CN115282274B - 一种用于增强光动治疗的级联纳米放大器及其制备方法与应用 - Google Patents
一种用于增强光动治疗的级联纳米放大器及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于增强光动治疗的级联纳米放大器及其制备方法与应用，属于药物制剂联合治疗新辅料和新剂型技术领域。所述级联纳米放大器由光敏剂、血红素和多不饱和脂肪酸共组装，共组装后修饰以PEG修饰，所述光敏剂与血红素及多不饱和脂肪酸的摩尔比为1:1:1～3:1:6，光敏剂、血红素和多不饱和脂肪酸之和与PEG修饰剂的质量比为10:90～50:40。本发明的共组装纳米制剂为开发药物的递送提供新的策略和更多的选择，满足临床中对光动治疗策略在制剂上的迫切需求。
Description
技术领域
本发明属于药物制剂联合治疗新辅料和新剂型技术领域，具体涉及一种用于增强光动治疗的级联纳米放大器及其制备方法与应用。
背景技术
目前，恶性肿瘤发病率高、死亡率高，严重威胁着人类健康。虽然肿瘤的治疗策略多种多样，但临床结果仍远不能令人满意。近年来，光动力疗法(PDT)作为一种可控的局部治疗方式引起了广泛关注。近红外(NIR)光可以选择性地激活集中于肿瘤组织中的光敏剂(PSs)，触发光化学反应破坏病变。具体来说，在近红外光照射下，能量可以从被激活的PSs转移到周围的氧气(O2)，产生高度致死的反应性单重态氧(1O2)。然后，产生的1O2可以氧化附近的生物大分子，导致肿瘤细胞凋亡。
与传统疗法相比，PDT具有治疗精确、副作用少的优点。然而，PDT的有效性仍然受到一些棘手问题的限制，特别是低氧肿瘤微环境。氧气是PDT必不可少的元素之一，改善肿瘤缺氧微环境对PDT具有重要意义。此外，PDT的另一个固有缺点是半衰期极短，1O2的作用范围有限。据报道，1O2的半衰期小于40ns。而且，1O2的有效作用范围仅为20nm，远小于肿瘤细胞的大小。这些都限制了PDT的效率。
虽然PDT是一种局部治疗方式，但PSs在肿瘤部位的有效积累仍然是抗肿瘤疗效的重要前提。随着纳米技术的快速发展，各种纳米载体被用于传递PSs，包括脂质体、聚合物和介孔硅。然而，传统的纳米载体往往与药物亲和力较差，这些载体材料的引入导致了载体相关的毒性。近年来，无载体纳米药物输送系统(CFNDS)已成为一种有前景的癌症治疗策略。在CFNDS中，某些药物分子被发现在多种分子间力的驱动下自组装成稳定的纳米粒。小分子自组装纳米药物与传统的载体基纳米药物(如脂质体和纳米微囊)相比具有明显的优势，包括制备方便、重现性好、无载体、无赋形剂相关毒性、载药量高、传递效率好。除了自组装，一些药物分子在一起可以共组装成二元或三元杂化NPs，尽管它们自己不能进行纳米组装。除了上述优势之外，混合纳米系统还可以提供一种通用的药物共给药纳米载体。与以载体材料为基础的药物共包封不同，开发纯药基共组装可实现高度同步的药物传递。因此，CFNDS的出现为PSs的有效递送带来了新的策略。
近年来，通过纯药物自组装的无载体纳米粒在药物递送中有着广阔前景，特别是对于某些无需载体材料即可自组装成稳定纳米粒的抗癌药物，构建具有多种药物分子的杂化纳米组装体在联合疗法中更具潜力。研究开发一种具有级联增强光动治疗的纳米放大器是当前亟待研究的重要课题。
发明内容
基于现有技术存在的技术问题，本发明进一步为了解决肿瘤缺氧，1O2半衰期短，及其大部分光敏剂水溶性差、组装能力差、包载于聚合物中导致载药量低、药物泄露和辅料相关毒性等问题。在此，我们通过分子工程策略构建了一个包含焦脱镁叶绿酸a(PPa)、花生四烯酸(AA)和血红素(Hemin)的三合一纳米放大器，用于级联放大PDT。在纳米体系中，AA的加入可以驱动PPa和血红素形成三元纳米组装(AA@PPa/hemin纳米粒)。在肿瘤细胞中，血红素可以催化过表达的过氧化氢(H2O2)产生O2，并通过提高O2浓度促进PDT。近红外光照射下，PPa有效缓解肿瘤缺氧微环境，使其产生的1O2量显著增加。有趣的是，组装驱动器AA可以被生成的1O2迅速氧化为细胞毒性脂质活性氧(ROS)。与短暂的1O2相比，稳定的脂质ROS具有更长的半衰期，可以有效地扩散到细胞的各个部位，更有效地杀死肿瘤细胞。结果，AA@PPa/Hemin纳米粒在4T1乳腺肿瘤BALB/c小鼠中显示了强大的抗肿瘤活性。这种自驱动的纳米放大器为有效的PDT治疗肿瘤提供了一种有前景的策略。
本发明通过以下技术方案实现上述目的：
本发明提供了一种用于增强光动治疗的级联纳米放大器，所述级联纳米放大器由光敏剂、血红素和多不饱和脂肪酸通过分子间作用力共组装而成，并修饰以PEG修饰剂，所述光敏剂与血红素及多不饱和脂肪酸的摩尔比为1:1:1～3:1:6，优选为3:1:6；光敏剂、血红素和多不饱和脂肪酸之和与PEG修饰剂的质量比为10:90～50:40。
进一步地，所述分子间作用力包括π-π堆积、疏水作用。
进一步地，所述多不饱和脂肪酸包括亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸等；优选为花生四烯酸。
进一步地，所述的光敏剂包括焦脱镁叶绿酸a、叶绿素a、脱镁叶绿酸a、焦脱镁叶绿酸a己醚、二氢卟吩e6中的一种或二种以上。优选为焦脱镁叶绿酸a。
进一步地，所述PEG修饰剂包括PCL-PEG、DSPE-PEG、DSPE-SS-PEG、PLGA-PEG、PE-PEG中的一种或二种以上，PEG的分子量为200-20000。优选为DSPE-PEG2K。
本发明还提供了一种用于增强光动治疗的级联纳米放大器的制备方法，包括如下步骤：
将光敏剂、血红素和多不饱和脂肪酸分别溶解到有机溶剂中，搅拌下混匀，将混匀后的溶液缓慢滴加到水中，自发形成均匀的共组装纳米粒，将PEG修饰剂的有机溶剂在搅拌下滴加至共组装纳米粒中；除去有机溶剂，即得。
进一步，所述的有机溶剂包括乙醇、四氢呋喃、二甲基亚砜中的一种或任意两种及以上的组合。
进一步地，所述有机溶剂优选为二甲基亚砜。
进一步，除去有机溶剂的方法包括溶剂蒸发法、超滤法和膜渗透法。
本发明还提供了上述方法制备的光敏剂、血红素与多不饱和脂肪酸共组装形成的级联纳米放大器。
本发明还提供了光敏剂、血红素与多不饱和脂肪酸共组装形成的级联纳米放大器在制备药物递送系统中的应用。
本发明还提供了光敏剂、血红素与多不饱和脂肪酸共组装形成的级联纳米放大器在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明还提供了光敏剂、血红素与多不饱和脂肪酸共组装形成的级联纳米放大器在制备注射给药、口服给药或局部给药系统中的应用系统中的应用。
本发明相对于现有技术具有的有益效果如下：
1.本发明制备光敏剂(优选为PPa)、血红素Hemin与多不饱和脂肪酸(优选为花生四烯酸)共组装形成的级联纳米放大器，可用于肿瘤光动治疗，Hemin可以催化肿瘤细胞内的H2O2产生O2使其有效的缓解肿瘤缺氧，光敏剂在光照条件可以产生1O2消耗大量O2。
2.本发明的光敏剂(优选为PPa)、血红素Hemin与多不饱和脂肪酸(优选为花生四烯酸)共组装形成的级联纳米放大器实现了载药量高、稳定性好、毒副作用低等技术效果，满足临床中对高效低毒制剂的迫切需求，为光动治疗中光敏剂与其他药物协同联用的组装提供了一个新策略，为开发无载体的杂化纳米组装体以及增强光动治疗提供了一个有效的纳米平台。
附图说明
图1为本发明实施例1的AA@PPa/Hemin纳米粒的照片。
图2为本发明实施例1的(3:1:6)比例下的AA@PPa/Hemin纳米粒的马尔文粒径分布图。
图3为本发明实施例1的AA@PPa/Hemin纳米粒的透射电镜图。
图4为本发明实施例2的AA@PPa/Hemin纳米粒的胶体稳定性图。
图5为本发明实施例3的AA@PPa/Hemin纳米粒的紫外吸收谱图。
图6为本发明实施例3的AA@PPa/Hemin纳米粒的分子作用力破坏图。
图7为本发明实施例4的AA@PPa/Hemin纳米粒体外耗氧情况。
图8为本发明实施例4的AA@PPa/Hemin纳米粒体外产氧情况。
图9为本发明实施例5的AA@PPa/Hemin纳米粒体外单线态氧产生情况。
图10为本发明实施例6的AA@PPa/Hemin纳米粒体外活性氧产生情况。
图11为本发明实施例7的AA@PPa/Hemin纳米粒的2小时和4小时的细胞摄取共聚焦显微镜下照片。
图12为本发明实施例8的AA@PPa/Hemin纳米粒的细胞毒结果。
图13为本发明实施例9的AA@PPa/Hemin纳米粒的脂质过氧化水平的共聚焦显微镜下的照片和性氧水平的倒置荧光显微镜下的照片。
图14为本发明实施例10的AA@PPa/Hemin纳米粒的血药浓度-时间曲线图。
图15为本发明实施例11中AA@PPa/Hemin纳米粒的组织分布情况。
图16为本发明实施例12在体抗肿瘤实验的小鼠肿瘤生长曲线图。
图17为本发明实施例12在体抗肿瘤实验的小鼠荷瘤率统计图。
图18为本发明实施例12在体抗肿瘤实验的小鼠体重变化图。
图19为本发明实施例12在体抗肿瘤实验的小鼠离体肿瘤H&E、HIF-a和TUNEL染色图。
图20为本发明实施例12组织病理切片图。
图21为本发明实施例12的肝肾功能分析结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但本发明的实施方式不限于此，显而易见地，下面描述中的实施例仅是本发明的部分实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，获得其他的类似的实施例均落入本发明的保护范围。
实施例1：AA@PPa/Hemin纳米粒的制备
将不同摩尔比的PPa、Hemin和AA溶解到DMSO中，得5mg/mL(PPa浓度)含药溶液。搅拌下，将该溶液200μL缓缓滴加到2mL去离子水中，PPa、Hemin和AA自发形成均匀的纳米粒，然后采用超速离心法除去纳米制剂中的有机溶剂，得到不含任何有机溶剂的纳米胶体溶液。
检测所制备的纳米制剂的粒径、粒径分布结果见表1-3。
表1.AA@PPa/Hemin纳米粒的粒径、粒径分布(1:1:1-1:1:8)
表2.AA@PPa/Hemin纳米粒的粒径、粒径分布(2:1:1-2:1:8)
表3.AA@PPa/Hemin纳米粒的粒径、粒径分布(3:1:1-3:1:8)
如表1-3所示，纳米粒的粒径都在110-330nm之间。其中PPa:He:AA＝3:1:6时，AA@PPa/Hemin纳米粒的粒径较小且分布较均匀，初步优选PPa:He:AA的比例为3:1:6。后续实验均在PPa:He:AA为3:1:6条件下进行。
(1)非PEG化的AA@PPa/Hemin纳米粒的制备方法：精密称取PPa 0.5mg，hemin0.2mg和AA 0.6mg，用100μLDMSO将其溶解，搅拌下，将该溶液缓缓滴加到2mL去离子水中，自发形成均匀的纳米粒，然后经过超滤离心法除去纳米制剂中的有机溶剂，得到不含任何有机溶剂的纳米胶体溶液。
(2)DSPE-PEG2K修饰的AA@PPa/Hemin纳米粒制备方法：精密称取PPa 0.5mg，hemin0.2mg、AA 0.6mg和不同比例的DSPE-PEG2K，用100μLDMSO将其溶解；在搅拌下，先PPa、hemin和AA的混合溶液缓缓滴加到2mL去离子水中，再将DSPE-PEG2K的DMSO溶液在搅拌下滴加至上述溶液中，得到均匀AA@PPa/Hemin纳米粒。然后经过超滤离心法除去纳米制剂中的有机溶剂，得到不含任何有机溶剂的纳米胶体溶液(图1)。结果证明，单独的PPa和hemin不能组装成纳米粒，而加入AA后，三者可以共组装形成纳米粒。通过动态光散射法检测所制备的纳米粒的粒径、粒径分布(表4和图2)和载药量(表5)。
注：后文AA@PPa/Hemin纳米粒均指代采用PEG修饰的AA@PPa/Hemin纳米粒，非PEG的AA@PPa/Hemin纳米粒均指代未采用PEG修饰的AA@PPa/Hemin纳米粒。
表4.AA@PPa/Hemin纳米粒用量的筛选
表5.AA@PPa/Hemin纳米粒的粒径、粒径分布及Zeta电位
表6.纳米粒中药物的载药量
| 药物/载药量(％) | PPa | Hemin | AA | 总药物 |
| AA@PPa/Hemin纳米粒 | 33.1 | 12.7 | 37.6 | 83.4 |
从表4-6可知，质量分数为20％比例下，AA@PPa/Hemin纳米粒的粒径和PDI较好，PEG化的纳米粒，zeta电位为-20左右，载药量高达83.4％。
通过透射电子显微镜测定实施例1中制备的AA@PPa/Hemin纳米粒的粒径和形态，结果如图3，透射电镜图表明纳米粒为均一的球形，粒径在70nm左右。
实施例2：纳米粒的胶体稳定性试验
将实施例1中制备的AA@PPa/Hemin纳米粒和非PEG的AA@PPa/Hemin纳米粒(0.5mg/mL)各取出1mL，加入到10mL含有10％FBS的PBS(pH 7.4)中，在37℃的摇床中下孵育12小时，并且在预定的时间点(0，1，2，4，8和12小时)通过动态光散射法测定其粒径变化。结果如图4所示，与非PEG的AA@PPa/Hemin纳米粒相比，AA@PPa/Hemin纳米粒在PBS中胶体稳定性较好，在12小时内粒径没有发生明显的变化。如图4所示，AA@PPa/Hemin纳米粒在含有10％FBS的PBS中胶体稳定性较好。
实施例3：PPa、Hemin和AA组装机理分析
通过紫外光谱扫描实验，初步研究纳米组装体的组装机理。使用酶标仪测定空白DMSO、PPa溶液剂、Hemin溶液剂、AA溶液剂、AA@PPa/Hemin纳米粒+DMSO或AA@PPa/Hemin纳米粒(1mm,PPa当量)的紫外吸收光谱。此外，为了进一步研究组装过程中可能涉及的力，进行了分子间力破坏实验。AA@PPa/Hemin纳米粒加入氯化钠(NaCl,50mM)、十二烷基硫酸钠(SDS,50mM)或尿素(50mM)的溶液中，37℃摇瓶孵育。在预定的时间点，使用MalvernZetasizer对AA@PPa/Hemin纳米粒的粒径进行了表征。
结果表明，AA@PPa/Hemin纳米粒的紫外吸收光谱与PPa溶液剂相比有明显的红移，并且加入DMSO后红移消失，这证明了AA@PPa/Hemin纳米粒中π-π叠加的存在(图5)。随后，我们通过分子间力破坏实验继续研究其组装机理。如图6所示，在NaCl和尿素溶液中，AA@PPa/Hemin纳米粒的粒径几乎没有变化，说明静电力和氢键力对组装的影响最小。相比之下，AA@PPa/Hemin纳米粒在SDS溶液中结构严重受损，粒径显著增大，说明疏水力在AA@PPa/Hemin纳米粒的组装过程中起关键作用。因此，AA@PPa/Hemin纳米粒的组装过程主要由π-π叠加和疏水力驱动。
实施例4：纳米粒的体外氧气消耗和产生
采用光学溶氧检测器对纳米放大器的催化产氧能力进行了测试。将O2电极探针插入含10mM H2O2的PBS中。指标平衡后，加入空白PBS(对照)、Hemin和AA@PPa/Hemin纳米粒(20μg/mL,PPa当量)实时监测和测量氧容量。
为了研究激光照射下NPs的耗氧情况，采用光学溶氧检测器测定了NPs中O2含量的变化。将O2电极探针插入含10mM H2O2的PBS中。待指示剂平衡后，在溶液中加入空白PBS(对照)、PPa和AA@PPa/Hemin纳米粒(20μg/mL,PPa当量)。在激光照射(660nm,200mW/cm2,5分钟)下，实时监测并测量O2浓度。
在这个纳米体系中，Hemin可以作为过氧化氢酶类催化剂，由H2O2生成O2。因此，研究纳米放大器在含H2O2的PBS中产生O2的能力具有重要意义。采用光学溶氧检测器实时记录溶氧浓度变化。如图7所示，不含Hemin的H2O2溶液中O2的浓度基本保持不变，说明它不能产生O2。将血Hemin加入H2O2溶液中，15分钟内检测到的O2浓度立即增加到18mg/L左右。同样，含AA@PPa/Hemin纳米粒的H2O2溶液也表现出类似的产氧能力。
此外，为了研究处理过程中纳米放大器的O2消耗情况，我们测量了激光照射前后O2浓度的变化。如图8所示，激光照射后，PPa溶液剂处理组O2浓度下降约5mg/L。相比之下，AA@PPa/Hemin纳米粒处理组的O2浓度几乎没有变化，表明纳米放大器具有高效的O2补充能力。这些结果表明，即使在缺氧环境中，纳米放大器也能实现有效的PDT。
实施例5：纳米粒的体外单线态氧产生
用SOSG探针测定了低氧(浓度2％)和常氧(浓度20％)条件下光诱导的1O2生成。简单地说，将PPa溶液剂、Hemin溶液剂、AA溶液剂、PPa/Hemin溶液剂、PPa/AA溶液剂、PPa/Hemin/AA溶液剂或AA@PPa/Hemin纳米粒(1mM,PPa当量)与SOSG(1mM)混合，在含10mM H2O2的PBS溶液中稀释。样品生成的1O2在近红外(660nm,200mW/cm2,5分钟)光照射下可以与荧光探针结合。用酶标仪在504nm激发和525nm发射下测量SOSG的荧光强度。
结果如图9所示，在激光照射下，AA和血红素在正常或缺氧条件下都不能产生1O2。与常氧条件相比，在缺氧条件下，PPa和PPa/AA的1O2生成能力明显下降。而在常氧和低氧条件下，PPa/Hemin、PPa/Hemin/AA和AA@PPa/Hemin纳米粒的1O2生成量无显著差异，说明Hemin催化产生O2的能力有利于提高1O2的生成。与PPa溶液剂相比，AA@PPa/Hemin NPs产生的1O2量有一定程度的减弱，这可能与纳米粒的ACQ效应有关。
实施例6：纳米粒的活性氧(ROS)的产生
首先，将1mM的DCFH-DA用0.01N的NaOH溶液在室温下水解0.5h，然后用NaH2PO4(25mM)中和，用铝箔屏蔽，得到最终的DCFH溶液。随后，在上述DCFH溶液中分别加入空白PBS、PPa、AA、PPa/AA和AA@PPa/Hemin纳米粒(0.2μM,PPa当量)。在不同时间(660nm,200mW/cm2)的激光照射下，产生的1O2或ROS可将DCFH转化为高荧光的DCF。最后，用酶标仪测定DCF的荧光强度(激发:485nm,发射:520nm)。
结果如图10所示在激光照射下，即使在光照射5分钟后，对照组和AA组也几乎没有检测到ROS。与预期一致，PPa/AA和AA@PPa/Hemin纳米粒组的ROS生成量显著高于PPa组。这些结果表明AA可以被生成的1O2快速氧化生成脂质ROS。
实施例7：纳米粒的细胞摄取
采用共聚焦显微镜测定实施例1中制备的AA@PPa/Hemin纳米粒在4T1细胞(小鼠乳腺癌细胞)中的摄取情况。将4T1细胞以5×104cells/well的密度接种到24孔板上，置培养箱中孵育24h使其贴壁，待细胞贴壁后加入PPa溶液剂和AA@PPa/Hemin纳米粒，PPa的浓度均为50nM，在37℃孵化0.5小时和2小时后，清洗细胞，进行细胞固定，最后用共聚焦显微镜分析细胞对各种制剂的摄取情况。实验结果如图11所示。
上述实验结果表明，细胞摄取呈现出时间依赖性摄取，且AA@PPa/Hemin纳米粒处理的细胞比PPa溶液剂处理的细胞具有更高的细胞内荧光强度。因此，制备的AA@PPa/Hemin纳米粒具有比PPa溶液剂更高的细胞摄取效率。
实施例8：纳米粒的细胞毒性
采用MTT法考察PPa溶液剂、PPa溶液剂+光照、Hemin溶液剂、AA溶液剂、PPa/AA溶液剂+光照、PPa/Hemin溶液剂+光照、PPa/AA/Hemin溶液剂+光照、AA@PPa/Hemin纳米粒和AA@PPa/Hemin纳米粒+光照对小鼠乳腺癌(4T1)细胞的细胞毒性。将状态良好的细胞消化，用培养液稀释至1×104个细胞/毫升的细胞密度，吹匀后于96孔板中每孔加入细胞悬液200μL，置培养箱中孵育12h使其贴壁(常氧和低氧两种模式培养)。待细胞贴壁后用含药的培养基培养细胞，每孔200μL。对照组用不含药液的培养基培养。4小时后，光照组给予激光照射、44小时后，将96孔板取出，每孔加入5mg mL-1MTT溶液25μL，置培养箱中孵育4小时后甩板，将96孔板倒扣于滤纸上充分吸干残留液体后，每孔加入200μLDMSO于振荡器上振荡10min以溶解蓝紫色结晶物。使用酶标仪在490nm处测定各孔调零后的吸光度值。
细胞毒性结果如图12所示，AA溶液或Hemin溶液在常氧或缺氧条件下几乎没有毒性。在常氧条件下，PPa溶液剂+光照与PPa/血红素溶液+光照的细胞毒性无显著差异。而缺氧条件下，PPa/hemin溶液剂+光照的细胞毒性显著高于PPa溶液+光照。这是因为血红素可以催化H2O2生成O2，从而提高PDT的效率。与单纯PPa溶液剂+光照相比，PPa/AA溶液剂+光照表现出更强的抗肿瘤活性，这可能与产生细胞毒LPOs有关。正如预期的那样，由于级联放大，PPa/Hemin/AA溶液+光照比其他溶液组表现出更高的细胞毒性。此外，AA@PPa/Hemin纳米粒具有更强的抗肿瘤活性，三药的协同指数为0.23，表现出高效的协同放大效果，其细胞毒性结果与细胞摄取结果一致。
实施例9：脂质过氧化物(LPOs)和ROS检测
细胞内LPOs采用C11 BODIPY 581/591探针检测。将4T1细胞(5×104个/孔)接种到24孔板上，在低氧或常氧条件下孵育24h。24h后，分别用50nM PPa溶液剂+光照、16.7nMHemin溶液剂、100nM AA溶液剂、PPa/Hemin溶液剂+光照、PPa/AA溶液剂+光照、PPa/Hemin/AA溶液剂+光照、AA@PPa/Hemin纳米粒或AA@PPa/Hemin纳米粒+光照，按PPa、Hemin和AA等量处理细胞，并给予激光(660nM,200mW/cm2，5分钟)孵育4小时后。将C11 BODIPY 581/591探针加入细胞中孵育1h。孵育1h后，用细胞组织固定液固定细胞，在激光共聚焦显微镜下观察。
生成的ROS用C11 BODIPY 581/591探针测量。将4T1细胞(5×104cells/well)接种于24孔板，在低氧或常氧条件下孵育24h。24h后，分别用50nM PPa溶液剂+光照、16.7nMHemin溶液剂、100nM AA溶液剂、PPa/Hemin溶液剂+光照、PPa/AA溶液剂+光照、PPa/Hemin/AA溶液剂+光照、AA@PPa/Hemin纳米粒或AA@PPa/Hemin纳米粒+光照，按PPa、Hemin和AA等量处理细胞，孵育4h后给予激光(660nM,200mW/cm2,5分钟)。用10μM DCFH-DA孵育细胞30分钟，最后用细胞组织固定液固定细胞，激光共聚焦显微镜观察。
细胞内ROS和LPOs水平可直接反映细胞内氧化应激的状态和PDT的作用。结果显示，缺氧条件下PPa溶液剂+光照组产生的ROS和LPOs量明显低于常氧条件下(图13)。与PPa溶液剂+光照组相比，PPa/Hemin溶液剂+光照组产生ROS和LPOs的能力更强。这是因为Hemin对细胞内H2O2的催化作用可以有效缓解缺氧困境。此外，PPa/AA溶液剂+光照处理的细胞中ROS和LPOs的数量高于PPa溶液剂+光照处理的细胞，这是由于PPa产生的1O2使AA快速脂质过氧化。AA@PPa/Hemin纳米粒+光照组可见较强的荧光信号，表明ROS和LPOs的级联放大效应与细胞毒性结果一致。
实施例10：纳米粒的药代动力学研究
取体重在200-250g之间的SD大鼠，随机分组，给药前禁食12h，自由饮水。分别静脉注射PPa溶液剂以及实施例1制备的AA@PPa/Hemin纳米粒(均以PPa计2mg/kg)，于规定的时间点眼眶取血，分离获得血浆。之后通过离心和沉淀蛋白法提取PPa，最后用酶标仪(激发415nm，发射675nm)检测各制剂的药动学行为。实验结果如图14所示，由于半衰期短，PPa溶液剂很快就被代谢清除。相比于溶液剂，AA@PPa/Hemin纳米粒的循环时间明显延长，明显提高了PPa的AUC，为药物在体内肿瘤的蓄积提高了很好基础。
实施例11：纳米粒的组织分布实验
将4T1细胞悬液接种于BALB/c小鼠，当肿瘤体积达到300mm3时，尾静脉注射给药：PPa溶液剂，AA@PPa/Hemin纳米粒(给药剂量均为2mg/kg PPa)。于给药后3小时、6小时、9小时和12小时，将小鼠猝死，进行离体组织器官的荧光强度分析。
结果如图15所示，PPa溶液剂在体内被快速清除，随着给药时间的延长，其在肿瘤组织中的蓄积量逐渐减少。与PPa溶液剂不同，AA@PPa/Hemin纳米粒表现出更强的肿瘤积累能力，尤其是在给药后6h，这可能是由于其较好的胶体稳定性和增强的通透性和保留(EPR)效应。
实施例12：纳米粒的体内抗肿瘤实验
采用4T1荷瘤小鼠(20-22g)，研究AA@PPa/Hemin纳米粒的体内抗肿瘤活性。首先将100μL的4T1细胞(5×107个/mL)皮下注射到小鼠右背部。当肿瘤体积达到150mm3左右时，将荷瘤小鼠随机分为9组(n＝5)。然后，用PBS、PPa溶液剂+光照、血红素溶液、AA溶液剂、PPa/血红素溶液剂+光照、PPa/血红素溶液剂+光照、PPa/血红素/AA溶液剂+光照、AA@PPa/Hemin纳米粒或AA@PPa/Hemin纳米粒+光照，PPa浓度为4mg/kg(剂量，PPa:Hemin:AA＝3:1:6，摩尔比)，每隔一天治疗荷瘤小鼠5次。PPa溶液剂、PPa/Hemin溶液剂、PPa/AA溶液剂和PPa/Hemin/AA溶液剂在注射后3小时接受激光照射(660nm,200mW/cm2,5分钟)，AA@PPa/Hemin纳米粒在注射后6小时接受激光照射。治疗期间每天测量并记录小鼠体重和肿瘤体积。最后一次处理后，处死小鼠，采集血样进行肝肾功能分析。取心、肝、脾、肺、肾和肿瘤组件进行H&E染色。对切除的肿瘤称重并进行缺氧诱导因子-α(HIF-α)和TUNEL染色分析。
结果如图16-17所示，PBS处理小鼠后，肿瘤快速增殖。同样，AA溶液剂，Hemin溶液剂，AA@PPa/Hemin纳米粒的抗肿瘤效果较差。而PPa溶液剂+光照，PPa/AA溶液剂+光照和PPa/Hemin溶液剂+光照则能有效抑制肿瘤生长。此外，PPa/Hemin/AA溶液剂+光照具有有效的级联放大效应。正如我们所预期的那样，AA@PPa/Hemin纳米粒+光照治疗小鼠的抗肿瘤效果最强。治疗后小鼠肿瘤体积甚至下降。H&E、HIF-a和TUNEL染色结果也显示AA@PPa/Hemin纳米粒+光照处理小鼠肿瘤组织中凋亡和坏死面积最大(图19)。AA@PPa/Hemin纳米粒+光照具有胶体稳定性高,细胞摄取增强,血液循环时间延长,肿瘤积聚有效,O2浓度升高,脂质过氧化放大等优点,因此具有有效的治疗效果。在评估缓解缺氧时,含血红素的治疗组低氧诱导因子-α表达明显降低,尤其是AA@PPa/Hemin纳米粒+光照治疗组(图19)。在治疗期间，小鼠的体重没有明显变化(图18)。同样，肝肾功能参数和组织器官H&E染色切片的差异也可以忽略不计(图20和21)。这些结果证实了纳米放大器具有良好的耐受性。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (7)
1.一种用于增强光动治疗的级联纳米放大器，其特征在于，所述级联纳米放大器由光敏剂、血红素和多不饱和脂肪酸通过分子间作用力共组装而成，并修饰以PEG修饰剂，所述光敏剂与血红素及多不饱和脂肪酸的摩尔比为1:1:1~3:1:6，光敏剂、血红素和多不饱和脂肪酸之和与PEG修饰剂的质量比为10:90~50:40；
所述的多不饱和脂肪酸包括亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸；所述的光敏剂为焦脱镁叶绿酸a；
所述的PEG修饰剂包括PCL-PEG、DSPE-PEG、DSPE-SS-PEG 、PLGA-PEG、PE-PEG中的一种或二种以上，PEG的分子量为200-20000；
所述的用于增强光动治疗的级联纳米放大器的制备方法包括如下步骤：
将光敏剂、血红素和多不饱和脂肪酸分别溶解到有机溶剂中，搅拌下混匀，将混匀后的溶液缓慢滴加到水中，自发形成均匀的共组装纳米粒，将PEG修饰剂的有机溶剂在搅拌下滴加至共组装纳米粒中；除去有机溶剂，即得。
2.如权利要求1所述的一种用于增强光动治疗的级联纳米放大器，其特征在于，所述分子间作用力包括π-π堆积、疏水作用。
3.如权利要求1所述的一种用于增强光动治疗的级联纳米放大器，其特征在于，所述的PEG修饰剂为DSPE-PEG2K。
4.如权利要求1所述的一种用于增强光动治疗的级联纳米放大器，其特征在于，所述的有机溶剂包括乙醇、四氢呋喃、二甲基亚砜中的一种或任意两种的组合。
5.权利要求1-4任何一项所述的用于增强光动治疗的级联纳米放大器在制备药物传递系统中的应用。
6.权利要求1-4任何一项所述的用于增强光动治疗的级联纳米放大器在制备抗肿瘤药物中的应用。
7.权利要求1-4任何一项所述的用于增强光动治疗的级联纳米放大器在制备注射给药、口服给药或局部给药系统中的应用。
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Non-Patent Citations (2)
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| Molecularly Self-Engineered Nanoamplifier for Boosting Photodynamic Therapy via Cascade Oxygen Elevation and Lipid ROS Accumulation;Shenwu Zhang等;《ACS Appl. Mater. Interfaces》;第38497−38505页 * |
| 氟化共价有机聚合物在肿瘤光/声动力治疗中的应用;陶丹蕾;《中国优秀硕士学位论文全文数据库工程科技Ⅰ辑》(第4期);第3页，尤其是第3页第2段 * |
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