达两种目的基因一定会产生好的效果。因此本发明获得了意想不到的效果，而且本发明涉及的3种新型溶瘤痘苗病毒还能够抑制裸鼠肝癌移植瘤的生长和延长小鼠生存期。
下文将结合详细附图1-15具体描述本发明具体实施例。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特征或技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互结合从而达到更好的技术效果。
实施例1
表达IL-7和CCL19的溶瘤痘苗病毒的构建方法，包括如下步骤：
(1)高保真PCR扩增IL-7基因、CCL19基因和IL-7-F2A-CCL19基因，PC R体系为：
Figure BDA0003441313980000071
(2)构建pCB-IL-7、pCB-CCL19、pCB-IL-7-F2A-CCL19重组质粒：
首先利用EcoRⅠ和BglⅡ对IL-7和pCB进行双酶切，利用EcoRⅠ和XbaⅠ对CCL19和pCB进行双酶切，利用EcoRⅠ和XbaⅠ对IL-7-F2A-CCL19和pCB进行双酶切，酶切体系为：
Figure BDA0003441313980000081
37℃水浴加热酶切过夜。然后将双酶切后的大小产物连接，连接体系为：
Figure BDA0003441313980000082
根据公式V小/V大＝M小/M大×10×C大/C小计算上述体系中x/y的体积。
在16℃条件下连接过夜，将连接产物经转化后，挑取单克隆至含Amp的LB培养基，37℃，220rpm摇床培养过夜，提取质粒并酶切鉴定，得到正确的pCB-IL-7、pCB-CCL19、pCB-IL-7-F2A-CCL19。
(3)溶瘤痘苗病毒vv-IL-7、vv-CCL19、vv-IL-7-F2A-CCL19的构建：
取对数生长期的293A细胞3×105/ml铺6孔板，细胞贴壁后利用野生痘苗病毒感染细胞2小时，然后用脂质体转染的方法使重组质粒和野生痘苗病毒在293A细胞内发生同源重组，待细胞基本病变(当细胞间出现大量空隙且呈半贴壁状态时，属于细胞基本病变)收病毒。在-80℃和37℃反复冻融3次，1000rpm离心，5mins，得到vv-IL-7、vv-CCL19、vv-IL-7-F2A-CCL19(包含有野生病毒)。
(4)溶瘤痘苗病毒vv-IL-7、vv-CCL19、vv-IL-7-F2A-CCL19的筛选和鉴定：
①药物筛选：用含有1×黄嘌呤、次黄嘌呤、霉酚酸3种药物的培养基筛选重组病毒，野生病毒因为TK区缺失鸟嘌呤合成途径受阻，病毒无法正常复制，重组病毒在gpt基因、黄嘌呤、次黄嘌呤、霉酚酸存在时可以替代鸟嘌呤合成途径，病毒正常复制。上述构建得到的溶瘤痘苗病毒vv-IL-7、vv-CCL19、vv-IL-7-F2A-CCL19感染293A细胞2小时后，用含有1×黄嘌呤、次黄嘌呤、霉酚酸3种药物的培养基培养，带细胞基本病变，收集细胞，在-80℃和37℃条件下反复冻融3次，1000rpm离心5mins，收集上清。此过程重复至少3次。
②挑空斑筛选：药物筛选后的病毒液感染细胞后铺低熔点胶，细胞出现病变空斑时挑空斑培养，继续感染细胞，细胞基本病变后收集病毒液。
③重组病毒鉴定：提取病毒液病毒基因组，PCR鉴定是否含有野生病毒基因和目的基因IL-7、CCL19和IL-7-F2A-CCL19，选择鉴定正确的病毒液作为种子病毒。
本发明制备的溶瘤痘苗病毒vv-IL-7、vv-CCL19、vv-IL-7-F2A-CCL19的扩增与保存方法：
取状态良好的BSC40细胞大量传代培养，向2-3×106/dish细胞中分别加入50μl溶瘤痘苗病毒vv-IL-7、vv-CCL19、vv-IL-7-F2A-CCL19，放入37℃细胞培养箱培养48小时左右，待细胞基本病变，收集病变细胞至离心管，-80℃和37℃反复冻融3次，使病毒颗粒完全释放；蔗糖梯度离心法纯化溶瘤痘苗病毒；TCID50法测溶瘤痘苗病毒滴度，所得测定结果为vv-IL-7:5.7×109pfu/ml，vv-CCL19:4.35×109pfu/ml，vv-IL-7-F2A-CCL19:3.65×109pfu/ml。最后分装纯化病毒保存于-80℃。
实施例2
qPCR方法检测病毒感染MHCC-97H细胞和后IL-7和CCL19的表达情况(如图4-5所示)：
肝癌细胞MHCC-97在含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基种培养，培养条件为37℃、5％CO2的饱和湿度培养箱，取对数生长期的细胞4×105/ml铺于6孔板，细胞贴壁后设置control组、vv-kz组、vv-IL-7组、vv-CCL19组和vv-IL-7-F2A-CCL19组，每组加入5MOI的病毒，control组加入等体积的PBS。病毒感染细胞30-36小时后弃上清，裂解细胞，提取细胞总RNA(GENERAY动物总RNA快速提取试剂盒CK3016)，逆转录(CWBIO逆转录试剂盒CW2569M)，实施实时荧光定量PCR，每组设置3个复孔，取Ct值计算IL-7和CCL19的相对表达量，应用prism-graphpad软件绘图，结果如图1-3所示重组溶瘤痘苗病毒感染肝癌细胞后IL-7和CCL19显著高表达。
实施例3
子代复制实验检测病毒在MHCC-97H细胞和Hepa1-6细胞中复制能力：
取对数生长期的细胞2×104/ml铺于24孔板，细胞贴壁后设置control组、vv-kz组、vv-IL-7组、vv-CCL19组和vv-IL-7-F2A-CCL19组，每组加入5MOI的病毒，control组加入等体积的PBS，每组设置3个重复孔，病毒感染细胞48小时后收集病毒上清和细胞，-80℃和37℃反复冻融3次，1000rpm离心5mins，取上清液用TCID50法测病毒滴度。检测结果以1×105设置为1，应用prism-graphpad软件绘图，结果如图6-7所示，表达IL-7和CCL19的新型溶瘤痘苗病毒肝癌肿瘤细胞中能够正常复制。
实施例4
MTT法检测肝癌细胞MHCC-97H存活率分析(如图8-11)：
取对数生长期的MHCC-97H细胞4×104/ml铺于96孔板，设置空白对照control组(加入PBS)、空载对照vv-kz组(加入空载病毒vv-kz)、对照vv-IL-7组(加入仅表达IL-7的vv-IL-7病毒)、对照vv-CCL19组(加入仅表达CCL19的vv-CCL19病毒)和实验组vv-IL-7-F2A-CCL19组，每组均设置3个复孔；待细胞贴壁后分别加入vv-kz(0.5MOI、1MOI、2MOI、5MOI、10MOI)，vv-IL-7(0.5MOI、1MOI、2MOI、5MOI、10MOI)，vv-CCL19(0.5MOI、1MOI、2MOI、5MOI、10MOI)，vv-IL-7-F2A-CCL19(0.5MOI、1MOI、2MOI、5MOI、10MOI)。分别在持续24h、48h、72h和96h4个时间段取一块96孔板，加入20μlMTT溶液，37℃细胞培养箱继续培养4个小时后，加入150μlDMSO，振荡摇匀10mins后将96孔板置于酶标仪中，测量490nm波长处的吸光度值(OD值)，上述实验重复3次。根据各孔的吸光度值求得实验组细胞的存活率，计算公式为：细胞存活率(％)＝实验组OD值/对照组OD值×100％。结果如图4所示，随时间和药物浓度的增加，病毒药物对MHCC-97H细胞的存活有显著抑制作用。
实施例5
MTT法检测小鼠肝癌细胞Hepa1-6存活率分析(如图12-15所示)：
取对数生长期的Hepa1-6细胞4×104/ml铺于96孔板，设置空白对照control组(加入PBS)、空载对照vv-kz组(加入空载病毒vv-kz)、对照vv-IL-7组(加入仅表达IL-7的vv-IL-7病毒)、对照vv-CCL19组(加入仅表达CCL19的vv-CCL19病毒)和实验组vv-IL-7-F2A-CCL19组，每组均设置3个复孔；待细胞贴壁后分别加入vv-kz(0.5MOI、1MOI、2MOI、5MOI、10MOI)，vv-IL-7(0.5MOI、1MOI、2MOI、5MOI、10MOI)，vv-CCL19(0.5MOI、1MOI、2MOI、5MOI、10MOI)，vv-IL-7-F2A-CCL19(0.5MOI、1MOI、2MOI、5MOI、10MOI)。分别在持续24h、48h、72h和96h4个时间段取一块96孔板，加入20μlMTT溶液，37℃细胞培养箱继续培养4个小时后，加入150μlDMSO，振荡摇匀10mins后将96孔板置于酶标仪中，测量490nm波长处的吸光度值(OD值)，上述实验重复3次。根据各孔的吸光度值求得实验组细胞的存活率，计算公式为：细胞存活率(％)＝实验组OD值/对照组OD值×100％。结果如图4所示，随时间和药物浓度的增加，病毒药物对Hepa1-6细胞的存活有显著抑制作用。
SEQ NO.1
GacagatctGCCACCatgttccatgtttcttttaggtatatc。
SEQ NO.2
GGGAATTCtcaAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTA。
SEQ NO.3
GCTCTAGAGCCACCatggccctgctact。
SEQ NO.4
GGAATTCttaATGGTGATGGTGATGATGactgctg。
SEQ NO.5
AATTCtcaAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAgtgttctttagtgcccatcaaaattttattccaacaagtttttatctcttgtaatagtctctttaggaaacacaagtcattcagttttttctgttcctttaaagatttattttcttccaaactctttgttggttgggcttcacccagggcagctggttttcttcctttaacctggccagtgcagttcaacagtattgttgtgccttctgaaacttttaataagtggagatcaaaatcaccagtgctattcattttaagaaattgcctcaacttgcgagcagcacggaataaaaacataccttccttattagcatcacagatatgtcttttaaaaaagttaaattcattattcaggcaattgctaccaatttctttcatgctgtccaataattgatcgatgctgaccattagaacactctcatattgtttgccatctttaccttcaatatcacaatcagatgatgctactggcaacagaacaaggatcaggggaggaagtccaaagatatacctaaaagaaacatggaacatGGTGGCagatc。
SEQ NO.6
TaATGGTGATGGTGATGATGactgctgcggcgcttcatcttggctgaggtcctctgcagtctctggatgatgcgttctacccagggctggtctgggggtgcacagagctggcggcccctcagtgtggtgaacactacagcaggcaccctgcagccatccttgatgagaaggtagtggaagttcctcacgatgtacccagggatgggtttctgggtcacagacaggcagcagtcttcagcatcattggtgccactcagagttggggctggggaagtccagagaaccagcaggctgagggccagtagcagggccat。
SEQ NO.7
TtaATGGTGATGGTGATGATGactgctgcggcgcttcatcttggctgaggtcctctgcagtctctggatgatgcgttctacccagggctggtctgggggtgcacagagctggcggcccctcagtgtggtgaacactacagcaggcaccctgcagccatccttgatgagaaggtagtggaagttcctcacgatgtacccagggatgggtttctgggtcacagacaggcagcagtcttcagcatcattggtgccactcagagttggggctggggaagtccagagaaccagcaggctgagggccagtagcagggccatGGTGGCTGGACCTGGGTTGCTCTCAACATCTCCAGCGAGCTTGAGAAGATCGAAGTTTAGAGTCTGCTTTACTGGAGCCCTCTTAGCTCTAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAgtgttctttagtgcccatcaaaattttattccaacaagtttttatctcttgtaatagtctctttaggaaacacaagtcattcagttttttctgttcctttaaagatttattttcttccaaactctttgttggttgggcttcacccagggcagctggttttcttcctttaacctggccagtgcagttcaacagtattgttgtgccttctgaaacttttaataagtggagatcaaaatcaccagtgctattcattttaagaaattgcctcaacttgcgagcagcacggaataaaaacataccttccttattagcatcacagatatgtcttttaaaaaagttaaattcattattcaggcaattgctaccaatttctttcatgctgtccaataattgatcgatgctgaccattagaacactctcatattgtttgccatctttaccttcaatatcacaatcagatgatgctactggcaacagaacaaggatcaggggaggaagtccaaagatatacctaaaagaaacatggaacat。
最后，需要注意的是，本发明不限于以上实施例，还可以有很多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容中直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
名称：一种重组溶瘤痘苗病毒的构建方法及其应用
第一申请人：浙江理工大学
第一申请人：浙江理工大学绍兴生物医药研究院有限公司
SEQ NO.1
GacagatctGCCACCatgttccatgtttcttttaggtatatc。
SEQ NO.2
GGGAATTCtcaAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTA。
SEQ NO.3
GCTCTAGAGCCACCatggccctgctact。
SEQ NO.4
GGAATTCttaATGGTGATGGTGATGATGactgctg。
SEQ NO.5
AATTCtcaAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAgtgttctttagtgcccatcaaaattttattccaacaagtttttatctcttgtaatagtctctttaggaaacacaagtcattcagttttttctgttcctttaaagatttattttcttccaaactctttgttggttgggcttcacccagggcagctggttttcttcctttaacctggccagtgcagttcaacagtattgttgtgccttctgaaacttttaataagtggagatcaaaatcaccagtgctattcattttaagaaattgcctcaacttgcgagcagcacggaataaaaacataccttccttattagcatcacagatatgtcttttaaaaaagttaaattcattattcaggcaattgctaccaatttctttcatgctgtccaataattgatcgatgctgaccattagaacactctcatattgtttgccatctttaccttcaatatcacaatcagatgatgctactggcaacagaacaaggatcaggggaggaagtccaaagatatacctaaaagaaacatggaacatGGTGGCagatc。
SEQ NO.6
TaATGGTGATGGTGATGATGactgctgcggcgcttcatcttggctgaggtcctctgcagtctctggatgatgcgttctacccagggctggtctgggggtgcacagagctggcggcccctcagtgtggtgaacactacagcaggcaccctgcagccatccttgatgagaaggtagtggaagttcctcacgatgtacccagggatgggtttctgggtcacagacaggcagcagtcttcagcatcattggtgccactcagagttggggctggggaagtccagagaaccagcaggctgagggccagtagcagggccat。
SEQ NO.7
TtaATGGTGATGGTGATGATGactgctgcggcgcttcatcttggctgaggtcctctgcagtctctggatgatgcgttctacccagggctggtctgggggtgcacagagctggcggcccctcagtgtggtgaacactacagcaggcaccctgcagccatccttgatgagaaggtagtggaagttcctcacgatgtacccagggatgggtttctgggtcacagacaggcagcagtcttcagcatcattggtgccactcagagttggggctggggaagtccagagaaccagcaggctgagggccagtagcagggccatGGTGGCTGGACCTGGGTTGCTCTCAACATCTCCAGCGAGCTTGAGAAGATCGAAGTTTAGAGTCTGCTTTACTGGAGCCCTCTTAGCTCTAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAgtgttctttagtgcccatcaaaattttattccaacaagtttttatctcttgtaatagtctctttaggaaacacaagtcattcagttttttctgttcctttaaagatttattttcttccaaactctttgttggttgggcttcacccagggcagctggttttcttcctttaacctggccagtgcagttcaacagtattgttgtgccttctgaaacttttaataagtggagatcaaaatcaccagtgctattcattttaagaaattgcctcaacttgcgagcagcacggaataaaaacataccttccttattagcatcacagatatgtcttttaaaaaagttaaattcattattcaggcaattgctaccaatttctttcatgctgtccaataattgatcgatgctgaccattagaacactctcatattgtttgccatctttaccttcaatatcacaatcagatgatgctactggcaacagaacaaggatcaggggaggaagtccaaagatatacctaaaagaaacatggaacat。

Claims (10)

1.一种重组溶瘤痘苗病毒的构建方法，其特征在于包括如下步骤：
1)构建TK区缺失的pCB质粒；
2)以pCB质粒为载体，通过酶切连接的方法将目的基因连接到载体质粒上以构建pCB-IL-7质粒、pCB-CCL19质粒和pCB-IL-7-F2A-CCL19质粒；目的基因包括IL-7基因、CCL19基因和IL-7-F2A-CCL19基因；
3)通过脂质体转染，将步骤2)所得的pCB-IL-7质粒、pCB-CCL19质粒和pCB-IL-7-F2A-CCL19质粒分别转至293A细胞，获得3种重组溶瘤痘苗病毒。
2.根据权利要求1所述的一种重组溶瘤痘苗病毒的构建方法，其特征在于：
1)首先应用高保真PCR方法扩增IL-7基因片段、CCL19基因片段和IL-7-F2A-CCL19基因片段；
2)然后将3种基因片段通过限制酶酶切和连接酶连接的方法连接到pCB载体质粒中，得到pCB-hIL-7质粒、pCB-hCCL19质粒和pCB-IL-7-F2A-CCL19质粒；
3)将3种重组质粒和野生病毒通过脂质体转染的方法在293A细胞内同源重组包装病毒；
4)步骤3)所属野生病毒为经过改造TK缺失的WR株；
5)包装后经过药物筛选；
6)挑空斑筛选，药筛后的病毒梯度稀释后铺低熔点胶，出现病毒空板后挑取空板提基因组，PCR鉴定是否含有野生病毒基因和目的基因，鉴定正确后扩增病毒，获得3种重组溶瘤痘苗病毒，分别未溶瘤痘苗病毒vv-IL-7、vv-CCL19、vv-IL-7-F2A-CCL19。
3.根据权利要求2所述的一种重组溶瘤痘苗病毒的构建方法，其特征在于：利用EcoRⅠ和BglⅡ双酶切IL-7和pCB质粒，并将酶切后的大小产物利用连接酶连接，得到pCB-IL-7重组质粒；利用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切CCL19和pCB质粒，并将酶切后的大小产物利用连接酶连接，得到pCB-CCL19重组质粒；利用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切IL-7-F2A-CCL19和pCB质粒，并将酶切后的大小产物利用连接酶连接，得到pCB-IL-7-F2A-CCL19重组质粒。
4.根据权利要求1或2或3所述的一种重组溶瘤痘苗病毒的构建方法，其特征在于：IL-7的引物如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示；CCL19引物如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示；IL-7-F2A-CCL19引物如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.4所示，IL-7基因序列如SEQ ID NO.5所示；CCL19基因序列如SEQ ID NO.6所示；IL-7-F2A-CCL19基因序列如SEQ ID NO.7所示。
5.根据权利要求2或3所述的一种重组溶瘤痘苗病毒的构建方法，其特征在于：步骤5)中药物筛选为：
用含有1×黄嘌呤、次黄嘌呤、霉酚酸3种药物的培养基筛选重组病毒，将构建得到的溶瘤痘苗病毒vv-IL-7、vv-CCL19、vv-IL-7-F2A-CCL19感染293A细胞2小时后，用含有1×黄嘌呤、次黄嘌呤、霉酚酸3种药物的培养基培养，带细胞基本病变，收集细胞，-80℃和37℃反复冻融3次，1000rpm离心5mins，此过程重复至少3次。
6.根据权利要求2或3所述的一种重组溶瘤痘苗病毒的构建方法，其特征在于：鉴定为：对3种重组溶瘤痘苗病毒进行qPCR、westernblot和Elisa检测，检测痘苗病毒感染肿瘤细胞是否表达IL-7基因和CCL19基因。
7.根据权利要求6所述的一种重组溶瘤痘苗病毒的构建方法，其特征在于：具体鉴定方法为：提取病毒液病毒基因组，PCR鉴定是否含有野生病毒基因和目的基因IL-7、CCL19和IL-7-F2A-CCL19，选择鉴定正确的病毒液作为种子病毒。
8.根据权利要求2或3或7所述的一种重组溶瘤痘苗病毒的构建方法，其特征在于：还包括重组溶瘤痘苗病毒的扩增、纯化和保存步骤：利用BSC40细胞扩增重组溶瘤痘苗病毒vv-IL-7、vv-CCL19、vv-IL-7-F2A-CCL19；利用蔗糖梯度离心方法纯化重组溶瘤痘苗病毒；利用TCID50法测定重组溶瘤痘苗病毒vv-IL-7、vv-CCL19、vv-IL-7-F2A-CCL19的滴度，最后分装纯化病毒，保存于-80℃冰箱。
9.一种重组溶瘤痘苗病毒用在制备治疗消化道恶性肿瘤药物中的应用。
10.一种抑制肝癌细胞增殖的药物，其特征在于由溶瘤痘苗病毒vv-IL-7、vv-CCL19、vv-IL-7-F2A-CCL19为原料制成。
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