CN115287229A - 一株能够促进扁蓿豆生长和结瘤固氮的根瘤菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种根瘤菌菌剂及其制备和应用，属于微生物技术领域。该发明所采用的根瘤菌GBXD30菌株，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2021669，本发明的根瘤菌菌剂适用于高寒豆科牧草扁蓿豆的种植，能够促进青藏高原重要豆科牧草扁蓿豆植株的生长和结瘤固氮，所述的根瘤菌GBXD‑30菌株接种扁蓿豆具有高效结瘤和固氮能力，可促进扁蓿豆的生长，并进一步提高高寒豆科牧草的品质和生物量，具有广阔的应用前景。

Description

一株能够促进扁蓿豆生长和结瘤固氮的根瘤菌及其应用
技术领域
本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及一株能够促进扁蓿豆生长和结瘤固氮的根瘤菌及其应用。
背景技术
近年来，全球极端天气现象频繁发生，我国部分地区出现极寒天气，导致高寒草地大面积，优质牧草品种比例下降，草地放牧价值降低。随着高寒草地畜牧业的不断发展，国家对天然草地的改良和人工草地的建设力度不断加大，对适应不同地区和环境特点的牧草也提出了一系列新的要求，如抗冷，抗寒，抗盐碱等成为了牧草向环境更极端的区域发展和推广的重要考量指标。因此，一些具有代表性的禾本科植物成为了首选的种质资源。但是，这些治理措施中只重视禾本科牧草的作用，造成了牧草多样性单一化，因此必须重视优质的豆科牧草在高寒草地中发挥的重要作用，从而增加高寒草地牧草多样性和丰富度。
扁蓿豆(Medicago ruthenica)又称为野苜蓿、花苜蓿和扁豆子等，是豆科植物苜蓿属中寿命较长的草本植物。扁蓿豆与其他牧草相比返青较晚，在甘南地区一般于4～5月初返青，春季生长缓慢，进入夏季后扁蓿豆迅速生长，6月中下旬孕蕾，7月初开花，8月底种子基本成熟，整个生长发育其大致在120天左右。扁蓿豆属于抗寒能力极强的豆科牧草，幼苗可在-3～-4℃下正常生长，成株则能够在-45℃的高寒牧草区域安全越冬，同时扁蓿豆也具有较强的耐旱能力，并且可在pH值为8-9的盐碱地正常生长。但是，扁蓿豆在生长过程中的氮素供应问题一直没有解决。
氮素供应匮乏是我国大规模牧草种植和推广中存在的突出问题，传统的化工类氮肥能够为牧草提供氮肥，但是，传统的施肥方式不适用于大面积天然牧草和人工牧草。利用微生物固氮是本领域技术人员解决植物固氮能力差的技术手段，例如，发明专利CN109735468A公开了一株具有广谱结瘤特性的大豆慢生根瘤菌及其应用和以其制备的复合根瘤菌剂；发明专利CN104387150B公开了苜蓿种子根瘤菌种衣剂及其应用；发明专利CN113005059A公开了一株四翅槐中间根瘤菌及其培养方法、黄芪根瘤菌剂及方法和应用。但是，现有的类似农用菌剂产品很难适应扁蓿豆生长的寒冷、干旱和高海拔的环境条件，根瘤菌株难以存活、结瘤及固氮，导致高寒豆科牧草种植中缺乏高效安全的根瘤菌剂产品的问题，很难结瘤或形成有效根瘤。
发明人在研究过程中，从高寒草地扁蓿豆根际分离得到了一株针扁蓿豆根瘤菌，所述的根瘤菌能够适应寒冷、干旱和高海拔的环境，接种扁蓿豆能够有效固氮，并促进扁蓿豆的生长。
发明内容
本发明的首要目的是提供一株根瘤菌(Rhizobium yanglingense)GBXD-30，于2022年6月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2021669。
优选的，所述的根瘤菌GBXD-30的培养条件为：乳糖10g L-1，酵母7g L-1，CaCl2 0.7g L-1。
本发明的第二目的是提供所述的根瘤菌GBXD-30在促进植物生长中的应用。
本发明的第三目的是提供所述的根瘤菌GBXD-30在促进植物固氮中的应用。
优选的，所述的植物为扁蓿豆。
本发明的第四目的是提供一种含有权利要求1所述的根瘤菌GBXD-30的微生物菌剂。
本发明的第五目的是提供所述的根瘤菌GBXD-30在制备促进植物生长制剂中的应用，所述的促进植物生长制剂为微生物菌剂或微生物肥料。
优选的，所述的植物为扁蓿豆。
本发明的第六目的是提供一种固氮菌剂，包括所述的根瘤菌GBXD-30。
本发明还提供了所述的微生物菌肥或所述的固氮菌剂的施用方法，包括如下步骤：
①预先将土层表皮翻耕，整平以备播种；
②准备好豆科牧草种子，将其装入干净的拌种器内，添加所述根瘤菌复合菌剂和预冷的开水，搅拌均匀，该根瘤菌菌剂使用量为每1千克种子使用菌剂0.2升，加水量以菌剂全部粘附在种子上为宜；
③将拌好的种子在避光通风处晾15-30分钟；
④按常规方法播种。
本发明的有益效果是：本发明提供了一株能够促进高寒草地重要豆科牧草扁蓿豆生长和结瘤固氮的根瘤菌GBXD-30，所述的根瘤菌GBXD-30对扁蓿豆具有高效结瘤和固氮能力，可以高效固定大气中的氮气，促进植物生长，进一步提高豆科牧草的品质和生物量，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1根瘤菌GBXD-30的平板菌落形态特征
图2根瘤菌GBXD-30培养条件单因素优化试验注：A转速对根瘤菌GBXD-30培养的影响；B初始pH对根瘤菌GBXD-30培养的影响；C培养基装瓶量对根瘤菌GBXD-30培养的影响；D培养温度对根瘤菌GBXD-30培养的影响
图3根瘤菌GBXD-30培养基组分单因素优化试验注：A培养基中碳源种类对根瘤菌GBXD-30的影响；B培养基中碳源浓度对根瘤菌GBXD-30生长的影响；C培养基中氮源种类对根瘤菌GBXD-30的影响；D培养基中氮源浓度对根瘤菌GBXD-30的影响；E培养基中无机盐种类对根瘤菌GBXD-30的影响；F培养基中无机盐浓度对根瘤菌GBXD-30的影响
图4响应面法优化根瘤菌GBXD-30培养基组分试验
图5根瘤菌GBXD-30促进扁蓿豆生长注：A、C不同根瘤菌对扁蓿豆株高的影响B、D不同根瘤菌对扁蓿豆根长的影响
图6根瘤菌GBXD-30提高扁蓿豆结瘤固氮注：A不同根瘤菌的结瘤数量；B不同根瘤菌的固氮酶酶活；C不同根瘤菌处理后植株的C含量；D不同根瘤菌处理后植株的N含量
具体实施方式
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明的保护范围进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
在本发明中，扁蓿豆模式根瘤菌菌株USDA1844中国农业大学农业生物技术国家重点实验室购买。
以下实施例中，
Figure BDA0003782428440000031
固体培养基的配方为：0.5mM MgSO4，0.7mM KH2PO4，0.8mMNa2HPO4，20uM Ferric citrate，1mM KNO3，0.68mM CaCl2，2.03mg·L-1MnSO4，0.08mg·L- 1CuSO4·5H2O，0.22mg·L-1ZnSO4·7H2O，2.86mg·L-1H3BO3，and 0.08mg·L-1Na2MoO4·2H2O。
以下实施例中，若无特殊说明，所用的方法均是本领域的常规方法，所使用的仪器和试剂均可在市面上购买得到。
实施例一、菌株的分离及鉴定
从甘肃省甘南州夏河县境内的高寒豆科植物扁蓿豆根际土中通过通用根瘤菌分离的TY培养基(胰蛋白胨5g L-1，酵母粉3g L-1，CaCl2 0.05g L-1)进行根瘤菌的分离，分离得到了单菌落，然后通过16S rRNA分子生物学鉴定，结合伯杰氏细菌鉴定手册对根瘤菌生理生化特征进行鉴定，最终确定为根瘤菌菌株，将其命名为根瘤菌(Rhizobiumyanglingense)GBXD30。
根瘤菌(Rhizobium yanglingense)GBXD30呈乳白色，椭圆状，直径0.3-0.5cm的菌斑，将其于2022年6月4日保藏于于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2021669，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学中国典型培养物保藏中心，联系电话为027-68754052。
以下实施例中，将根瘤菌(Rhizobium yanglingense)GBXD30简写为根瘤菌GBXD30。
实施例二、根瘤菌GBXD30发酵培养环境和培养基条件优化
1.发酵培养条件的优化
种子液的制备：挑取斜面培养基保存的根瘤菌GBXD-30接种到装有50mL已灭菌的TY液体培养基中，置于37℃的恒温振荡培养箱中，200r·min-1振荡培养24h，制备成种子液。
(1)转速的优化
使根瘤菌GBXD-30其他培养条件不变，只改变培养箱的转速。将已制备好的种子液按2％的量分别接入液体牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于转速分别为140r·min-1、160r·min-1、180r·min-1、200r·min-1、220r·min-1的恒温振荡培养箱中培养36h后于OD600nm处测定根瘤菌GBXD-30的菌悬液浓度，每个处理3个重复。
(2)初始pH的优化
使根瘤菌GBXD-30其他培养条件不变，只改变液体牛肉膏蛋白胨培养基的pH。将已制备好的种子液按2％的量分别接入初始pH为6.5、7.0、7.5、8.0、8.5的液体牛肉膏蛋白胨液体培养基中培养72h每隔12h后于OD600nm处测定根瘤菌GBXD-30的菌悬液浓度，每个处理3个重复。
(3)培养基装瓶量的优化
使根瘤菌GBXD-30其他培养条件不变，只改变液体牛肉膏蛋白胨液体培养基的装瓶量。将已制备好的种子液按2％的量分别接入装瓶量分别为25mL、50mL、75mL、100mL、125mL的液体牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于恒温振荡培养箱中培养36h后于OD600nm处测定根瘤菌GBXD-30的菌悬液浓度，每个处理3个重复。
(4)培养温度的优化
使根瘤菌GBXD-30其他培养条件不变，只改变培养温度。将配置好的液体TY培养基以每瓶100mL的量分装到250mL三角瓶中灭菌后使温度降至30℃左右时，按2％的量接入已制备好的种子液，分别于28℃、30℃、32℃、34℃、37℃温度下培养72h，每隔12h后于OD600nm处测定根瘤菌GBXD-30的菌悬液浓度，每个处理3个重复。
发酵培养条件的优化如图2所示，从图2中可以看出，根瘤菌GBXD-30在摇床转速分别为140rmp，160rmp，180rmp，200rmp，220rmp时生物量均有不同程度的提高，其中在摇床转速为200rmp时，OD值在72h内达到最大值，说明根瘤菌GBXD-30最适的摇床转速为200rmp；分别设置不同pH范围的TY液体培养基发酵根瘤菌GBXD-30可知，在pH为7.5时，OD值达到最高，说明根瘤菌GBXD-30最适的pH值为7.5；通过设置不同的装液量进行发酵效果鉴定发现，根瘤菌GBXD-30在装液量为100mL时OD值达到最高；发酵温度梯度实验进一步证明，在温度为32℃时，OD值达到最大值。综上所述，对根瘤菌GBXD-30发酵培养条件优化的发现，其发酵的最佳条件为转速200rmp，pH为7.5，装液量为100mL和温度为32℃。
2.根瘤菌GBXD-30培养基组分的单因素优化试验
(1)碳源种类及浓度的优化
最适碳源的筛选：在除去碳源的初始TY培养基中，分别添加质量浓度为1％的葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉、麦芽糖代替蛋白胨为碳源，以2％的接种量分别接入种子液，于30℃、80r·min-1条件下恒温振荡培养36h，每个处理3个重复，于OD600nm处测定根瘤菌GBXD-30的菌悬液浓度。
乳糖最佳浓度的优化：在除去牛肉膏和蛋白胨的初始培养基中，分别添加浓度依次为5.0g·L-1，7.5g·L-1，10.0g·L-1，12.5g·L-1，15.0g·L-1的乳糖，以2％的接种量分别接入种子液，于30℃、180r·min-1条件下恒温振荡培养36h，每个处理3个重复，于OD600nm处测定根瘤菌GBXD-30的菌悬液浓度。
(2)氮源种类及浓度的优化
最适氮源的筛选：在除去牛肉膏和蛋白胨的初始TY培养基中，分别添加质量浓度为1％的KNO3、尿素、NH4NO3、蛋白胨和酵母粉代替氮源，以2％的接种量分别接入种子液，于30℃、180r·min-1条件下恒温振荡培养36h，每个处理3个重复，于OD600nm处测定根瘤菌GBXD-30的菌悬液浓度。
酵母粉最佳浓度的优化：在除去氮源的初始培养基中，分别添加浓度依次为1.0g·L-1，3g·L-1，5g·L-1，7g·L-1，9g·L-1的酵母粉，以2％的接种量分别接入种子液，于30℃、180r·min-1条件下恒温振荡培养36h，每个处理3个重复，于OD600nm处测定根瘤菌GBXD-30的菌悬液浓度。
(3)无机盐种类及浓度的的优化
最适无机盐的筛选：在除去无机盐的初始NB培养基中，分别添加质量浓度为0.5％的Na Cl，KH2PO4，MgSO4，MnSO4，CaCl2代替无机盐，以2％的接种量分别接入种子液，于30℃、180r·min-1条件下恒温振荡培养36h，每个处理3个重复，于OD600nm处测定根瘤菌GBXD-30的菌悬液浓度。
CaCl2最佳浓度的优化：在除去无机盐的初始培养基中，分别添加浓度依次为0.1g·L-1，0.3g·L-1，0.5g·L-1，0.7g·L-1，0.9g·L-1的CaCl2，以2％的接种量分别接入种子液，于30℃、180r·min-1条件下恒温振荡培养36h，每个处理3个重复，于OD600nm处测定根瘤菌GBXD-30的菌悬液浓度。
根瘤菌GBXD-30培养基组分的单因素优化试验结果如图3所示，碳源优化可知，乳糖可以很好的促进GBXD-30发酵，并且在其浓度为10.0g·L-1时，生物量达到最大值；对氮源优化发现，酵母粉为最佳的氮源，且其在浓度为7g·L-1时生物量达到最大值；无机盐优化发现，选用CaCl2代替无机盐，且在浓度为0.7g·L-1时达到最大值。
3.响应面法优化根瘤菌GBXD-30培养基组分试验
通过对根瘤菌GBXD30的发酵培养的外部环境条件如摇床转速，pH值，装液量和温度进行了测定。发现其发酵的最优条件为：摇床转速200rmp，pH值7.5，装液量100mL，温度为32℃。
根瘤菌GBXD30发酵培养基条件优化如表1和图4所示，分别对根瘤菌GBXD30发酵培养基条件进行选择和浓度筛选，获得了最佳的碳源和氮源以及最适的浓度。
表1根瘤菌GBXD30发酵培养基条件优化
Figure BDA0003782428440000061
利用Design-Expert统计软件对表数据进行回归分析，建立回归模型，以GBXD-30的吸光值为响应值(R1)，得到二次回归方程：分别获得了R1＝1.28-0.025*A-0.087*B-0.022*C-0.081*A*B+9.000E-003*A*C-0.055*B*C-0.22*A2-0.12*B2-0.24*C2
进一步实验验证确定根瘤菌GBXD30最优的培养基条件为：乳糖10g L-1，酵母粉7gL-1，CaCl20.7g L-1
实施例三、根瘤菌GBXD-30对植物的促生效果
1.实验方法
(1)精选一批扁蓿豆种子装至无菌锥形瓶中，98％浓硫酸浸泡3min并不断摇晃，用无菌水冲洗4-6次后，再用6％的次氯酸钠溶液浸泡3min，最后用无菌水至少冲洗10次，直至将种子表面次氯酸钠溶液冲洗干净。将种子平铺于
Figure BDA0003782428440000062
固体培养基，置于4℃冰箱中春化24h，备用。
(2)配制1瓶200mL的TY液体培养基，用立式压力蒸汽灭菌锅(LDZX-50KBS，上海申安)对培养基进行121℃高温灭菌20min备用。将已活化模式根瘤菌USDA1844、根瘤菌GBXD30、根瘤菌XBXD4、根瘤菌XBXD22和根瘤菌XBXD2按1:100的比例分别加至灭菌后的TY液体培养基中，置于28℃、转速180r/min的恒温摇床(THZ-300，上海一恒科技)中培养48h。将培养至对数生长期的各菌株进行超速离心后，去除上清液，用无菌水将六株PGPR的浓度调至OD600＝0.5，Sm1021的浓度调至OD600＝0.1，调好后待接种用。
(3)盆栽实验分别设置6个处理，以不接菌作为空白对照。将在培养基上萌发的种子幼苗移栽至装有灭菌蛭石的小花盆(9cm×10cm)中，每盆3株，一周后间苗至每盆1株，每个处理15盆。间苗后于紫花苜蓿茎基部进行接种处理，待苜蓿生长至28天时，进行二次接种。苜蓿生长期间定期浇灌
Figure BDA0003782428440000071
无氮营养液。
2.扁蓿豆生长和生理指标测定
(1)生物量测定
对各处理植株进行拍照，然后分别对各处理幼苗进行取样，将各处理幼苗根表面的蛭石冲洗干净，沿茎基部将单株幼苗剪断分为地上部和根部。分别测量株高及根长，统计结瘤总数和有效根瘤数，称量植株地上部及根的鲜干重。每个处理6个重复。
(2)固氮酶活性测定
采用乙炔还原法(Acetylene reduction assay，ARA)对各处理植株的固氮酶活性进行测定。将各处理的根部剪下放入50mL西林瓶中，并用橡皮塞密封，使用注射器抽出瓶中20mL空气，再注入等体积乙炔气体，使用密封条和保鲜膜将注射孔封住，置于28℃培养箱中反应2h。使用气相色谱仪(GC9720，兰州大学化学化工学院)测定瓶内由乙炔还原得到乙烯的浓度，换算该菌株的固氮酶活性。
(3)植株碳氮含量测定
采用元素分析仪进行整株的碳氮含量测定。
3.结果分析
生物量测定结果如图5所示，从图5中可知，相较于空白对照组，所有实验组的根瘤菌均促进了扁蓿豆的植株株高生长和根长生长，根瘤菌GBXD30促进扁蓿豆生长的效果最显著，高于模式根瘤菌USDA1844；固氮酶活和植株碳氮含量测定如图6所示，进一步统计植株的根瘤总数目和有效根瘤数目发现，根瘤菌GBXD-30的根瘤总数目和有效根瘤数均高于模式菌株USDA1844和其他根瘤菌效果。固氮酶活性以及植株碳氮含量的测定也充分说明根瘤菌GBXD30处理的植株的各项指标均高于模式菌株USDA1844。使用徕卡M205A体式显微镜对各处理下的根瘤进行拍照观察发现，接种所得的根瘤菌体积最大，而且与之相应的根瘤菌数目和有效根瘤菌数目均为最多。固氮酶活性数据分析得知，根瘤菌GBXD30为最高。植株的碳和氮含量也是根瘤菌GBXD30最高。
综上所述，本发明提供了一株能够促进植物生长和结瘤固氮的根瘤菌GBXD-30，所述的根瘤菌GBXD-30对扁蓿豆具有高效结瘤和固氮能力，可以高效固定大气中的氮气，调节植物生长，增强植物抗病，减少牧草病害，进一步提高高寒豆科牧草的品质和生物量，具有广阔的应用前景。

Claims (10)

1.一株根瘤菌(Rhizobiumyanglingense)GBXD-30，于2022年6月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2021669。
2.如权利要求1所述的根瘤菌GBXD-30，其特征在于，培养条件为：乳糖10g L-1，酵母7gL-1，CaCl20.7g L-1。
3.如权利要求1所述的根瘤菌GBXD-30在促进植物生长中的应用。
4.如权利要求1所述的根瘤菌GBXD-30在促进植物固氮中的应用。
5.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述的植物为扁蓿豆。
6.一种含有权利要求1所述的根瘤菌GBXD-30的微生物菌剂。
7.如权利要求1所述的根瘤菌GBXD-30在制备促进植物生长制剂中的应用，其特征在于，所述的促进植物生长制剂为微生物菌剂或微生物肥料。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的植物为扁蓿豆。
9.一种固氮菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述的根瘤菌GBXD-30。
10.如权利要求6所述的微生物菌剂或如权利要求9所述的固氮菌剂的施用方法，其特征在于，包括如下步骤：
①预先将土层表皮翻耕，整平以备播种；
②准备好豆科牧草种子，将其装入干净的拌种器内，添加所述根瘤菌和预冷的开水，搅拌均匀，该根瘤菌菌剂使用量为每1千克种子使用菌剂0.2升，加水量以菌剂全部粘附在种子上为宜；
③将拌好的种子在避光通风处晾15-30分钟；
④按常规方法播种。
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