CN115266271A - 脱黑色素溶液及应用、脱黑色素的方法及应用和染色方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种脱黑色素溶液及应用、脱黑色素的方法及应用和染色方法，脱黑色素的方法包括向沸腾的所述脱黑色素溶液中加入待脱黑色素的组织切片后保温20分钟；操作简单方便，修复同时即可去除黑色素，黑色素脱色均匀彻底，无论黑色素含量多少都可适用；组织完整性、抗原性均保留完整，减少了染色过程中弱阳性和假阴性的出现；无需额外花时间脱色素，大大缩短操作时间，避免了脱色时间、漂白时间、变化温度等不易控制因素的干扰。

Description

脱黑色素溶液及应用、脱黑色素的方法及应用和染色方法
技术领域
本发明涉及免疫组织化学染色技术领域，具体涉及一种脱黑色素溶液及应用、脱黑色素的方法及应用和染色方法。
背景技术
恶性黑色素瘤是病理科日常工作中比较常见的一类肿瘤，需进行免疫组化染色辅助诊断，但部分黑色素瘤中黑色素大量沉积，形成深浅不一的棕黄色、棕褐色或棕黑色的黑色素颗粒与免疫组化染色常用的DNA显色剂颜色非常接近，相互干扰，难以区分，影响判读；因此需要进行脱色素处理。据文献报道国内外学者对脱黑色素进行了多种方法的探索，大致分为五类。
第一类是在常规免疫组织化学染色DAB显色后，运用不同的染液复染将黑色素颗粒显色为不同程度的绿色，可与棕褐色的阳性颗粒区分，但无论使用哪种染液复染，都存在有过量黑色素在组织和细胞中堆积时物理遮蔽严重的现象，使得组织结构和细胞的形态不清，细胞的异型性和核分裂像观察困难，并妨碍抗体与细胞中抗原结合，造成假阴性或染色减弱的现象，影响诊断，因此此方法不适合含大量黑色素组织。
第二类是运用罗氏免疫组化ultra View Universal AP Red Delection Kit(AP染色液)来标记抗原，FR显色使阳性颗粒为玫红色与组织原有的棕褐色色素颗粒形成对比，但FR显色切片不可使用乙醇类脱水剂脱水，接触乙醇类脱水剂可使标记的红色阳性颗粒褪色，令实验失败；也不能使用二甲苯进行透明处理，影响切片的透明度和清晰度；并且FR显色切片需使用水性封片剂封固，不利于切片的长期保存；同时也存在细胞中堆积过量黑色素时会妨碍抗体与细胞中抗原结合，造成假阴性或染色减弱的的问题。
第三类是在组织脱水前进行脱黑色素处理获得满意结果，但该方法耗时太长(36-40小时)，脱黑色素时间与黑色素含量呈正比脱色时间难以掌握，且对是否含有黑色素难以估计。
第四类是运用不同浓度的高锰酸钾脱黑色素，也是目前最经典常用的方法，但组织切片经强氧化剂脱黑色素处理后进行免疫组织化学检测存在一定的问题，一是这种传统的脱色素方法费时长(2-4小时)，脱色素的时间与色素含量呈正比，且对是否含有色素难以估计，脱色时间难以掌握；二是草酸漂白时间不易控制，草酸漂白时要根据色素多少，随时关注切片颜色变化，至组织不再脱色时应立即水洗终止反应，若漂白时间过短，脱色不干净，若漂白时间过长，会出现细胞核淡然不着色，组织结构不清，影响阅片；三是需考虑抗原的敏感性和特异性存在的差异，切片长时间浸泡在高锰酸钾中会引起部分抗原丢失，抗原抗体结合位点失去活性的情况，从而出现弱阳性或假阴性的结果；四是易造成组织掉片，可能是由于强氧化剂作用于切片破坏了玻片上的涂胶多聚赖氨酸阳离子基团的结构，使载玻片粘附力下降导致的，从而无法进行后续的免疫组织化学染色。
第五类是用H2O2脱黑色素，H2O2对大部分抗原均适用，室温下对抗原性基本无影响；但是H2O2脱色素的能力与温度和处理时间密切相关，温度越高时间越长脱色素越彻底，但对组织结构的破坏和抗原性的丢失也越严重，所以运用H2O2法脱黑色素时，处理好温度时间对组织结构的完整性和抗原性的关系至关重要，既要保证色素去除干净又要保证组织结构完整和抗原性不丢失。刘兴华等采用DAB显色后再用10％H2O2浸染，37℃过夜，出片时间会延迟一天，且若机染时复染了苏木素，苏木素也会被H2O2氧化为无色，脱色素后续再次复染苏木素，增加了操作步骤，稍显繁琐。陈永华等采用PBS(pH7.4-7.6)、NaOH(pH10.0)配制的1.8％H2O2溶液在70℃时经70-130min，陈琼荣等3％H2O2加热至40℃持续90min快速升温至55℃持续25min，或3％H2O2过夜处理，取得较好效果，但仍需耗时2小时左右，变换的温度也不易控制。
发明内容
本发明的目的在于提供一种脱黑色素溶液及应用、脱黑色素的方法及应用和染色方法，以解决现有各种免疫组织染色方法存在的上述问题。
第一方面，本发明提供一种脱黑色素溶液，向pH值为8.8～9.0的EDTA修复液中加入过氧化氢溶液制备而成，所述脱黑色素溶液中过氧化氢的浓度为0.75％。
采用上述技术方案，仅仅采用过氧化氢(H2O2)脱出黑色素时存在所需的浓度较高(至少1.8％)和所需的时间较长；乙二胺四乙酸二钠(英文简称EDTA)对免疫组织具有修复的作用；将乙二胺四乙酸二钠和过氧化氢同时使用时，两者具有协同作用，既能达到修复和脱黑色素的目的，还能降低过氧化氢的浓度，最主要是整个过程所需的时间远远低于现有仅仅采用过氧化氢脱黑色素的时间；由此可知，本发明公开的脱黑色素溶液在免疫组织化学染色中具有潜在的应用价值。
第二方面，本发明提供一种脱黑色素的方法，向沸腾的所述脱黑色素溶液中加入待脱黑色素的组织切片后保温20分钟。
采用上述技术方案，碱性环境中过氧化氢不稳定易分解形成HO2-离子，HO2-离子是活性漂白离子，HO2-离子主要与共轭羰基结构反应破坏其发色基团，起到消色的目的，在沸腾的环境下过氧化氢更容易分解；由此可知，适当的升高温度有利于缩短脱黑色素的时间；还能减少实验步骤进一步节约时间；本发明公开的脱黑色素的方法在免疫组织化学染色中具有潜在的应用价值。
第三方面，本发明提供一种免疫组织的染色方法，向沸腾的所述脱黑色素溶液中加入待脱黑色素的组织切片后保温20分钟，得到待染色组织切片；
对所述待染色组织切片进行染色。
采用上述技术方案后无需再用3％过氧化氢阻断内源性过氧化物酶，由此可知该方法节省了步骤；由于处理时间短，因此该方法还能降低组织结构的破坏和抗原性的丢失。
附图说明
图1为实施例2中编号为1的切片的HE染色后镜下图；
图2为实施例2中编号为6的切片的HE染色后镜下图；
图3为实施例2中编号为3的切片的免疫组织化HMB45染色后镜下图；
图4为实施例2中编号为7的切片的免疫组织化HMB45染色后镜下图。
具体实施方式
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明的发明人发现在采用现有的化学染色方法对免疫组织进行染色时均在所需时间太长，并且有的还存在假阴性或染色减弱的现象，严重影响诊断；其中，过氧化氢溶液脱黑色素的方法，虽然时间越长脱黑色素越彻底，但是对免疫组织结构造成的破坏和抗原性的丢失就越严重，因此需要缩短脱黑色素的时间。
基于上述问题，采用H2O2进行脱黑色素的方法上进行改进，本发明的发明人偶然发现，虽然碱性的EDTA溶液本身并没有脱色素的作用，但是将其与过氧化氢结合使用，不仅能够缩短脱黑色素的时间，还能降低过氧化氢所需的浓度，并且在高温下脱色效果还优于仅仅采用H2O2的效果(对组织结构和抗原性没有明显影响，不影响组织修复)，对后续染色过程没有明显的影响。
本发明公开了一种脱黑色素溶液，向pH值为8.8～9.0的EDTA修复液中加入过氧化氢溶液制备而成，所述脱黑色素溶液中过氧化氢的浓度为0.75％。
本发明中，碱性环境中过氧化氢分解形成HO2-离子，HO2-离子是活性漂白离子，HO2-离子主要与共轭羰基结构反应破坏其发色基团，起到消色的目的；碱性的EDTA本身没有脱色素的作用仅仅具有修复的作用；但是将两者结合用来脱出黑色素时，不仅适用于不同含量黑色素的脱除，而且黑色素脱色均匀且彻底，组织完整性和抗原性均保留完整，减少了弱阳性和假阴性的出现；无需额外花时间脱黑色素，大大缩短操作时间，避免了脱色时间、漂白时间、变化温度等不易控制因素的干扰；由此可知，本发明公开的脱黑色素溶液在免疫组织化学染色具有良好的应用前景。
使用本发明公开的脱黑色素溶液在后续免疫组织化学染色的过程中省略3％H2O2阻断这一步骤，节约时间和减少成本，并可与不需脱色素组织同步操作；染色结束后可用酒精脱水二甲苯透明保证了切片的透明度和清晰度；值得推广使用。
值得注意的是：过氧化氢加热易分解为H2O和O2，0.75％H2O2属于较低浓度，即使在较高温度的情况下会爆炸风险也会很低，而且在使用过程中采用敞口加热，基本能够完全杜绝爆炸的风险。
本发明中，合适地，EDTA修复液的pH值为9.0。
本发明中，所述过氧化氢的浓度为0.75％，现有单独使用过氧化氢进行脱黑色素的浓度，由此可知，本发明公开的脱黑色素溶液不仅降低了脱色素的时间，而且还降低了双氧水的浓度，提高了实验的安全性。
本发明中，所述脱黑色素溶液也可以由EDTA溶液和双氧水混合后通过强碱溶液调整pH得到，所述强碱包括但不限于氢氧化钠和氢氧化钾等。
本发明公开了一种脱黑色素的方法，所述方法包括：向沸腾的权利要求1或2所述脱黑色素溶液中加入待脱黑色素的组织切片后保温20分钟。
本发明公开的方法不仅操作步骤简单、安全而且还省略了时间。通过提升温度进一步降低了脱黑色素所需的时间，并且温度提高对组织结构和抗原性没有明显的影响，有利于后续染色得到良好的染色效果，使得结果更加准确，因此该方法在免疫组织化学染色中具有良好的应用前景。
本发明中，所述待脱黑色素的组织的厚度一般为2～5μm，合适地，3μm。
本发明还公开了一种免疫组织的染色方法，所述方法包括：向沸腾的前述脱黑色素溶液中加入待脱黑色素的组织切片后保温20分钟，得到待染色组织切片；
对所述待染色组织切片进行染色。
本发明所公开的染色方法简单易行，且染色效果良好，完全适合推广使用。
本发明中，在对待染色组织切片进行染色中可以采用常规可实现的染色液进行染色，如HE染色；或采用免疫组织化学染色，具体可以为将所述待染色组织切片进行第一次滴加一抗，室温下保持30～45min；第二次滴加第二抗试剂，室温下保持20～30min；DAB显色，室温保持10～15min；由此可知采用免疫组织化学染色时，与现有的方法相比能够省略3％过氧化氢阻断内源性过氧化物酶的步骤，从而节约了时间，也减少了步骤，可以在某种程度上提高染色成功的可能性。
本发明中，一抗和二抗均为免疫组织化学染色中常用的试剂，比如均购买于福州迈新公司的一抗HMB45、S-100、MelanA、Ki-67以及包含有二抗和DAB的免疫组化Maxvision试剂盒。
实施例
实施例1
制备脱黑色素溶液，包括以下步骤：向pH值为8.8～9.0的EDTA修复液中加入过氧化氢溶液制备而成，所述脱黑色素溶液中过氧化氢的浓度为0.75％。
实施例2
采用实施例1制备得到的脱黑色素溶液对组织切片进行脱色处理后染色。本实施例中组织切片为黑色素瘤组织。
制备标本：将所有未处理标本均用10％中性缓冲福尔马林固定，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡浸泡后包埋制成蜡块；从诊断后的标本中选取5例黑色素瘤组织的肿瘤且富含黑色素部分(一般整个肿瘤组织有至少50％被黑色素覆盖，该组织被称之为富含黑色素的组织)与对照组织一同制成芯片组织，连续切片10张，编号1-10，厚3μm，多聚赖氨酸包被载玻片捞片，65℃烤片2h，脱蜡至水待用。本实施例分为对照组和实验组两组。
对照组：不做脱黑色素处理，取编号为1的切片常规步骤做HE染色，再取编号为2-5的切片常规Maxvision法行免疫组织化学染色，2-5号分别标记HMB45、S-100、MelanA、Ki-67。免疫组织化学染色具体步骤如下：pH9.0的沸腾EDTA溶液中修复20min，3wt％H2O215min，第一次滴加一抗，室温下保持45min；第二次滴加二抗，室温下保持20min；DAB显色，室温保持15min，流水冲洗，苏木素对比染色后脱水透明封片。
实验组：取编号为6-10的切片，放入沸腾的实施例1制备得到的脱黑色素溶液中修复20min，自然冷却，蒸馏水洗，取出编号为6的切片常规步骤做HE染色，7-10号切片常规法进行免疫组织化学染色，7-10号切片分别标记抗体HMB45、S-100、MelanA、Ki-67。实验组中，免疫组织化学染色具体步骤如下：第一次滴加一抗，室温下保持45min；第二次滴加二抗，室温下保持20min；DAB显色，室温保持15min，流水冲洗，苏木素对比染色后脱水透明封片。
编号为1的切片镜下图如图1所示，由图1可知，未进行脱色素处理就直接HE染色，低倍放大，HE染色后的组织中可见大量棕黄色黑色素颗粒，影响诊断。
编号为6的切片染色镜下图如图2所示，由图2可知，在脱色素溶液中处理后，HE染色，低倍放大，黑色素去除干净，组织结构完整色彩亮丽，对比鲜明，核染色质清晰。
编号为2的切片染色镜下图如图3所示，由图3可知，，富含黑色素组织未脱色素，低倍放大，HMB45免疫组织化学染色后，组织中的黑色素与DNA显色的颜色相互混淆，无法判读。
编号为7的切片染色镜下图如图4所示，由图4可知，在脱色素溶液中处理后行HMB45免疫组织化学染色，低倍放大，黑色素去除干净，组织结构完整阳性部位准确，着色清晰。
由上可知，采用本发明公开的脱黑色素溶液，不仅可以节约脱黑色素的时间还可以降低过氧化氢的浓度，提高了脱色过程的安全性；经过采用本发明公开的脱黑色素及方法处理后的组织切片经染色后镜下观察组织黑色素去除干净，阳性着色清晰，强度尚好，定位准确，有利于诊断；在免疫组织化学染色的过程中还可以省略“用3％过氧化氢去除内源性过氧化物酶”这一步骤，进一步节约脱色素所需的时间；由此可知，本发明公开的脱黑色素溶液值得推广使用。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种脱黑色素溶液，其特征在于，向pH值为8.8～9.0的EDTA修复液中加入过氧化氢溶液制备而成，所述脱黑色素溶液中过氧化氢的浓度为0.75％。
2.根据权利要求1所述的脱黑色素溶液，其特征在于，所述EDTA修复液的pH值为9.0。
3.一种脱黑色素的方法，其特征在于，所述方法包括：向沸腾的权利要求1或2所述脱黑色素溶液中加入待脱黑色素的组织切片后保温20分钟。
4.一种权利要求1或2所述的脱黑色素溶液在免疫组织化学染色中的应用。
5.一种权利要求3所述的脱黑色素的方法在免疫组织化学染色中的应用。
6.一种免疫组织的染色方法，其特征在于，所述方法包括：
向沸腾的权利要求1或2所述脱黑色素溶液中加入待脱黑色素的组织切片后保温20分钟，得到待染色组织切片；
对所述待染色组织切片进行染色。
7.根据权利要求6所述的免疫组织的染色方法，其特征在于，在所述对待染色组织切片进行染色中采用HE染色液进行染色。
8.根据权利要求6所述的免疫组织的染色方法，其特征在于，在所述对待染色组织切片进行染色中采用免疫组织化学染色。
9.根据权利要求8所述的免疫组织的染色方法，其特征在于，所述免疫组织化学染色包括以下步骤：
将所述待染色组织切片进行第一次滴加一抗，室温下保持30～45min；第二次滴加第二抗试剂，室温下保持20～30min；DAB显色，室温保持10～15min。
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